CN105061536A - 一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法，通过将双孢菇子实体经干燥，按照料液比1:10加入75%乙醇浸泡24h，在50℃超声波提取50min后收集提取液浓缩、过滤，并经微孔滤膜过滤和分离提取液浓缩后，加入5-6倍体积95%乙醇，搅拌沉淀，经水解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次醇沉，合并两次醇沉液，减压浓缩至无醇，经活性炭柱吸附、乙醇溶液洗脱、减压浓缩，放置结晶获得虫草素。本发明针对目前未见双孢菇子实体中能够提取虫草素的现状，具有提取率高、成本低、易于操作等优点，解决了现有虫草素资源的缺乏和由于提取原料价格高昂带来的虫草素成本显著高的不利后果等技术问题，具有广泛的应用价值。

Description

一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法

技术领域

本发明涉及天然活性成分分离提取的技术领域，具体的，本发明涉及一种虫草素新的来源提取技术领域。

背景技术

虫草素（Cordycepin）又称3'—脱氧腺苷(3'-Deoxyadenosine)是一种具有熟知抗菌活性的核苷类物质，又称蛹虫草菌素、虫草菌素。冬虫夏草具有护心养脑、强肾固本、改善血液循环、抗疲提神、改善亚健康状况等作用，是众所周知的滋补品。现代药理学研究表明虫草素具有：抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、降血糖、降血脂、治疗白血病等多种功效，对十大恶性疾病的临床治疗具有功能显著的、潜在的应用空间。虫草素作为虫草中特有的活性成分，已引起世界范围内的广泛关注，具有良好的应用前景。

目前已知的含虫草素主要来源于真菌，常见的是虫草属，如蛹虫草、冬虫夏草、新疆虫草等，除了蛹虫草子实体及其无性型蛹草拟青霉发酵菌丝体外，还有泰山虫草、九州虫草、蝉花及其无性型蝉拟青霉、香棒虫草、虫草头孢菌、古尼虫草、无冠构巢菌霉、蝙蝠蛾被孢霉、拟黑虫草、蝙蝠蛾柱霉、克列特尼棒束孢霉等。黄国鑫等测定出人工蛹虫草子实体中的虫草素含量为0.503mg/g(黄国鑫，任薇，吕在坤，严钦惠，苏子仁.HPLC法测定蛹虫草子实体及其培养基的虫草素含量.亚太传统医药，2010,10（6）:36-38.)。王雅玲等以蛹虫草大米培养残基为原料,采用超声波辅助提取法测定蛹虫草大米培养残基中虫草素含量为.011-2.185g/Kg(王雅玲,孙力军,赵轶男,李婷婷,郭宇森.蛹虫草大米培养残基中虫草素提取方法的优化研究.安徽农业科学,2009,37(8):3364-3366.)。在此之前，从未发现双孢菇中含有虫草素，现有技术未有能够从双孢菇中提取虫草素的报道。

目前虫草素含量的测定方法很多，主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-ESI/MS)法及薄层色谱扫描法等。常用的虫草素分离纯化方法主要有离子交换树脂吸附法、氧化铝柱层析、硅胶柱层析以及活性炭吸附法等。其中离子交换树脂吸附法需要用酸碱处理，后处理比较复杂，其他几种方法提取得率低，分离纯化选择性差，难以进行工业化生产。何余堂等利用超声波酶法辅助分离提取人工栽培北虫草中虫草素的提取率为0.923%(何余堂，张晓莉，解玉梅，王博，励建荣.人工栽培北虫草中虫草素的分离提取研究.食品工业科技,2013,34(13):215-222.)，而郭涛等利用高效液相色谱法测定人工蛹虫草中的虫草素提取率为1.537%(郭涛,张龙,王兵,申鸿.不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定,蚕业科学,2011,37(6):1117-1122.)，因此需要寻找更好的提取率高、成本低和易于工艺化生产的虫草素纯化工艺。

目前，尚未有任何研究表明，双孢菇中含有虫草素，现有技术中没有披露能够从双孢菇中提取虫草素的技术方法，更没有研究出一种方法能够从双孢菇子实体中提取出虫草素。采用常见的虫草素分离纯化方法也未见从双孢菇中能够提取出虫草素的报道。

双孢菇属草腐菌，中低温性菇类，生长速度中偏快，是最常见的食用菌种之一，肉质肥厚。子实体中等至稍大，菌盖直径3-15厘米不等。菌肉白色，厚，担子上有两个担孢子，所以称为双孢蘑菇。很多国家都有栽培，其中我国总产占第二位，我国稻草、麦草丰富，气候比较适合双孢菇的生长，具有很大发展潜力。

双孢菇的菌肉肥嫩，并含有较多的甘露糖、海藻糖及各种氨基酸类物质，所以味道鲜美，营养丰富。双孢菇蛋白质含量为35%—38%，含有人体必须的6种氨基酸，还含有丰富的维生素B1，维生素B2，维生素PP，核苷酸，烟酸，抗坏血酸和维生素D等，其营养价值是蔬菜和水果的4—12倍，享有“保健食品”和“素中之王”美称。深受国内市场，尤其是国际市场的青睐。双孢菇不仅是一种味道鲜美，营养齐全的菇类蔬菜，而且是具有保健作用的健康食品。

双孢菇易于大规模生产，且价格低廉，如果作为虫草素的原料来源，经济实惠，具有很大的提取价值。鉴于目前尚无关于在双孢菇子实体中提取虫草素的方法，因此提供一种能够从双孢菇子实体中提取虫草素的方法具有重要的实质性意义。

发明内容

针对目前国内外未见双孢菇子实体中含有虫草素的现状，也未见披露能够从双孢菇中提取虫草素的技术报道，本发明旨在于提供一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法，克服了目前虫草素提取过程中原料缺乏、价格昂贵的现状，能够解决现有虫草素资源的缺乏和由于提取原料价格高昂带来的虫草素成本显著高的不利后果等技术问题。采用本发明提供的从双孢菇子实体中提取虫草素的方法，能够实现从常见的价格比较低廉的双孢菇子实体中提取虫草素，改变了传统虫草素的提取来源和方法，能够大幅度降低虫草素提取成本和价格，并实现工业化生产，具有极大的经济价值。

本发明的技术方案：

通过以从双孢菇子实体中提取虫草素为目的，采用提取双孢菇子实体原料在65℃干燥12h，按照料液比1:10加入75%乙醇浸泡24h，在50℃超声波提取50min后收集提取液，提取液浓缩至原液的5%后过滤，得到粗提液；粗体液经薄层层析法初步测定虫草素含量；粗提液再经微孔滤膜过滤后，经高效液相法进一步测定虫草素含量；分离提取液浓缩后，加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次醇沉，合并两次醇沉液，减压浓缩至无醇，加入活性炭柱吸附，乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素。

本发明具体提供一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法，采用的提取方法具体步骤如下：

（1）采用双孢菇子实体原料在65℃干燥12h，按照料液比1:10加入75%乙醇浸泡24h，在50℃超声波提取50min后收集提取液，提取液浓缩至原液的5%后过滤，得到粗提液。

（2）将粗体液经0.45μm微孔滤膜用10mL注射器过滤后浓缩获得分离提取液。

（3）将上述获得浓缩后的分离提取液加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用5mL水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次加入5-6倍体积95%乙醇进行醇沉，过滤，合并两次醇沉液，40℃减压浓缩至无醇，加入活性炭柱以2BV/h流速吸附，再用2-3倍柱体积50%乙醇溶液洗脱，洗脱液40℃减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素。

本发明中，采用薄层层析法能够快速测定提取液中的虫草素，提取溶媒用量少，能耗低，提取时间短，有效成分不损失。本发明中，采用HPLC法快速测定提取液中虫草素的含量，此方法灵敏度高，测量准确误差小，提取率高，出峰时间为5.749min,其含量可达4.48ug/mL。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

（1）本发明在天然活性成分分离纯化基础上，通过系列性实验验证，采用薄层层析法首次发现双孢菇中含有微量虫草素，薄层板中样品展开点与标样点有相同的对应点。采用HPLC法测定样品中虫草素含量，出峰时间为5.749min,其含量可达4.48ug/mL。从技术角度和实验结果表明，本发明提供的方法，在双孢菇子实体中提取出虫草素有开创性的意义。

（2）本发明提供的方法具有提取率高、成本低、易于操作等优点，解决了虫草素在传统提取过程中的提取率低、价格昂贵、原料供应不足等问题。通过本发明的方法，可从双孢菇子实体中提取出从虫草素，使其产量大幅度提高，且生产成本降低、利润明显增加。

（3）由于双孢菇的易获取性、提取方法的可操作性，以及双孢菇实现大规模产业化生产加工，获取成本低，有利于虫草素的工业化提取的推广。可见本发明提供的从双孢菇子实体中提取虫草素的方法具有广泛的实用性和开发价值，为充分开发利用双孢菇资源具有重要的现实开发价值。

附图说明

图1显示为TLC法测定的双孢菇中虫草素含量。

具体实施例方式：

下面，举实施例说明本发明：

采用的主要原辅料：双孢菇，由新疆农业科学院社区蔬菜供应站提供，实验所用双孢菇为未清洗等处理的新鲜双孢菇，菌盖菌柄均用于实验。

采用的主要试剂：95%乙醇和无水乙醇为分析纯，无水甲醇为色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司；去离子水（实验室自制）；三氯甲烷，乙酸乙酯，异丙醇，浓氨水等均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂。

采用主要的仪器设备：FW-100高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；AnkeTDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；ZF-6型紫外分析仪，上海越众仪器设备有限公司；HL-2型恒流泵，上海市沪西仪器厂；安捷伦2200型高效液相色谱仪，北京立元电子科技有限公司；洁盟牌JD-040s型超声波震荡清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；1×20cm活性炭柱有机玻璃管，上海帅登仪器有限公司，粉末活性炭，承德翼北燕山活性炭有限公司。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施，尤其利用本领域已熟知常规技术也落入本发明的保护范围。

实施例一：

从双孢菇子实体中提取虫草素的具体方法步骤如下：

（1）采用双孢菇子实体原料在65℃干燥12h，按照料液比1:10加入75%乙醇浸泡24h，在50℃超声波提取50min后收集提取液，提取液浓缩至原液的5%后过滤，得到粗提液。

（2）将粗体液经0.45μm微孔滤膜用10mL注射器过滤后浓缩获得分离提取液。

（3）将上述获得浓缩后的分离提取液加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用5mL水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次加入5-6倍体积95%乙醇进行醇沉，过滤，合并两次醇沉液，40℃减压浓缩至无醇，加入活性炭柱以2BV/h流速吸附，再用2-3倍柱体积50%乙醇溶液洗脱，洗脱液40℃减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素。

将上述获得浓缩后的分离提取液加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用5mL水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次加入5-6倍体积95%乙醇进行醇沉，过滤，合并两次醇沉液，40℃减压浓缩至无醇，加入活性炭柱以2BV/h流速吸附，再用2-3倍柱体积50%乙醇溶液洗脱，洗脱液40℃减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素

实施例二：

称取双孢菇干燥样品10g加入100mL75%乙醇浸泡24h后，50℃超声波提取50min,过滤后提取液浓缩至5mL,浓缩液离心，取上清液为样品液；取1μL样品液在硅胶薄层铝板上用微量毛细管取点样，直立上行展开9cm（展开剂为氯仿：醋酸乙酯：异丙醇：水：浓氨水=8:2:6:0.3:0.2，展开前饱和15min左右）。取出薄层板，待溶剂挥干后，用紫外灯照射仪检测虫草素；结果在紫外灯下检测出在259nm处的吸收点与标准样品相对应，其Rf值为0.573，参见附图1。

实施例三：

称取双孢菇干燥样品10g加入100mL75%乙醇浸泡24h后，50℃超声波提取50min,过滤后提取液浓缩至5mL,浓缩液离心，取2mL用0.22μm微孔滤膜过滤注入进样瓶待用；采用不同比例的甲醇、水作为流动相，甲醇和水分别用0.45μm水相滤膜和有机相滤膜过滤，超声波震荡脱气处理30min，HPLC法进样分析。高效液相色谱条件为：色谱柱：C18制备柱（7.8mm×150mm,5um），柱温：35℃，流动相组成：15%甲醇，85%双蒸水，流速：1ml/min，检测波长：260nm，进样量：10ul；经测定，虫草素出峰时间为5.749min，样品中虫草素含量达4.48ug/mL。

通过上述实施例提供的技术方案，并经过系列实验证明：本发明提供的从双孢菇子实体中提取虫草素的方法具有易操作、实用价值高等特点，解决了现有虫草素资源的缺乏问题。通过本发明的方法，可工业化提取虫草素，使其产量大幅度提高。此外，由于双孢菇作为原料经济实惠，容易获取，此前并未发现双孢菇子实体中含有虫草素，可见，本发明提供的从双孢菇子实体中提取虫草素的方法具有广泛的实用性和开创新的经济价值，因此在实践中便于提取虫草素具有现实的作用。

如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种从双孢菇子实体中提取虫草素的方法，其特征在于，采用的方法具体步骤如下：

（1）采用双孢菇子实体原料在65℃干燥12h，按照料液比1:10加入75%乙醇浸泡24h，在50℃超声波提取50min后收集提取液，提取液浓缩至原液的5%后过滤，得到粗提液；

（2）将粗体液经0.45μm微孔滤膜用10mL注射器过滤后浓缩获得分离提取液；

（3）将上述获得浓缩后的分离提取液加入5-6倍体积95%乙醇，充分搅拌充分沉淀，沉淀物再次用5mL水溶解，加入浓度3%-10%的三氯乙酸除去蛋白，再次加入5-6倍体积95%乙醇进行醇沉，过滤，合并两次醇沉液，40℃减压浓缩至无醇，加入活性炭柱以2BV/h流速吸附，再用2-3倍柱体积50%乙醇溶液洗脱，洗脱液40℃减压浓缩，放置结晶，结晶物干燥即得虫草素。