CN104911123B - 一株乳酸片球菌p3-4及其筛选鉴定和在降解红霉素、罗红霉素中的应用 - Google Patents

一株乳酸片球菌p3-4及其筛选鉴定和在降解红霉素、罗红霉素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株乳酸片球菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10574，通过采用微生物方法与化学方法相结合的方式建立了筛选乳酸菌的新方法，通过抗生素选择培养基初筛以及复筛，从土壤中筛选出一株具有红霉素、罗红霉素降解作用的乳酸菌。建立合理、有效的红霉素、罗红霉素降解菌株的筛选方法，得到适合需要的乳酸菌株，通过乳酸菌的分离纯化以及筛选；降解红霉素、罗红霉素乳酸菌的初筛及复筛工作，筛选得到安全有效的红霉素、罗红霉素降解菌株。应用于红霉素、罗红霉素污染的治理，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低的优点。为微生物治理复杂环境的抗生素污染提供更多选择。

Description

一株乳酸片球菌P3-4及其筛选鉴定和在降解红霉素、罗红霉 素中的应用
技术领域
本发明涉及一株微生物、筛选鉴定及应用，特别涉及一株乳酸片球菌P3-4及其筛选鉴定和在降解红霉素、罗红霉素中的应用，属于微生物的检测及应用技术领域。
背景技术
乳酸菌主要分布于矿物质和有机营养物丰富的微酸环境中，奶制品、肉制品、泡菜、果酒、蔬菜等材料中都富含乳酸菌，此外，动物消化道等也是乳酸菌的重要来源。乳酸菌对动物的营养和健康有重要作用，具有抑菌消炎，抗氧化，抗肿瘤，降低胆固醇，提高免疫力等功效。
大环内酯类抗生素对革兰氏阳性菌和支原体具有突出的抗菌活性，已广泛用于畜牧业中，其在动物性食品中药物残留较为普遍，高残留会对人类造成致敏性、毒性反应，尤其是敏感个体。长期使用，会改变人类肠道菌群的微生态环境，造成人体肠道细菌菌群失调，同时易产生细菌抗药性。由于其对人体的潜在危害，包括中国在内的许多国家都已对大环内酯类药物在动物源性食品中的最高残留限量做出规定。
微生物的降解作用是食品中药物分解与转化的重要途径，利用微生物治理药物污染是一种行之有效的方法，已显示出良好的应用前景。
本研究旨在筛选一种能降解大环内酯类兽药残留的乳酸菌株，为微生物治理复杂环境的抗生素污染提供更多选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对以上不足，提供一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4及其在降解红霉素、罗红霉素中的应用，实现以下目的：
1、通过筛选能够降解红霉素、罗红霉素的菌株；建立合理有效的降解红霉素、罗红霉素菌株的筛选方法。
2、应用于被抗生素污染的土壤和其他环境中，提高治理抗生素污染的效率，减少二次污染，降低成本。
3、为微生物治理复杂环境的红霉素、罗红霉素污染提供更多选择。
4、提供高效降解红霉素、罗红霉素的安全、有效、经济的工程菌产品。
5、应用于被抗生素污染的土壤和其他环境中，提高治理红霉素、罗红霉素污染的效率，减少二次污染，降低成本。
该菌株于2015年3月6日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.10574，分类命名：乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10574。
基于以上所述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4，本发明提供一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4在降解红霉素、罗红霉素中的应用。
基于以上所述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4，本发明提供一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：乳酸菌的分离纯化；
步骤b：乳酸菌的筛选；
步骤c：降解抗生素的乳酸菌的筛选；
步骤d：乳酸菌对抗生素降解能力的检测。
一种优化方案，所述步骤a包括：称取样品25g，加入225ml MRS液体培养基，37℃培养48h，混合均匀后分别用微量移液器吸取1ml培养液用生理盐水稀释10-1-10-6六个梯度，取10-4、10-5、10-6三个浓度各0.1ml涂布MRS平板，37℃培养24h，挑取单菌落纯化。
进一步地，所述步骤b包括：采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液中的乳酸含量；
挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37℃培养48h后，取发酵液5mL，8000r/min离心10min，除去菌体，加入5mL 0.01mol/L的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸钙，以0.22µm的滤膜过滤，取1mL滤液稀释10倍即得到待测液供上机检测，用HPLC方法测定乳酸含量；
将检测到产生乳酸的纯化后菌落进行革兰氏染色镜检和过氧化氢实验，选取革兰氏阳性过氧化氢酶阴性菌为所需乳酸菌并保存。
进一步地，所述步骤c包括：取1 mL富集培养液分别接种于含2 mg/L不同抗生素的新鲜液体培养基，37℃培养；待抗生素选择培养基浑浊后，从中取1 mL培养液接种于含3mg/L抗生素的液体培养基中，逐级类推提高抗生素浓度；
根据菌体对各抗生素耐受程度的不同，选取较高浓度的耐受生长条件进行多次驯化培养；
用接种环取最高耐受浓度培养物划线接种于含相应抗生素的固体平板上，37℃培养24-72 h；
根据平板菌落形态挑取单菌落再接种至液体抗生素选择培养基进行验证，循环三次，以获得抗生素耐受能力较好的纯菌株。
进一步地，所述步骤d包括：将筛选获得的耐抗生素单菌落分别接种于相应的适当浓度的液体抗生素选择培养基中，37℃培养1-7d；
12000r/min离心5min，取上清稀释后用HPLC/MS/MS方法测定抗生素浓度。
经鉴定，测得的基因序列为：
1 aagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccagaagca ggggataaca
61 cctggaaaca gatgctaata ccgtataaca gagaaaaccg cctggttttc ttttaaaaga
121 tggctctgct atcacttctg gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg
181 ctcaccaagg cgatgatgcg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag
241 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc
301 tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc tgttgttaaa
361 gaagaacgtg ggtgagagta actgttcacc cagtgacggt atttaaccag aaagccacgg
421 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg
481 ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtcttttaa gtctaatgtg aaagccttcg gctcaaccga
541 agaagtgcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt
601 agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg
661 taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc
721 atgccgtaaa cgatgattac taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa
781 cgcattaagt aatccgcctg。
本发明采用以上技术方案，具有以下技术效果：
通过采用微生物方法与化学方法相结合的方式建立了筛选乳酸菌的新方法，通过抗生素选择培养基初筛以及复筛，从土壤中筛选出一株具有红霉素、罗红霉素降解作用的乳酸菌。建立合理、有效的红霉素、罗红霉素降解菌株的筛选方法，得到适合需要的乳酸菌株。通过乳酸菌的分离纯化以及筛选；降解红霉素、罗红霉素乳酸菌的初筛及复筛工作，筛选得到安全有效的红霉素、罗红霉素降解菌株。应用于红霉素、罗红霉素污染的治理，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低的优点。为微生物治理复杂环境的抗生素污染提供更多选择。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为乳酸标准品2ppm色谱图；
图2为乳酸标准品与检测样品色谱叠加图；
图3为图2中检测到的乳酸色谱峰图；
图4为菌株P3-4对红霉素的降解效果；
图5为菌株P3-4对罗红霉素的降解效果；
图6为菌株P3-4的Biolog鉴定结果。
具体实施方式
实施例，一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10574。
以上乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4的筛选方法，包括以下步骤：
1 实验材料
1.1实验菌株
样品来源
从潍坊、烟台等地区采集不同地点的土样
1.2实验仪器
立式压力蒸汽灭菌器（日本Hirayama HVE-50）；生物安全柜（XUN BSC-1300ⅡA/B3）；显微镜（OLYMPUS CX21）；高效液相色谱仪（Aglient 1260）；高效液相色谱/质谱/质谱联用仪（Aglient 1260-6430）；分析天平（瑞士Mettler Toledo PL 602-S）；恒温培养箱（德国MMM Incucell 111）；移液枪（德国Eppendorf）；台式高速离心机（德国Eppendorf5417R）；
1.3培养基
MRS肉汤：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM187。称取52.3g粉末加入1L水，加热煮沸至完全溶解。115℃ 高压灭菌15min。
MRS 琼脂：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM188。称取64.25g粉末加入1L水，加热煮沸至完全溶解。121℃ 高压灭菌15min。冷却至46℃左右倒平板或斜面。
2实验方法
2.1乳酸菌的分离纯化及筛选
称取样品25g，加入225 ml MRS液体培养基，37℃培养48 h，混合均匀后分别用微量移液器吸取1ml培养液用生理盐水稀释10-1-10-6六个梯度，取10-410-510-6三个浓度各0.1ml涂布MRS平板，37℃培养24h，挑取单菌落纯化。
采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液中的乳酸含量。挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37℃培养48h后，取发酵液5 mL，8000 r/min离心10 min，除去菌体，加入5 mL 0.01 mol/L 的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸钙，以0.22 µm的滤膜过滤，取1 mL滤液稀释10倍即得到待测液供上机检测，用HPLC方法测定乳酸含量。
将检测到产生乳酸的纯化后菌落进行革兰氏染色镜检和过氧化氢实验，选取革兰氏阳性过氧化氢酶阴性菌为所需乳酸菌并保存。
2.2耐抗生素菌株的筛选及复筛
取1mL富集培养液分别接种于含2mg/L不同抗生素的新鲜液体培养基，37℃培养；待抗生素选择培养基浑浊后，从中取1mL培养液接种于含3mg/L抗生素的液体培养基中，逐级类推提高抗生素浓度。根据菌体对各抗生素耐受程度的不同，选取较高浓度的耐受生长条件进行多次驯化培养。用接种环取最高耐受浓度培养物划线接种于含相应抗生素的固体平板上，37℃培养24-72 h。根据平板菌落形态挑取单菌落再接种至液体抗生素选择培养基进行验证，循环三次，以获得抗生素耐受能力较好的纯菌株。
2.3菌体对抗生素降解能力的检测
将筛选获得的耐抗生素单菌落分别接种于相应的适当浓度的液体抗生素选择培养基中，37℃培养1-7d。12000r/min离心5min，取上清稀释后用HPLC/MS/MS方法测定抗生素浓度。
2.4 菌株鉴定
在MRS平板中挑取菌体于50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板。反应条件：80℃，15 min。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No.RR176），进行PCR扩增目的片段。反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环；72℃5min。
挑取菌种纯培养物单菌落，接种于BUG培养基平板，37℃恒温培养24 h，CO2浓度为6.5%，转接1-2代。在无菌条件下，使用Inoculatorz棉签从BUG平板中沾取直径约3mm的菌落接种于IF-C接种液中，将浊度调整为62-68%。菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，每孔100 µL。微孔板37℃恒温培养16-48 h，使用Biolog GenIII MicroStation自动微生物鉴定系统进行鉴定。
Biolog微生物鉴定系统利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，在BiologGenIII微孔板上对微生物进行94种表型测试（71种碳源利用、23种化学敏感性测试）。通过检测微生物代谢过程中产生的氧化还原物质与四唑类物质（如TTC、TV）发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得出鉴定结果。
3实验结果与分析
3.1乳酸菌的筛选
通过高效液相色谱法对纯化后细菌发酵液中的乳酸的检测，以及革兰氏染色和过氧化氢实验筛选出乳酸菌。检测结果见图1、图2、图3。
3.2耐抗生素菌株的筛选及复筛
通过不同浓度的抗生素的驯化培养，红霉素浓度为3mg/L时，菌株降解能力开始降低，取最高耐受浓度为2mg/L的培养物划线接种于含红霉素的固体平板上进行纯化培养。在罗红霉素浓度为9mg/L时，菌株降解能力开始降低，取最高耐受浓度为8mg/L的培养物划线接种于含罗红霉素的固体平板上进行纯化培养。获得能够降解红霉素、罗红霉素效果较好的乳酸菌株P3-4。进行重点研究。
3.3菌体对抗生素降解能力的检测
随着培养时间的延长，菌株对红霉素的降解能力显著提高，在第一天即达到最高值92.1%，随后降解率平缓下降。如图4所示。菌株对罗红霉素的降解能力逐渐提高，培养至第五天达到最高值68.9%，随后降解率逐渐下降。如图5所示。
3.4菌株鉴定
提取菌株P3-4基因组DNA，扩增其16S rDNA基因序列，进行测序。
使用Biolog GenIII MicroStation自动微生物鉴定系统对菌株P3-4进行鉴定，得出鉴定结果。见图6。
测得的基因序列为：
1 aagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccagaagca ggggataaca
61 cctggaaaca gatgctaata ccgtataaca gagaaaaccg cctggttttc ttttaaaaga
121 tggctctgct atcacttctg gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg
181 ctcaccaagg cgatgatgcg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag
241 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc
301 tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc tgttgttaaa
361 gaagaacgtg ggtgagagta actgttcacc cagtgacggt atttaaccag aaagccacgg
421 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg
481 ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtcttttaa gtctaatgtg aaagccttcg gctcaaccga
541 agaagtgcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt
601 agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg
661 taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc
721 atgccgtaaa cgatgattac taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa
781 cgcattaagt aatccgcctg。
所有上述为这一知识产权的首要实施方法，并没有设定限制以其他形式实施这种新方法和/或新产品。本领域技术人员将利用这一重要信息，对上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法，属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (2)

1.一株用于降解红霉素、罗红霉素的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10574。
2.一种如权利要求1所述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）P3-4在降解红霉素、罗红霉素中的应用。
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