CN105008524A

CN105008524A - 用于治疗脑癌的组合物和方法

Info

Publication number: CN105008524A
Application number: CN201280077698.6A
Authority: CN
Inventors: 大卫·斯托多; 约翰·卡梅伦·贝尔
Original assignee: Ottawa Hospital Research Institute; CHEO Research Institute
Current assignee: Limited Partnership
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2015-10-28
Also published as: IL239374B; AU2012396787B2; AU2012396787A1; EP2931880A4; IL239374A0; MX2015007093A; CA2894618A1; RU2015128078A; BR112015013669A2; EP2931880A1; JP2016501528A; WO2014089668A1; US20150307559A1; RU2705244C2; EP2931880B1; RU2015128078A3; MX366493B; JP6162818B2; AU2012396787B9

Abstract

本发明记载了具有如下基因组的分离的病毒粒子，所述基因组包含编码如下蛋白的开放阅读框：马拉巴蛋白N、P和L或其变体；以及马拉巴蛋白M或蛋白Δ5IM或其变体；和BahiaGrandeG蛋白、LCMVG蛋白或埃博拉G蛋白。马拉巴蛋白N可具有包含SEQIDNO:1的序列。马拉巴蛋白P可以具有包含SEQIDNO:2的序列，马拉巴蛋白L可具有包含SEQIDNO:3的序列，马拉巴蛋白M和ΔIM可以分别具有包含SEQIDNO:4和5的序列。BahiaGrandeG蛋白可以具有包含SEQIDNO:6的序列。LCMVG蛋白可以具有包含SEQIDNO:7的序列。埃博拉G蛋白可以具有包含SEQIDNO:8的序列。

Description

用于治疗脑癌的组合物和方法

技术领域

本发明涉及弹状病毒嵌合体及它们作为溶瘤治疗物的用途。更具体地，本发明涉及马拉巴弹状病毒嵌合体及其在原发性和继发性脑癌的治疗中的用途。

背景技术

脑肿瘤是由在大脑中表现出无限制生长的细胞组成。它们可以是良性的(即，非癌)或恶性的(即，癌性的)。癌性脑肿瘤被进一步分为原发性或继发性肿瘤。

原发性肿瘤在大脑中开始，而继发性肿瘤从另一个点(如乳腺或肺)扩散至大脑。继发性肿瘤还可以称为转移性的。当癌细胞从身体的另一部分中的原发性癌扩散到脑中时，发生继发性(即，转移性)脑肿瘤。继发性肿瘤的普遍性比原发性脑肿瘤高出三倍。所有的转移性脑肿瘤都是恶性的。

通常根据以下对脑肿瘤进行命名和分类：来自它们起源或者癌症发展的位置的脑细胞的类型。这些肿瘤的生物多样性使得分类变得困难。约80％恶性原发性脑肿瘤统称为神经胶质瘤(即，它们由神经胶质细胞起源)并被分为反映恶性程度的4个等级。

脑癌是年龄小于35岁的患者中的癌症相关死亡的首要原因，在北美州占所有癌症诊断的大约10％。脑肿瘤治疗是复杂，因为有超过120种不同的类型，其范围从低级别的星形细胞瘤到4级多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

恶性神经胶质瘤如GBM，是迄今为止成人中最常见的脑癌，但却是增长速度最快、最恶性的原发性脑肿瘤，因此是最难治疗。即使有积极的单一模式和多模式治疗方案，如手术、化疗、放疗和小分子抑制剂，生存率在过去的三十年一直保持不变，诊断后平均存活时不超过一年。

常规治疗的失败的原因是多因素的，包含GBM高度浸润性/攻击性、通过血脑屏障和神经薄壁组织的药物递送的限制以及导致对有效治疗的固有抗性和积极抗性克隆上升的遗传异质性。因此，非常需要新的治疗方案，所述方案使得针对一般脑癌，尤其是GBM，的溶瘤病毒疗法复兴。

水泡性口炎病毒(VSV)是一种有效的溶瘤弹状病毒，可以感染并杀死多种肿瘤细胞类型(Brun et al.,Mol Ther 18:1440-1449，2010)。与其他的弹状病毒一样，趋向神经性与随后的神经毒力以及高度有效的nAb反应仍是问题(Diallo et al.,Methods Mol Biol797:127-140，2011)。尽管已知在神经肿瘤模型中通过全身给药，VSV是有效的(Caryet al.,J Virol 85:5708-5717，2011；Lun et al.,J Natl Cancer Inst 98:1546-1547，2006；Wollmann et al.,J Virol 84:1563-1573，2010)，其固有的神经毒性阻碍了其作为临床候选物的考虑(Hoffmann et al.,J Gen Virol 91:2782-2793，2010；Sur et al.,Vet Pathol 40:512-520，2003)。

马拉巴是最近表征的溶瘤弹状病毒，其与VSV具有某些序列相似性、相似但更有效的溶瘤谱以及相似的神经毒性特征曲线(Brun et al.,Mol Ther 18:1440-1449，2010)。弹状病毒VSV和马拉巴构成临床前测试的最有效的病毒中的一些。然而，对于脑癌，所期望的病毒给药路径是在脑内递送，然而由于VSV或马拉巴固有的神经毒性，目前无论使用VSV还是马拉巴都是不可能。

理想的是，提供用于治疗癌症，更具体地治疗脑癌的溶瘤病毒疗法，其能够消除或减轻先前溶瘤病毒疗法的至少一个缺点。

发明内容

本发明的目的是消除或减轻先前的溶瘤病毒疗法的至少一个缺点。在一些实例中，所述溶瘤病毒疗法可显示出降低的神经毒性水平。

根据本发明的一个方面，提供了具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组的分离的病毒颗粒：具有包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白或其变体；具有包含SEQ IDNO:2的序列的蛋白或其变体；具有包含SEQ ID NO:3的序列的蛋白或其变体；具有包含SEQ ID NO:4或5的序列的蛋白或其变体；以及具有包含SEQ ID NO:6、7或8的序列的蛋白。

参照蛋白的变体可以是具有如下序列的蛋白，所述序列与所述参照蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性，并且变体蛋白保持与参照蛋白相同的生物学功能。

所述基因组可以包含编码具有包含SEQ ID NO:6的序列的蛋白的开放阅读框。或者所述基因组可以包含编码具有包含SEQ ID NO:7的序列的蛋白的开放阅读框。或者，所述基因组可以包含编码具有包含SEQ ID NO:8的序列的蛋白的开放阅读框。

所述病毒基因组可以包含编码如下蛋白的开放阅读框：具有包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白；具有包含SEQ ID NO:2的序列的蛋白；具有包含SEQ ID NO:3的序列的蛋白；具有包含SEQ ID NO:5的序列的蛋白和具有包含SEQ ID NO:7的序列的蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:10的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第4943至11272位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第3041至4816位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

核苷酸序列的保守变体可以是与参照核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。保守变体可以是包含一个或多个沉默置换的序列。

分离的病毒颗粒可以是当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:9的序列。

分离的病毒颗粒可以是包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:10的序列。

根据本发明的又一个方面，提供了包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:12的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第4664至10933位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第3041至4537位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

分离的病毒颗粒可以是当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:11的序列。

分离的病毒颗粒可以是包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:12的序列。

根据本发明的再一个方面，提供了包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:14的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第5195至11524位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第2256至2942位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第3038至5068位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

分离的病毒颗粒可以是当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:13的序列。

分离的病毒颗粒可以是包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:14的序列。

根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的分离的病毒颗粒在治疗癌症中的用途。所述癌症可以是脑癌。脑癌可以是胶质母细胞瘤。

分离的病毒颗粒可用于感染细胞，其中感染的细胞被用于治疗癌症。

根据本发明的又一方面，提供了根据本发明的分离的病毒颗粒在被给药所述病毒的人中诱导细胞毒性应答的用途。所述细胞毒性应答可以是一种抗癌应答。

可以将所述分离的病毒颗粒配制成用于直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外，血/脑屏障内或它们的任何组合。可以将所述分离的病毒颗粒配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合而给药。

所述分离的病毒颗粒可用于感染细胞，感染的细胞被用来产生细胞毒性应答。可以将受感染的细胞配制成用于直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合。受感染的细胞可被配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合而给药。

根据本发明的又一个方面，提供了用于治疗癌症的方法。所述方法包含向患有癌症的患者给药根据本发明的分离的病毒颗粒。所述癌症可以是脑癌。所述脑癌可以是胶质母细胞瘤。

可以向患者直接给药所述分离的病毒颗粒。可以向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合直接给药所述分离的病毒颗粒。可以通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合向患者给药所述分离的病毒。

所述方法可以包含用分离的病毒颗粒感染细胞，并向患者给药感染的细胞。可以将向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合直接给药所述感染的细胞。可以通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合向患者给药所述感染的细胞。

根据本发明的又一方面，提供用于在患者中诱导细胞毒性应答的方法。所述方法包含向患者给药根据本发明的分离的病毒颗粒。

所述方法可以包含用所述分离的病毒颗粒感染细胞，并向患者给药感染的细胞。可以将向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合直接给药所述感染的细胞。可以通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合向患者给药所述感染的细胞。

根据本发明的又一方面，提供用于治疗患者的癌症的试剂盒。所述试剂盒包含：根据本发明的分离的病毒颗粒和向患者给药所述分离的病毒颗粒的使用说明书。

癌症可以为脑癌。所述脑癌可以为胶质母细胞瘤。

可以将分离的病毒颗粒配制为用于直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。可以将分离的病毒颗粒配制为用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合给药。

可以将分离的病毒颗粒配制为用于感染细胞，所述细胞可以配制成用于递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。所述细胞可以用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续的组合给药。

在结合附图阅读具体实施例的如下说明的前提下，对本领域技术人员来说，本发明的其他方面和特征将变得显而易见。

附图说明

现在仅通过实例并参照所附附图的方式描述本发明的具体实施方式。

图1是显示在脑内给药单一剂量的所示病毒(1e7pfu)之后基于Balb/C小鼠的存活率鉴定非神经毒性的弹状病毒的图。监测动物的重量减轻、竖毛、后腿瘫痪、发病率和死亡率。

图2A是MRB G与BG G或EB G的G交换示意图。

图2B和2C是显示存活测定结果图，其显示在正常人星形胶质细胞(NHA)和GM38皮肤成纤维细胞中病毒弱化。误差棒代表4个生物平行样的平均标准误差(SEM)。

图2D至2K是显示存活测定结果的图，其显示对人脑癌细胞系MRBGG是溶细胞的。存活率为处理后72小时使用Alamar blue测定。误差棒代表4个生物平行样的SEM。

图3A是在VSV和MRB载体中的野生型FMT、BG、MS、MRB和几株改造的弹状病毒毒株脑内毒性的总结。MRBGG和马拉巴EbGΔ51为根据本发明的病毒。

图3B是脑内接种3个月后杀死的动物的脑组织匀浆中病毒载量的总结。检测限是10¹。

图3C显示病理学的照片。急性感染的Balb/C小鼠的FMT和MRBGG病理学照片与盐水注射的动物之间不能区分。Balb/C小鼠被所示的病毒脑内接种(1e7pfu)，接种48小时后杀死。

图3D是显示用非神经毒性的弹状病毒处理的小鼠和对照小鼠的运动机能图。脑内注射非神经毒性的弹状病毒后，运动机能未受损害。通过测量从加速棒上落下的时延的旋转棒分析评估运动机能。

图3E是显示FMT或MRBGG嵌合体以不同剂量单次IV注射后的毒性特征谱。最大耐受剂量(MTD)等于没有造成如按行为和重量测量的持久发病的最高剂量。

图4A是MRBGG或Ebg IV治疗后(3个剂量1e9pfu)与使用PBS的对照治疗后U87MG肿瘤的IVIS图像。在人类U87MG移植瘤模型中这些病毒的全身给药提高了疗效。

图4B显示了波动曲线图，其表明响应于3IV剂量的MRBGG或EbG(1e9pfu)的显著的肿瘤消退。误差棒代表SEM。

图4C是MRBGG(时序检验P＝0.01)与EbG(时序检验P＝0.01)IV治疗的动物的Kaplan Meir生存曲线图。

图5是显示人胶质瘤母细胞板上的各种病毒的溶瘤活性图。

图6A是显示根据本发明的马拉巴嵌合病毒与对照病毒的体内神经毒性图。该图示出所示病毒的单剂量(1e6pfu)脑内给药后Balb/C小鼠的Kaplan Meir存活曲线。

图6B是显示图6A的动物的体重变化图。

图7A是显示根据本发明的马拉巴嵌合体与对照病毒的体内疗效图。该图显示具有U87MG肿瘤的CD-1裸鼠的治疗后Kaplan Meir存活曲线。

图7B是示出图7A的动物的体重变化图。

图8A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示人类U87MG移植瘤模型中PBS对照的体内疗效。该图像显示治疗前和治疗后(1周、2周、3周、4周)的肿瘤。

图8B是波动曲线图，该图表明未治疗的对照动物中的肿瘤荷载随时间显著增加。

图9A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示人类U87MG移植瘤模型中BG野生型(BG-WT)病毒治疗的体内疗效。该图像显示BG治疗(1剂量1e7pfu：IC)后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。

图9B是波动曲线图，显示响应于IC剂量(1e7pfu)的BG的初始中等程度肿瘤消退，其后肿瘤负荷复发。

图10A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中FMT野生型(FMT-WT)病毒治疗的体内疗效。该图像显示FMT-WT(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。

图10B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的FMT-WT(1e7pfu)的显著的肿瘤消退。

图11A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRBBG(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB BG(G)治疗(1剂量1e7pfu：IC)后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。

图11B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的MRB BGG(1e7pfu)的中等程度肿瘤消退。

图12A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRBFMT(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB FMT(G)(1剂量1e7pfu)治疗后(1周、2周、3周)的U87MG肿瘤。

图12B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的MRB FMT G显著的肿瘤消退。然而，在治疗后4周之前，所有的动物都死于MRB FMT(G)治疗的神经毒性作用。

图13A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中FMTMRB(G)治疗的体内疗效。该图像显示FMT MRB(G)(1剂量1e7pfu：IC))治疗后(1周、2周、3周)的U87MG肿瘤。

图13B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的FMT MRB(G)显著的肿瘤消退。然而，在治疗后4周之前，所有的动物都死于FMT MRB G治疗的神经毒性作用。

图14A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中VSV-LCMV(G)治疗的体内疗效。该图像显示VSV LCMV G(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。

图14B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量(1e7pfu)的VSV-LCMV(G)的显著的肿瘤消退。

图15A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRBLCMV(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB LCMV G(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。

图15B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量(1e7pfu)的MRB-LCMV(G)的显著的肿瘤消退。

图16是显示用野生型马拉巴病毒、减毒VSV(VSV-Δ51)、马拉巴LCMV(G)嵌合体或VSV-LCMV(G)嵌合体治疗的Balb/C小鼠的中和抗体滴度的图。

具体实施方式

定义

在整个本发明中，使用的几个术语在以下段落中定义。

如本文所使用的，词语“所期望”或“所需的”是指在某些情况下提供某些益处的技术的实施方式。然而，在相同或其他情况下，其他实施方式也可以是可取的。此外，一个或多个所期望的实施方式的叙述并不意味着其他实施方式是不可用的，并且不旨在将其它实施方式从所述技术范围内排除。

如本文所使用的，词语“包含”和其变形应是非限制的，这样列表中的项的叙述不排除所述技术的材料、组合物、装置和方法中也可以使用的其他类似项。类似地，术语“能”和“可以”以及其变形旨在为非限制性的，使得能或者可以包含某些要素或特征的实施方式的叙述并不排除本技术的不包含这些要素或特征的其它实施方式。

尽管开放式术语“包含”，作为非限制性的术语如包含、含有或者具有的同义词，在本文中用于描述和要求本技术实施方式的权利，实施方式也可以使用更多限定性术语，例如“由......组成”或“主要由...组成”来描述。因此，对于记载材料、组件或方法步骤的任何给定的实施方式，本技术还特别包含由这些材料、组件或方法步骤或基本上由这种材料、组件或方法步骤组成的实施方式，排除其他材料、组件或方法(对于由......组成)和排除影响所述实施方式的重要性质的其他材料、组件或方法(对于基本上由...组成)，即使这样的其他材料、组件或方法没有明确记载在本申请中。例如，记载要素A、B和C的组合物或方法的叙述预期为由A、B和C组成或基本由A、B和C组成的实施方式，但不包含现有技术中记载的要素D，即使在本文中没有明确描述排除要素D。

如本文所指，所有组成百分比都是以总组合物的重量计，除非另有规定。公开的范围，除非另有规定，包含端点并包含所有不同的值和整个范围内进一步划分的范围。因此，例如，“A至B”或“约A至约B“的范围包含A和B。特定参数(如温度、分子量、重量百分比等)的值和值范围不排除可用于本文的其他值和值范围。预期给定参数的两个或多个具体例示的值可以定义对所述参数可以主张的值范围的端点。例如，如果本文例示的参数X具有值A且还例示具有值Z，可以预期到所述参数X可以具有从约A到约Z的值范围。同样，预期到参数的两个或多个值范围(无论这些范围是嵌套的、重叠的或不同的)的公开包含对使用所公开的范围的端点可以主张的值的范围的所有可能的组合。例如，如果在本文例示参数X具有在1至10或2至9或3至8范围内的值，也可以预期到参数X可以具有其它的值范围，包含1至9、1至8、1至3、1至2、2至10、2至8、2至3、3至10和3至9。

如本文所用的“一个(a)”和“一个(an)”表示存在“至少一个”项，在可能的情况下，可以存在多个这样的项。

“约”当用于数值时表示所述值中的计算或测量允许的一些轻微不精确(相当接近所述值的正确值；近似或合理地接近所述值；几乎)。如果为某些原因，在本领域中不能以通常意义理解“约”所提供的不精确性，那么本文所用的“约”至少表示由测量的常规方法或使用这种参数可能产生的变化。

如本文所使用的，术语“和/或”包含一个或多个相关所列项的任何和所有组合。

如本文所使用的，具有“降低水平的神经毒性”或“降低的神经毒性”的病毒被理解为是指这样一种病毒，当将其以给定的剂量注入鼠脑的右侧纹状体时，与用相应的野生型病毒注射的小鼠相比，其导致小鼠具有更少的神经毒性迹象(例如，体重减轻、竖毛、后腿瘫痪、发病和死亡)。

如本文所使用的，具有“基本上零水平的神经毒性”或“基本上没有神经毒性”的病毒被理解为指的是这样一种病毒，当将有效剂量的该病毒注射到患者中时，与采用针对这个物种的患者的标准方案注射病毒前的患者相比，未产生可检测的运动机能降低的迹象。例如，“基本上没有神经毒性”的病毒将被理解为是指与注射病毒前的小鼠相比，当以1e7pfu剂量将病毒注射到小鼠中时未产生可检测的运动机能降低的迹象的病毒，所述运动机能通过在旋转棒上计时测定。

详细说明

在目前鉴定的超过250种弹状病毒中，本发明的作者测试了几种野生型的弹状病毒并确定很多都能有效杀死CNS肿瘤细胞系。还确定了这些有效的病毒分离株中的几种，其显示显著的减毒，使得脑内接种后存活率为100％。这与以前测试的马拉巴和VSV病毒形成鲜明的对比。本发明的作者随后进行测序并改造了嵌合病毒以与已知的非神经毒性的野生型菌株一起检测。

一般地，本发明提供了涉及改造的嵌合马拉巴弹状病毒以及相关的核苷酸序列和蛋白序列的系统、方法、用途、过程、制品和组合物。例如，本发明提供了嵌合马拉巴弹状病毒在溶瘤治疗，例如原发性或继发性脑癌治疗中的用途。

预期的溶瘤病毒可以用于通过向患者直接给药病毒或通过用病毒感染细胞并向患者给药感染的细胞来递送所述病毒从而治疗癌症。被病毒感染的细胞可以是来自患者的癌细胞、正常的免疫细胞或干细胞。在一些实施例中，待治疗的癌症是脑癌，如恶性胶质瘤。恶性胶质瘤的一个实例为胶质母细胞瘤。

根据本发明的病毒颗粒可以不含有野生型质粒，可以不含有编码野生型马拉巴G蛋白的序列或两者都不含有。

在根据本发明的病毒颗粒的一个实例中，提供了一种具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组的分离的病毒粒子：马拉巴蛋白N、P和L，或它们的任何变体；以及马拉巴蛋白M或蛋白Δ51M或它们的任何变体；和Bahia Grande G蛋白、LCMV G蛋白或埃博拉G蛋白。

马拉巴蛋白N可以具有包含SEQ ID NO:1的序列。马拉巴蛋白P可以具有包含SEQ ID NO:2的序列。马拉巴蛋白L可以具有包含SEQ ID NO:3的序列。马拉巴蛋白M和Δ51M可以分别具有包含SEQ ID NO:4和5的序列。Bahia Grande G蛋白可以具有包含SEQ ID NO:6的序列。LCMV G蛋白可以具有包含SEQ ID NO:7的序列。埃博拉G蛋白可以具有包含SEQ ID NO:8的序列。

参照蛋白的变体可以是具有与参照蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列的蛋白，并且变体蛋白保持与参照蛋白相同的生物学功能。例如，如果用变体蛋白修饰的病毒颗粒具有与带有参照蛋白的病毒颗粒相同的细胞毒性和神经毒性，则认为变体蛋白与参照蛋白保持相同的生物学功能。

在一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、4和6的序列的蛋白。

在另一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、4和7的序列的蛋白。

在又一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、4和8的序列的蛋白。

在另一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、5和6的序列的蛋白。

在又一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、5和7的序列的蛋白。

在再一个实例中，分离的病毒颗粒具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：具有包含SEQ ID NO:1、2、3、5和8的序列的蛋白。

在根据本发明的病毒颗粒的其他实例中，提供了包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:10的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第4943至11272位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:10的第3041至4816位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

保守变体可以是与参照核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。保守变体可以是包含一个或多个沉默置换的序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:9的序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:10的序列。

在根据本发明的病毒颗粒的另一个实例中，提供了包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:12的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:12的第4664至10933位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ IDNO:12的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ IDNO:12的第3041至4537位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:11的序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:12的序列。

在根据本发明的病毒颗粒的另一个实例中，提供了包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：由SEQ ID NO:14的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ ID NO:14的第5195至11524位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ IDNO:14的第2256至2942位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；由SEQ IDNO:14的第3038至5068位所限定的序列的反向互补序列；以及其启动子的反向互补序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为当病毒在宿主细胞中时能产生cDNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述cDNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:13的序列。

根据本发明的病毒颗粒的具体实例为包含RNA多核苷酸的分离的病毒颗粒，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ ID NO:14的序列。

根据本发明的另一方面，根据本发明的分离的病毒颗粒可以用于治疗癌症。所述癌症可以是脑癌，例如胶质母细胞瘤。

所述分离的病毒颗粒可以用于感染细胞，感染的细胞可以用于治疗癌症。

根据本发明的另一个方面，根据本发明的分离的病毒颗粒可以用于在被给药所述病毒的人中诱导细胞毒性应答。所述细胞毒性应答可以是抗癌应答。所述分离的病毒颗粒可以用于感染细胞，感染的细胞可以用于产生细胞毒性应答。

可以将所述分离的病毒颗粒配制成用于直接递送至中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合。可以将所述分离的病毒颗粒配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续的组合而给药。

可以将所述感染的细胞配制成用于直接递送至中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或它们的任意组合。可以将所述感染的细胞配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续的组合而给药。

因此，根据本发明的另一方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的患者给药根据本发明的分离的病毒颗粒。所述癌症可以脑癌，例如胶质母细胞瘤。

可以直接向所述患者给药所述分离的病毒颗粒。可以向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述分离的病毒颗粒。可以通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向患者给药所述分离的病毒颗粒。

所述方法可以包含用所述分离的病毒颗粒感染细胞并向患者给药感染的细胞。可以向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述感染的细胞。可以通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向患者给药所述感染的细胞。

根据本发明的另一个方面，提供在患者中诱导细胞毒性应答的方法，所述方法包含向患者给药根据本发明的分离的病毒颗粒。

根据本发明的另一方面，提供用于治疗患者的癌症的试剂盒。所述试剂盒包含根据本发明的分离的病毒颗粒和向患者给药所述分离的病毒颗粒的使用说明。

所述的癌症可以是脑癌，例如胶质母细胞瘤。

所述分离的病毒颗粒可以配制为用于直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。所述分离的病毒颗粒可以配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合给药。

所述分离的病毒颗粒可以配制成用于感染细胞，所述细胞用于递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。所述细胞可以被配制成用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续的组合给药。

在上述方面中的任一方面，通过一种途径给药可以与一种或多种其他给药途径组合。通过不同途径给药所述病毒颗粒可以连续和/或同时进行。不预期根据本发明的病毒的给药途径或模式会影响病毒感染并杀死癌细胞的能力，无论是否将所述病毒向患者直接给药或者首先感染细胞并向患者给药感染的细胞。预期根据本发明的病毒，当被给药至血/脑屏障内或血/脑屏障外时，能穿过血/脑屏障并感染位于血/脑屏障的另一侧的癌细胞。

在例如Power AT et al.,Carrier cell-based delivery of an oncolytic病毒circumvents antiviral immunity.Mol Ther.200710Jan；15(1):123-30；和Tyler MA etal.Neural stem cells target intracranial glioma todeliver an oncolytic adenovirus invivo.Gene Ther.2009Feb；16(2):262-78中讨论了用病毒感染细胞以及使用感染的细胞递送所述病毒的技术。

多核苷酸和氨基酸序列

提供了可用于分子生物学领域的技术人员已知的各种方法和技术中的包含核酸序列(例如，DNA和RNA)的多核苷酸序列和氨基酸序列(例如，蛋白)。它们包含分离、纯化和重组形式的所列出的序列并进一步包含完全或部分形式的所列出的序列。氨基酸序列的非限制性用途包含制备包含所公开的氨基酸序列的蛋白或肽的抗体。多核苷酸序列的非限制性用途包含制备杂交探针，作为引物用于聚合酶链反应(PCR)中，用于染色体和基因图谱等。完整的或部分的氨基酸序列或多核苷酸序列可以用于此类方法和技术。

本发明的特征是鉴定多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含基因序列和编码核酸序列和氨基酸序列。除了在所附的序列表中提供的序列之外，还包含在结构和/或功能上与其相关的多核苷酸序列。此外，还包含在严苛条件下与序列表中任一多核苷酸序列或者其子序列杂交的多核苷酸序列(例如，含有至少100个连续核苷酸的子序列)。多核苷酸序列还包含用于RNA生成和/或翻译的序列和/或子序列，例如，mRNA，反义RNA，正义RNA，RNA沉默和干扰构型等。

与在序列表中所提供的多核苷酸序列基本上相同的那些多核苷酸序列可以用于本文公开的组合物和方法中。基本相同或基本相似的多核苷酸序列被定义为至少与参照多核苷酸序列的子序列在核苷酸-核苷酸基础上一致的多核苷酸序列。此类多核苷酸可以包含相对于任何序列表中所列出那些序列的任一个的例如插入、缺失和替换。例如，这样的多核苷酸典型地与选自序列表中的那些序列或其子序列的参照序列具有至少约70％的同一性。例如，在比较窗口内十个核苷酸中至少七个与所选择的参照序列相同。此外，这样的序列可以与参照序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的同一性。这些多核苷酸的子序列可以包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约500、约1000或更多的连续核苷酸或互补序列。这样子序列可以是，例如，寡核苷酸，如合成寡核苷酸，分离的寡核苷酸或全长基因或cDNA。与所述序列的任一序列互补的多核苷酸序列也包含在内。

氨基酸序列包含序列表中所表示的氨基酸序列和其子序列。也包含在结构和/或功能上与其高度相关的氨基酸序列。例如，除了在序列表中所列的氨基酸序列之外，基本上相同的氨基酸序列也可以用于所公开的组合物和方法。基本上相同或基本上相似的氨基酸序列被定义为至少与参照氨基酸序列的子序列在氨基酸-氨基酸基础上具有同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列可以包含相对于在序列表中的任何氨基酸序列的例如插入、缺失和替换。例如，这种氨基酸序列通常与参照氨基酸序列或其子序列具有至少约70％同一性。例如，在比较窗口内十个氨基酸中的至少七个与所选择的参照氨基酸序列相同。常常，这类氨基酸序列是与参照序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的子序列可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约500、约1000或更多的连续的氨基酸。氨基酸序列或子序列的保守变体也是可能的。氨基酸序列可以是细胞毒性的、酶促活性的、无酶活性的等。

其中，多核苷酸序列被翻译成多肽或多肽的子序列，核苷酸的变化可导致保守的或非保守的氨基酸替换。保守氨基酸替换是指具有功能上相似的侧链的残基的可互换性。提供了功能上相似的氨基酸的保守替换表是现有技术中已知的。表1列出了六组含彼此“保守替换”的氨基酸的实例。在现有技术中可以获得其他的保守替换表并可以类似的方式使用。

表1

保守替换组
	1 丙氨酸(A) 丝氨酸(S) 苏氨酸(T)
2 天冬氨酸(D) 谷氨酸(G)
	3 天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)
4 精氨酸(R) 赖氨酸(K)
	5 异亮氨酸(I) 亮氨酸(L) 甲硫氨酸(M) 缬氨酸(V)
6 苯丙氨酸(F) 酪氨酸(Y) 色氨酸(W)

本领域技术人员将理解，许多保守替换产生功能上相同的结构。例如，如上面所讨论的，由于遗传密码的简并性，“沉默置换”(即，多核苷酸序列上的替换未导致所编码的多肽改变)是每个编码氨基酸的多核苷酸序列的隐含特征。类似的，在氨基酸序列中一个或在几个氨基酸的“保守的氨基酸替换”(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多)是用具有高度相似性质的不同氨基酸进行替换，也容易识别，因为与所公开的结构体高度相似。每个所公开的序列的这样的保守变体也是预期的。

获得保守变体以及更不同的版本多核苷酸序列和氨基酸序列的方法是本领域中已知的，除了根据各种已建立的方案中的任一种(参见例如Ausubel et al.CurrentProtocols in Molecular Biology(2004增刊)John Wiley&Sons，纽约("Ausubel")；Sam brook et al.Molecular Cloning–A Laboratory Manual(第二版.)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989("Sambrook")，和Berger and Kimmel,Guide toMolecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,152卷学术出版公司，加利福尼亚州圣迭戈("Berger"))能够例如通过筛选基因文库或表达文库获得的天然存在的同系物之外，可以通过各种诱变程序的任一种产生其他变体。许多这样的程序是本领域已知的，包含定点诱变，寡核苷酸定向诱变以及许多其他程序。例如，在例如下述文献中描述了定点诱变变，Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.Rev.Genet.19:423-462，以及其中的参考文献，Botstein&Shortie(1985)“Strategies andapplications of in vitro mutagenesis”Science 229:1193-1201；和Carter(1986)“Site-directed mutagenesis”Biochem.J.237:1-7。在例如下述文献中描述了寡核苷酸定向诱变，例如，Zoller&Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors:an efficient and general procedure for the production of pointmutations in any DNA fragment”Nucleic Acids Res.10:6487-6500。在例如下述文献中描述了使用修饰的碱基的诱变，Kunkel(1985)“Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492，以及Taylor et al.(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutation athigh frequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.13:8765-8787。在例如下述文献中描述了使用缺口双螺旋DNA的诱变，Kramer et al.(1984)“The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction”Nucl.Acids Res.12:9441-9460)。在例如下述文献中描述了点错配诱变，Kramer et al.(1984)“Point Mismatch Repair”Cell 38:879-887).在例如下述文献中描述了双链断裂诱变，Mandecki(1986)“Oligonucleotide-directed double-strandbreak repair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83:7177-7181，和Arnold(1993)“Protein engineering forunusual environments”Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。在例如下述文献中描述了使用修复缺陷宿主菌株的诱变，Carter et al.(1985)“Improvedoligonucleotide site-sirected mutagenesis using M13vectors”Nucl.Acids Res.13:4431-4443。在例如下述文献中描述了通过全基因合成的诱变：Nambiar et al.(1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein”Science223:1299-1301。在例如下述文献中描述了DNA重排，Stemmer(1994)“Rapidevolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370:389-391和Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:In vitrorecombination for molecular evolution”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751。

在Methods in Enzymology第154卷中进一步描述了上述方法中的许多方法，其还描述了针对故障排除问题的有用的控件与各种诱变方法。诱变试剂盒、文库构建和其他各自生产方法也是可以从商业途径获得的。例如，由例如以下公司获得试剂盒，Amersham International pic(皮斯卡塔韦，新泽西州)(例如使用如上Eckstein方法)，Bio/Can Scientific(密西沙加，安大略省，加拿大)，Bio-Rad(海格立斯，加利福尼亚州)(例如使用如上所述的Kunkel方法)，Boehringer MannheimCorp.(里奇菲尔德，康涅狄格州)，Clonetech Laboratories of BD Biosciences(帕洛阿尔托，加州)，DNA Technologies(盖瑟斯堡，马里兰州)，Epicentre Technologies(麦迪逊，威斯康星州)(例如5引物3引物试剂盒)；Genpak Inc.(石溪，纽约)，Lemargo Inc(多伦多，加拿大)，Invitrogen Life Technologies(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，New England Biolabs(贝弗利，马萨诸塞州)，Pharmacia Biotech(皮帕克，新泽西州)，Promega Corp.(麦迪逊，威斯康星州)，QBiogene(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和Stratagene(拉霍亚，加利福尼亚州)(例如QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒和Chameleon^TM双链位点定向诱变试剂盒)。

确定序列关系

相似序列可通过许多方法例如，同一性百分比、杂交、免疫学方法等进行客观判断。在现有技术中，各种用于确定两个或多个序列之间的关系(例如，同一性、相似性和/或同源性)的方法是可获得的且已知的。方法包含：例如，手动比对、计算机辅助序列比对以及它们的组合。许多用于进行序列比对的算法(一般由计算机来实现)是容易获得的或者可以由技术人员来制造。这些方法包含，例如，Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(1970)J.Mol.BioI.48:443；Pearson和Lipman的相似性方法的检索(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444：2444；和/或通过计算机实现这些算法(例如，Wisconsin遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康星州)。

例如，在Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述了使用BLAST算法用于执行序列同一性(和序列相似性)分析的软件。该软件是可公开可用的，例如，通过国家生物技术信息中心的互联网，网址为ncbi.nlm.nih.gov。该算法包含首先通过识别查询序列中长度为W的短字而识别高得分序列对(HSP)，当与数据库中具有相同长度的字比对时查询序列中长度为W的短字匹配或满足某些正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值。这些初始邻近字匹配记录作为起始搜索的种子以找到包含它们的更长的HSP。在两个方向沿每个序列扩展该词的匹配记录直到能增加累积的比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，打分矩阵用于计算累计分值。当发生如下情况时，该词的匹配记录在每个方向上的扩展停止：累积比对得分从其最大获得值下降了量X；由于的一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分达到0以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，截止为100，M＝5，N＝-4并且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP(BLAST蛋白)程序使用字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62打分矩阵(参见，Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1091)。

此外，BLAST算法进行两个序列之间的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小的概率和(p(N))，其通过两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生的匹配提供概率指示。例如，如果在待测核酸与参照核酸的比较中最小的概率和小于约0.1，或小于约0.01，或甚至小于约0.001，则认为核酸类似于参照序列(因此，在这一方面，同源)。

序列比对算法的另一个实例是PILEUP，它使用渐进式成对比对建立了来自相关序列组的多重序列比对。它也可以绘制显示用于建立比对的簇关系的树。PILEUP使用Feng&Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35:351-360的渐进式比对方法的简化。所使用的方法类似于Higgins&Sharp(1989)CABIOS5:151-153所描述的方法(1989)。该程序可以比对，例如，高达300个最大长度为5000字母的序列。该多重比对程序始于两个最相似序列的成对比对，产生两个比对序列簇。然后该簇可以与下一个最相关序列或比对序列簇进行比对。两个序列簇可以通过两个单独序列的成对比对的简单扩展进行比对。最终比对通过一系列渐进式成对比对而实现。该程序还可以用于绘制簇关系的树状图或树形图或。该程序通过为序列比较区域指定具体序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标来运行。

适合于多重DNA或氨基酸序列比对的算法的其他实例是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.et al.(1994)Nucl.Acids.Res.22:4673-4680)。CLUSTALW在序列组之间进行多重成对比较，基于同源性将它们整合到多重比对中。空位开放和空位延伸罚分可以分别为，例如，10和0.05。对于氨基酸比对，BLOSUM算法可被用作蛋白权重矩阵。参见，例如Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919。

多核苷酸杂交相似性也可以通过具有互补或部分互补的多核苷酸序列的单链核酸(或核酸的单链区)之间的杂交评价。杂交是在溶液中或者在将核酸链之一固定在固体支持物，例如膜、珠子、芯片、滤纸等上的情况下核酸之间典型的物理结合的量度。基于各种充分表征的物理化学力，如氢键、溶剂排斥、碱基堆积等，发生核酸杂交。核酸杂交众多规程是本领域已知的。核酸杂交的延伸指导参见Tijssen的Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology–Hybridization with Nucleic Acid Probes，第一部分，第2章；“Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”(1993)(Elsevier，N.Y.)以及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(2004年增刊)JohnWiley&Sons，纽约(“奥苏贝尔”)；Sam brook et al.,Molecular Cloning–A LaboratoryManual(第二版)，1至3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(“Sambrook”)；Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology，第152卷，学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(“Berger”)。Hames和Higgins(1995)Gene Probes 1，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津大学，英国(Hames和Higgins)以及Hames和Higgins(1995)Gene Probes 2，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津大学，英国(Hames和Higgins 2)提供了有关包含寡核苷酸的DNA和RNA的合成、标记、检测和定量的详细信息。

根据互补和部分互补的核酸之间的理论熔解温度(Tm)选择适于获得杂交(包含差示杂交)的条件。在给定的系列条件下，例如，溶剂成分、离子强度等，Tm是当杂交核酸链之间的双链50％变性时的温度。即，Tm为对应于从螺旋到无规卷曲过渡的中点的温度；对于很长一段核苷酸，它取决于多核苷酸的长度、核苷酸组成和离子强度。

杂交后，未杂交的核酸可以通过系列洗涤去除，它的严苛性可根据所期望的结果来调节。低严苛性洗涤条件(例如，使用较高的盐和低温)提高灵敏度，但可产生非特异性杂交信号和高背景信号。更高的严苛性条件(例如，使用较低的盐和高温，即接近Tm)降低背景信号，通常主要剩余特异性信号，还可参见Rapley，R.和Walker，J.M.eds.，Molecular Biomethods Handbook(胡马纳出版社公司1998)。

在核酸杂交实验，例如Southern和northern杂交情况下的“严苛杂交洗涤条件”或“严苛条件”取决于序列，并在不同的环境参数下不同。核酸杂交的延伸指导参见Tijssen(1993)，同上，Hames和Higgins 1以及Hames和Higgins 2，同上。

对于在Southern和northern杂交中具有超过100个互补碱基的互补核酸在滤纸上的杂交，严苛杂交条件的实例为2×SSC，50％甲酰胺，42℃杂交过夜(例如，约20小时)。严苛洗涤条件是0.2×SSC洗涤液65℃下进行15分钟(关于SSC缓冲液的描述参见如上Sambrook)。通常，确定严苛性的洗涤在去除由剩余的未杂交探针产生的信号的低严苛性洗涤之后进行。低严苛性洗涤的实例是室温下2×SSC(例如，20℃下15分钟)。

在一般情况下，在特定的杂交测定中信号信噪比为对无关探针所观察到的信噪比的至少2.5倍至5倍(通常更高)表明检测到特异性杂交。在两个序列之间至少检测到严苛杂交表明与本文序列表中所提供的序列相对高的结构相似性。

通常，对于特定的序列，在确定的离子强度和pH下，“高严苛”杂交和洗涤条件被选择为低于比热熔点(Tm)低约5℃以下(如下面所指出的，高严苛条件也可以是相对而言)。与感兴趣的核苷酸序列密切相关或相同的靶序列(例如，“探针”)可以在严苛或高严苛条件下确定。低严苛性条件适合于具有较低的互补性的序列。

例如，在确定严苛或高严苛杂交(或甚至更严苛的杂交)和洗涤条件时，杂交和洗涤条件的严苛性逐渐增大(例如，通过在杂交或洗涤中升高温度、降低盐浓度、增加洗涤剂浓度和/或增加有机溶剂如甲酰胺的浓度)直到达到所选定的系列标准。例如，杂交和洗涤条件的严苛性是逐渐增加直到包含一种或多种本发明的多核苷酸序列或其子序列和/或其互补的多核苷酸序列结合至完全匹配的互补靶上，如所期望的，信噪比为探针与不匹配的靶杂交所观察到的信噪比的至少2.5倍，以及可选的5倍，或10倍，或100倍或更多。

使用来源于序列表中所列出的核酸的子序列，可以获得靶核酸；这样的靶核酸也是本发明的一个特征。例如，这样的靶核酸包含在严苛条件下杂交到寡核苷酸探针上的序列，所述寡核苷酸探针对应于序列表中任一多核苷酸的特定子序列或其互补序列；该探针可选地编码序列表中任一氨基酸序列的特定子序列。

例如，当与寡核苷酸探针完全互补的靶寡核苷酸杂交到探针上并其信噪比为靶寡核苷酸与阴性对照的非互补核酸的杂交的信噪比至少约5至10倍时，选择杂交条件。更高的信噪比的比值可以通过增加杂交条件的严苛性来实现，使得获得约15倍、20倍、30倍、50倍或更高的比值。具体的信号将取决于在相关测定中所使用的标记物，例如荧光标记物、热标记物、放射性标记物等。

载体，启动子和表达系统

本发明的多核苷酸序列可以为各种形式中的任何一种，例如，表达组件、载体、质粒、病毒颗粒或线性核酸序列。例如，载体、质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、YACs(酵母人工染色体)、噬菌体、病毒和核酸片段可以包含本发明的核酸序列或其子序列。这些核酸构建体可以进一步包含启动子、增强子、聚合接头、调控基因等。因此，本发明还涉及，例如，包含此处公开的多核苷酸的载体，包含这些载体的宿主细胞，以及通过重组技术生产的各种公开的多肽(包含序列表的那些)。

根据这些方面，载体可以是，例如，质粒载体、单链或双链噬菌体载体，或单链或双链RNA或DNA病毒载体。可通过将DNA和RNA导入细胞的已知技术将这些载体作为多核苷酸，优选DNA，引入到细胞中。在噬菌体和病毒载体的情况下，通过已知的感染和转导技术也可以并且优选将该载体作为包装或包被病毒被引入细胞。病毒载体可以是有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒传播通常只发生在互补的宿主细胞中。

在一些实例中，载体包含可用于表达本发明的多核苷酸和多肽的载体。通常，这些载体包含对在宿主中表达有效的顺式作用控制区，其可操作地被连接到要表达的多核苷酸上。适当的反式作用因子由宿主提供、由互补载体提供或在被引入到宿主中时由载体本身提供。

就这一点而言，在某些实例中，载体提供了蛋白表达。这种优选的表达可以是诱导型表达、时间限制表达或主要限于某些类型的细胞的表达或任何以上组合。诱导型载体的一些实施方式可以由容易操纵的环境因素(如温度和营养添加剂)诱导以用于表达。适于这方面的各种载体，包含在原核和真核宿主中使用的组成型和诱导型表达载体，是本领域技术人员已知并且常规使用的。其中这样的载体包含，来源于染色体、附加体和病毒的载体，例如，来源于细菌质粒、噬菌体、转座子，酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如弹状病毒、杆状病毒、如SV40的乳多泡病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒)的载体以及来源于它们的组合的载体，例如来源于质粒和噬菌体遗传元件(如粘粒和噬菌粒)的载体，以及用于农杆菌介导的转化的二元载体。

载体可以包含可选标记和报道基因。为了便于获得足够量的载体，可以使用允许在大肠杆菌中复制的细菌来源。市售的以下载体作为示例提供。其中优选在细菌中使用的载体是pQE70、pQE60和pQE-9，购自Qiagen；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、购自Stratagene；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，购自Pharmacia。其中，优选的真核载体是pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，购自Stratagene；pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，购自Pharmacia。有用的植物二元载体包含购自Clontech的BIN19和其衍生物。列出这些载体仅为了示例说明本领域技术人员可用的许多市售且已知的载体。应当理解的是，可以使用适于例如在宿主中引入、保持、增殖或表达本发明序列表中所提供的一种或多种多核苷酸和/或多肽(包含所描述的其变体)的任何其它质粒或载体。

在一般情况下，表达构建体将包含转录起始和终止的位点，且在转录区内包含在该构建体编码多肽时用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将在起始处包含翻译起始AUG并在待翻译的多肽的末端的适当位置包含终止密码子。此外，该构建体可以含有调控以及产生表达的调控区。通常，根据许多通常的实践程序，这样的区域通过控制转录进行操纵，其中例如转录因子、阻遏蛋白结合位点和终止信号。为了使翻译的蛋白分泌到内质网腔、分泌到壁膜间隙或分泌到细胞外环境，可以将合适的分泌信号掺入到所表达的多肽中。这些信号对于该多肽可以是内源性的，这些信号也可以是异源信号。

可以将增强子序列插入到载体中来增强本发明的DNA通过高等真核生物的转录(例如，编码多肽)。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，在给定的宿主细胞类型中用于增加启动子的转录活性。增强子的实例包含SV40增强子(位于复制起点的后侧100至270bp处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。在本发明中用于增强引入的DNA片段转录的其他的增强子包含，尤其是，Odell et al.,Plant Mol.BioI.10:263-72(1988)所示的35S启动子内的病毒增强子以及Fromm et al.,Plant Cell 1:977(1989)所描述的冠瘿碱基因的增强子。增强子可影响载体中包含的序列表达的组织特异性和/或时间特异性。

通过在合适的点终止转录，终止区也有利于有效表达。有用的终止子包含，但不限于pinll(参见An et al.,Plant Cell 1(1):115-122(1989))，glb1(参见Genbank登录号#L22345)，gz(参见gzw64a终止子，Genbank登录号#S78780)，和来自农杆菌的nos终止子。终止区可与启动子核苷酸序列来自相同来源(be native with)，也可与感兴趣的DNA序列来自相同来源，或者可以来源于其他来源。例如，其他方便的终止区可以由根癌农杆菌的Ti质粒获得，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶的终止区。也可参见：Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogenet et al.(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi et al.(1987)NucleicAcid Res.30 15:9627-9639。

适于一般表达的已知真核启动子是CMV立即早期启动子；HSV胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒LTR的启动子，如劳氏肉瘤病毒(“RSV”)的启动子；金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子和各种植物启动子，如球蛋白-1。还可以使用序列表所列出的多核苷酸序列的天然启动子。原核启动子的代表，仅举几个已知的的启动子的实例，包含噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启子。

分离的或重组的病毒、病毒感染的细胞或包含本发明的多核苷酸序列的一个或多个部分和/或表达本发明的氨基酸序列的一个或多个部分的细胞也可以考虑。

一般使用标准技术将多核苷酸(可选地编码所公开的氨基酸序列的异源结构序列)插入到载体中，以便被可操作地连接到启动子上进行表达。如本文所用的可操作的连接包含涉及启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应于第二序列的DNA的转录。通常，可操作的连接表示被连接的多核苷酸序列是相邻的，并且当需要加入两个蛋白编码区时它们是相邻的且在同一阅读框中。当多核苷酸被用于表达多肽时，所述多核苷酸被定位以使转录起始位点适当地位于5'端至核糖体结合位点。核糖体结合位点为5'端至起始待表达多肽的翻译的AUG。一般地，不存在由起始密码子(通常AUG)开始并位于核糖体结合位点和起始密码子之间的其他开放阅读框。此外，通常在多肽的末端存在翻译终止密码子，并且真核宿主中使用的构建体中存在多腺苷酸化信号。在多核苷酸构建体中也可以包含适当地设置于转录区的3'末端的转录终止信号。

对于被设计为表达多肽的核酸构建体，表达组件可以另外含有5'前导序列。这样的前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包含：小核糖核酸病毒前导序列，例如：EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)，Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:6126-6130；马铃薯y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)，Allison et al.(1986)；MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)，Virology 154:9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak et al.(1991)Nature 353:90-94；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)，Jobling et al.(1987)Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie et al.(1989)Molecular Biology of RNA，237-256页；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)Lommel et al.(1991)Virology81:382-385。也参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiology 84:965-968。表达组件还可以含有增强翻译的序列和/或增强mRNA稳定性的序列，如内含子。表达组件还可以在感兴趣的分离的核苷酸序列的3'末端包含翻译终止区。

在期望具有针对特定的细胞器或分泌到细胞表面的多核苷酸序列表达产物的情况下，表达组件还可以包含编码转运肽的序列。这种转运肽是现有技术中已知的，包含但不限于：酰基载体蛋白的转运肽、RUBISCO小亚基、植物EPSP合酶等。

在制备表达组件中，可以操作各种DNA片段，从而在适当的方向上(视情况而定，在正确的阅读框架中)提供多核苷酸序列。为此目的，接头或连接子可以用于连接DNA片段或者可以涉及提供方便的限制性内切位点、去除多余DNA、去除限制性内切位点等的其它操作。为了这个目的，可以使用体外诱变、引物修复、限制性酶切消化、退火以及如转换和颠换的重置换。

将构建体引入宿主细胞中，可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载、弹道引入、感染或其他方法来实现。在许多标准实验室手册，如Davis et al.,Basic Methods inMolecular Biology,(1986)和Sambrook et al.,Molecular Cloning–A LaboratoryManual，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)中描述了这些方法。

合适的宿主的代表性实例包含细菌细胞，如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉菌细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS和人黑素瘤细胞；和植物细胞。

所述宿主细胞可以培养在常规营养培养基中，可以适当地改造，视情况而定，尤其激活启动子、选择转化子或扩增基因。在选择用于表达的宿主细胞中预先使用的培养条件，如温度、pH等，通常适合于表达核酸和/或多肽，这对本领域技术人员来说是显而易见的。可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在合适的启动子控制下表达成熟蛋白。使用来源于本发明所公开的多核苷酸的RNA、无细胞翻译系统也可以用来生产这种蛋白。

在合适的宿主菌株转化以及宿主菌株生长到适当的细胞密度之后，其中所选择的启动子是诱导型的，通过适当的方式(例如，温度变化或暴露于化学诱导剂)诱导启动子，细胞再培养一段时间。然后通常通过离心收集细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，保留得到的粗提取物用于进一步纯化。在蛋白表达中可以通过任何方便的方法包含反复冻融、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂破碎所使用的微生物细胞；这样的方法是本领域技术人员所熟知的。

本发明的组合物和方法可包含给药本文所提供的多核苷酸和/或氨基酸。例如，治疗胶质母细胞瘤可包含给药一个或多个多核苷酸和/或氨基酸。所述一个或多个多核苷酸和/或氨基酸可以是分离的形式或者可以是包含病毒颗粒的组合物的一部分。在各种实施方式中，可采取以下形式给药：皮内、透皮、肠胃外、血管内、静脉内、肌内、鼻内、皮下、局部、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、灌注、灌洗、直接注射、消化道、口腔或颅内给药。给药方式可以取决于

实施例

实施例1：非神经性弹状病毒的鉴定和体外细胞毒性

为了确定体内神经毒性：6至8周龄雌性BALB//C小鼠组(n＝3/组)接受1e7pfu所示病毒的单颅内(IC)注射。IC注射后，每天监测小鼠的不适迹象，包含体重减轻、竖毛、后腿瘫痪和呼吸窘迫。

图1是显示在颅内给药一剂量(1e7pfu)所示病毒之后Balb/C小鼠的存活。用IC注射VSV、马拉巴病毒(MR)或Carajas病毒(CRJ)治疗的动物比对照组动物(PBS)少存活10天，用IC注射Farmington(FMT)、Bahia Grande(BG)和Muir Springs(MS)的所有其它动物IC注射后30天显示100％存活，表明其无神经毒性潜在性。使用Mantel-Cox Log秩次分析比较Kaplan Meier生存曲线(GraphPad Prism)。

除了探索野生型FMT、BG和MS的溶瘤潜力，本发明的作者详细论述了，生产马拉巴病毒(MRB)的嵌合病毒和非神经毒性病毒(例如，BG)将获得具有两个所期望的性能的病毒。将来自BG的糖蛋白调换到MRB中从而产生称为“MRBGG”或“MRB-BG(G)的具有BG糖蛋白的嵌合马拉巴病毒或它们的变体，其包含与SEQID NO:10反向互补的RNA序列。弹状病毒，例如马拉巴病毒，携带它们的反义单链RNA形式的遗传物质。本发明公开的RNA序列对应于编码病毒遗传物质的RNA链，因此与弹状病毒所携带的遗传RNA的反向互补。

马拉巴MGG病毒颗粒的基因组具有编码马拉巴蛋白N、P和L以及马拉巴蛋白M和Bahia Grande G蛋白的开放阅读框。马拉巴蛋白N具有对应于SEQ ID NO:1的序列。马拉巴蛋白P具有对应于SEQ ID NO:2的序列。马拉巴蛋白L具有对应于SEQ ID NO:的3序列。马拉巴蛋白M具有对应于SEQ ID NO:4的序列。BahiaGrande G蛋白具有对应于SEQ ID NO:6的序列。

通过用埃博拉病毒糖蛋白替换出MRB糖蛋白，这时再引入到更减毒的马拉巴载体(Δ51MRB)中产生称为“"马拉巴EBG”或“EBG”的嵌合病毒或其变体从而生产其他嵌合病毒，该嵌合病毒包含与SEQ ID NO:14反向互补的RNA序列(参见图2A)。马拉巴EbG病毒颗粒的基因组具有编码马拉巴蛋白N、P和L以及马拉巴蛋白Δ51和埃博拉病毒G蛋白的开放阅读。马拉巴蛋白N具有对应于SEQ ID NO:1的序列。马拉巴蛋白P具有对应于SEQ ID NO:2的序列。马拉巴蛋白L具有对应于SEQ ID NO:3的序列。马拉巴蛋白Δ51具有对应于SEQ ID NO:的5序列。埃博拉病毒G蛋白具有对应于SEQ ID NO:的8序列。

本发明的作者假设在复制溶瘤弹状病毒中马拉巴EBG变体将增加嵌合病毒的治疗窗口(图2A)，因为先前已经证明具有埃博拉扎伊尔糖蛋白的慢病毒载体假型导致病毒未转导鼠CNS，然而其保留了转导293T癌细胞系的能力(参见Watson，O.J.，Kobinger，G.P.，Passini，M.A.，Wilson，J.M.&Wolfe，J.H.小鼠大脑中具有VSV、埃博拉、Mokola、LCMV或MuLV包膜蛋白的慢病毒载体假型的靶向转导模式，Mol Ther 5，528-537(2002)；和Watson，O.J.，Passini，M.A.&Wolfe，J.H.水泡性口炎病毒糖蛋白假型慢病毒和腺相关病毒5型载体的新生鼠脑中的脉络丛和室管膜的转导，Hum Gene Ther 16，49-56(2005))。

为了测试这些嵌合病毒的杀伤能力，与野生型分离株相比，在2个正常人二倍体细胞系，原代正常人星形细胞(NHA)和原代成纤维细胞(GM38)(图2B和图2C)和CNS肿瘤细胞系SF268、SNB19、U118、U343、SF295、SNB75、SF539和U373的8个平板(图2D至2K)上进行细胞杀伤测定。

从新泽西州卡姆登的国家普通医学科学研究所突变细胞库获得细胞，该细胞在补充10％胎牛血清(Cansera，Etobicoke，安大略省，加拿大)的杜尔贝科改进的伊格尔培养基(Hyclone，洛根，犹他州)中增殖。生活力检测分别用所示细胞系进行，如下：细胞以10000个细胞/孔的密度铺板到96孔板中，在第二天以不同感染复数(0.0001至10pfu/细胞)用野生型马拉巴、野生型FMT、野生型BG、减毒马拉巴、马拉巴EBG或马拉巴BGG进行感染。

48小时温育后，加入Alamar Blue(刃天青钠盐(Sigma-Aldrich公司)至终浓度为20μg/ml。培养6小时后，在573纳米波长读取吸光度。虽然野生型马拉巴对所有的GBM细胞系都有效，但是NHA和GM38都是高度溶解的。相比之下，马拉巴EBG和野生型BG证明以对正常细胞(NHA和GM38)无害的MOI(10pfu)显著选择性地杀伤肿瘤细胞系。嵌合病毒“MRBGG”针对大多数GBM细胞系比马拉巴EBG或野生型BG表现出更大的效能，而在正常成纤维细胞中仍然保持非常安全。野生型FMT表明了最大的治疗指数，在大多数GBM系中具有比得上MRB的效能同时在NHA和GM38原代细胞系中保持高度减活。这表明，将野生型FMT和马拉巴病毒改造成嵌合BG或埃博拉病毒糖蛋白的病毒，当再次针对脑肿瘤细胞系进行检测时，它们表现出有效的且选择性的溶瘤活性。

实施例2：两种马拉巴病毒嵌合体的体内安全性

对在体外未转化的细胞中表现出减毒(见实施例1)的野生型分离株(FMT、BG和MS)和两个嵌合病毒(EBG和MRBGG)进行了测试以确定所观察到的减毒是否转换为体内安全。动物脑内以两个剂量给药，低剂量(1e3pfu)和高剂量(1e7pfu)(图3A)。

发现所有的5个病毒都是安全的，100天治疗后具有100％的动物存活，无持续性感染。在这些剂量下，动物显示与病毒感染一致的短暂的体重减轻和竖毛，但在5至7天后的接种中这些症状消失。与此相反，接受相似IC剂量的野生型或减毒马拉巴和VSV株的所有动物在一周内死于感染。这些动物显示CNS感染的临床症状，快速并逐渐的体重减轻，后腿瘫痪并且在刚死亡之前的大脑中具有显著的病毒滴度(数据未显示)。

用野生型FMT(IC和IV)和嵌合马拉巴病毒(EBG和MRBGG)治疗后3个月，通过动物大脑上的噬菌斑测定确定病毒滴度。使用以5e5个细胞/孔的密度接种于6孔盘的Vero细胞上进行噬菌斑测定。第二天，制备100μl连续稀释的病毒并将其加入到Vero细胞中1小时。病毒吸附后，加入2ml琼脂糖覆盖物(1：11％的琼脂糖：2×OMEM和20％FCS)，次日对噬菌斑进行计数。IC感染后3个月的动物大脑中没有检测到病毒(图3B)。

此外，在大脑中给药高剂量FMT(1e7pfu)和MRBGG(1e7pfu)之后，与盐水注射的对照小鼠相比，没有发现细胞死亡或炎症反应的迹象(图3C)。这与野生型MRB注射的动物显著地不同，野生型MRB注射的动物表现出炎症细胞、稠核、多孔形态显着增加。

虽然FMT、BG或MS的IC治疗没有产生急性毒性，但是在病毒感染之后评估了他们的认知和运动功能数天。在用这3个野生型病毒治疗之前和之后进行运动功能评估(图3D)。IC病毒给药之前在旋转棒装置上测试了Balb/C小鼠的运动功能/性能。小鼠置于旋转棒，每天3个试验，连续4天。给动物0.5分钟来适应装置，以0.1rpm线性方式加速该旋转棒。以分钟计量掉落时延，将动物分为3组。天然的(未注射)、PBS、FMT、马拉巴EBG、BG、MRBGG和MS IC治疗动物后一周评估运动功能。计算平均值的标准误差。具体而言，在注射前一周和注射后一周，模拟感染的动物或病毒感染的动物之间的掉落时延没有显著差别(图3D)。

除了颅内毒性，当用不断升高剂量的病毒静脉内(IV)给药时评价免疫活性小鼠中FMT和MRBGG的毒性(图3E)。耐受高达3e8pfu剂量MRBGG，这表明IV安全性，MRBGG的结果比野生型马拉巴所公开的结果要更安全一个数量级。耐受IV FMT良好，甚至在我们的最高剂量3e9pfu也没有达到LD50，这与先前描述的减毒版马拉巴相当(Brun，J et al.基因改造的马拉巴病毒鉴定为溶瘤弹状病毒，MolTher 18，1440(2010))。大于3e8pfu FMT的动物IV剂量显示短暂的重量减轻和中度竖毛，治疗后5至7天消失(数据未显示)。

实施例3：马拉巴病毒嵌合体的体内功效

可以在胶质母细胞瘤小鼠模型中测定嵌合马拉巴病毒的体内功效。测定了人胶质母细胞瘤细胞系U87MG对病毒感染的体外敏感性。FMT和野生型马拉巴在杀死U87MG细胞方面同样有效，EC 50得分小于0.001感染复数(数据未显示)。马拉巴病毒嵌合体(马拉巴EBG、马拉巴BGG)和BG野生型在体外杀死U87MG细胞方面也都有效，EC 50得分小于0.1感染复数(数据未显示)。

对U87MG胶质瘤细胞进行改造用于生物发光成像后，在无胸腺小鼠中建立脑内U87MG胶质瘤模型，在该模型中检测根据本发明所公开的马拉巴病毒嵌合体的IV功效(图4A至C)。在人脑胶质母细胞瘤移植瘤模型中，通过分别用含有萤火虫荧光素酶(FLUC)的慢病毒转导并感染FLUC质粒对成胶质母细胞瘤U87MG胞进行改造以用于生物发光成像。IC注射U87MG FLUC细胞到CD1裸鼠体内。在约15至21天未处理的CD-1动物发展肿瘤。

IP注射荧光素(Gold Biotechnology Inc)后，使用实时成像IVIS 200系统监测具有表达FLUC肿瘤的动物的肿瘤进展。监测这些动物的不适迹象，包含生存、体重减轻、发病率、竖毛、后腿瘫痪和呼吸窘迫。第一次治疗后3天观察到肿瘤负荷显著减少，第7天(图4A和B)观察到最大功效。然而，到第14天肿瘤开始复发。用马拉巴病毒嵌合体静脉内治疗之后，也观察到死亡时间的延迟(图4C)。有趣的是，所有携带肿瘤的动物中完全清除了马拉巴病毒嵌合体治疗的动物的模型中的脊椎转移瘤。与此相反，用UV灭活病毒治疗的动物到第7天肿瘤负荷显著增加，这时他们开始显示出来自它们的脑肿瘤的神经系统症状。所有IV治疗的动物对治疗有反应，治疗后3/8持久治愈，存活超过100天。

实施例4：探索其他马拉巴病毒嵌合体

水泡性口炎病毒(VSV)是有效的溶瘤弹状病毒。然而，趋向神经性与随后的神经毒性以及高度有效的nAb反应是与VSV治疗相关的问题。固有的神经毒性阻碍其作为临床候选物的考虑。

据认为固有的神经毒性由它的糖蛋白(VSV-G)介导。然而，通过用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒G蛋白(LCMV-G)假型化，通常使用VSV-G的慢病毒载体具有减毒的神经毒性(Beyer et al.,J Virol 76:1488-1495，2002；和Von Lae美国专利公开号2011/025018)。LCMV是被膜的反义RNA病毒沙粒病毒家族的原型成员。本发明的作者假定可以通过用LCMV-G蛋白替换其糖蛋白(马拉巴-G蛋白)来减弱马拉巴病毒的神经毒性。通过用LCMV-G蛋白替换出MRB G糖蛋白产生称为“马拉巴LCMV-G”或“马拉巴LCMV(G)”的嵌合病毒来生产具有LCMV-G蛋白的嵌合马拉巴病毒，其包含与SEQ ID NO:12反向互补的RNA序列(参见图2A)。

马拉巴LCMV-G病毒颗粒的基因组具有编码马拉巴蛋白N、P和L以及马拉巴蛋白M和LCMV-G蛋白的开放阅读框。马拉巴蛋白N具有对应于SEQ ID NO:1的序列。马拉巴蛋白P具有对应于SEQ ID NO:2的序列。马拉巴蛋白L具有对应于SEQ ID NO:3的序列。马拉巴蛋白M具有对应于SEQ ID NO:4的序列。LCMV-G蛋白具有对应于SEQ ID NO:7的序列。

按如下进行马拉巴嵌合病毒的制造和拯救：通过标准DNA克隆方法修饰编码野生型重组马拉巴病毒基因组的质粒(Brun et al.,2010)使得马拉巴糖蛋白序列替换为来自Bahia Grande病毒、白细胞的脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或Farmington病毒的糖蛋白序列。简要地说，通过基于PCR的直接突变将NotI限制位点引入到马拉巴G序列的终止密码子之后。在M和G蛋白序列之间，使用这种新引进的NotI位点和现有的KpnI位点，通过限制性消化去除马拉巴G产生PMRB(-G)-KpnI/NotI。设计扩增Farmington和Bahia Grande的糖蛋白序列的引物从而引入5'KpnI和3'NotI限制站点。这些序列通过PCR扩增并连接到PMRB(-G)-KpnI/NotI位。合成(整合DNA技术，Coralville，IA)具有引入的5'KpnI和3'NotI位点的LCMV糖蛋白前体序列(GenBank EF164923.1)。将DNA片段连接到上述PMRB(-G)-KpnI/NotI成为PMRB-LCMV-G，PMRB-BG-G和PMRB-FMT-G。

此外，用马拉巴糖蛋白替换野生型Farmington糖蛋白来改造Farmington病毒的重组基因组，如PCT申请号PCT/CA2012/050385中所述，并以类似的方式产生上述马拉巴蛋白变体。

使用先前描述的技术由上述改造的马拉巴基因组质粒生成重组马拉巴病毒颗粒[MRBGG，MRB FMTG，MRB LCMVG](Brun et al.,2010)。简言之，用T7RNA聚合酶表达痘苗病毒以10MOl感染A549细胞1.5小时。随后通过具有上述改造的重组马拉巴基因组质粒和编码马拉巴N、P和L蛋白的pCI-Neo构建体的脂质体2000转染细胞。转染48小时后除去培养基，用0.2μM过滤器过滤，滤液用于感染SNB19细胞。48小时后在成功拯救中观察到细胞病变效应，然后在Vero细胞上空斑纯化病毒三次。以如上类似的方式产生FMT-MRB-G病毒，所不同的是初始转染含有PFMT-MRB-G和编码Farmington N、P和L蛋白的PCI-Neo构建体。

在放大试验之前，在蔗糖垫层上重组病毒经过三轮空斑纯化(在SNB19细胞上)并重悬于含有15％葡萄糖的PBS。

在胶质母细胞瘤(星形细胞瘤)细胞(U87MG、SF268、U118、U373、U343、SNB19、2个原代患者GBM细胞样品)的平板上进行各种病毒的相对细胞毒性测定。所示细胞系接种到96孔板上(1e4细胞/孔)。第二天用不同MOI(PFU 0.0001至10/细胞)所示病毒感染细胞：野生型BG、野生型FMT、VSV LCMVG(“VSV(LCMVG”)，MRB BGG(“MRB(BGG)”)或MRB LCMVG(“MRB(LCMV G)”)。6小时培养后，将Alamar Blue(刃天青钠盐(Sigma-Aldrich公司))加入，终浓度为20μg/ml。6小时温育后，在波长为573纳米处读取吸光度。对细胞代谢活力制图，测定感染复数(MOI)EC50值，然后在如下范围内进行打分：1＝MOI<0.01；2＝MOI<0.1；3＝MOI<1；4＝MOI<10；5＝MOI>10；6＝抗性。对于每个病毒，绘制所有8个胶质瘤系的EC50得分的平均值的图(图5)。相对于MRBBG和VSV-LCMVG嵌合体或野生型非神经毒性BG和FMT病毒，该MRB-LCMVG嵌合体显示最低EC50值(因此就针对脑癌细胞系的溶瘤活性而言为最高功效)。

实施例5：其他弹状病毒嵌合体的体内安全性

为了确定体内神经毒性：6至8周龄雌性BALB//C小鼠组(n＝2～10/组)接受1e7pfu所示病毒的单颅内(IC)注射。给药全身麻醉剂(异氟烷)后，通过修刮头部，应用洗必泰消毒头皮，用抗生素软膏覆盖眼睛和对耳朵进行局部麻醉剂制备用于外科手术的小鼠。然后将小鼠放置到立体安装并固定使用的耳棒上。用手术刀片制作头皮中线向下0.5cm的切口以暴露颅骨顶部。使用一次性23G针头，在冠状缝之上大约0.5mm距矢状缝2mm的颅骨右侧之上制作孔。10μL汉密尔顿玻璃注射器装载用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的病毒，并安装在立体定位注射泵上。针头插入到4mm深度，30秒后抽回0.5mm。然后，该病毒(剂量1e7pfu)以5μL/分钟的速率灌注到大脑中。经过随后30秒的等待时间，将针头抽回，用兽用粘合剂将头皮胶合，使动物在婴儿培养箱中从全身麻醉中恢复。手术后小鼠接受后续疼痛控制(丁丙诺啡)72小时，在这段时间内每12小时测量体重以及进行健康评估。

图6A显示单IC剂量(1e7pfu)所示病毒后BALB/c小鼠的Kaplan Meier存活曲线。使用Mantel Cox Log秩次分析(Graphpad Prism)比较存活曲线。用野生型马拉巴病毒(MRB-WT)或具有马拉巴-G蛋白的嵌合Farmington病毒(FMT-MRB(G))IC注射的动物存活小于10天，而用野生型Farmington(FMT-WT)、马拉巴LCMV-G和马拉巴BGG IC注射的动物在IC注射30天后显示100％存活，表明无神经毒性潜在性。

具有Farmington G蛋白的嵌合马拉巴病毒(MRB-FMT(G))在IC注射30天后显示不到100％存活，但与对照相比生存提高。由于两只老鼠由于体重损失而被早期安乐死，用MRB-FMT(G)嵌合体治疗的动物显示中间存活率。

当病毒在宿主细胞中时，该MRB-FMT(G)病毒颗粒产生包含SEQ ID NO:15的cDNA多核苷酸。该MRB-FMT(G)病毒颗粒包含与SEQ ID NO:16反向互补的RNA序列。MRB-FMT(G)病毒基因组具有编码马拉巴蛋白N、P和L以及马拉巴蛋白M和Farmington G蛋白的开放阅读框。马拉巴蛋白N具有对应于SEQ ID NO:1的序列。马拉巴蛋白P具有对应于SEQ ID NO:2的序列。马拉巴蛋白L具有对应于SEQ ID NO:3的序列。马拉巴蛋白M具有对应于SEQ ID NO:4的序列。Farmington G蛋白具有对应于SEQ ID NO:17的序列。

当病毒在宿主细胞中时，FMT-MRB(G)病毒颗粒产生包含SEQ ID NO:18的cDNA多核苷酸。FMT-MRB(G)病毒颗粒包含与SEQ ID NO:19反向互补的RNA序列。FMT-MRB(G)病毒基因组具有编码Farmington蛋白N、P和L以及Farmington蛋白M和马拉巴-G蛋白的开放阅读框。Farmington蛋白N具有对应于SEQ ID NO:20的序列。Farmington蛋白P具有对应于SEQ ID NO:21的序列。Farmington蛋白L具有对应于SEQ ID NO:22的序列。Farmington蛋白M具有对应于SEQ ID NO:23的序列。马拉巴-G蛋白具有对应于SEQ ID NO:24的序列。

图6B显示相应的体重变化。治疗后3至5天，所有动物显示最初的体重下降。在用IC注射野生型FMT或嵌合体MRBGG或MRB LCMVG治疗的动物中体重下降是暂时的，在治疗后20至25天之间动物恢复初始体重。由用嵌合体MRB FMTG治疗的组剩下的三只动物在同一时期显示中等程度的体重恢复。

图6A和6B表示(i)Farmington病毒，非神经毒性病毒，可以通过用来自神经毒性病毒，马拉巴病毒的野生型G蛋白替换其G-蛋白将其制成神经毒性的病毒；(ii)马拉巴病毒，神经毒性病毒，通过用来自非神经毒性病毒的任何G蛋白替换其G-蛋白都不能将其制成非神经毒性的病毒，因为来自Farmington病毒的G-蛋白的替换未赋予非神经毒性(要清楚，马拉巴病毒是通过用特定的非神经毒性G-蛋白替换其G蛋白来将其制成非神经毒性的)。

实施例6：根据本发明的马拉巴嵌合病毒和对照病毒的体内功效

也可以在小鼠胶质母细胞瘤模型中测定嵌合病毒在体内的功效。如上所述，六至八周龄CD-1裸鼠颅内注射1e6U87MG-Fluc细胞(用表达萤火虫荧光素酶的慢病毒转导人胶质母细胞瘤细胞)。一周后，使用体内成像系统(Xenogen IVIS 200成像系统，Caliper Life Sciences)对小鼠成像并打分以便五个组具有相似的来自它们大脑中已移植生长的肿瘤的萤火虫荧光素酶表达水平。简言之，用异氟烷将小鼠麻醉，注射荧光素溶液(2mg/小鼠)并放入IVIS机器中。使用制造商的软件(LivingCaliper Life Sciences)进行图片拍摄和荧光定量。按照来自曝光的背景信号将每只小鼠的肿瘤信号标准化。该预处理值被赋值为100％，所有后续值与该起始点进行比较。如先前所描述的，第二天再次用所示病毒(剂量1e7pfu或磷酸盐缓冲盐水作为对照)立体定位注射小鼠。每隔五周，对小鼠进行IVIS成像一周，在此期间，由于批准的肿瘤相关的健康指标，按机构准则对小鼠处以人道的安乐死。

图7A是显示根据本发明的马拉巴嵌合体相对于对照病毒的体内功效的图。该图显示用U87MG治疗肿瘤后CD-1裸鼠的Kaplan Meir存活曲线。用FMT-MRB(G)和MRB-FMT(G)治疗的动物IC注射后存活20天以上，但少于30天。用PBS治疗的动物IC注射后在死于它们的肿瘤之前存活约30天。用MRB-BGG治疗的动物在IC注射后30天显示50％的存活率。用野生型的BG治疗的动物在IC注射后30天显示超过75％的存活率。用MRB-LEMV(G)、VSV-LEMV(G)和FMT-WT治疗后的动物在IC注射后30天显示100％存活。图7B是图7A的动物的体重变化的曲线图。所有动物在治疗3至5天后显示最初体重减轻。在用IC注射野生型FMT、BG或嵌合MRB LCMVG或VSV LCMVG治疗的动物中，体重下降是暂时的，在治疗后20天动物恢复初始体重。在同一时间段用嵌合体MRB FMTG或FMTMRBG或PBS对照治疗的动物没有显示任何体重恢复。详细的结果示于图8至15。

图8A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示人类U87MG移植瘤模型中PBS对照的体内疗效。该图像显示治疗前和治疗后(1周、2周、3周、4周)的肿瘤。图8B是波动曲线图，该图证明随着时间的推移未治疗的对照动物的肿瘤荷载显著增加。

图9A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示人类U87MG移植瘤模型中BG野生型(BG-WT)病毒治疗的体内疗效。该图像显示BG治疗(1剂量1e7pfu：IC)后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。图9B是波动曲线图，显示响应于IC剂量(1e7pfu)的BG初始中等程度肿瘤消退，其后肿瘤负荷复发。

图10A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中FMT野生型(FMT-WT)病毒治疗的体内疗效。该图像显示FMT-WT(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。图10B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的FMT-WT(1e7pfu)的显著的肿瘤消退。

图11A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRB BG(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB BG(G)(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。图11B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的MRB BGG(1e7pfu)中等程度肿瘤消退。

图12A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRB FMT(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB FMT(G)(1剂量1e7pfu)治疗后(1周、2周、3周)的U87MG肿瘤。图12B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的MRB FMT G显著的肿瘤消退。然而，在治疗后4周之前，所有的动物都死于MRBFMT(G)治疗的神经毒性作用。

图13A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中FMTMRB(G)治疗的体内疗效。该图像显示FMT MRB(G)(1剂量1e7

pfu：IC))治疗后(1周、2周、3周)的U87MG肿瘤。图13B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量的FMT MRB(G)显著的肿瘤消退。然而，在治疗后4周之前，所有的动物都死于FMT MRB(G)治疗的神经毒性作用。

图14A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中VSV-LCMV(G)治疗的体内疗效。该图像显示VSV LCMV(G)(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。图14B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量(1e7pfu)的VSV-LCMV(G)的显著的肿瘤消退。

图15A是U87MG肿瘤的IVIS图像，其显示在人类U87MG移植瘤模型中MRB LCMV(G)治疗的体内疗效。该图像显示MRB LCMV G(1剂量1e7pfu：IC)治疗后(1周、2周、3周、4周)的U87MG肿瘤。图15B是波动曲线图，其显示响应于IC剂量(1e7pfu)的MRB-LCMV(G)的显著的肿瘤消退。

实施例7：:响应马拉巴嵌合病毒的中和抗体

如先前描述的(溶瘤的水泡性口炎病毒株的增殖、纯化和体内检测，J-S Dialloet al.,溶瘤病毒：方法和规程，分子生物学方法，第797卷(2012))，进行针对所示病毒的中和抗体的存在的定量分析。

简单地说，在第0天从6至8周龄的雌性Balb/c小鼠中采集50μL隐静脉血到肝素包被管中，离心，去除血清。随后，每组3只动物通过尾静脉注射静脉内注射1e7pfu所示病毒。在第7天再次取小鼠的血，然后以与第0天同样的方式进行注射。在第14天通过末端心脏穿刺最后一次取小鼠的血。从96孔板的一边到另一边以1/50的初始稀释度开始以1：2连续稀释来自每只动物、三个时间点(0，7，14天)的每一个时间点的血清。含有血清的每一个孔与2.5e4pfu/孔所注射的病毒孵育一个小时，初始血清稀释为1/100。然后，将血清和病毒的混合物加入到前一天用1.25e4Vero细胞/孔接种的96孔板中。两天后，用显微镜对单层进行评估以确定细胞病变效应(CPE)。最低稀释度测定特定样品的中和抗体滴度，在最低稀释度50％CPE是明显的。

图16是显示用减毒的VSV(VSV-Δ51)或野生型马拉巴病毒(MRB-WT)、VSV-LCMV(G)或马拉巴-LCMV(G)嵌合体病毒治疗的Balb/C小鼠中的中和抗体滴度的图。野生型和MRB VSVΔ51(减毒)引起显著的中和抗体滴度，而相应的嵌合体的VSV-LCMV(G)和MRB-LCMV(G)未引发中和抗体响应。还进行了来自14天小鼠的血清的相互激发。用MRB-LCMV(G)、VSV-LCMV(G)、VSV-Δ51(减毒)和野生型MRB分别激发收集自野生型MRB、VSVΔ51(减毒)、VSV-LCMV(G)、MRB-LCMV(G)中的每一个的血清。在所有情况下中和抗体反应并不明显。

实施例8：生产细胞中的嵌合病毒滴度

为了制造所示的病毒，将每个以感染复数为0.01接种到40个15cm具有Vero细胞融汇单层的塑料组织培养板中。20小时后，收集培养基，纯化病毒，依照Diallo et al.2012测定滴度。计算产率，每个LCMV(G)嵌合体与其亲本野生型进行比较。当与其亲本菌株相比时，MRB-LCMV(G)病毒产生比VSV-LCMV多达超过2倍的病毒(VSV-LCMVG与野生型VSV的滴度比为0.028；相比较，MRB-LCMV(G)与野生型MRB的滴度比为0.067)。

在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节以便彻底理解这些实施例。然而，这些实施例。对本领域技术人员来说是显而易见的，这些特定的细节不是必需的。上述实施例旨在仅是示例性的。本领域的技术人员可以对特定的实施例进行修改、修饰和变型，而不脱离由所附的权利要求唯一所限定的的范围。

Claims

1.分离的病毒颗粒，其具有包含编码如下蛋白的开放阅读框的基因组：

具有包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白或其变体；

具有包含SEQ ID NO:2的序列的蛋白或其变体；

具有包含SEQ ID NO:3的序列的蛋白或其变体；

具有包含SEQ ID NO:4或5的序列的蛋白或其变体；以及

具有包含SEQ ID NO:6、7或8的序列的蛋白。

2.根据权利要求1所述的分离的病毒颗粒，其中参照蛋白的变体为具有如下序列的蛋白，所述序列与所述参照蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性，并且变体蛋白保持与参照蛋白相同的生物功能。

3.根据权利要求1所述的分离的病毒颗粒，其中所述基因组包含编码具有包含SEQ ID NO:6的序列的蛋白的开放阅读框。

4.根据权利要求1所述的分离的病毒颗粒，其中所述基因组包含编码具有包含SEQ ID NO:7的序列的蛋白的开放阅读框。

5.根据权利要求1所述的分离的病毒颗粒，其中所述基因组包含编码具有包含SEQ ID NO:8的序列蛋白的开放阅读框。

6.根据权利要求1所述的分离的病毒颗粒，其中病毒基因组包含编码如下蛋白的开放阅读框：

具有包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白；

具有包含SEQ ID NO:2的序列的蛋白；

具有包含SEQ ID NO:3的序列的蛋白；

具有包含SEQ ID NO:5的序列的蛋白；以及

具有包含SEQ ID NO:7的序列的蛋白。

7.分离的病毒颗粒，包含具有包含如下序列的序列的RNA多核苷酸：

由SEQ ID NO:10的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:10的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:10的第4943至11272位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:10的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:10的第3041至4816位所限定的序列的反向互补序列；以及

其启动子的反向互补序列。

8.根据权利要求8所述的分离的病毒颗粒，其中核苷酸序列的保守变体为与参照核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

9.根据权利要求8所述的分离的病毒颗粒，其中保守变体为包含一个或多个沉默置换的序列。

10.分离的病毒颗粒，当所述病毒在宿主细胞中时能够产生包含根据SEQ ID NO:9的序列的cDNA多核苷酸。

11.分离的病毒颗粒，包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含根据SEQ IDNO:10的序列。

12.分离的病毒颗粒，包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：

由SEQ ID NO:12的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:12的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:12的第4664至10993位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:12的第2256至2945位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:12的第3041至4537位所限定的序列的反向互补序列；以及

其启动子的反向互补序列。

13.根据权利要求12所述的分离的病毒颗粒，其中核苷酸序列的保守变体为与参照核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

14.根据权利要求12所述的分离的病毒颗粒，其中保守变体为包含一个或多个沉默置换的序列。

15.分离的病毒颗粒，当所述病毒在宿主细胞中时能够产生包含根据SEQ ID NO:11的序列的cDNA多核苷酸。

16.分离的病毒颗粒，包含根据SEQ ID NO:12的序列的RNA多核苷酸。

17.分离的病毒颗粒，包含RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有包含如下序列的序列：

由SEQ ID NO:14的第64至1332位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:14的第1393至2190位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:14的第5195至11524位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:14的第2256至2942位所限定的序列的反向互补序列或其保守变体；

由SEQ ID NO:14的第3038至5068位所限定的序列的反向互补序列；以及

其启动子的反向互补序列。

18.根据权利要求17所述的分离的病毒颗粒，其中核苷酸序列的保守变体为与参照核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。

19.根据权利要求17所述的分离的病毒颗粒，其中保守变体为包含一个或多个沉默置换的序列。

20.分离的病毒颗粒，当所述病毒在宿主细胞中时其能够产生包含根据SEQ ID NO:13的序列的cDNA多核苷酸。

21.分离的病毒颗粒，包含根据SEQ ID NO:14的序列的RNA多核苷酸。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的分离的病毒颗粒在治疗癌症中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述癌症为脑癌。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述脑癌为胶质母细胞瘤。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的用途，其中所述分离的病毒颗粒用于感染细胞，感染的细胞用于治疗癌症。

26.根据权利要求1至21中任一项所述的分离的病毒颗粒在被给药所述病毒的人中诱导细胞毒性应答的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述细胞毒性应答为抗癌应答。

28.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述分离的病毒颗粒用于感染细胞，并且感染的细胞用于产生细胞毒性应答。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的用途，其中所述分离的病毒颗粒被配制为直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述分离的病毒颗粒被配制为通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何组合给药。

31.根据权利要求25或28所述的用途，其中所述感染的细胞被配制为直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述感染的细胞被配制为通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何组合给药。

33.用于治疗癌症的方法，包含向患有癌症的患者给药根据权利要求1至21中任一项所述的分离的病毒颗粒。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症为脑癌。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述脑癌为胶质母细胞瘤。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中向所述患者直接给药所述分离的病毒颗粒。

37.根据权利要求36所述的方法，其中向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述分离的病毒颗粒。

38.根据权利要求37所述的方法，其中通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向所述患者给药所述分离的病毒颗粒。

39.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中用所述分离的病毒颗粒感染细胞，并向所述患者给药感染的细胞。

40.根据权利要求39所述的方法，其中向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述感染的细胞。

41.根据权利要求39所述的方法，其中通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向所述患者给药所述感染的细胞。

42.用于诱导患者的细胞毒性应答的方法，所述方法包含向所述患者给药根据权利要求1至21中任一项所述的分离的病毒颗粒。

43.根据权利要求42所述的方法，其中向所述患者直接给药所述分离的病毒颗粒。

44.根据权利要求43所述的方法，其中向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述分离的病毒颗粒。

45.根据权利要求44所述的方法，其中通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向所述患者给药所述分离的病毒颗粒。

46.根据权利要求43所述的方法，其中用所述分离的病毒颗粒感染细胞，并向所述患者给药感染的细胞。

47.根据权利要求46所述的方法，其中向中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合直接给药所述感染的细胞。

48.根据权利要求47所述的方法，其中通过鞘内注射、静脉注射、经颅内注射或它们的任何同时或连续的组合向所述患者给药所述感染的细胞。

49.用于治疗患者的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：

根据权利要求1至21中任一项所述的分离的病毒颗粒；和

向所述患者给药所述分离的病毒颗粒的使用说明书。

50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述癌症为脑癌。

51.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述脑癌为胶质母细胞瘤。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的试剂盒，其中所述分离的病毒颗粒被配制为直接递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述分离的病毒颗粒被配制为通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续组合给药。

54.根据权利要求59至51中任一项所述的试剂盒，其中将所述分离的病毒颗粒配制为用于感染细胞，且所述细胞用于被递送到中枢神经系统、血/脑屏障外、血/脑屏障内或其任何组合。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中所述细胞用于通过鞘内注射、静脉注射、颅内注射或它们的任何同时或连续的组合给药。