CN110169949A - 一种含np10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含NP10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用，属于抗菌水凝胶技术领域。所述水凝胶，包括以下质量百分含量的原料制备得到：NP10抗菌肽0.015％～0.045％、凝胶基质3％～7％、β‑甘油磷酸钠1％～3％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液5％～7％，余量的水。以NP10抗菌肽为抑菌核心组分，既可以独立地作用于细胞壁来破坏细胞而发挥其杀菌、抗菌作用，又与凝胶基质、β‑甘油磷酸钠和质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液协同作用为水凝胶形成提供原料还能协同发挥抑菌、杀菌作用，同时还能保持水凝胶体系的pH值呈中性，有利于NP10抗菌肽保持良好的抗菌活性。

Description

一种含NP10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗菌水凝胶技术领域，具体涉及一种含NP10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一类具有广泛应用的聚合物材料，它在水中能够吸收大量水分而溶胀，并在溶胀之后能够继续保持其原有结构而不被溶解。高分子水凝胶与生物组织的结构和性能比较相似，生物相容性和生物安全性好，因此被广泛应用于组织工程、药物输送、创伤敷料等领域，同时在对重金属和染料吸附、喷墨打印等非医学方面具有非常广阔的应用前景。
由于水凝胶在生物医药方面的应用，对水凝胶的抗菌性能有严格的要求。例如申请号201310517751.6的专利公开了一种含有活性成分抗菌肽的医用水凝胶敷料及其制备方法，主要是经过使用天然生物多糖高分子原位聚合包埋仁源抗菌肽分子制备出一种具有较好生物相容性和药物安全性的医用水凝胶敷料。该抗菌肽水凝胶敷料良好的柔韧性，能与创面紧密贴合；能促进愈合，缩短伤口愈合时间并减少伤疤的生成，具有广泛的应用前景，但是抗菌性能却不能令人满意。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含NP10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用，所述含NP10抗菌肽的水凝胶具有高效、广谱的抗菌性能。
本发明提供一种含NP10抗菌肽的水凝胶，包括以下质量百分含量的原料制备得到：
NP10抗菌肽0.015％～0.045％、凝胶基质3％～7％、β-甘油磷酸钠1％～3％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液5％～7％，余量的水。
优选的，包括以下质量百分含量的原料制备得到：
NP10抗菌肽0.03％、凝胶基质5％、β-甘油磷酸钠2％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液6％，余量的水。
优选的，所述凝胶基质包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆、明胶和淀粉中一种或几种。
优选的，以水凝胶的原料总量为100％计，所述凝胶基质包括以下质量百分含量的组分：海藻酸钠3％和羧甲基壳聚糖2％。
优选的，所述CaCl2水溶液的质量浓度为1％。
本发明提供了所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将凝胶基质和水混合溶胀，得到一号溶液；
2)将所述一号溶液和β-甘油磷酸钠混合，得到二号溶液；
3)将NP10抗菌肽用水溶解，得到NP10抗菌肽溶液；
4)将所述二号溶液、CaCl2水溶液、所述NP10抗菌肽溶液混合，得到水凝胶；所述步骤1)～2)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
优选的，当凝胶基质包括海藻酸钠和羧甲基壳聚糖时，将海藻酸钠和水混合搅拌，溶胀12～24h，得到A液；将羧甲基壳聚糖和水混合溶解，超声13～20min，得到C液；将所述A液和C液混合，得到一号溶液。
优选的，所述超声的功率为70～80W；所述超声的时间为18min。
本发明提供了所述的水凝胶或所述制备方法制备得到的水凝胶在创伤敷料中的应用。
本发明提供的一种含NP10抗菌肽的水凝胶，包括以下质量百分含量的原料制备得到：NP10抗菌肽0.015％～0.045％、凝胶基质3％～7％、β-甘油磷酸钠1％～3％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液5％～7％，余量的水；所述NP10抗菌肽的氨基酸序列如序列表中SEQID No.1所示。本发明提供水凝胶是以NP10抗菌肽为杀菌抑菌核心组分，NP10抗菌肽针对广谱有害菌类的细胞壁，并不涉及特定的靶点，它直接通过静电作用来破坏细胞，因此可以迅速杀死有害细菌和微生物；NP10抗菌肽拥有独特的杀菌机制可快速消炎止痛、对过敏性皮肤和损伤皮肤具有显著的保护和促进修复的作用，既可以独立地作用于细胞壁来破坏细胞而发挥其杀菌、抗菌作用，也可以与其他因子协同作用，从而发挥更高的杀菌效率，例如NP10抗菌肽与凝胶基质、β-甘油磷酸钠和质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液配合发挥协同抑菌杀菌作用还为水凝胶的形成提供原料，同时还能保持水凝胶体系呈中性，水凝胶的pH值在7.0左右，黏度适中，在中性环境中有利于NP10抗菌肽保持良好的抗菌活性，具有高效抗菌。由于细菌表面的结构和带电性无法改变，所以很难产生抗药性。再加上它能被体内蛋白酶及时水解，其半衰期也比传统抗生素要短。产品直接作用于有害细菌的细胞膜，它最大的优点就在于作用迅速并具有很高的杀伤力。针对广谱的有害细菌及微生物来实施抗菌及杀菌的多重生物功能。同时抗菌肽是由氨基酸排列组合成的多肽，经由生物酶发酵而成，不含抗生素、酒精、中药和化药，所以不会产生抗药性，无毒副作用，使用后可分解为人体自身营养成分-氨基酸，天然安全见效快。
附图说明
图1为本发明实施例1中水凝胶制备步骤；
图2为本发明中NP10抗菌肽的生物来源示意图。
具体实施方式
本发明提供一种含NP10抗菌肽的水凝胶，包括以下质量百分含量的原料制备得到：
NP10抗菌肽0.015％～0.045％、凝胶基质3％～7％、β-甘油磷酸钠1％～3％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液5％～7％，余量的水。
本发明提供的含NP10抗菌肽的水凝胶的原料包括NP10抗菌肽。按以水凝胶的原料总量为100％计，所述NP10抗菌肽为0.015％～0.045％，优选为0.03％。所述NP10抗菌肽抗菌谱广，对临床常见的金黄色葡萄球菌如VRSA、MRSA以及多重耐药的绿脓杆菌、耐药的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、艰难梭菌、阪崎肠杆菌、肠球菌、阴沟肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、痤疮丙酸杆菌、芽孢杆菌、支原体等以及常见真菌的抗菌，常见的真菌包括白色念珠菌、马拉色菌、须廯毛廯菌、絮状表皮癣菌、红色毛廯菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌等15种皮肤廯症的病原真菌具有显著的抗菌效果。所述NP10抗菌肽首先在动物体内发现，后通过基因工程技术，以体外原核表达(生物发酵)的方式进行生产，拥有卓越的抗菌能力，安全无毒副作用，对皮肤、粘膜无刺激性。无色无味，有较强的吸水性，可保湿护肤，成分安全，进入体内可被水解为氨基酸作为营养物质被吸收。所述NP10抗菌肽具有独特的杀菌机制避免产生耐药性，抗菌肽是由氨基酸组成的有机物质，具有自带正电离子及亲水特性，而细菌细胞膜带有负电荷，正负相吸，大量抗菌肽聚集在细胞膜表面后会破坏细菌细胞膜，导致细菌营养物质流失，从而导致其死亡。本发明对所述NP10抗菌肽的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的NP10抗菌肽的来源即可。所述NP10抗菌肽的制备方法参见图2。在本发明实施例中，所述NP10抗菌肽购自纳肽得(青岛)生物医药有限公司。
本发明提供的含NP10抗菌肽的水凝胶的原料包括凝胶基质。按以水凝胶的原料总量为100％计，所述凝胶基质为3％～7％，优选为5％。所述凝胶基质优选包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆、明胶和淀粉中一种或几种；以水凝胶的原料总量为100％计，更优选包括以下质量百分含量的组分：海藻酸钠3％和羧甲基壳聚糖2％。所述海藻酸钠是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。所述羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，有许多特性，如抗菌性强，具有保鲜作用，是一种两性聚电解质等。在化妆品、保鲜、医药等方面有多种应用，也是近年来研究得较多的壳聚糖衍生物之一。羧甲基壳聚糖是近年来出现的一种化工合成物，在医药、化工、环保、保健品方面都有重要的意义。而其稳定的性质和抗菌抗感染，降脂和防治动脉硬化等药理作用注定了它在人类未来的日常生活中将发挥更大作用。本发明对所述凝胶基质的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的凝胶基质的来源即可。
本发明提供的含NP10抗菌肽的水凝胶的原料包括β-甘油磷酸钠。按以水凝胶的原料总量为100％计，所述β-甘油磷酸钠为1％～3％，优选为2％。所述β-甘油磷酸钠的作用为甘油磷酸钠的加入使壳聚糖的聚合网络结构得到加强，与单纯壳聚糖相比，释药时间明显延长。本发明对所述β-甘油磷酸钠的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的β-甘油磷酸钠的来源即可。
本发明提供的含NP10抗菌肽的水凝胶的原料包括CaCl2水溶液。按以水凝胶的原料总量为100％计，所述CaCl2水溶液为5％～7％，优选为6％。所述CaCl2水溶液的质量浓度为0.5～2％，优选为1％。CaCl2水溶液的作用是海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶，海藻酸钠与钙离子形成的凝胶具有热不可逆性，凝胶性能不受温度影响。
本发明提供的含NP10抗菌肽的水凝胶的原料包括水。水作为溶剂，补足原料至100％。所述水优选为蒸馏水。
本发明提供了所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将凝胶基质和水混合溶胀，得到一号溶液；
2)将所述一号溶液和β-甘油磷酸钠混合，得到二号溶液；
3)将NP10抗菌肽用水溶解，得到NP10抗菌肽溶液；
4)将所述二号溶液、CaCl2水溶液、所述NP10抗菌肽溶液混合，得到水凝胶；
所述步骤1)～2)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
在本发明中，所述制备方法的流程见图1。当凝胶基质优选包括海藻酸钠和羧甲基壳聚糖时，将海藻酸钠和水混合搅拌，溶胀12～24h，得到A液；将羧甲基壳聚糖和水混合溶解，超声13～20min，得到C液；将所述A液和C液混合，得到一号溶液。
本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方案即可。在本发明中，所述超声的功率优选为70～80W；所述超声的时间优选为18min。本发明对所述超声用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的超声仪即可。
鉴于所述水凝胶的高效抗菌性，本发明提供了所述的水凝胶或所述制备方法制备得到的水凝胶在创伤敷料中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种含NP10抗菌肽的水凝胶及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
配制下列质量百分含量的原料：NP10抗菌肽0.03％，β-甘油磷酸钠(β-GP)2％，海藻酸钠3％，羧甲基壳聚糖2％，1％CaCl2水溶液6％，蒸馏水补足余量。
含NP10抗菌肽水凝胶剂的制备方法，包括以下步骤:
a.在室温下用精密称取一定量海藻酸钠均匀撒于600ml蒸馏水中搅拌溶胀12～24h，得到A液；
b.精密称取一定量羧甲基壳聚糖溶于200ml蒸馏水中，搅拌均匀，超声15min，使其充分溶解，放置室温得到C液；
c.在A液中加入一定量β-GP得到B液；
d.将0.1g CaCl2溶于10ml蒸馏水中配得1％CaCl2溶液，得到D液；
e.在室温下用精密称取一定量抗菌肽粉末溶于10ml蒸馏水中，得到F；
f.取适量E液、F液与D液混合，搅拌均匀制得水凝胶成品，避光保存。
实施例2
配制下列质量百分含量的原料：NP10抗菌肽0.045％，β-甘油磷酸钠(β-GP)1％，羧甲基纤维素钠5％，1％CaCl2水溶液7％，蒸馏水补足余量。
含NP10抗菌肽水凝胶剂的制备方法，包括以下步骤:
a.在室温下用精密称取一定量羧甲基纤维素钠均匀撒于600ml蒸馏水中搅拌溶胀12～24h，得到A液；
b.在A液中加入一定量β-GP得到B液；
c.将0.1g CaCl2溶于10ml蒸馏水中配得1％CaCl2溶液，得到D液；
d.在室温下用精密称取一定量抗菌肽粉末溶于10ml蒸馏水中，得到F；
e.取适量E液、F液与D液混合，搅拌均匀制得水凝胶成品，避光保存。
实施例3
配制下列质量百分含量的原料：NP10抗菌肽0.02％，β-甘油磷酸钠(β-GP)3％，卡波姆3％、明胶3％，1％CaCl2水溶液5％，蒸馏水补足余量。
含NP10抗菌肽水凝胶剂的制备方法，包括以下步骤:
a.在室温下用精密称取一定量卡波姆均匀撒于600ml蒸馏水中搅拌，充分溶解得到A液；
b.精密称取一定量明胶溶于200ml蒸馏水中，搅拌均匀，使其充分溶解，放置室温得到C液；
c.在A液中加入一定量β-GP得到B液；
d.将0.1g CaCl2溶于10ml蒸馏水中配得1％CaCl2溶液，得到D液；
E.在室温下用精密称取一定量抗菌肽粉末溶于10ml蒸馏水中，得到F；
f.取适量E液、F液与D液混合，搅拌均匀制得水凝胶成品，避光保存。
对比例1
β-甘油磷酸钠2％，海藻酸钠3％，羧甲基壳聚糖2％，1％CaCl2水溶液6％，蒸馏水补足余量。
实施例4
抗菌实验
1、实验方法
a.培养菌种将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种到6ml TSB培养基中，35℃孵育20h；白色念珠菌接种到6ml TSB培养基中，27℃孵育48h；取1μl菌液吹入6ml TSB培养基中，备用。
b.制备不同样品：A组为空白组(不加凝胶)；B组为本发明抗菌肽凝胶组；C组为本发明不含抗菌肽凝胶组；
c.铺琼脂板：配置琼脂培养基并高压灭菌，在培养皿中均匀铺开，冷却备用；
d.将滤纸片用打孔机打成直径为6mm的圆片，高压灭菌得到无菌滤纸片；
e.将a中稀释好的菌液均匀涂在琼脂板上，将板旋转60°，再涂一遍菌液；
f.在滤纸片表面涂上不同的凝胶样品B、C、D、E、F，涂膜厚度均为10μm，涂抹面贴于涂菌琼脂板上，置于37℃培养20h，测定抑菌圈直径。
2、实验分组：
A.空白组，不加凝胶；
B.含抗菌肽凝胶组1实施例1制备的水凝胶；
C.含抗菌肽凝胶组2实施例2制备的水凝胶；
D.含抗菌肽凝胶组3实施例3制备的水凝胶；
E.不含抗菌肽凝胶组对比例1制备的水凝胶；
F.仅含抗菌肽凝胶组NP10抗菌肽。
实验结果见表1。
表1抑菌圈直径(mm)
由表1结果可知，与空白组相比，添加本发明实施例1制备的水凝胶和对比例1制备的水凝胶对三种菌具有一定程度的抑制作用，同时使用本发明实施例1制备的水凝胶比对比例1制备的水凝胶在抑菌方面具有更加显著的作用。这说明本发明提供含有NP10抗菌肽的水凝胶具有较强的抑菌性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种含NP10抗菌肽的水凝胶，其特征在于，包括以下质量百分含量的原料制备得到：
NP10抗菌肽0.015％～0.045％、凝胶基质3％～7％、β-甘油磷酸钠1％～3％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液5％～7％，余量的水。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，包括以下质量百分含量的原料制备得到：
NP10抗菌肽0.03％、凝胶基质5％、β-甘油磷酸钠2％、质量浓度0.5～2％CaCl2水溶液6％，余量的水。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，所述凝胶基质包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆、明胶和淀粉中一种或几种。
4.根据权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，以水凝胶的原料总量为100％计，所述凝胶基质包括以下质量百分含量的组分：海藻酸钠3％和羧甲基壳聚糖2％。
5.根据权利要求1、2和4任意一项所述的水凝胶，其特征在于，所述CaCl2水溶液的质量浓度为1％。
6.权利要求1～5任意一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将凝胶基质和水混合溶胀，得到一号溶液；
2)将所述一号溶液和β-甘油磷酸钠混合，得到二号溶液；
3)将NP10抗菌肽用水溶解，得到NP10抗菌肽溶液；
4)将所述二号溶液、CaCl2水溶液、所述NP10抗菌肽溶液混合，得到水凝胶；所述步骤1)～2)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
7.根据权利要求6所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，当凝胶基质包括海藻酸钠和羧甲基壳聚糖时，将海藻酸钠和水混合搅拌，溶胀12～24h，得到A液；将羧甲基壳聚糖和水混合溶解，超声13～20min，得到C液；将所述A液和C液混合，得到一号溶液。
8.根据权利要求7所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为70～80W；所述超声的时间为18min。
9.权利要求1～5任意一项所述的水凝胶或权利要求6～8任意一项所述制备方法制备得到的水凝胶在创伤敷料中的应用。
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