CN110478391A - 一种具有抑菌作用的茶树油微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开具有抑菌作用的茶树油微球及其制备方法。采用生物学机制以及超声乳化制备技术，选用茶树油作为油相，丝素蛋白，透明质酸有机相作为嵌入体，吐温80作为乳化液，两相混合制备具有抑菌功能的微球。选用的材料其生物相容性好、保湿效果好，与天然产物递送系统使用来实现缓慢释放以及界面相分离，在抵御外环境流体预防炎症感染的同时不影响皮肤呼吸，诱导皮肤再生，通过油相茶树油粒子在有机基质上的均匀分散，实现层层自组装的稳定油相水相界面，选用有机粒子和茶树精油的结合，仿生制备具有抑菌作用的茶树油微球。

Description

一种具有抑菌作用的茶树油微球及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种具有抑菌作用的茶树油微球及其制备方法。
背景技术
烧伤是最常见和最具破坏性的创伤形式之一。烧伤创面感染与修复主要是革兰阳性和革兰阴性细菌的活性相关变化。在烧伤初期，伤口部位是内源性和外源性生物体机会性定植的敏感部位。患者因素，如年龄、损伤程度和烧伤深度都会影响创伤性烧伤感染的可能性与强度。据资料显示，中国每年约有4万起火灾报告，造成2600万人烧伤。需要住院治疗的中重度烧伤患者约占1000万例，约有2300名患者死于烧伤相关并发症，平均损失近200亿元。其中有200万患者接受烧伤引起的治疗，大多数患者是通过自体或者异体移植新的皮肤组织，其价格昂贵，且会诱发更严重的免疫排斥反应。因此，开发新的抗菌消炎、去腐生肌医用材料，同时预防细菌感染，促进伤口修复以及皮肤再生刻不容缓。
天然产物是指动物、植物提取物（简称植提）或昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分。通过化学工艺技术和高通量筛选天然产物可以得到很多为人类所用的药物与制剂，大量的研究表明，这些天然产物在促进组织愈合、细胞增殖方面有重要作用。茶树油（TTO）是通过提取互叶白千层的叶子而得到的一种纯天然的植物精油。它是由大约100种不同化合物组成的复杂混合物，主要是单萜类以及相应的醇。TTO被认为具有多种药物特性，包括抗菌、抗病毒、抗炎和镇痛性能。近年来，它作为一种局部抗菌剂特别受欢迎。被广泛应用于各种疾病，如伤口感染、细菌和真菌感染的皮肤、口腔粘膜以及治疗水疱和阴道炎。
蚕丝是一种天然的高分子蛋白质聚合物，在特定腺体的上皮细胞中合成，分泌到管腔中，最终被几只鳞翅目幼虫纺成纤维。蚕丝由纤维蛋白和丝胶蛋白两种蛋白质组成。丝素蛋白是形成蚕丝的蛋白质。丝素蛋白是由5507个氨基酸重复序列组成的基于蛋白质的生物大分子，由（Gly-Ala-Gly-Ser）n重复序列的6个残基组成。它以支架、水凝胶、薄膜纤维和微球等形式应用于临床研究。丝素蛋白具有良好的生物相容性，良好的水蒸气渗透性，生物降解性，几乎没有炎症反应。已广泛应用于化妆品、医药等各个领域。
透明质酸（HA）是一种线性多糖，由重复双糖β-1,4-葡萄糖醛酸和β-1,3-N-乙酰-葡萄糖胺交替组成。透明质酸是细胞外基质（ECM）的一个重要组成部分，是自然界中最亲水（亲水）的分子之一，被称为大自然的保湿剂。HA的独特粘弹性、生物相容性、非免疫原性和生物学特性介导其在细胞信号传导、伤口修复、形态发生和基质组织中的活性与广泛应用。
本研究选用丝素蛋白，透明质酸作为有机相，通过油相茶树油粒子在有机基质上的均匀分散，实现层层自组装的稳定油相水相界面，仿生制备具有抑菌作用的茶树油微球。能够延长茶树油在给伤口创面的滞留时间，增加界面效应，抵御外界流体的入侵，抑制细菌感染，从而实现伤口正常呼吸与再生，无毒副作用，有望更好的促进皮肤的再生、皮肤烫伤等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于皮肤烫伤与细菌感染的油相/水相两相混合的茶树油微球材料。采用界面分离原位复合制备技术，选用丝素蛋白，透明质酸作为有机相，通过油相茶树油粒子在有机基质上的均匀分散，实现层层自组装的稳定油相水相界面，仿生制备具有抑菌作用的茶树油微球。本发明制备工艺简单，成本低，无毒副作用且制备的乳液分散性好，粒径均匀，贮藏稳定性好。本发明意在开发出一种新型实用的治疗皮肤烧伤的新型医用材料。
一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，采用生物学机制以及超声乳化制备技术，选用茶树油作为油相，丝素蛋白和透明质酸有机相作为嵌入体，吐温80作为乳化液，两相混合制备具有抑菌功能的微球。
一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将丝素蛋白溶解于去离子水中，制备成浓度为1.0wt%~2 .0wt％的丝素蛋白溶液；
（2）将透明质酸溶解于去离子水中，制备成浓度为1.0wt%~2 .0wt％的透明质酸溶液；
（3）将步骤（1）制备的丝素蛋白溶液和步骤（2）制备的透明质酸溶液混合形成有机相嵌入体，磁力搅拌30min，使其混合均匀；
（4）茶树油中加入步骤（3）得到的混合液，磁力搅拌2h，使得有机相均匀分布于茶树油中，得到油包水型的茶树油初乳液，在超声条件下向所得茶树油初乳液中缓慢滴加入0.025-0.05g吐温80，均质机超声5~10min，涡旋机处理10-15min，即得茶树油纳米乳液；
（5）向步骤（4）所得茶树油纳米乳液加入戊二醛，室温磁力搅拌4h使其交联；
（6）将0.1M甘氨酸以每次1ml的体积连续3次加入到乳液中处理交联后的溶液去除多余的戊二醛，冷冻干燥三天得到样品。
上述步骤（3）中，步骤（1）制备的丝素蛋白溶液和步骤（2）制备的透明质酸溶液按体积比为1:1的比例混合。
上述步骤（4）中，茶树油与步骤（3）得到的混合液之间的体积比为20:1~2。
上述步骤（4）中，茶树油初乳液中按每毫升茶树油加0.005g~0.01g吐温80的量加入吐温80。
上述步骤（5）中茶树油纳米乳液加入戊二醛使其终浓度为3wt%。
一种如上述方法制备所得的具有抑菌作用的茶树油微球。
上述具有抑菌作用的茶树油微球应用于伤口修复。
上述具有抑菌作用的茶树油微球应用于制备烧伤修复美容的复合材料。
本发明的显著优点在于：选用的材料其生物相容性好、保湿效果好，与天然产物递送系统使用来实现缓慢释放以及界面相分离，在抵御外环境流体预防炎症感染的同时不影响皮肤呼吸，诱导皮肤再生，通过油相茶树油粒子在有机基质上的均匀分散，实现层层自组装的稳定油相水相界面，选用有机粒子和茶树精油的结合，仿生制备具有抑菌作用的茶树油微球。乳液的制备条件温和，工艺较简单，操作方便，成本低。
附图说明
图1实施例3制备的具有抑菌作用的茶树油微球的粒径分布图。TTO 微球：茶树油微球。
图2实施例3制备的具有抑菌作用的茶树油微球与大肠杆菌共培养的细菌增长率。TTO 微球：茶树油微球。
图3实施例3制备的具有抑菌作用的茶树油微球与金黄色葡萄球菌共培养的细菌增长率。TTO 微球：茶树油微球。
图4实施例3制备的具有抑菌作用的茶树油微球伤口修复图。TTO 微球：茶树油微球。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将1g丝素蛋白溶解于去离子水中，使其浓度为1％（w/v）；
（2）将1g透明质酸溶解于去离子水中，使其浓度为1％（w/v）；
（3）将步骤（1）制备的丝素蛋白溶液和步骤（2）制备的透明质酸溶液，按体积比为1:1的比例混合形成250ul的有机相嵌入体，磁力搅拌30min，使其混合均匀；
（4）5mL茶树油加入到步骤（3）得到的混合液中，磁力搅拌2h，使得有机内相均匀分布于茶树油中，得到油包水型的茶树油初乳液，在超声条件下向所得茶树油初乳液中缓慢滴加入0.025g吐温80，均质机超声10min，涡旋机处理15min，即得茶树油纳米乳液；
（5）向步骤（4）所得茶树油纳米乳液中加入终浓度为3wt%的戊二醛，室温磁力搅拌4h使其交联；
（6）将0.1M甘氨酸以每次1ml的体积连续3次加入到乳液中处理交联后的溶液去除多余的戊二醛，冷冻干燥三天得到样品。
实施例2
一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将1.5g丝素蛋白溶解于去离子水中，使其浓度为1.5％（w/v）；
（2）将1.5g透明质酸溶解于去离子水中，使其浓度为1.5％（w/v）；
（3）将步骤（1）制备的丝素蛋白和步骤（2）制备的透明质酸溶液，按体积比为1:1的比例混合形成250ul的有机相嵌入体，磁力搅拌30min，使其混合均匀；
（4）5mL茶树油中加入到步骤（3）得到的混合液中，磁力搅拌2h，使得有机内相均匀分布于茶树油中，得到油包水型的茶树油初乳液，在超声条件下向所得茶树油初乳液中缓慢滴加入0.05g吐温80，均质机超声10min，涡旋机处理15min，即得茶树油纳米乳液；
（5）向步骤（4）所得茶树油纳米乳液中加入终浓度为3wt%的戊二醛，室温磁力搅拌4h使其交联；
（6）将0.1M甘氨酸以每次1ml的体积连续3次加入到乳液中处理交联后的溶液去除多余的戊二醛，冷冻干燥三天得到样品。
实施例3
一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2g丝素蛋白溶解于去离子水中，使其体积浓度为2％（w/v）；
（2）将2g透明质酸溶解于去离子水中，使其体积浓度为2％（w/v）
（3）将步骤（1）制备的丝素蛋白和步骤（2）制备的透明质酸溶液，按体积比为1:1的比例混合形成500ul的有机相嵌入体，磁力搅拌30min，使其混合均匀；
（4）5mL茶树油中加入到步骤（3）得到的混合液中，磁力搅拌2h，使得有机内相均匀分布于茶树油中，得到油包水型的茶树油初乳液，在超声条件下向所得茶树油初乳液中缓慢滴加入0.05g吐温80，均质机超声10min，涡旋机处理15min，即得茶树油纳米乳液；
（5）向步骤（4）所得茶树油纳米乳液中加入终浓度为3wt%的戊二醛，室温磁力搅拌4h使其交联；
（6）将0.1M甘氨酸以每次1ml的体积连续3次加入到乳液中处理交联后的溶液去除多余的戊二醛，冷冻干燥三天得到样品。
本实施例制备所得具有抑菌作用的茶树油微球的粒径分布情况见图1。
本实施例制备所得具有抑菌作用的茶树油微球的微球的粒径和分散性指数PDI见表1。
表1茶树油微球的微球的粒径和分散性指数
茶树油微球与细菌共培养的活性测试：
配制牛肉膏蛋白胨培养基分布活化大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将实施例3制备的0.1g茶树油微球与10ml两种浓度为10-8CFU/ml菌悬液分别共培养，放置在37°恒温培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况，分别测定24h前后菌悬液在600nm处的OD值以此评价微球的抑菌效果。菌种增长率计算公式如下：增长率（%） =(OD2-OD1)/OD1×100%
其中，OD1和OD2分别表示初始OD值和在24h共培养后的OD值。
结果见图2和3。从图2中可看出，24h后空白组大肠杆菌数目快速增长，而茶树油微球组菌落数量负增长表明对大肠杆菌具有良好的抑菌性。从图3中可看出，24h后空白组金黄色葡萄球菌数目快速增长，而茶树油微球组菌落数量负增长表明对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌性。
SD大鼠的皮肤全层切伤模型构建以及修复性能测试：
采用腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后用自动剃须刀去除背部毛发，用消毒的眼科剪在背部切开大小直径15 mm，深度为4mm的全层创口，将实施例3制备的0.5g茶油微球涂抹以及空白对照组（未加任何材料覆盖）应用于创面。术后的大鼠置于单笼伺养，连续观察并用卡尺测量其创面的大小并采集照片。从图4中可看出，茶树油微球具有良好的伤口修复功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，其特征在于：采用生物学机制以及超声乳化制备技术，选用茶树油作为油相，丝素蛋白，透明质酸有机相作为嵌入体，吐温80作为乳化液，两相混合制备具有抑菌功能的微球。
2.根据权利要求1所述的一种具有抑菌作用的茶树油微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将丝素蛋白溶解于去离子水中，制备成浓度为1.0wt%~2 .0wt％的丝素蛋白溶液；
将透明质酸溶解于去离子水中，制备成浓度为1.0wt%~2 .0wt％的透明质酸溶液；
（3）将步骤（1）制备的丝素蛋白溶液和步骤（2）制备的透明质酸溶液混合形成有机相嵌入体，磁力搅拌30min，使其混合均匀；
（4）茶树油中加入步骤（3）得到的混合液，磁力搅拌2h，使得有机相均匀分布于茶树油中，得到油包水型的茶树油初乳液，在超声条件下向所得茶树油初乳液中缓慢滴加入0.025-0.05g吐温80，均质机超声5~10min，涡旋机处理10-15min，即得茶树油纳米乳液；
（5）向步骤（4）所得茶树油纳米乳液加入戊二醛，室温磁力搅拌4h使其交联；
（6）将0.1M甘氨酸以每次1ml的体积连续3次加入到乳液中处理交联后的溶液去除多余的戊二醛，冷冻干燥三天得到样品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述步骤（1）制备的丝素蛋白溶液和步骤（2）制备的透明质酸溶液按体积比为1:1的比例混合。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，茶树油与步骤（3）得到的混合液之间的体积比为20:1~2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，茶树油初乳液中按每毫升茶树油加0.005g~0.01g吐温80的量加入吐温80。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中茶树油纳米乳液中加入戊二醛使其终浓度为3wt%。
7.如权利要求1-6所述制备方法制备所得的具有抑菌作用的茶树油微球。
8.如权利要求7所述的具有抑菌作用的茶树油微球的应用于伤口修复。
9.如权利要求7所述的具有抑菌作用的茶树油微球的应用于制备烧伤修复美容的复合材料。
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