CN104878101B - 一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法，该方法包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，所述酶切目标核酸序列所采用的试剂包括定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明方法具有简单、特异性高和通用性强等优势，彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题，降低了目前等温扩增方法中引物设计的难度，有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法。
背景技术
病原体和遗传标志物相关基因的定性和定量检测已成为临床化学中发展最迅速的领域之一。由于即时检测的需要，核酸检测正逐步走出实验室环境。但目前，核酸检测仍主要使用PCR技术和其衍生技术如逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR(Real-time PCR)、多重PCR(Multiplex PCR)、巢式PCR(Nested PCR)等。这些技术严重依赖于循环变温过程来实现核酸链的变性、退火和延伸三步骤，属于变温核酸扩增技术，需要专门的实验室仪器，因而不利于即时检测的实现。
近年来，等温核酸扩增技术逐渐兴起，并得以迅猛发展，不仅丰富了核酸扩增技术的内容，还代表着核酸扩增技术发展的新趋势。目前已报到的等温扩增技术有转录介导扩增技术(Transcription-mediated amplification，TMA)、链置换扩增技术(Stranddisplacement amplification，SDA)、基于核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、环介导扩增技术(Loop-mediated amplification，LAMP)、解链酶依赖型扩增技术(Helicase dependent amplification，HDA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、单引物等温扩增技术(Single primerisothermal amplification，SPIA)和基因指数等温扩增反应(Genome exponentialamplification reaction，GEAR)等。这些等温核酸扩增技术避免了PCR技术的循环升、降温过程，能在较短的时间内实现目标核酸序列的指数扩增，使核酸检测设备更加便携，有利于即时检测的实现。然而，这些技术均是从人工合成引物沿目标核酸序列延伸开始启动，其主要缺点在于引物设计上的困难。为了实现目标核酸序列以及新生成的反义序列的循环利用，常常需要复杂的引物设计，例如LAMP需要针对目标核酸序列的6个区域设计至少4条引物，这不仅要依赖于专业的设计软件，还要求设计者具有丰富的经验。SDA等虽然具有相对简单的反应机理，但由于内切酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖，其通用性受到了很大挑战。为了在目标核酸中引入内切酶的识别序列，也不得不诉诸于复杂的引物设计，这不仅大大增加了非特异性扩增的严重程度，同时加大了扩增失败的风险。另一方面，从引物延伸开始启动的扩增反应还缺乏有效的手段来抑制非特异性扩增反应，这是目前绝大多数等温指数扩增方法尚未解决的难题。相比较而言，从目标核酸序列的延伸开始启动的等温指数扩增反应不仅可以灵活设计引物/模板的序列结构，而且可以采用各种化学修饰的引物/模板以降低非特异性扩增。但绝大多数情况下，待测目标核酸序列的3’段断点位置是不可知的，这就使得目标核酸序列沿特定引物/模板的延伸面临着巨大的挑战。使用“Fingerprinting”技术(Niemz，A.(2009)，Clin.Chem.53：2017-2020)虽然可以从基因组靶核酸序列中直接得到扩增“引物”，即利用内切酶对目标核酸序列实施剪切以精确“自定义”其3’段断点位置，从而引发指数扩增反应，但是这种方法需要目标核酸序列中含有内切酶识别序列，且剪切位点只能位于该识别序列内或附近的某一固定位置，无法按实际需要实现精细调节，针对不同的目标核酸序列来还需选择不同的内切酶才能实现剪切，因而其通用性较差，对于有些序列片段甚至会由于没有适合的内切酶而无法实现特异性剪切。为了克服上述不足，有必要探究一种新的核酸检测方法，应用于微生物检测、肿瘤标志物鉴定和转基因成分筛查等方面。
发明内容
本发明提供了一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法，该方法是一种可对目标核酸序列任意位点进行剪切，生成相应的核酸序列作为引物以触发后续等温指数扩增反应的简单、通用的核酸检测方法。
一种核酸检测方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，酶切目标核酸序列所采用的试剂包括定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。
上述方法中内切酶与所述定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链的识别区与目标核酸序列进行杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的精确剪切。
上述核酸检测方法是在现有依赖链置换扩增技术的核酸检测方法的基础上做的进一步改进，以荧光分析方法进行核酸检测为例，主要包括以下几个过程：目标核酸序列的剪切、链置换扩增和荧光检测。
该方法的整个反应体系中，主要包括以下组分：待检测的目标核酸序列，具有链置换活性的核苷酸聚合酶(简称聚合酶)，扩增模板，定位探针，内切酶，反应缓冲液，dNTPs、镁离子和荧光探针。
该方法的具体反应原理，如下：
a)定位探针会与目标核酸序列进行特异性杂交，而内切酶与定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸序列进行剪切；
b)剪切后，目标核酸序列与定位探针分离，转而与扩增模板上3’端的目标核酸结合序列特异性结合，并在聚合酶的作用下，以扩增模板为模板延伸，延伸的核酸序列与扩增模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5’端的扩增序列的反义序列；
c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对目标核酸序列的延伸序列进行剪切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸，并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成更多的扩增序列的反义序列；
d)该反义序列与游离的扩增模板特异性结合，并在聚合酶的作用下以扩增模板为模板延伸，延伸的核酸序列与扩增模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5’端的扩增序列的反义序列；
e)不断重复步骤c)和d)以实现指数扩增，由于可产生大量的双链扩增模板，因而将使双链特异性荧光染料SYBR Green I的荧光信号逐渐增强，从而实现对目标核酸序列的检测。
核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来确定。
本发明所述的“靠近”是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位点间的核苷酸数量来确定。
作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。
理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：
所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。
若以两条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补区域中至少包含一段与目标核酸序列互补的识别区，当然，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来定。说明书附图1B中提供的即为两条核苷酸链形式的核酸定位探针中的一种具体形式，图中3’侧臂和5’侧臂位于双链的同侧，且均含有一段识别区，该结构的核酸定位探针有助于提高核酸定位探针与目标核酸序列结合的稳定性，提高剪切效率。为了提高核酸定位探针的稳定性，双链中非内切酶识别序列的长度可依据所需退火温度进行调整；增加两单链识别区的序列长度也可以促进核酸定位探针双链结合区的形成与稳定。
若以单条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针中应有两段互补的序列，并杂交形成带单链环的茎环结构，上述茎环结构能够提高核酸定位探针的稳定性。上述单链环的核苷酸数≥0，≤50；单链环的核苷酸数为0时，是指互补区域的一端通过最末两个核苷酸之间的磷酸二酯键连接。当然，该核酸定位探针的未互补区域也应具有至少一段与目标核酸序列互补的识别区。
作为优选，上文所述定位探针的3’末端处具有保护结构，例如：3’终止剂或3’悬垂序列，其中，3’悬垂序列的核苷酸数目为0～5，3’终止剂包括：Inverted-dT、3’-propylphosphate、dideoxyC。
作为优选，扩增采用的扩增模板包括依次连接的目标核酸序列的结合序列、内切酶识别序列、连接序列和扩增序列，扩增模板3’端设有终止剂或垂悬序列。其中，3’悬垂序列的核苷酸数目为0～5，3’终止剂包括Inverted-dT、3’-propyl phosphate、dideoxy C。连接序列用于连接内切酶识别序列与扩增序列，以调节剪切位点，扩增序列与结合序列的部分或全部相同。上述结合序列位于扩增模板的3’端。
上述定位探针和扩增模板的3’末端均连接有保护结构，其作用在于，既可以防止扩增模板先沿目标核酸序列延伸而致定位探针不能与目标核酸序列结合，又可以防止定位探针沿目标核酸序列延伸而致剪切后的目标核酸序列不能离去，二者均使扩增反应不能被启动。另一方面，终止剂作为3’保护结构还可以防止引物二聚体作用，以降低非特异性扩增。
所述的内切酶为切口内切酶，包括Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、N.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI。
所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。
所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的核苷酸聚合酶，包括Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)聚合酶、Klenow DNA聚合酶。
本发明公开的检测方法还可以用于制备核酸检测试剂盒，该试剂盒包含具有链置换活性的核苷酸聚合酶，扩增模板，内切酶，还包括定位探针；
所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。
该试剂盒中还包含扩增所需的基本原料，如dNTPs、镁离子等；也包含荧光检测分析的荧光探针，如：SYBR Green I等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法利用内切酶和含内切酶识别序列的定位探针来实现目标核酸序列的精确、可调剪切，并从剪切后的目标核酸序列的延伸开始启动核酸等温指数扩增反应，利用聚合酶、内切酶和含内切酶识别序列的扩增模板不断重复剪切-延伸过程，实现目标核酸序列的指数信号放大。该方法具有简单、灵敏度与特异性高、通用性强等优势，彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题，降低了目前等温扩增方法中扩增模板设计的难度，有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围，可应用于微生物检测、肿瘤标志物鉴定和转基因成分筛查等方面。
附图说明
图1为本发明核酸定位探针的结构示意图；
A为带茎环结构的定位探针，B为由两条寡核苷酸链杂交形成的非茎环结构的定位探针；阴影部分为内切酶识别序列；圆点代指3’保护结构(以3’终止剂作为保护结构为例)。
图2为本发明核酸检测方法的原理示意图(以茎环结构核酸定位探针以及使用扩增序列与结合序列完全相同的扩增模板为例)。
图3为实施例1中在分别存在和不存在定位探针的条件下荧光随时间变化的曲线。
图4为实施例1中扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(15％)(SYBR Green I显色)；其中，M泳道为DNA Marker，其他泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为D1；泳道2为C1；泳道3为B1；泳道4为A1。
图5为实施例2中目标核酸序列和不同单碱基错配核酸序列引起的荧光随时间变化曲线。
图6为实施例3中不同浓度梯度的SARS病毒核酸序列引起的荧光随时间变化曲线。
图7为实施例4中不同浓度梯度的Ebola病毒核酸序列引起的荧光随时间变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例说明本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明方法利用含内切酶双链识别序列的定位探针、含内切酶单链识别序列的扩增模板、内切酶和DNA聚合酶在等温条件下对目标核酸序列进行指数信号放大，其基本反应原理如下：
a)内切酶与定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链识别区与目标核酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的剪切；
b)被剪切后的目标核酸序列与定位探针分离，转而与扩增模板3’区域的目标核酸结合序列结合，并在聚合酶的作用下沿扩增模板延伸，形成双链的内切酶识别序列及扩增模板中扩增序列部分的反义序列；
c)内切酶绑定在上述内切酶双链识别序列上，并对延伸产物进行剪切以形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成越来越多的扩增序列的反义序列；
d)扩增序列的反义序列与游离的扩增模板的结合序列结合，并在聚合酶的作用下沿扩增模板延伸，以形成双链的内切酶识别序列及扩增序列部分的反义序列；
e)内切酶绑定在上述内切酶双链识别序列上，并对延伸产物进行剪切以形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成越来越多的扩增序列的反义序列；
f)步骤d到e不断重复，整个过程进入指数反应阶段。
实施例1
在该实施例中，待测目标核酸序列T1、非目标核酸序列T2、直接引物T3(模拟T1被剪切后的序列，可直接与扩增模板的结合序列杂交以引发后续扩增)均为人工合成的寡核苷酸序列，根据目标核酸序列所需的剪切位点设计相应的定位探针P1和扩增模板P2。检测原理参见图2，具体步骤如下：
(1)取八个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，1μL dNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)和11.35μL水，标号A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2；
(2)往A1、B1、C1、D1管内各加入1.25μL定位探针P1(浓度为1μM)；往A2、B2、C2、D2管内各加入1.25μL水；
(3)往A1、A2管内各加入2.5μL目标核酸序列T1(浓度为1nM)；往B1、B2管内各加入2.5μL非目标核酸序列T2(浓度为1nM)；往C1、C2管内各加入2.5μL直接引物T3(浓度为1nM)；往D1、D2管内各加入2.5μL水；
(4)将上述八管溶液置于55℃温育30分钟，使定位探针与各核酸序列充分结合、充分剪切；
(5)往上述八个管内分别加入0.05μLBstDNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1.25μL扩增模板P2(浓度为1μM)和0.5μL SYBR Green I(浓度为25x)；
(6)将上述八管溶液置于55℃温育60分钟，测定混合溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
在该实施例中，T1、T2、T3、P1、P2的核酸序列如下：
T1：5’-GTGTAGCGTGAGGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.1)；
T2：5’-ACCAGAATGGAGGACGCAATG-3’(SEQ ID No.4)；
T3：5’-GTAGCGTGAG-3’(SEQ ID No.5)；
P1：5’-GGCAGTGACCTCTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACGCTACAC-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.2)(用3’Inverted dT作为终止剂)；
P2：5’-CTCACGCTACGGACGACTCTCTCACGCTAC-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.3)(用3’Inverted dT作为终止剂)；
实验结果和分析：不同核酸序列引起的荧光随时间变化曲线如图3所示，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果如图4所示。
由图3可见，当存在定位探针P1时，由目标核酸序列T1引起的荧光信号变化与直接引物T3引起的信号变化类似，均在10min左右开始显著增强，明显早于非目标核酸序列T2和阴性对照组(H2O)的结果；而当不存在定位探针P1时，由目标核酸序列T1和非目标核酸序列T2引起的荧光信号变化均与阴性对照组(H2O)的结果相当，明显慢于直接引物T3引起的信号变化。此组数据充分说明了本发明中定位探针的重要性，即只有在定位探针的帮助下，目标核酸序列被剪切，才能触发后续的等温指数扩增反应，证明了本方法的反应原理与可行性。由于定位探针与内切酶的结合作用，使得作用于扩增模板的有效内切酶数量减少，这是不加定位探针的各实验组的荧光变化明显早于加定位探针的实验组的主要原因。
图4所示的凝胶电泳结果显示，当目标核酸序列T1存在时，出现了一条30bp左右的条带，这与直接引物T3引起的结果相似，说明体系中形成了大量的双链扩增模板；而对于非目标核酸序列T2和阴性对照组(H2O)则没有出现该条带，仅显示一条略长于20bp的条带，对应体系中的定位探针。这些结果从另一方面再次证明了本检测方法的反应原理与可行性。
实施例2
在该实施列中，待测目标核酸序列T1(同实施例1)、单碱基变异核酸序列T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10均为人工合成的寡核苷酸序列，根据目标核酸序列所需的剪切位点设计相应的定位探针P1(同实施例1)和扩增模板P2(同实施例1)。检测原理参见图2，具体步骤如下：
(1)取九个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，1μL dNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、1.25μL定位探针P1(浓度为1μM)和11.35μL水，标号A、B、C、D、E、F、G、H、I；
(2)往A管内加入2.5μL T1(浓度为1nM)，往B管内加入2.5μL T4(浓度为1nM)，往C管内加入2.5μL T5(浓度为1nM)，往D管内加入2.5μL T6(浓度为1nM)，往E管内加入2.5μL T7(浓度为1nM)，往F管内加入2.5μL T8(浓度为1nM)，往G管内加入2.5μL T9(浓度为1nM)，往H管内加入2.5μL T10(浓度为1nM)，往I管内加入2.5μL水；
(3)将上述九管溶液置于55℃温育30分钟，使定位探针与各核酸序列充分结合、充分剪切；
(4)往上述九个管内分别加入0.05μL BstDNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1.25μL扩增模板P2(浓度为1μM)和0.5μL SYBR Green I(浓度为25x)；
(5)将上述八管溶液置于55℃温育60分钟，测定混合溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
在该实施例中，T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10的核酸序列如下：
T4：5’-GTGTAGCGTAGGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.6)(中划线处的碱基为相对于目标核酸序列T1发生变异的碱基，下同)。
T5：5’-GTGTAGCGTGGGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.7)；
T6：5’-GTGTAGCGTGAGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.8)；
T7：5’-GTGTAGCGTGAGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.9)；
T8：5’-GTGTAGCGTGAGGCACTGCC-3’(SEQ ID No.10)；
T9：5’-GTGTAGCGGAGGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.11)；
T10：5’-GTGTGCGTGAGGTCACTGCC-3’(SEQ ID No.12)。
实验结果和分析：
本实施例证明了本检测方法的特异性。
待测目标核酸序列(T1)和单碱基变异核酸序列(T4-T10)引起的荧光随时间变化曲线如图5所示。T4-T10对应的荧光变化曲线均介于T1和阴性对照组(H2O)之间，尤其是T4、T5、T6，即单碱基变异发生在第10-12三个碱基(也即剪切位点上游的三个碱基)处时，荧光变化曲线较T1延迟了近10min，表明这三个碱基对于该检测方法的特异性影响更为显著。以上结果说明本发明方法不但具有良好的选择性，而且具有较强的区别单碱基变异的能力。
实施例3
在该实施列中，使用一种公开的SARS病毒核酸序列(GenBank accessionno.AY278491)来验证本发明方法的通用性，所选择的目标核酸序列T11为该种SARS病毒Ngene区的核酸序列，对应的核苷酸序列号为：28204-28228。根据目标核酸序列所需的剪切位点设计相应的定位探针P3和扩增模板P4。检测原理参见图2，具体步骤如下：
(1)将目标核酸序列T11采用10倍稀释方式稀释为8个浓度梯度：10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM；
(2)取九个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，1μL dNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、1.25μL定位探针P3(浓度为1μM)和11.35μL水，标号A、B、C、D、E、F、G、H、I；
(3)往A管内加入2.5μL T11(浓度为10nM)，往B管内加入2.5μL T11(浓度为1nM)，往C管内加入2.5μL T11(浓度为100pM)，往D管内加入2.5μL T11(浓度为10pM)，往E管内加入2.5μL T11(浓度为1pM)，往F管内加入2.5μL T11(浓度为100fM)，往G管内加入2.5μL T11(浓度为10fM)，往H管内加入2.5μL T11(浓度为1fM)，往I管内加入2.5μL水；
(4)将上述九管溶液置于55℃温育30分钟，使定位探针P3与各核酸序列充分结合、充分剪切；
(5)往上述九个管内分别加入0.05μL BstDNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1.25μL扩增模板P4(浓度为1μM)和0.5μL SYBR Green I(浓度为25x)；
(6)将上述九管溶液置于55℃温育60分钟，测定混合溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
在该实施例中，T11、P3和P4的核酸序列如下：
T11：5’-CAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAA-3’(SEQ ID No.13)；
P3：5’-TTGCCCCATTGCGTCCTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCATCCATTCTG-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.14)(用3’Inverted dT作为终止剂)；
P4：5’-TCCTCCATTCGGACGACTCTTCCTCCATTCTG-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.15)(用3’Inverted dT作为终止剂)。
实验结果和分析：
本实施例证明了本检测方法的灵敏度与通用性。
不同浓度目标核酸序列T11所引起的荧光变化曲线如图6所示，表明本发明方法可用于该SARS病毒特征核酸序列的灵敏检测，其检测下限可达100aM，同时也在一定程度上证明了本发明方法具有良好的通用性。
实施例4
在该实施列中，使用一种公开的Ebola病毒核酸序列(GenBank accessionno.AY058895)来验证本发明方法的通用性，所选择的目标核酸序列T12为该种Ebola病毒核苷酸序列号为691-715区段的核酸序列。根据目标核酸序列所需的剪切位点设计相应的定位探针P5和扩增模板P6。检测原理参见图2，具体步骤如下：
(1)将目标核酸序列T12采用10倍稀释方式稀释为7个浓度梯度：10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM；
(2)取八个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，1μL dNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、1.25μL定位探针P5(浓度为1μM)和11.35μL水，标号A、B、C、D、E、F、G、H；
(3)往A管内加入2.5μL T12(浓度为10nM)，往B管内加入2.5μL T12(浓度为1nM)，往C管内加入2.5μL T12(浓度为100pM)，往D管内加入2.5μL T12(浓度为10pM)，往E管内加入2.5μL T12(浓度为1pM)，往F管内加入2.5μL T12(浓度为100fM)，往G管内加入2.5μL T12(浓度为10fM)，往H管内加入2.5μL水；
(4)将上述八管溶液置于55℃温育30分钟，使定位探针P5与各核酸序列充分结合、充分剪切；
(5)往上述八个管内分别加入0.05μL BstDNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1.25μL扩增模板P6(浓度为1μM)和0.5μL SYBR Green I(浓度为25x)；
(6)将上述八管溶液置于55℃温育60分钟，测定混合溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
在该实施例中，T12、P5和P6的核酸序列如下：
T12：5’-GCAGGAGTAAATGTTGGAGAACAGT-3’(SEQ ID No.16)；
P5：5’-ACTGTTCTCCAACATTTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCATACTCCTGC-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.17)(3’用Inverted dT作为终止剂)；
P6：5’-ATTTACTCCTGGACGACTCTATTTACTCCTGC-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.18)(3’用Inverted dT作为终止剂)。
实验结果和分析：
本实施例证明了本检测方法的灵敏度与通用性。
不同浓度目标核酸序列T12所引起的荧光变化曲线如图7所示，表明本发明方法可用于该Ebola病毒特征核酸序列的灵敏检测，其检测下限可达1fM，同时也在一定程度上证明了本发明方法具有良好的通用性。
Claims (8)
1.一种核酸检测方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，其特征在于，酶切目标核酸序列所采用的试剂包括定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区；所述内切酶为切口内切酶；所述定位探针的3’端设有终止剂或垂悬序列；
所述核酸检测的过程，包括：
a)定位探针与目标核酸序列进行特异性杂交，内切酶与定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸序列进行剪切；
b)剪切后，目标核酸序列与定位探针分离，转而与扩增模板上3’端的目标核酸结合序列特异性结合，并在具有链置换活性的核苷酸聚合酶的作用下，以扩增模板为模板延伸，延伸的核酸序列与扩增模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5’端的扩增序列的反义序列；
c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对目标核酸序列的延伸序列进行剪切，形成切口，聚合酶从该切口位置开始催化延伸，并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成更多的扩增序列的反义序列；
d)所述反义序列与游离的扩增模板特异性结合，并在聚合酶的作用下以扩增模板为模板延伸，延伸的核酸序列与扩增模板形成双链的内切酶识别序列以及扩增模板5’端的扩增序列的反义序列；
e)不断重复步骤c)和d)进行指数扩增。
2.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述定位探针包含两段单链，两段单链连接于双链的同一端。
3.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
4.如权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。
5.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，扩增采用的扩增模板包括依次连接的目标核酸序列的结合序列、内切酶识别序列、连接序列和扩增序列，扩增模板3’端设有终止剂或垂悬序列。
6.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。
7.如权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。
8.一种核酸检测试剂盒，包括：具有链置换活性的核苷酸聚合酶，扩增模板，内切酶，其特征在于，还包括定位探针；所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区；所述内切酶为切口内切酶，切口内切酶与所述双链结合区进行结合，内切酶通过识别区与目标核酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，完成对目标核酸序列的剪切。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| A continuous assay for DNA cleacage:The application of "break lights" to enediynes, iron-dependent agents,and nucleases;Biggins等;《PNAS》;20001205;第97卷(第25期);第13538页图2 * |
| 缺口酶依赖的DNA链置换扩增技术的研究;何艳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20110515(第5期);第19页第2.2节 * |
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