CN114081939A - 一种抗菌肽Cbf-14水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽Cbf‑14水凝胶及其制备方法和应用，上述水凝胶包括以下质量百分含量的材料：多肽Cbf‑14 0.5％～2.0％、甲基纤维素1.0％～2.0％、丙三醇10.0％～15.0％、余量的蒸馏水。本发明所述的抗菌水凝胶对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌等病原微生物菌均具有良好的抗菌活性，可有效降低大鼠皮肤伤口处的细菌载量，促进皮肤伤口愈合。本抗菌肽Cbf‑14水凝胶具有独特的制备工艺及便捷的给药方式，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用，具体涉及一种抗菌肽Cbf-14的水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
水凝胶是一种三维交联的网状高分子材料，以水为分散介质，其亲水残基与水分子结合将水分子连结在网状内部，疏水残基遇水发生膨胀，这一特点使其在遇水溶胀之后可保持其原有结构而不被溶解。由于水凝胶具有良好的生物相容性以及生物安全性能，在生物酶的固定、组织工程、药物输送等领域被广泛应用，同时在环境卫生、记忆开关元件、化妆品以及食品工业等非医学领域也具有非常广阔的应用前景。
多肽Cbf-14是本实验室从金环蛇多肽BF-30的基础上设计改造衍生而来的含有14个氨基酸的阳离子多肽，其氨基酸序列为RLLRKFFRKLKKSV，具有抗耐药性病原菌感染的功效(该技术记载在中国专利ZL201611120800.2中)。多肽由于本身为机体防御的非特异性屏障，并且具有分子量小、热稳定性能强、抗菌谱广、免疫原力低的特点，相比较于化学凝胶剂更加安全、低毒、高效、广谱。但是目前缺少能进一步降低毒性的外用剂型。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种抗菌肽Cbf-14水凝胶(Cbf-14 Gel)，该制剂可抗菌并促进皮肤伤口愈合。本发明的另一个目的是提供该水凝胶的制备方法。本发明还有一个目的是提供抗菌肽Cbf-14水凝胶在制备创伤药物中的应用。
技术方案：本发明所述的抗菌肽Cbf-14的水凝胶，该水凝胶由以下质量百分含量的原材料制成：
多肽Cbf-14 0.5％～2.0％、凝胶基质1.0％～2.0％、保湿剂5.0％～15.0％、余量为蒸馏水。
该水凝胶由以下质量百分含量的原材料制成：
多肽Cbf-14 1.0％～2.0％、凝胶基质1.5％～2.0％、保湿剂8.0％～12.0％、余量为蒸馏水。
凝胶基质为甲基纤维素、羟乙基纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、卡波姆中的一种或几种。
所述的水凝胶，以水凝胶原料的总量100.0％计算，凝胶基质由以下质量百分组分的成分组成：甲基纤维素2.0％～3.0％。
所述的水凝胶，保湿剂为甘油、丙二醇中的一种或几种。
所述的水凝胶，以水凝胶原料总量的100.0％计，保湿剂由以下质量百分含量的成分组成：甘油8.0％～10.0％。
所述水凝胶的制备方法，具体操作步骤如下：
(1)将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；
(2)将多肽Cbf-14溶解，过滤除菌；
(3)加入甘油搅拌溶解；
(4)将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得抗菌肽Cbf-14水凝胶。
所述的水凝胶在制备创伤伤口产品中的应用。
所述的水凝胶在制备创伤药物中的应用。
本发明所述凝胶剂的制备方法，具体实施方式见附图1。
本发明提供的水凝胶是以多肽Cbf-14为核心抑菌组分，是针对细菌自身(质膜破坏/耐药基因结合)和宿主防御体系(免疫调控通路)多靶点对抗耐药菌活性和机制进行研发的I类新药品种。对多种耐药菌(包括携带ndm-1和mcr-1的超级细菌)的MIC低、杀菌速度快，且溶血性和细胞毒性低，靶点明确，同时具有抗真菌活性。水凝胶pH在7.0左右，黏度适中，在中性体系下有利于多肽Cbf-14保持良好的抗菌活性，能够发挥其广谱、高效抗菌功能。甲基纤维素具有优良的润湿性、分散性、粘接性、增稠性、乳化性、保水性和成膜性，以及对油脂的不透性。在医药、化工等领域都有重要意义。甘油具有低挥发性，可保持凝胶水分不流失。
有益效果：本发明核心抑菌组分为多肽Cbf-14，低毒，但不可避免有一定的毒副作用，我们经过大量制剂和工艺的筛选，将多肽Cbf-14制成水凝胶制剂，最大程度的降低其透过皮肤进入全身血液循环的可能，提高了生物安全性，降低了产品的毒副作用，同时保留其广谱、高效、稳定的抗菌功能。并且，所述多肽Cbf-14制成水凝胶的制备工艺简单，易行，为后续进行大规模生产奠定了基础。
附图说明
图1是抗菌肽Cbf-14水凝胶制剂工艺流程图；
图2是保湿剂种类对空白凝胶失水率的影响；
图3是甘油含量对空白凝胶失水率的影响；
图4是制备得到的抗菌肽Cbf-14水凝胶实物图；
图5是抗菌肽Cbf-14水凝胶扫描电镜图；
图6是单位面积24小时内药物的累计经皮透过量(n＝3)；
图7是药物在角质层样品(A)和剩余皮肤层样品(B)中的滞留量(n＝3)；
图8是抗菌肽Cbf-14水凝胶对金黄色葡萄球菌(临床分离株)感染的大鼠皮肤伤口的治疗作用；(A)10天内伤口的愈合情况图片；(B)A图对应的量化图；
图9是金黄色葡萄球菌(临床分离株)感染大鼠皮肤创面经抗菌肽Cbf-14水凝胶治疗6天后的细菌载量；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
图10是金黄色葡萄球菌(临床分离株)感染大鼠皮肤创面经抗菌肽Cbf-14水凝胶治疗后的H&E染色结果。
具体实施方式
下列实施例中的“％”均为质量百分含量。
实施例1：
实施例1对抗菌肽Cbf-14水凝胶成胶基质的筛选进行公开。
常用的水溶性凝胶基质包括卡波姆、泊洛沙姆、纤维素类凝胶基质等，选择0.5％的卡波姆、4.0％的羧甲基纤维素钠、4.0％的羟乙基纤维素以及2.0％的甲基纤维素作为凝胶基质，制备凝胶基质与水混合形成的凝胶，并从外观性状、均一性、涂展性以及粘稠度进行评价以确定凝胶基质，具体结果见表1。
表1.多肽凝胶空白基质筛选考察结果
由表1结果可知，选择2.0％质量浓度的甲基纤维素可以形成质量较好的凝胶。
实施例2：
实施例2对抗菌肽Cbt-14水凝胶保湿剂的筛选进行公开。
选择甘油以及丙二醇进行保湿剂的筛选，分别加入不同的保湿剂、甲基纤维素以及蒸馏水进行凝胶的制备。对制备得到的凝胶进行失水率测定，并对其初步稳定性(离心稳定性、低温稳定性、耐热稳定性)进行评估。具体保湿剂的添加、分组情况以及实验结果见表2，不同保湿剂制备得到的凝胶的终点失水率见图2。
表2.不同保湿剂对制备凝胶的影响
由表2结果可知，选择甘油作为凝胶中的保湿剂有助于降低失水率，减少水分的流失，接下来对保湿剂用量进行进一步筛选，选择质量浓度为2.5％、5.0％、10.0％、15.0％的甘油进行凝胶的制备，并按照前述标准进行评价。具体制备所得的实验结果见表3，不同用量的甘油制备所得到的凝胶的终点失水率见图3。
表3.甘油用量对制备凝胶的影响
由表3结果可知，当甘油用量在10.0％以及15.0％时，都可以有效降低终点失水率，结合具体原材料的价格控制范围，因此最终确定甘油用量为10.0％。
实施例3：
配制含有下列质量百分含量原料的抗菌肽Cbf-14水凝胶：多肽Cbf-14 0.5％，甘油10.0％，甲基纤维素2.0％，蒸馏水补足余量。
含抗菌肽Cbf-14水凝胶的制备方法，包括以下步骤：首先将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；将多肽Cbf-14溶解，经过0.22μm滤膜过滤除菌；加入甘油搅拌溶解；将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得抗菌肽Cbf-14水凝胶，抗菌肽Cbf-14水凝胶实物图见图4，扫描电镜图见图5。
实施例4
配制含有下列质量百分含量原料的抗菌肽Cbf-14水凝胶：多肽Cbf-14 1.0％，甘油10.0％，甲基纤维素2.0％，蒸馏水补足余量。
含抗菌肽Cbf-14水凝胶的制备方法，包括以下步骤：首先将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；将多肽Cbf-14溶解，经过0.22μm滤膜过滤除菌；加入甘油搅拌溶解；将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得抗菌肽Cbf-14水凝胶。
实施例5
配制含有下列质量百分含量原料的抗菌肽Cbf-14水凝胶：多肽Cbf-14 2.0％，甘油10.0％，甲基纤维素2.0％，蒸馏水补足余量。
含抗菌肽Cbf-14水凝胶的制备方法，包括以下步骤：首先将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；将多肽Cbf-14溶解，经过0.22μm滤膜过滤除菌；加入甘油搅拌溶解；将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得抗菌肽Cbf-14水凝胶。
对比例1
配制含有下列质量百分含量原料的空白水凝胶：甘油10.0％，甲基纤维素2.0％，蒸馏水补足余量。
不含多肽Cbf-14的空白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：首先将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；加入甘油搅拌溶解；将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得空白水凝胶。
实施例6
抗菌肽Cbf-14水凝胶透皮吸收实验
(1)大鼠离体皮肤制备
采用乌拉糖(6mL/kg，20％w/v，腹腔注射)将大鼠麻醉，立即用宠物剃毛刀剃去大鼠腹部皮肤上的长毛，再用剃须刀仔细除去短毛，剃毛过程尽量不损伤皮肤，若有皮肤损伤，将损伤皮肤进行标记；随后将大鼠脱颈处死，剥离腹部皮肤，避开已受损的皮肤，将腹部皮肤剪成适当大小。将取下的大鼠腹部皮肤平铺并且固定于木板上，使角质层朝下，用眼用手术小剪刀剔除皮下脂肪组织及结缔组织，并且不损伤皮肤。以扩散池面积为大小标准，每块皮肤分成四小块，取每块皮肤中的一小块组成一个组，共四个组，密封好后放-70℃冰箱，可放置1～2个月。
(2)经皮透过实验
采用Franz扩散池(池体积6.5mL，有效扩散面积2.2cm2)考察制剂中药物的体外经皮透过量。取解冻后的鼠皮，将皮肤覆盖在扩散池上，使角质层朝上，置于透皮吸收扩散装置。供给池中加入0.25g制剂样品，接收池中加入6.5mL接收液(pH 7.4 PBS缓冲液)，接收液与皮肤之间不得留有气泡，于32±0.5℃，300rpm持续搅拌下进行。分别于2、8、24h从接收池中取样1mL，同时向接收池中补加等量新鲜的接收液。样品在12000rpm的转速下离心5min，上清液进行HPLC色谱测定。
(3)皮肤角质层和剩余层的分离处理
经皮透过实验后，将扩散池有效扩散面积部分的大鼠皮肤剪下来。用棉签轻轻将皮肤表面的液体拭去。之后用医用胶带粘贴皮肤角质层一侧，弃去前两次粘贴的胶带，收集之后12次粘贴后的胶带置于塑料管中，此部分为角质层样品(SC)。之后，将胶带粘贴后的皮肤剪碎，置于塑料管中，此部分为表皮真皮样品(EP&ED)。SC样品和EP&ED样品分别加入甲醇7mL和2mL，静置浸泡20min，超声40min 2次。样品在12000rpm的转速下离心5min，上清液进行HPLC色谱测定。
具体实验结果见表4、表5以及附图6、7，可看出与对照组复方多粘菌素软膏(Polymyxin)和莫匹罗星软膏(Mupirocin)相比，抗菌肽Cbf-14水凝胶中主药Cbf-14的经皮透过量、角质层中滞留量以及活性表皮&真皮层中的滞留量均低于定量限。因此本实验结果表明，与两个对照制剂相比，抗菌肽Cbt-14水凝胶中主药Cbf-14较难进入皮肤或透过皮肤进入全身血液循环。
表4不同时间点单位面积药物的经皮透过量(n＝3)
注：aND表示not detectable，即样品浓度在定量限之下；
b经皮透过量的单位为μg/cm2
表5单位面积24小时内药物在皮肤层中的滞留量(n＝3)
注：aND表示not detectable，即样品浓度在定量限之下；
b滞留量的单位为μg/cm2
实施例6
抗菌肽Cbf-14水凝胶皮肤伤口抗感染模型
实验动物：SD大鼠，体重120±10g，雌雄各半。
实验分组：实验分为6组，分别为模型组(给与0.9％的生理盐水)，实施例3、4、5对应的凝胶组别，对比例1对应的凝胶组别以及莫匹罗星软膏阳性对照组，每组SD大鼠数量均为12只，雌雄各半。
实验菌株：金黄色葡萄球菌临床分离株。
实验步骤：(1)菌液制备：将实验所用的细菌株从保藏于-20℃的甘油管中转接至营养琼脂斜面培养基上，37℃培养16～20h至长出适宜量菌苔，挑取少量菌体接种至含2ml的无菌营养肉汤培养基中，置37℃培养8h后的培养液用无菌MH肉汤培养基倍比稀释至107CFU/ml左右的菌悬液，备用。
(2)建立皮肤伤口模型：将SD大鼠进行麻醉处理，背部朝上妥善固定，手术区域进行脱毛处理，用碘酒对大鼠背部进行消毒处理，准备手术。在背部制造直径为2cm的圆形伤口，至肌筋膜深层部位，创建全层皮肤创伤模型。使用金黄色葡萄球菌(临床株)进行感染。
(3)给药：按照前述分组进行给药，给药剂量为0.1g，每日早晚各给药一次，连续给药5天。
(4)5天后，无菌取感染部位皮肤，按体积1∶10稀释并研磨匀浆，检测活菌并进行计数统计。取创口组织研究皮肤的修复情况，进行H&E染色。
如图8所示，10天后，实验组已经基本痊愈，创面上皮化，痂皮脱落，创面基本愈合，伤口处基本上完全被毛发覆盖，证明真皮层已基本恢复其功能；如图9所示，与模型组(使用生理盐水进行治疗)相比，每天给药抗菌肽Cbf-14水凝胶能够使大鼠皮肤表面金黄色葡萄球菌的浓度显著降低，并且高剂量水凝胶组别几乎可以达到与阳性药莫匹罗星软膏组相同的抗菌效果。说明抗菌肽Cbf-14水凝胶对金黄色葡萄球菌(临床株)所引起的伤口感染具有良好的治疗效果；如图10所示，对比例组可见重度坏死及结缔组织增生，伴有中度炎症与出血；模型组坏死程度显著重于对比例组，其余病变略轻于对比例组；实施例5组增生结缔组织面积小于对比例组，其余病变较对比例组无明显差异；整体而言，模型组恢复情况最差，阳性药组略好于模型组，实施例5组恢复情况最好，对比例组、实施例3、4组差异不明显。
Claims (9)
1.一种抗菌肽Cbf-14的水凝胶，其特征在于，该水凝胶由以下质量百分含量的原材料制成：
多肽Cbf-14 0.5％～2.0％、凝胶基质1.0％～2.0％、保湿剂5.0％～15.0％、余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，该水凝胶由以下质量百分含量的原材料制成：
多肽Cbf-14 1.0％～2.0％、凝胶基质1.5％～2.0％、保湿剂8.0％～12.0％、余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，凝胶基质为甲基纤维素、羟乙基纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、卡波姆中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，以水凝胶原料的总量100.0％计算，凝胶基质由以下质量百分组分的成分组成：甲基纤维素2.0％～3.0％。
5.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，保湿剂为甘油、丙二醇中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，以水凝胶原料总量的100.0％计，保湿剂由以下质量百分含量的成分组成：甘油8.0％～10.0％。
7.权利要求1所述水凝胶的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)将甲基纤维素加蒸馏水混合，室温静置溶胀；
(2)将多肽Cbf-14溶解，过滤除菌；
(3)加入甘油搅拌溶解；
(4)将上述各组分混合均匀，静置溶胀，离心去除气泡即得抗菌肽Cbf-14水凝胶。
8.权利要求1或2所述的水凝胶在制备创伤伤口产品中的应用。
9.权利要求1或2所述的水凝胶在制备创伤药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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