CN110669801B - 提高中华羊茅-内生真菌菌株pa次生代谢产物震颤素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供提高中华羊茅‑内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法，包括以下步骤：(1)将中华羊茅‑内生真菌菌株PA的菌丝接种到平板PDA培养基上进行黑暗培养；(2)接种至M102种子液体培养基中继续培养；(3)接种至M104T培养基中进行发酵培养，离心收集滤液；发酵培养的条件为：黑暗培养，初始pH8‑10，装液量25‑100mL，接种量0.5％‑5％，接种时间14d‑28d，转速120r/min‑160r/min，温度20℃‑30℃。本发明利用中华羊茅‑内生真菌菌株PA的发酵液为材料，通过优化发酵条件，提高菌株代谢产物活性物质的产率，为微生物农药的研发提供基础资料。
Description
技术领域
本发明涉及提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法。
背景技术
内生真菌是指在其生活史的部分或全部阶段生活于植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的真菌(Siegeletal.,1987；李秀璋等,2014)。研究表明
内生真菌可产生具有生物活性的次生代谢产物生物碱，分别是以震颤素(lolitremB)为代表的吲哚双萜类(lndolditerpene)、以波胺(peramine)为代表的吡咯并吡嗪类(pyrrolopyrazine)、以麦角新碱(ergonovine)和麦角酰胺(ergine)为代表的麦角碱类(ergotalkaloids)、以黑麦草碱(loline)为代表的饱和吡咯类化合物(pyrrolizidine)等(高嘉卉和南志标,2007；徐瑞等,2012；李秀璋等,2015)。四大类生物碱均对某些线虫和食草昆虫具有一定的毒性。据统计超过77种禾草被认定为携带有
禾草内生真菌(师茜等,2018)，已分离鉴定出45种
禾草内生真菌(Leuchtmannetal.,2014；金文进等,2015；Shymanovichetal.,2017；Mihwaetal.,2018)，并且其至少对79个种的害虫表现出较明显的抗性(李秀璋等,2015；Xiaetal.,2018)。说明禾草内生真菌资源丰富，有作为潜在生防因子的潜力。
众多研究人员发现纯培养条件下，
禾草内生真菌亦可以产生一些生物碱等次生代谢产物(Blankenshipetal.,2001；Yueetal.,2000；高嘉卉,2007)，其对害虫具有较高毒力作用(ChristensenandLatch,1991；Faeth,2002；张雪兵等,2010；Schardletal.,2013)，说明其可以作为生防资源，但是含量较低(高嘉卉,2007)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法。通过单因素实验和正交实验优化发酵条件，来提高菌株代谢物产量，缩短发酵时间，降低耗能，减少污染。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法，包括以下步骤：
(1)将中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的菌丝接种到平板PDA培养基上进行黑暗培养；
(2)接种至M102种子液体培养基中继续培养；
(3)接种至M104T培养基中进行发酵培养，离心，收集滤液；
其中，步骤(3)中，所述发酵培养的条件为：黑暗培养，初始pH8-10，装液量25-100mL，接种量0.5％-5％，接种时间14d-28d，转速120r/min-160r/min，温度20℃-30℃。
作为优选，步骤(1)中，所述黑暗培养是在22℃下黑暗培养四周。
作为优选，步骤(2)中，所述培养是在22℃，转速200r/min的条件下黑暗培养四周。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵培养的条件为：黑暗培养，pH9、装液量75mL、接种量3％、接种时间21d、转速140r/min、温度20℃。
作为优选，所述禾草为中华羊茅。
本发明率先利用中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的发酵液为材料，通过单因素实验和正交实验优化发酵条件(pH、装液量、接种量、接种时间、摇床转速和温度)，提高菌株代谢产物活性物质的产率，为微生物农药的研发提供基础资料。
本发明通过摇瓶发酵获得发酵液；通过单因素实验获得菌株最适发酵条件(pH、装液量、接种量、接种时间、摇床转速和温度)，再通过正交实验获得菌株的最优发酵组合；根据最优组合进行发酵，测定生物碱含量，进行评价。
本发明的有益效果为：
1、减少发酵过程中的污染，成本低；
2、缩短发酵周期，能耗低；
3、提高活性代谢产物的产率；
4、为
禾草内生真菌研发为杀虫剂提供了基础资料。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为pH对震颤素含量的影响。
图2为装液量对震颤素含量的影响。
图3为接种量对震颤素含量的影响。
图4为接种时间对震颤素含量的影响。
图5为转速对震颤素含量的影响。
图6为温度对震颤素含量的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株由兰州大学草地农业科技学院草地保护所提供，编号为MHLZU-FSPA。
本发明的提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：
1、种子发酵液的制备：挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取2mL种子液到含100mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速100r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养两周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。
其中，平板PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000mL。
M102种子液体培养基配方为：蔗糖30g，麦芽糖20g，酵母膏1.0g，蛋白胨2g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，KH2PO41g，蒸馏水1000mL。(Bacon,1988；parrott,1994)。
M104T培养基配方为：山梨醇100g，葡萄糖40g，酵母浸膏3g，谷氨酸10g，色氨酸0.8g，MgSO4·7H2O0.3g，蒸馏水1000ml(Bacon,1988；parrott,1994)。
2、震颤素的体外检测：量取200μL菌液置于2ml离心管，加1ml的二氯甲烷，超声萃取5min，1000rmp离心10min，吸取0.4ml的上清液过Sep-pak柱(1ml甲醇活化)进行萃取，用1ml体积百分比为20％的甲醇和体积百分比为80％的二氯甲烷冲洗，然后用1ml相同的溶液收集，将收集的液体经0.33mm孔径的聚乙烯有机过滤垫(购自奋力达公司，商品名NAVIGATOR)至1.5ml棕色瓶中进行HPLC检测(Gallagheretal.,1985；刘静等,2017)。
3、单因素发酵筛选
将M104T培养基作为基础培养基进行发酵条件单因子筛选，包括初始值(pH)、装液量(发酵体积)、接种量、接种时间、摇床转速和温度。
3.1初始值
在250mL三角瓶装100mLM104T培养基，接种量2％，发酵液初始值pH分别为8、9、10、11和12，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同初始值pH对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
3.2装液量
采用筛选出的初始pH，装液量分别设置为25、50、75、100、125mL，装于含有M104T培养基的250mL三角瓶中，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同装液量对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
3.3接种量
采用筛选出的初始pH和装液量，接种量分别为0.5％、1％、2％、3％、4％和5％，装于含有M104T培养基的250mL三角瓶中，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养两周。研究不同接种量对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
3.4接种时间
采用筛选出的初始pH、装液量和接种量，在250mL三角瓶装M104T培养基，发酵时间分别为0d、7d、14d、21d、28d和35d，置于回转式摇床，22℃，100r/min培养至所需时间。研究不同接种时间对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
3.5摇床转速
采用筛选出的初始pH、装液量、接种量和接种时间，250mL三角瓶装M104T培养基，置于回转式摇床培养，转速分别设为100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min，22℃培养至所需时间。研究不同转速对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
3.6发酵温度
采用筛选出的初始pH、装液量、接种量、接种时间和转速，在250mL三角瓶装M104T培养基，发酵温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，置于回转式摇床培养至所需时间。研究不同的发酵温度对震颤素含量的影响，每个处理重复三次。
4、正交实验设计
根据单因素筛选结果，本实验选择了最适初始值(pH)、装液量(发酵体积)、接种量、接种时间、摇床转速和温度进行6因素3水平的正交实验。
按正交实验优化结果，选择最优组合进行发酵，在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。测定震颤素含量，每个处理重复三次。
5、结果分析
5.1单因素实验
根据单因素发酵条件筛选结果表明，选择初始pH(8、9、10)、装液量(25mL、75mL、100mL)、接种量(0.5％、3％、5％)、接种时间(14d、21d、28d)、转速(120r/min、140r/min、160r/min)、温度(20℃、25℃、30℃)进行6因素3水平(见表1)正交实验。
表1 PA菌株震颤素发酵因素和水平
5.2显著性分析
正交实验结果如表2所示，影响因素中pH、装液量、接种量、接种时间和温度对PA菌株震颤素含量具有显著(P＜0.05)影响，而转速对其影响不显著(P>0.05)，6个因素的主次关系是：pH>装液量>接种量>接种时间>温度>转速。(见表2)。
表2 PA菌株震颤素含量主体间效应检验显著性分析
R方＝0.961(调整R方＝0.867)
5.3处理组合优选
根据各因素显著性分析结果可得，最适PA菌株产震颤素的组合为A2B2C2D2E2F1。即pH9、装液量75mL、接种量3％、接种时间21d、转速140r/min、温度20℃。
5.4优化结果验证
优化后的PA菌株发酵液产震颤素含量增长了3.5倍(表3)。
表3发酵优化验证结果
实施例1
本发明的提高中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：
挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取2.25mL种子液到含75mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为9，置于转速140r/min，温度20℃的摇床培养箱内黑暗培养三周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。
实施例2
本发明的提高
禾草内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：
挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取1.25mL种子液到含25mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为10，置于转速120r/min，温度25℃的摇床培养箱内黑暗培养两周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。
实施例3
本发明的提高
禾草内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素(LolitremB)含量的方法如下：
挑取斜面试管菌种中华羊茅(Festucasinensis)-内生真菌(
sp.)菌株PA的菌丝转接至平板PDA培养基上，22℃黑暗培养四周，四周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6mm的菌碟，尽量切碎，转入含100mLM102种子液体培养基的250mL三角烧瓶中，置于转速200r/min，温度22℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促进菌丝体生长，用一次性注射器分别吸取0.5mL种子液到含100mlM104T培养基的250mL三角烧瓶中，培养基的初始pH为8，置于转速160r/min，温度30℃的摇床培养箱内黑暗培养四周，促使菌丝体产碱。在无菌条件下，将发酵液用一次性针管吸取10mL置于离心管中。以6000r/min离心10min，抽滤，把滤液和菌丝体分开，收集滤液。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.提高中华羊茅-内生真菌菌株PA次生代谢产物震颤素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将中华羊茅(Festuca sinensis)-内生真菌Epichloësp.菌株PA的菌丝接种到平板PDA培养基上进行黑暗培养；所述黑暗培养是在22℃下黑暗培养四周；
（2）接种至M102种子液体培养基中继续培养；所述培养是在22℃，转速200 r/min的条件下黑暗培养四周；
（3）接种至M104T培养基中进行发酵培养，离心，收集滤液；
其中，步骤（3）中，所述发酵培养的条件为：黑暗培养，pH 9、装液量75 mL、接种量3%、接种时间21 d、转速140 r/min、温度20℃。
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