CN104946652A - 植物雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物的克隆及应用。本发明提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体。本发明公开了获得相应宿主菌和转化子的方法，并且，本发明将所获得的启动子、表达盒以及植物表达载体应用于植物基因工程中。本申请的发明人通过对水稻品种日本晴的特定基因组进行扩增、分离、分析、利用以及实验验证，从而获得并验证了具有特殊功能的一段DNA序列——水稻雌蕊特异性表达启动子OsPis1。本发明提供的启动子能够特异地驱动外源基因在水稻雌蕊中表达，因此在基因工程中用该启动子替代组成型启动子驱动目标基因，既可以特异性的表达目的基因，又将避免其它基因的无效表达，降低新陈代谢负担，从而达到改良水稻品质的作用。

Description

植物雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达。

背景技术

高等植物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的表达模式和表达强度。用组织特异表达启动子来驱动目的基因表达可有效地避免用组成型启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。因此，如何让外源基因在植物体内定向、高效、稳定的表达是植物基因工程研究的出发点和落脚点，深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重要意义。

由于植物的果实和种子是人类食物的主要来源，它们都是植物生殖器官发育的产物，而植物生殖发育的关键是花的形成，因此，对植物生殖器官尤其花的发育分子遗传的研究显得尤为重要。高等植物发育形成花器官的过程需要许多基因的协同表达。

水稻是非常重要的粮食作物之一，亦是功能基因组学研究的模式植物。水稻作为模式单子叶植物，是单子叶植物生殖器官发育研究的主要对象。尽管目前水稻等单子叶植物中均已经分离了多个决定花器官分化与发育的MADS-box基因和非MADS-box基因，但与双子叶植物相比，目前水稻等单子叶植物生殖器官即花发育分子遗传基础研究相对落后。因此，开展水稻等单子叶植物生殖器官特异表达启动子的遗传研究十分必要。

但是，目前人们对于生殖器官特异表达启动子的研究还不够深入，目前所开发出的生殖器官特异表达启动子种类非常有限，远远不能够满足科研人员在改良水稻品种过程中对启动子的需求。

发明内容

针对上述问题，本研究的目的就是从水稻中分离克隆生殖器官特异表达启动子，用于在雌蕊中特异性表达的一些功能基因或结构基因，为转基因水稻育种服务，来达到品种改良的目的，为长远的启动子改造和设计储备资源。而且，本发明希望获得一种分离鉴定本底信号低、特异性高的新型启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。

一方面，本发明提供一种水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1，其特征在于，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1提取自水稻属植物。

在一种优选实现方式中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1包含：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与含有1)中的DNA序列杂交后具有启动子功能的DNA序列；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有70％-75％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

4)与1)或2)限定的DNA序列具有75％-80％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

5)与1)或2)限定的DNA序列具有80％-85％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

6)与1)或2)限定的DNA序列具有85％-90％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

7)与1)或2)限定的DNA序列具有90％-95％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

8)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

9)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；

10)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；

11)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

在一种优选实现方式中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1提取自日本晴水稻。

另一方面，本发明提供一种含有所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1的重组表达载体或表达盒。

在一种优选实现方式中，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1连接于载体中待表达的基因序列的上游

在一种优选实现方式中，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。

另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将包含所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1、所述的重组表达载体、或所述的表达盒转入根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1转入第一菌种中，利用转入了所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1的第一菌种和植物载体构建植物表达载体，再将所述植物表达载体转入到作为受体菌的第二菌种中，并利用转化后的所述第二菌种获得转基因植物细胞、组织或植株。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的22bp“cagtgacaac gacgcagcag ag”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的22bp“ac gaacgacaac atgagcacca”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)OsPis1基因上游包括转录起始位点在内的1890bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsPis1。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株的雌蕊部位Gus基因表达水平提高，从而证明该1890bp的序列具有驱动基因在雌蕊部位特异性表达的活性。

本发明所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的雌蕊部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。因此，本发明的启动子可以替代组成型启动子。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsPis1能够调控基因在水稻雌蕊中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsPis1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsPis1示意图，其中示出了利用OsPis1启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为12周苗龄的OsPis1::GUS转基因植株组织染色图。在根、茎、叶、鞘组织中均没有观察到代表GUS活性的蓝色，而在花中，仅在雌蕊中有蓝色出现，而颖壳、雄蕊中也都没有表现出GUS活性(标尺＝2.5mm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的OsPis1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsPis1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，反向引物(SEQID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GAATTCCAGTGACAACGACGCAGCAGAG EcoRI

反向引物：GAATTCTGGTGCTCATGTTGTCGTTCGT EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsPis1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsPis1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1890bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用EcoRI进行酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsPis1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsPis1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用EcoRI酶切，回收启动子OsPis1片段。同时利用EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsPis1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsPis1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsPis1，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsPis1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗3-6遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养10-15天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsPis1::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based onphOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativaL.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

将转化OsPis1启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花器官分别进行GUS染色：将各组织分别浸于GUS染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基因在转基因水稻幼穗的小花显现出可明显观测到蓝色，且小花中只有雌蕊被染色而雄蕊则没有；在雌蕊的放大图中可以看出，在柱头和子房均被染成蓝色。另外，在其它各器官(根、茎、叶片和叶鞘)中，均没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的雌蕊中指导其下游的GUS蛋白表达，这种表达具有雌蕊组织表达特异性。因此，本发明的启动子能够替代组成型启动子，在转基因植物培育中既能改善植物的生殖特性，又能避免给植物带来过多的代谢负担。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1，其特征在于，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1提取自水稻属植物。

2.根据权利要求1所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1包含：

1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与含有1)中的DNA序列杂交后具有启动子功能的DNA序列；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有70％-75％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

4)与1)或2)限定的DNA序列具有75％-80％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

5)与1)或2)限定的DNA序列具有80％-85％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

6)与1)或2)限定的DNA序列具有85％-90％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

7)与1)或2)限定的DNA序列具有90％-95％的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

8)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA序列；或者

9)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

10)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

11)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1，其特征在于，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1提取自日本晴水稻。

4.一种含有权利要求1-3之一所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1的重组表达载体或表达盒。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入权利要求1-3之一所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1连接于载体中待表达的基因序列的上游。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。

7.一种获取用于转基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将包含权利要求1-3之一中所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1、权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的表达盒转入根癌农杆菌。

8.一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1转入第一菌种中，利用转入了所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1的第一菌种和植物载体构建植物表达载体，再将所述植物表达载体转入到作为受体菌的第二菌种中，并利 用所述第二菌种获得转基因植物细胞、组织、器官或植株。

9.一种根据权利要求1-3之一中所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1-3之一中所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPis1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。