CN105031609A - 含抗菌肽Cbf-14的消毒剂及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及消毒用品领域，具体公开了一种含有14个氨基酸的抗菌肽Cbf-14消毒喷雾剂的制备及用途。本发明消毒剂由Cbf-14、多肽保护剂、润肤剂和两性离子表面活性剂组成。本发明的主要剂型为喷雾剂，可用于手术后创面的消毒处理及手术伤口的护，外伤创面的皮肤消毒处理，烧伤、烫伤、灼烧、擦伤的皮肤消毒护理，手术器械的消毒处理，一般性的皮肤黏膜消毒护理。本发明的消毒喷雾剂对于革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌都有很好的杀菌活性，且其具有无毒、无刺激性的特点，是一种皮肤黏膜消毒产品。

Description

含抗菌肽Cbf-14的消毒剂及其制备和用途

技术领域

本发明涉及消毒剂研究及其应用技术领域，尤其是提供了一种含有抗菌肽Cbf-14的消毒剂处方研制及其制备方法和应用。

背景技术

消毒剂主要用于杀灭传播媒介中的病原微生物，使其达到无害化要求，将病原微生物消灭于人体之外，切断传染病的传播途径，达到控制传染病的目的。目前常用的消毒剂一般都是化学消毒剂，有刺激性气味，腐蚀性强，对呼吸道有剌激，对家具、电器、金属物品等有损害，还对环境有一定的污染。如果为了减少刺激，降低化学消毒的成分的含量，但是其对细菌及真菌的杀灭能力会大幅度降低，不能达到消毒剂的国家标准。因此迫切的需要研发出一种安全、低毒、高效、广谱的新型消毒剂。

随着对消毒剂的不断研究，研发出了一系列不同总类的消毒剂，为了针对不同适应症其制剂种类不断增多。对于主要针对皮肤、黏膜的消毒剂，液体消毒剂相对于其他剂型的消毒剂更加有优势，因为液体消毒剂对于皮肤的保护作用更强，它能够使得皮肤粗糙度降低，保持皮肤的水分不丢失，并且对于皮肤的刺激性较低。对剂型的进一步研究发现，喷雾剂能够将药物喷至腔道黏膜、皮肤上，且携带较为方便且应用范围更加广泛等优点，使其成为了本发明消毒剂的剂型首选。

在我们的前期研究中发现抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)具有广谱抗菌的作用，他对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌都有一定的杀菌作用，并且其是人体免疫体系的一部分，其与吞噬细胞、上皮细胞、干扰素、溶酶体、补体等一样是防御病原微生物入侵的非特异性屏障。抗菌肽Cbf-14是在金环蛇Cathelicidin抗菌肽BF-30的基础上通过生物信息学的优化得到了含有14个氨基酸序列的多肽，其氨基酸序列为RLLRKFFRKLKKSV，其带有7个正电荷，分子量为1819.33，等电点为12.31。根据研究发现其对细菌有着很好的杀菌活性，其对耐药细菌也有着很好的杀菌作用。公开于中国专利CN103435686A中。

发明内容

本发明公开了一种含有抗菌肽Cbf-14的消毒剂，消毒剂中加入了两性离子表面活性剂，使得消毒剂能够在更短的时间内达到国标要求的消毒效果，在消毒剂中添加了抗菌肽保护剂，使消毒剂中的抗菌肽Cbf-14在较长时间内维持在较高浓度，较好的延长了产品的有效期。

本发明还公开了一种含有抗菌肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备方法。

优选的本发明的消毒剂，含有下列各比例的组分：

余量为水。所述百分比为体积百分比。

其中聚乙二醇-400为多肽保护剂。丙三醇为多肽保护剂和保湿剂。异构醇聚氧乙烯醚为两性离子表面活性剂。

本发明的消毒剂主要用于手术后创面的消毒处理及手术伤口的护理，外伤创面的皮肤消毒处理，烧伤、烫伤、灼烧、擦伤的皮肤消毒护理，手术器械的消毒处理，一般性的皮肤黏膜消毒护理。

本发明的消毒制剂优选针对的菌种为革兰阳性菌金黄色葡萄球菌，革兰阴性菌铜绿假单胞菌和真菌白色念珠菌等菌株。

本发明的消毒剂其剂型优选为喷雾剂。

本发明的消毒剂可用如下方法制备：称取抗菌多肽Cbf-14，加无菌水一定量搅拌至溶解，再依次添加PEG400、异构醇聚氧乙烯醚、丙三醇，最后补加无菌水至定容，过滤除菌，即得。

下面是本发明消毒剂处方筛选、活性实验及结果。

一、消毒剂处方筛选试验：

(1)PEG400的配比筛选：

在抗菌肽Cbf-14最终浓度为300μg/mL的情况下调整PEG400的比例，使PEG400的比例为5％，10％，20％，30％，40％。在此条件中，分别测定其对于革兰阳性菌金黄色葡萄球菌，革兰阴性菌铜绿假单胞菌，真菌白色念珠菌的杀菌效力。

结果见图1。从图1我们可以看出PEG400的比例对于消毒剂的杀菌效果并无太大影响，且从图中我们发现多肽短时间内对白色念珠菌的杀菌效力不能达到国家消毒剂的标准(即对真菌的杀灭对数值大于4.00)，因此我们要提高消毒剂对于真菌的杀菌能力并且对于PEG400的比例也需进一步研究。

(2)异构醇聚氧乙烯醚的配比筛选：

在一系列试验之后我们发现两性离子表面活性剂能够很好的使细菌和真菌的细胞表面张力降低，能够辅助抗菌肽对于细菌及真菌更好的杀伤。

在抗菌肽Cbf-14最终浓度为300μg/mL的情况下调整异构醇聚氧乙烯醚的比例，使异构醇聚氧乙烯醚(AEO5-80N)的比例为0.5％，1％，2％，3％，4％，5％，在此条件中，分别测定其对于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌的杀菌效力。

结果见图2。从图2中我们可以看出在异构醇聚氧乙烯醚的配比为1％的时即能有很好的杀菌活性，因此配方中的异构醇聚氧乙烯醚的配比优选1％为下限。

(3)单纯的异构醇聚氧乙烯醚对于细菌和真菌的杀菌能力

在不添加任何抗菌肽Cbf-14的前提下测定不同配比的异构醇聚氧乙烯醚对于细菌和真菌的杀菌作用。

结果见图3。从图3中我们可以发现不同比例的异构醇聚氧乙烯醚(AEO5-80N)对于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌这些菌株在5min内并没有杀菌能力，但是在添加了抗菌肽Cbf-14的条件下消毒剂就能够快速导致细菌与真菌的死亡，这证明在添加了两性离子表面活性剂能够使得细菌与真菌细胞表面张力下降，从而辅助抗菌肽Cbf-14对于细菌和真菌的杀伤能力。

(4)消毒喷雾剂的多肽保护剂及皮肤保湿剂配比最终确定：

在本发明的开发过程中我们发现低配比的多元醇对于多肽有更好的保护作用，在丙三醇含量为2～10％范围内添加PEG400不同的浓度后，发现PEG400含量为5～20％时最适合。表1是在添加了5％丙三醇的基础上添加30％PEG400、20％PEG400、15％PEG400、10％PEG400和5％PEG400五种配比，将其放置于54℃的培养箱中孵育14天之后观察其中抗菌肽Cbf-14的含量的变化，选择对抗菌肽有更好保护作用的配比。

表1为经过54℃孵育14天不同配比溶液中抗菌肽Cbf-14含量测定

由表1中我们可以发现抗菌肽Cbf-14的保留时间在9.8min左右，与Cbf-14标样的峰面积相比5％PEG400与5％丙三醇组成的配比的峰面积在54℃经过14天之后仍无太大变化，其中Cbf-14含量下降只有6.4％，而30％PEG400溶液其含量下降了60.3％。

(5)抗菌肽Cbf-14浓度的筛选

在确定最优配比之后。我们调整抗菌肽Cbf-14的浓度，以降低生产成本，更好的服务于广大消费市场。在溶剂条件一定的情况下调整抗菌肽Cbf-14的质量浓度，使其最终药物浓度分别为100、150、200、300、400、500μg/mL,测定其对于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌的杀菌效力。

结果见图4。从图4中我们可以看出虽然在150μg/mL消毒剂对于金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌都还有不错的杀菌活性但是对于真菌白色念珠菌的杀伤作用不能满足国家对于消毒剂的标准，所以其优选的最低有效浓度为200μg/mL。

二、过滤冲洗法去除消毒剂残留的试验：

(1)试验菌与菌液制备：

细菌：金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15552；真菌：白色念珠菌ATCC10231

将试验用细菌从甘油管中接种至营养琼脂斜面，37℃培养24h，在挑取少量菌落于2mL的营养肉汤培养基中，37℃培养8h，即得菌悬液；将真菌接种至改良马丁琼脂斜面，30℃培养48h，挑取少量菌落于2mL改良马丁培养基中，30℃培养8h，即得菌悬液。

(2)消毒剂制备：

称取抗菌肽Cbf-14200mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐一添加50mLPEG400，10mL异构醇聚氧乙烯醚，50mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均匀，0.22μm滤膜过滤除菌。

(3)过滤冲洗法去除消毒剂残留实验：

第1组。吸取0.5mL试验菌悬液于试管内，加入0.5mL有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加4.0mL消毒剂(应先置20℃±1℃中水浴)于试管内，混匀，作用5min。吸取该最终样液0.5mL，加于含4.0mL稀释液试管中，混匀。吸取最终样液1.0mL接种于平皿内，做活菌培养计数。第2组。吸取0.5mL试验菌悬液于试管内，加入0.5mL有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加4.0mL消毒剂于试管中，混匀。作用5min，对其进行去除消毒剂处理，并取最终样液1.0mL接种于平皿内，做活菌培养计数(如为滤膜法，可先进行10倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面)。第3组。吸取试验菌悬液1.0mL，置含4.0mL稀释液的试管中，不加消毒剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。

(4)评价标准

第1组无试验菌，或仅有极少数生长；第2组有远较第1组为多，但较第3组为少的试验菌生长；第3组测定的结果，微生物数量应在1×10⁷～5×10⁷CFU/mL之间；连续3次试验取得合格评价。

(5)实验结果见表2。

表2即为膜过滤冲洗法去除残留消毒剂的结果

由表2可以看出用物理方式(即膜过滤冲洗)能够有效的去除其中的消毒剂残留，这使得消毒剂的药效评价更加的准确。

三、消毒喷雾剂对于细菌及真菌的杀菌作用

(1)试验菌与菌液制备：

细菌：金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15552；真菌：白色念珠菌ATCC10231

将试验用细菌从丙三醇管中接种至营养琼脂斜面，37℃培养24h，在挑取少量菌落于2mL的营养肉汤培养基中，37℃培养8h，即得菌悬液；将真菌接种至改良马丁琼脂斜面，30℃培养48h，挑取少量菌落于2mL改良马丁培养基中，30℃培养8h，即得菌悬液。

(2)消毒喷雾剂对于细菌及真菌的杀灭试验

试验组：取消毒试验用无菌试管，先加入0.5mL试验用菌悬液，再加入0.5mL有机干扰物质，混匀，置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取消毒液5.0mL注入其中，迅速混匀并立即计时；待试验菌与消毒剂相互作用5min，分别吸取1.0mL试验菌与消毒剂混合液加入到过滤器中过滤，然后加入150mL至500mL冲洗液(预先置20℃±1℃水浴中5min)做第1次冲洗过滤处理，再加入50mL蒸馏水做第2次冲洗过滤处理，最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置37℃恒温培养箱中培养至规定时间(白色念珠菌置于30℃培养)。阳性对照组：吸取0.5mL试验菌悬液于试管内，加入0.5mL有机干扰物，再加入5.0mL标准硬水，混匀。做系列10倍稀释后取适当稀释度该混合液1.0mL加入到过滤器中，然后加入50mL蒸馏水(预先置20℃±1℃水浴中5min)作冲洗过滤处理，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置37℃恒温培养箱中培养至规定时间(白色念珠菌置于30℃培养)，计数菌落数。阴性对照组：分别吸取稀释液、蒸馏水和硬水各1.0mL于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15～20mL，置37℃恒温培养箱中培养至规定时间，计数菌落数。

(3)实验结果见表3。

表3为消毒喷雾剂对于细菌及真菌的杀菌效果

从表3可以看出以抗菌肽Cbf-14为主药的消毒喷雾剂在5min内对于革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌和革兰阴性菌:铜绿假单胞菌的杀灭对数值都大于5lg(CFU/mL)；对于真菌白色念珠菌的杀灭对数值也超过4lg(CFU/mL)，这表明此消毒喷雾剂无论对于细菌还是真菌都有着良好的杀菌作用，其具有广谱杀菌的作用，因此此消毒喷雾剂是一种良好的生物消毒剂，可广泛的应用于临床的皮肤黏膜消毒。

四、消毒喷雾剂的稳定性测定

(1)消毒喷雾剂留样外观检查

观察记录消毒剂有无颜色变化并且对液体消毒剂应观察记录有无沉淀或悬浮物产生，对片剂应观察记录外观性状是否完好。性状变化的记录应写进检测报告。

将消毒喷雾剂放置于54℃，14天之后，其颜色仍为无色透明液体，并且无沉淀或悬浮物产生，其外观性状无明显变化。

(2)消毒喷雾剂加速测试实验

取包装好的消毒剂，置54℃恒温箱内14天。于放置前、后分别测定消毒剂杀菌有效成分含量。每次检测样品为三批，每批样品重复测3次，取其平均值即可。

(3)消毒喷雾剂温度加速实验后有效成分变化

选取高效液相(HPLC)的方式进行测定消毒喷雾剂中的抗菌肽的有效成分含量。检测的流动相设定：流动相A为含0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％的三氟乙酸的纯净水。检测波长的选取为：220nm；检测仪器为：安捷伦1100。洗脱条件为：

(4)消毒剂喷雾剂的温度加速实验Cbf-14含量变化见表4.

表4为消毒剂经过54℃，14天之后其中抗菌肽Cbf-14含量变化

表4为200μg/mL的抗菌肽Cbf-14标准品以及消毒喷雾剂经过54℃留样14天之后的HPLC图谱中Cbf-14的保留时间及峰面积

从表4中我们发现消毒剂主要成分Cbf-14的保留时间在10.42附近，通过比较两者的峰面积，我们可以看出经过54℃，14天留样之后其消毒喷雾剂中的主要成分抗菌肽Cbf-14的含量并没有明显降低，其有效成分下降5.8％符合国家消毒剂标准≤10％，说明本发明的消毒剂对热有着很好的稳定性。

结果表明本发明所研发的消毒剂产品稳定性良好。

五、消毒喷雾剂的皮肤、黏膜刺激性实验

(1)完整皮肤刺激性性实验

在试验前25h，用脱毛剂将豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，不得损伤皮肤。去毛范围，左、右各约3cm×3cm。次日将受试物(浓度一般为皮肤消毒应用液的5倍或原液0.5mL(g)直接滴于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛完整皮肤上，或滴于同样大小的2～5层纱布上并敷贴在一侧去毛皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛皮肤作为空白对照(或溶剂对照)，敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应。

(2)破损皮肤刺激性实验

涂受试物前，在2.5cm×2.5cm的去毛皮肤上，用75％酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头在皮区内划一个“井”形的破损伤口，并在该破损皮区内染毒。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。次日将受试物(浓度一般为皮肤消毒应用液的5倍或原液0.5mL(g)直接滴于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛破损皮肤上，另一侧去毛破损皮肤作为空白对照(或溶剂对照)，敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应。

(3)眼球黏膜刺激性实验

受试物一般为黏膜或空气消毒应用液的5倍浓度的溶液或原液。吸取受试物0.1mL，滴入家兔一侧眼结膜囊内。另一侧眼以生理盐水作为正常对照。滴受试物后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7天、14天和21天，肉眼观察家兔眼的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7天或第14天，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2％荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。

(4)急性经口毒性实验

小鼠或大鼠任选一种，雌雄各半。小鼠体重18～22g，大鼠体重180～220g，根据不同的计算LD₅₀方法，选用适当的动物数量，一般每组选用10只动物，动物总数不少于40只。

动物的准备：试验前，一般禁食过夜，不限制饮水。受试物的配制：常以水或食用植物油为溶剂配制成溶液，或采用0.5％羧甲基纤维素配制成混悬液。灌胃给予受试物的最大容量，小鼠不超过0.2mL/10g体重，大鼠不超过1.0mL/100g体重。染毒方法：用灌胃方式将受试物一次给予动物。若受试物毒性很低，一次灌胃容量太大，可在24h内分成2～3次给予，其总剂量作为一日剂量计算。染毒后观察动物的中毒表现和死亡数及死亡时间，并对死亡动物和观察期满处死动物进行尸体解剖，肉眼观察，发现有异常的组织或脏器，尚需进一步作组织病理学检查。观察时间14天。

(5)实验结果见表5。

表5为皮肤刺激性实验、眼球黏膜刺激性实验和急性经口毒性的实验结果：

从表5中我们发现本发明的消毒喷雾剂对于皮肤黏膜没有刺激性，有轻微的经口毒性，因此要防止误食，总体来说本发明的外用消毒喷雾剂相对于市面上的消毒剂具有对皮肤无毒、无刺激性的优点。所以本发明的消毒喷雾剂可以应用于烧伤病人的皮肤和黏膜，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为300μg/mL的Cbf-14中添加不同比例的PEG400，测定其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的杀菌活性。

图2为300μg/mL的Cbf-14中添加不同比例的AEO5-80N，测定其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的杀菌活性。

图3为单独的不同比例的AEO5-80N对于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的杀菌活性。

图4为在最优配比的溶剂中添加不同浓度的抗菌肽Cbf-14，测定其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的杀菌活性。

具体实施方案

实施例1

含有多肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备

称取抗菌肽Cbf-14200mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐一添加50mLPEG400，10mL异构醇聚氧乙烯醚，80mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均匀，过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)，灌注至无菌喷雾瓶中。

药物组合物制剂的组分如下：

实施例2

含有多肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备

称取抗菌肽Cbf-14300mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐一添加100mLPEG400，10mL异构醇聚氧乙烯醚，50mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均匀，过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)，灌注至无菌喷雾瓶中。

药物组合物制剂的组分如下：

实施例3

含有多肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备

称取抗菌肽Cbf-14200mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐一添加200mLPEG400，20mL异构醇聚氧乙烯醚，50mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均匀，过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)，灌注至无菌喷雾瓶中。

药物组合物制剂的组分如下：

实施例4

含有多肽Cbf-14的消毒喷雾剂的制备

称取抗菌肽Cbf-14500mg于洁净干燥烧杯中，加无菌水300mL，搅拌至溶解，再逐一添加200mLPEG400，50mL异构醇聚氧乙烯醚，50mL丙三醇，最后补加无菌水至1L，搅拌均匀，过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)，灌注至无菌喷雾瓶中。

药物组合物制剂的组分如下：

。

Claims (6)

1.一种消毒剂，其特征是含有抗菌肽Cbf-14。

2.权利要求1的消毒剂，含有下列各含量的组分：

余量为水。

3.权利要求1或2的消毒剂，其剂型为喷雾剂。

4.权利要求2的消毒剂的制备方法，包括：取抗菌肽Cbf-14，加无菌水搅拌至溶解，再依次添加PEG400、异构醇聚氧乙烯醚和丙三醇，最后补加无菌水至定容，过滤除菌，即得。

5.权利要求1或2的消毒剂用于制备杀灭皮肤黏膜中细菌和/或真菌的卫生消毒制品的用途。

6.权利要求5的用途，所述的细菌和/或真菌是选自革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌的一种或几种。