CN104906195B

CN104906195B - 降低尿蛋白的药物及保健品

Info

Publication number: CN104906195B
Application number: CN201510359629.XA
Authority: CN
Inventors: 张庆林; 杨晓曦; 程晓晨; 卢育新
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: CN104906195A

Abstract

本发明提供了一种降低尿蛋白的药物及保健品。该药物由有效量的芡实醇提物及辅料组成，能够显著降低尿蛋白和尿微量白蛋白，可用于治疗各种具有尿蛋白和尿微量白蛋白升高症状的包含糖尿病肾病在内的肾病。

Description

降低尿蛋白的药物及保健品

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体而言，涉及一种降低尿蛋白的药物及保健品。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以胰岛素的分泌相对或绝对缺乏及胰岛生物效应损伤导致的全球性慢性代谢性疾病，其临床的典型特征是高血糖及其引发的各类慢性并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)、糖尿病眼病(白内障、视网膜病变等)、糖尿病足等。其中，糖尿病肾病作为糖尿病最为严重和最为常见的慢性微血管并发症之一，是导致终末期肾功能衰竭(end-stage renal failure，ESRF)的主要原因。近年来，由于人们生活方式和饮食习惯的改变，国内DM与DN的发病率正在以惊人的速度迅速飙升。根据国际糖尿病组织报告，中国现已成为世界第二糖尿病大国，预计至2030年，全球的DM患者也将会超过5.52亿。

DN发病早期其症状并非十分明显，临床中以蛋白尿的产生作为诊断指标，伴随渐进性肾功能损害、高血压、高血脂、水肿等症状，并认为蛋白尿的严重程度与肾脏损伤成正比。事实上，早在DN发病前期，尿微量白蛋白(Urinary microalbumin，UALB)就已经发生，并伴随糖尿病肾病的整个进程，而病程一旦进入到大量蛋白尿时期，此时肾脏的病理损伤已经很难逆转，终将发展为终末期肾脏病。DN的临床病理特征主要表现有：肾小球细胞外基质(Extra cellular matrix，ECM)堆积，肾小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)增厚，系膜细胞扩张，肾小管及小管间纤维化，足细胞消失等。

目前DN的发病机制错综复杂且尚未完全阐明，通常认为是多种机制协同产生作用，如：糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)生成，氧化应激(Oxidative stress，OS)，炎性反应等多种机制。最近越来越多的研究者将研究目标转向OS致病机制，认为活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的产生对DN的发生起到关键作用。在持续性的高血糖状态下，ROS的积累导致脂代谢紊乱，而血脂异常又加速了DN的进展，这就形成一个恶性循环。因此，开发一种能够同时降低血糖和尿蛋白，且具有抵抗ROS能力的药物，对延缓DN的发生发展具深远意义。

既往针对DN的治疗，早期多采取控制血糖、血压和血脂，减少蛋白质摄入等手段延缓病情迅速恶化，此期间主要依靠血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotension convertingenzyme inhibitors，ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(Angiotension receptor blockers，ARBs)类药物进行控制。当病情进入肾脏衰竭时期，只能依靠血液透析或腹膜透析，而患者5年内的存活率仅为43％。肾脏移植被公认为是最为有效的方法，但是由于器官来源及高昂的手术费用等问题，此过程势必会给患者的家庭和整个社会带来沉重的负担。

而且，目前，降尿蛋白的药物多为西药或中药复方药物。西药作用强而迅速，但病人常因为药物毒副作用而被迫停药，停药又致症状反跳。而中药复方药基本上都是由天然中草药经简单的炮制和提取制成的，不仅成分相当复杂、制备不便；而且药效不清，难以深入研究药物的有效成分，不利于药物质量控制和中药现代化。因此，急需开发一种能有效降低尿蛋白且有效成分相对明确的单方中药制剂。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能有效降低尿蛋白且有效成分相对明确的单方中药制剂，以提供一种有效成分相对明确，利于质量控制的降尿蛋白的药物及保健品。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种降低尿蛋白的药物，该药物由有效量的芡实醇提物和辅料组成。

进一步地，芡实醇提物中含有酚类和三萜类物质，且酚类和三萜类物质的质量之和占芡实醇提物总质量的比例大于50％，优选大于60％。

进一步地，酚类物质包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；三萜类物质包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；优选地，芡实醇提物中的酚类和三萜类物质的质量比为1：1～2：1。

进一步地，辅料为载体、赋形剂或佐剂。

进一步地，药物的给药途径为口服给药；优选地，药物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂或悬浮剂。

进一步地，芡实醇提物的制备方法包括：用乙醇对芡实果仁粉进行醇提，得到醇粗提物；用大孔树脂对醇粗提物进行纯化，并用体积含量为20％～80％的乙醇进行洗脱，得到芡实醇提物；其中，大孔树脂选自AB-8、D101、DM-301或HPD-100中的任意一种。

进一步地，以SD大鼠体重计，芡实醇提物的有效剂量为75～600mg/kg。

根据本发明的另一方面，提供了一种保健品，该保健品包含有效量的芡实醇提物。

进一步地，保健品的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂或悬浮剂。

进一步地，芡实醇提物中含有酚类和三萜类物质，且酚类和三萜类物质的质量之和占芡实醇提物的总质量的比例大于50％，优选大于60％。

进一步地，酚类物质包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；三萜类物质包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；优选地，芡实醇提物中，酚类和三萜类物质的质量比为1：1～2：1。

应用本发明的技术方案，提供了一种降低尿蛋白的药物及保健品。该药物由有效量的芡实醇提物及辅料组成，能够显著降低尿蛋白和尿微量白蛋白，可用于治疗各种具有尿蛋白和尿微量白蛋白升高症状的包含糖尿病肾病在内的肾病。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了芡实各提取物的总还原能力的测定结果；

图2示出了芡实各提取物对DPPH清除能力的结果；

图3示出了芡实各提取物对超氧阴离子清除能力的测定结果；

图4示出了芡实各提取物对羟基自由基清除能力的测定结果；

图5A示出了雌性KM小鼠灌胃芡实醇提物后14天内的体重变化情况；其中，图5A表示雌性KM小鼠；

图5B示出了雄性KM小鼠灌胃芡实醇提物后14天内的体重变化情况；

图5C示出了雌性KM小鼠灌胃芡实醇提物后14天内的进食量变化情况；

图5D示出了雄性KM小鼠灌胃芡实醇提物后14天内的进食量变化情况；

图6示出了灌胃12周后各组SD大鼠的肾系数；

图7示出了灌胃12周后各组SD大鼠的尿蛋白水平变化；

图8示出了灌胃12周后各组SD大鼠的微量白蛋白水平变化；

图9A示出了灌胃12周后各组SD大鼠的血糖水平变化；

图9B示出了灌胃12周后各组SD大鼠的血清肌酐水平变化；

图9C示出了灌胃12周后各组SD大鼠的血清尿素氮水平变化；

图9D示出了灌胃12周后各组SD大鼠的甘油三酯水平变化；

图9E示出了灌胃12周后各组SD大鼠的总胆固醇水平变化；

图10示出了灌胃12周后各组SD大鼠的肾脏病理切片图；

图11示出了本发明的一种优选的实施例中芡实醇提物经UPLC-MS分析得到的总离子流图；

图12A至图12D示出了本发明的芡实提取物与现有技术的芡实合剂在抗氧化能力方面的差异；其中，

图12A示出了本发明的芡实各提取物与现有技术的芡实合剂的总还原能力的测定结果；

图12B示出了本发明的芡实各提取物与现有技术的芡实合剂对DPPH清除能力的结果；

图12C示出了本发明的芡实各提取物与现有技术的芡实合剂对超氧阴离子清除能力的测定结果；以及

图12D示出了本发明的芡实各提取物与现有技术的芡实合剂对羟基自由基清除能力的测定结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实验数据来详细说明本发明。

名称简称说明：

Scr(Serum creatinine)血清肌酐；BUN(Blood urea nitrogen)血清尿素氮；TC(Total cholesterol)总胆固醇；TG(Triglyceride)，甘油三酯；BG(Blood glucose)，血糖。

如背景技术部分所提到的，现有技术中治疗糖尿病肾病的药物类型为西药或中药复方药，西药往往伴随着毒副作用，而中药复方药由于成分复杂，药效不清，难以实现有效成分的控制。为改善上述状况，本发明首先通过分光光度计法体外筛选芡实(Euryaleferox)各部位对DPPH、O2^-、OH^-的清除能力及其总还原能力，实验证明芡实醇提物浓度在0.6、0.8、1.0mg/ml时能显示出一定的还原能力，且对各种有害自由基的均显示出相当的清除能力，其中对DPPH自由基的清除功能最为显著，由此说明，芡实醇提物具有较强的抗氧化能力。芡实水提物上清只在较高浓度时展现出较为微弱的还原能力和清除自由基功能，而水提物沉淀并不具有抗氧化的能力。

在上述筛选结果的基础上，利用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠模型检测芡实醇提物的降尿蛋白作用。模型大鼠均出现预期病理症状，给予厄贝沙坦阳性对照药和不同剂量的芡实醇提物后，发现中、高剂量芡实醇提物对尿蛋白和UALB的改善作用较为明显，而对血糖虽有相应的缓解趋势，只是这种疗效与本实验所设的剂量并没有相关性。而对于血脂紊乱的调节，芡实醇提物在300、600mg/kg浓度下，能够对TC和TG表现出一定的降低作用。实验证明，芡实醇提物可以调节DN引起的BUN水平上升。

而且，从病理切片可观察到模型组大鼠肾脏出现不同程度的损伤，而给药组均可见近曲小管变性和间质充血有所减轻，肾小球体积膨胀也有所减轻等缓解症状，因而认为一定浓度(300～600mg/kg)的芡实醇提物具有保护肾脏，延缓DN病理进程的作用。

上述实验结果表明，芡实醇提物具有降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白和尿微量白蛋白的作用。因此芡实醇提物可以作为一种具有降尿蛋白功效的药物用于治疗糖尿病肾病。

为了更详细地了解芡实醇提物中的有效成分，发明人还对本发明的芡实醇提物进行了UPLC-MS化合物鉴定，发现本发明的芡实醇提物中的酚类物质至少包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；三萜类物质至少包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。而且，上述芡实醇提物中的酚类物质与三萜类的质量比在1：1～2：1之间。

基于上述研究结果，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种降尿蛋白药物，该药物由有效量的芡实醇提物及辅料组成。此处的“有效量”包括治疗有效量和预防有效量。“治疗有效量”是指在必要的剂量和特定的持续时间下实现期望的治疗结果的有效量。药剂的治疗有效量可以根据多种因素而改变，例如个体的病状、年龄、性别、和体重，以及药剂在个体体内引起期望的反应的能力。治疗有效量也是治疗有益效果超过药剂的任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的预防结果，如预防或抑制尿蛋白升高的量。可以根据上述对治疗有效量的描述确定预防有效量。对于任何具体受试者，可以根据个体需要和施用人的职业判断随时间调节特定剂量。辅料可以根据不同剂型或给药途径的不同而选择合适的现有的辅料即可。

在本发明一种更优选的实施例中，以KM小鼠体重计，芡实醇提物的给药剂量在18～22g/kg以下是安全的，而有效剂量是以SD大鼠计为75～600mg/kg。在具体病例中，可根据动物与人的重量及给药剂量之间的换算关系，得出病人实际可以给予的有效剂量范围。

在本发明一种优选的实施例中，上述药物中的芡实醇提物从芡实单味药中经乙醇提取并经大孔树脂分离得到。更优选地，该药物既为芡实乙醇提取后经AB-8、D101、DM-301或HPD-100中的任意一种大孔树脂分离得到。最优选地，是在用上述任一种大孔树脂吸附后，再用体积含量为20％～80％的乙醇进行洗脱，即可得到本发明的芡实醇提物。本发明的实验结果表明，由芡实醇提物单味药所形成的冻干粉具有更稳定的药效，能够显著减低尿蛋白和尿微量白蛋白的作用。因而，来源于芡实的醇提物具有治疗糖尿病肾病的作用。

上述实验结果中，芡实醇提物中含有酚类和三萜类物质，且酚类和三萜类物质在芡实醇提物中的质量百分含量之和大于50％，更优选大于60％。具有上述成分和含量的芡实醇提物具有降低尿蛋白和尿微量白蛋白的功效，即在本发明的保护范围之内；而且，由于上述成分为降低尿蛋白和尿微量白蛋白的有效成分，因而上述成分的含量越高，降低尿蛋白和尿微量白蛋白的效果越好，是本发明更优选的保护范围。

在本发明另一种优选的实施例中，上述药物中的酚类物质至少包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；三萜类物质至少包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；更优选地，上述芡实醇提物中酚类和三萜类物质的质量比为1：1～2：1。本发明的实验证明，至少含有上述酚类物质和三萜类物质的成分及相应质量比的芡实醇提物具有显著降低尿蛋白和尿微量白蛋白的作用。

上述芡实醇提物，制备成一种降蛋白药物，进一步需要药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂等辅料。而且，该药物可以制成不同的剂型以适应多样化的给药途径，具体可适用的给药途径包括口服给药和胃肠道给药。而药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂和悬浮剂。

本发明可按照制药工业中已知的方法将本发明的含有芡实醇提物的药物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂以及溶液剂和悬浮剂，其中优选的是适合于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。

另外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途经给药的溶液剂和悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或者低深度(例如1-100mm)磷酸缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型的制剂中还可以含有其他的增溶剂、崩解剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。

在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种保健品，该保健品包含有效量的芡实醇提物。此处的保健品是指具有特定功能，特定人群使用保健品。因此，此处的有效量是指该保健品有效降低糖尿病肾病病人尿蛋白的量。由于芡实醇提物为纯天然产物，具有良好的降低尿蛋白和尿微量白蛋白的作用，因而制作成保健品，同样能够起到缓解糖尿病肾病的效果。

上述保健品同样可以根据给药途径的不同，制备成不同的剂型。在本发明中，上述保健品的剂型包括但不仅限于片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂或悬浮剂。

同样，该保健品中的芡实醇提物也是从芡实单味药中提取得到，同样含有酚类和三萜类物质，且酚类和三萜类物质的质量之和占芡实醇提物总质量的百分比大于50％，更优选，占60％。上述两类物质为降低尿蛋白和尿微量白蛋白的有效成分，因而其含量越高，效果越好。

类似地，该保健品中的酚类物质包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；三萜类物质包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；优选地，芡实醇提物中酚类和三萜类物质的质量比为1：1～2：1。

下面将结合具体的药理学实验进一步说明本发明的芡实醇提物的药效。

实验一芡实提取物体外抗氧化能力的筛选

1.1芡实提取物的制备

称取芡实果仁粗粉1公斤，用16000毫升体积浓度为80％的含水乙醇分两次回流，每次3小时。回流液进行过滤，并对滤液进行合并，减压回收乙醇并浓缩成浸膏，经大孔树脂吸附后，再用体积含量为20％～80％的乙醇洗脱，得到芡实醇提物。

按已知方法福林酚法测定酚类物质含量、香草醛-冰乙酸-高氯酸法测定萜类物质含量，结果表明，所得产物中酚类和三萜类物质的含量之和为53％。上述纯化步骤所用的大孔树脂包括AB-8、D101、DM-301或HPD-100中的任意一种。

用醇提后所剩药渣，以10倍量水加热提取，适当浓缩后加3倍体积量的乙醇进行醇沉，得到沉淀粉末和水提物上清。

1.2从芡实醇提物、水提物上清和沉淀粉末中筛选抗氧化能力(总还原能力、对DPPH、O^2-和OH^-的清除能力)较强的组分。

1.2.1总还原能力的测定

分别量取1ml不同浓度的芡实醇提物、水提物上清和沉淀三种样品溶液，分别加入质量浓度为1％的K₃Fe(CN)₆和pH＝6.6的磷酸缓冲液各2.5ml，于水浴锅中50℃加热25min后取出，待样品冷却至室温后加入质量浓度为10％的三氯乙酸溶液1ml，3500r/min离心10min后，取上清2ml并加入质量浓度0.1％的FeCl₃溶液0.5ml和2ml蒸馏水，摇匀后再静置5min，于700nm下测定吸光度值，同时以维生素C(VC)作为阳性对照。

其中，总还原能力的测定公式为：总还原能力＝A样品吸光度-A空白对照吸光度。具体测定结果见图1。

从图1可以看出，芡实醇提物具有明显还原能力，具有明显的抗氧化作用，虽不如对照品VC的还原能力强。在0.6mg/ml浓度下吸光度值已接近1.0。而水提物上清部分的还原能力则较弱；水提物沉淀部分没有显示出还原能力。

1.2.2清除DPPH能力的测定

分别量取2ml不同浓度的芡实醇提物、水提物上清和沉淀三种样品溶液，分别加入2ml浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，摇匀后静置30min，于517nm下测定吸光度值A样。以相同体积的无水乙醇作为空白对照，重复上述操作，测定吸光度A空；再取2ml样品溶液和2ml无水乙醇，混匀后测定溶剂的吸光度A0，同时以VC作为阳性对照。

其中，对DPPH的清除能力的测定公式为：对DPPH的清除能力＝[1-(A样-A0)/A空]×100％。具体测定结果见图2。

从图2可以看出，芡实醇提物在浓度为0.2mg/ml时对DPPH自由基的清除能力已与VC对照品相似，均在90％以上；水提物上清在浓度为0.6mg/ml时的DPPH清除能力也达到VC水平；而水提物沉淀所得结果显示，其没有明显的清除DPPH能力。

1.2.3清除超氧阴离子能力的测定

量取4.5ml浓度为0.05mmol/L pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液，于25℃水浴锅中加热15min，后加入1ml不同浓度的芡实醇提物、水提物上清和沉淀三种样品溶液，再分别加入已经提前预热的浓度为3mmol/l的邻苯三酚溶液0.5ml，于25℃加热10min后，滴加8mol/L HCl约1ml使反应终止，于325nm下测定吸光度值A样；同时以蒸馏水作为空白测定反应吸光度A空，以VC作为阳性对照。

其中，对超氧阴离子的清除能力的测定公式为：对超氧阴离子的清除能力＝[(A空-A样)/A空]×100％。具体测定结果见图3。

从图3可以看出，VC对照品对羟基自由基的清除能力最强，且在0.8mg/ml的浓度时达到最大清除值；芡实醇提物在相同浓度下也具有明显的清除超氧阴离子的能力，且清除能力随着浓度的增加而增加，在浓度为0.6mg/ml时清除能力明显提高；而芡实水提物上清和沉淀对羟基自由基的清除能力则不明显。

1.2.4.芡实提取物对羟基自由基的清除能力测定

分别量取浓度为6mmol/L的FeSO₄溶液、H₂O₂和水杨酸各2ml，再分别加入2ml不同浓度的芡实醇提物、水提物上清和沉淀三种样品溶液，于37℃水浴加热15min后，冷却并于510nm下测定吸光度值A样；标准管以蒸馏水代替样品溶液A标，空白管以蒸馏水代替水杨酸A空，测定吸光度值。同时以VC作为阳性对照组。

其中，对羟基自由基的清除能力的测定公式为：对羟基自由基的清除能力＝[A标-(A样-A空)]/A样×100％，具体测定结果见图4。

图4结果表明，VC对照品对羟基自由基的清除能力最强，且在0.8mg/ml的浓度时达到最大清除值；芡实醇提物在相同浓度下具有明显的清除超氧阴离子的能力，且清除能力随着浓度的增加而增加，在浓度为0.6mg/ml时清除能力明显提高；而芡实水提物上清和沉淀对羟基自由基的清除能力则不明显。

上述实验通过分光光度计法测定芡实各部位对DPPH、O^2-、OH^-的清除能力及其总还原能力，实验表明芡实醇提物浓度在0.6、0.8、1.0mg/ml时能显示出明显的还原能力，且对各种有害自由基的均显示出明显的清除能力，其中以其对DPPH自由基的清除功能最为显著，因此认为芡实醇提物具有较强的抗氧化能力，芡实水提物上清只在较高浓度时展现出较为微弱的还原能力和清除自由基功能，而水提物沉淀并不具有抗氧化的能力。

现有研究普遍认为糖尿病肾病的发生发展与氧化应激和自由基学说紧密相关，在上述芡实醇提物具有较强的抗氧化作用的实验结果的基础上，本发明优先选择醇提物研究其在降低尿蛋白方面的功效。

实验二小鼠灌胃芡实醇提物的急性毒性实验

实验动物：SPF级KM小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心，体重为18-22g。

药物：上述芡实醇提物的冻干粉末。

2.1灌胃药物及对照阴性药物的配制

(1)0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的配制：称取0.5g羧甲基纤维素钠，加入100ml纯净水中，置于水浴锅上加热煮沸，放冷后滤去不溶物即得。

(2)灌胃药物配制：取适量芡实醇提物粉末，溶于配制好的羧甲基纤维素钠溶液中，在研钵中细细磨匀，制成浓度为20g/kg的混悬液(即0.4ml/10g)。

2.2芡实醇提物对小鼠体重与进食量的影响

KM小鼠雌雄各半，按照体重大小均匀分为两组，每组20只，雌雄各一半，后随机将上述二组分为对照组和灌胃组。

全部小鼠进食12h后给药，依照药物最大受试量实验方法，灌胃浓度设置为20g/kg，容积为0.8ml/只(即0.4ml/10g)给予芡实醇提物2次，每次间隔1.5h，对照组给予相同剂量的0.5％CMC-Na。小鼠于给药后1、3、5、7、10、14d称量体重和进食量。具体结果见图5A、5B、5C和5D(*P<0.05与对照组比较，**P<0.01与对照组比较)。

其中，图5A和图5B分别示出了雌性和雄性KM小鼠灌胃芡实醇提物14天内体重的变化，图5C和图5D分别示出了雌性和雄性KM小鼠灌胃芡实醇提物14天内进食量的变化。在观察中发现，动物给药后出现的毒性反应：小鼠灌胃5min后，出现懒动卧笼现象，排深褐色粪便，前2d内质偏硬，第3d恢复正常。

以上结果表明：小鼠灌胃芡实醇提物后1-3d内，食欲明显受到抑制，可能与灌胃容积有关，至第5天开始恢复，但仍与对照组有明显差异，至第10天可达到对照组水平。药后5-8d内给药组小鼠体重受到抑制，至第10天左右逐渐恢复至正常水平。

2.3芡实醇提物对小鼠其他脏器的影响

药后连续观察小鼠6h，是否发生呕吐、弓背、腹泻等症状。继续观察14d，记录有无毒性反应，有无死亡小鼠及死前表现，及时解剖并分析动物死亡原因。第14天处死全部小鼠，解剖观察主要脏器有无肉眼可见的病变，必要时进行病理组织检查。

实验期间没有动物死亡，药后14d处死全部小鼠，解剖观察心、肝、脾、肺、胃、肠、肾等主要器官，未有肉眼可见的明显病变。实验证明，芡实醇提物在20g/kg(即0.4ml/10g)的剂量范围内灌胃，是KM小鼠可以承受的安全剂量。

实验三对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠模型的降尿蛋白作用

3.1实验动物

SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体重约150±20g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号为SCXK-(军)2012-0004。

3.2主要试剂

上述芡实醇提物的冻干粉末；

链脲佐菌素(美国Sigma-Aldrich公司)；

水合氯醛、柠檬酸、柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；

医用消毒酒精、碘伏(山东利尔康消毒科技有限公司)；

生理盐水(石家庄四药有限公司)；

尿蛋白试剂盒(上海执诚生物科技股份有限公司)；

尿微量白蛋白试剂盒(英国朗道实验诊断有限公司)；

肌酐测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)；

厄贝沙坦(赛诺菲安万特制药有限公司)。

3.3实验动物分组及灌胃剂量设定

SD大鼠，按照体重平均分组，每组8只。具体分组情况如下：

正常对照组(Sham组)：灌胃0.5％羧甲基纤维素钠

模型组(DN组)：灌胃0.5％羧甲基纤维素钠

阳性药组(Irbesartan组)：灌胃20mg/kg厄贝沙坦

小剂量组(QS 75mg/kg组)：灌胃75mg/kg芡实醇提物

低剂量组(QS 150mg/kg组)：灌胃150mg/kg芡实醇提物

中剂量组(QS 300mg/kg组)：灌胃300mg/kg芡实醇提物

高剂量组(QS 600mg/kg组)：灌胃600mg/kg芡实醇提物

3.4糖尿病肾病动物模型的建立

大鼠禁食过夜后，全部待造模大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg造模。注射72h后检测到部分大鼠血糖水平已升高，观察两周后，全部模型大鼠血糖水平已达到16.7mmol/L，此时认为造模成功。

3.5芡实醇提物对糖尿病肾病大鼠体重肾重及相关血、尿生化指标的影响

观察大鼠身体及精神状况，待大鼠血糖水平稳定，此时距离造模初约六周，以代谢笼收集全部大鼠24h尿液，记录尿量并取少量尿液低速离心后，吸取上清适量，用以检测基础尿蛋白和尿微量白蛋白(UALB)。

按照实验分组计划，灌胃给予厄贝沙坦或不同剂量的芡实醇提物12周，正常对照组和模型组给予等量的CMC-Na溶液。期间每隔四周，称量全部大鼠体重并收集一次尿液测量24h尿蛋白和尿微量白蛋白。

各组大鼠给药至12周时，监测血糖(超过测量范围者记为最大值33.3mmol/L)后麻醉经腹主动脉取血，于室温下静置30min后，离心取上层血清测定Scr、BUN、TC和TG。

3.6实验结果

3.6.1芡实醇提物对糖尿病肾病大鼠体重和肾重的影响

与正常组相较，注射STZ 72h后，DN大鼠已经开始出现多饮、多尿的症状，伴随时间的推移，DN大鼠逐渐出现“三多一少”(多饮、多食、多尿、体重减少)的典型症状，体重增长缓慢，甚至出现负增长情况，毛发粗糙暗黄，卧笼懒动且精神状态萎靡，给予厄贝沙坦和中、高剂量芡实醇提物的组别此情况明显少于模型组和小、低剂量芡实醇提物给药组。

至给药12周时，各组大鼠单侧肾系数即单侧肾重与体重之比(KW/BW)(如图6所示)，显示与正常组大鼠比较，各模型组大鼠肾系数明显升高且具有统计学意义；而与各模型组比较，各剂量芡实醇提物与厄贝沙坦阳性药对病鼠体重增加和肾重缩小均无明显差异。

3.6.2芡实醇提物对糖尿病肾病大鼠尿生化指标的影响

糖尿病肾病大鼠每日尿量可以达到250-350ml，尿液呈现粘稠浑浊状且具有大量泡沫，给药期间每隔四周收集尿液考察24h尿蛋白和尿微量白蛋白，结果如表1、表2((n＝8))、图7(*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，与模型组比较)和图8(*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较)，显示DN组与正常组比较，随着病程的延长，其尿蛋白和尿微量白蛋白明显升高，且呈持续上升状态。给药周期结束时，四个给药组和阳性药组的尿蛋白和尿微量白蛋白均低于模型组，高剂量给药组尤为明显。

此外，发明人还对酚类物质与三萜类物质总质量的百分含量为60％和75％的芡实醇提物进行了尿蛋白和尿微量白蛋白含量的检测，发现对尿蛋白和尿微量白蛋白的降低作用趋势与图7和图8相同，而且降低效果更明显。

而且，发明人还以酚类物质和三萜类物质的质量比为1：1和2：1的芡实醇提物分别进行上述实验，发现实验结果同样与图7和图8类似。该结果表明，酚类物质和三萜类物质的质质量比在1：1～2：1之间的芡实醇提物具有显著的降低效果。

表1：

*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；#P<0.05，##P<0.01，vs.DN组。

表2：

*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；#P<0.05，##P<0.01，vs.DN组。

3.6.3芡实醇提物对糖尿病肾病大鼠血生化指标的影响

12周灌胃结束后，监测三次空腹血糖并取平均值，具体结果见图9A。图9A中的结果显示DN组与正常组比较，血糖(BG)水平明显升高，平均水平均大于所能测量的最大值33.3mmol/L。芡实各给药组相对于DN组BG并无明显改善，说明芡实醇提物对降低血糖的作用不明显。

测量血清Scr和BUN的结果分别如图9B和9C。结果表明，芡实醇提物对肌酐值的改善不显著，芡实醇提物四个给药组均有降低BUN的效果。

测量TC和TG的结果表明，分别如图9D和图9E所示，芡实醇提物各组对TC和TG的影响程度不十分明显。

3.6.4芡实醇提物对糖尿病肾病大鼠肾脏的病理改变

对上述各组大鼠的肾脏病理切片进行HE染色，检测在细胞水平上的病理结构的变化，检测结果见图10。从图10中可以看出，正常对照组，显示出正常肾组织结构；模型组肾脏可见部分肾小球体积增大，肾小球囊腔减小，基底膜增厚，近曲小管上皮细胞空泡变性，肾间质充血，并可见适量炎细胞浸润；阳性药组可见近曲小管变性和间质充血有所减轻，肾小球体积增大未见明显减轻；小剂量组较模型组肾脏病变未见减轻；低剂量组较模型组肾脏病变未见减轻；中和高剂量组肾小球肿胀有所减轻，近曲小管变性和间质充血也有所减轻。

从上述实验结果可知，建立DN模型后，模型大鼠均出现预期病理症状，给予厄贝沙坦阳性对照药和不同剂量的芡实醇提物后，可发现：中、高剂量芡实醇提物对尿蛋白和UALB的改善作用较为明显，而对血糖虽有相应的缓解趋势，只是这种疗效与醇提物的剂量并没有相关性。对于血脂紊乱的调节，根据所得TC和TG的数据认为，芡实醇提物对血脂调节作用效果并不明显，还需进一步确证。实验证明，芡实醇提物可以调节DN引起的BUN水平上升，且在中剂量给药时此效果较好。

由病理切片可观察到大鼠肾脏出现不同程度的损伤，阳性给药组，中、高剂量组均可见近曲小管变性和间质充血有所减轻，肾小球体积膨胀也有所减轻等缓解症状，而小、低剂量组则与模型组比较无明显差异。

因而，本发明的实验结果表明芡实醇提物具有降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白和尿微量白蛋白的作用，一定浓度(300、600mg/kg)的芡实醇提物具有保护肾脏，延缓DN病理进程的作用。

进一步地，发明人利用UPLC-MS对上述芡实醇提物中的化学成分进行了鉴定。具体步骤如下：

实验四、UPLC-MS分析芡实醇提物化学成分

4.1实验材料和仪器

4.1.1主要试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific公司)；超纯水(Millipore制备)；甲酸(国药集团化学试剂有限公司)；上述自制芡实醇提物冻干粉末。

4.1.2主要设备

电子天平(美国奥豪斯电子天平)；Waters Acquity UPLC-Q-TOF-MS液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司)；MassLynx V4.1质谱工作站(美国Waters公司)；UPLCTM HSST3超高效液相色谱柱(美国Waters公司，2.1mm×100mm，1.8μm)；Millipore Simplicity纯水仪。

4.2实验方法

4.2.1样品制备

称取10mg芡实醇提物粉末，溶于1ml 10％的乙腈-水中，离心取上清，经0.22μm的微孔滤膜过滤后，得浓度为10mg/ml的样品溶液。

4.3.1 UPLC色谱条件优化

对比甲醇-水和乙腈-水体系，最终选定峰形较好的乙腈-水系统进一步优化，具体分离条件如下：流动相为A相(0.1％甲酸-水)，B相(乙腈)，柱温35℃，进样体积2μl，详细洗脱程序见下表3。

4.3.2 UPLC-Q-TOF-MS对芡实醇提物的分析

4.3.2.1 UPLC-MS总离子流图

分别采用UPLC正、负离子模式对芡实醇提物进行分析，得到两种模式下的总离子流图，如图11，由图11中结果显示，负离子模式较正离子模式信号峰更为丰富，峰形分离的更好，因此，本实验主要以负离子模式为分析对象，结合正离子模式作为参考。

表3：

4.3.2.2对芡实醇提物中化学成分的鉴别

负离子模式下的一级质谱中低能量轰击时主要产生[M-H]^-、[2M-H]^-、[M-HCOO]^-等碎片离子峰，而正离子模式下低能量轰击时主要产生[M+H]⁺、[2M+H]⁺、[M+Na]⁺等碎片离子峰。利用MassLynx software数据分析软件，结合给出的化合物的高分辨分子量，参照提供的可能分子式，联合SciFinder数据库进行参照，并与现有文献对比，比较化合物二级质谱的差异，得到9个化学结构。具体分析结果见表4，其中第6个化合物为萜类，其他化合物为酚类化合物。

表4：

此外，为了比较现有的包含芡实原料药的复方药与本发明的芡实醇提物单味药在治疗肾病，尤其是具有尿蛋白升高症状的肾病方面的作用，发明人基于前述的氧化应激及自由基学说，也对含有芡实原料的中药复方组合物在抗氧化方面的作用进行了检测。

其中，含有芡实原料的中药复方组合物为芡实合剂，包括：芡实30g，白术12g，茯苓12g，怀山药15g，菟丝子24g，金樱子24g，黄精24g，百合18g，枇杷叶9g，党参9g。采用现有复方中药的常规制备方法进行制备，即：以10倍量的水加热煮沸提取1次，约1.5h，过滤浓缩后即得(称为水提物)。另外，也采用本发明的方法进行醇提，得到芡实合剂的醇提物。

对芡实合剂的水提物及本发明的各芡实提取物进行抗氧化能力的测定，具体方法同实验一。检测结果如图12A至12D所示。从图12A至12D可以看出，与本发明的芡实醇提物相比，芡实合剂不具有抗氧化的能力，且对各种有害自由基不具有明显的清除能力。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的含有芡实醇提物的降蛋白药物具有降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白和尿微量白蛋白的作用，对肾脏具有一定的具有保护作用，能够延缓DN病理的进程。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种组合物在制备用于降低尿蛋白的药物中的用途，其特征在于，所述组合物由有效量的芡实醇提物和辅料组成，其中所述芡实醇提物的制备方法包括：

用乙醇对芡实果仁粉进行醇提，得到醇粗提物；

用大孔树脂对所述醇粗提物进行纯化，并用体积含量为20％～80％的乙醇进行洗脱，得到所述芡实醇提物；

其中，所述大孔树脂选自AB-8、D101、DM-301或HPD-100中的任意一种，

其中，所述芡实醇提物中含有酚类物质和三萜类物质，且所述酚类物质和三萜类物质的质量之和占所述芡实醇提物总质量的比例大于50％。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述酚类物质和三萜类物质的质量之和占所述芡实醇提物总质量的比例大于60％。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述酚类物质包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；所述三萜类物质包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述芡实醇提物中的所述酚类物质与所述三萜类物质的质量比为1：1～2：1。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述辅料为载体、赋形剂或佐剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物的给药途径为口服给药；其中，所述大孔树脂选自AB-8、D101、DM-301或HPD-100中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂或悬浮剂。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于，以SD大鼠体重计，所述芡实醇提物的有效剂量为75～600mg/kg。

9.一种组合物在制备用于降低尿蛋白的保健品中的用途，其特征在于，所述组合物包含有效量的芡实醇提物，其中所述芡实醇提物的制备方法包括：

用乙醇对芡实果仁粉进行醇提，得到醇粗提物；

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、溶液剂或悬浮剂。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述酚类物质和三萜类物质的质量之和占所述芡实醇提物的总质量的比例大于60％。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述酚类物质包含没食子酸、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、5,7,3’,4’,5’-五羟基二氢黄酮以及5,7,4’-三羟基二氢黄酮；所述三萜类物质包括异落叶松树酯醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述芡实醇提物中，所述酚类物质与所述三萜类物质的质量比为1：1～2：1。