JP2013500705A - ライゲーションに基づく核酸の正規化した定量化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の特定の実施形態では、定量化される核酸はRNAであり、特定のクラスの核酸はRNAである。
mRNA上でのオリゴヌクレオチドプローブの環状化
試料中に含有されるメッセンジャーRNAの最初の量に正比例する増幅標的を生成するために、図1に示されているとおりの、図4に示されている配列を有するプローブ分子を供給する。
試料のmRNA含有量を示す環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅
環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅を、実施例1に記載のライゲーション反応物を用いて行った。ライゲーション反応物を、1:10または1:100のいずれかに希釈し、これらの希釈物2μlを、最終的な容積20μl中、2×QuantiFast SYBR Green PCR Kit Master Mix(QIAGEN)、および濃度1μMのプライマーを含有する増幅反応に供した。プライマー配列は以下の通りであった:プライマー1:5’−tggaggtccattaaagccaagtt−3’およびプライマー2:5’−tggtgccatgtaaggatgaatgt−3’。95℃で5分間のホットスタートポリメラーゼ再活性化ステップの後、サイクルのプロトコールは、95℃で10秒間および60℃で30秒間の40サイクルからなった。シグナルを、ABI PRISM 7500 Sequence Detection Instrumentにおいて、dsDNAに特異的な結合色素であるSYBR Green Iを使用した、反応物のリアルタイムモニタリングを用いて検出した。あるいは、図1の青色の配列と相補的な配列特異的な蛍光標識プローブも、検出のために使用することができる。表1に示されているデータにより、元のRNA投入量に比例する閾値サイクル数(Ct)値(2倍の鋳型の希釈物により、およそ1Ctのシフトが生じる)が明白に示され、これは、メッセンジャーRNA分子のポリ(A)部分とハイブリダイズしている一本鎖オリゴヌクレオチドの環状化および検出を利用して、試料中に含有されるmRNAの量を検出することができ、したがって、全体の遺伝子発現レベルを試料の総mRNA含有量に対して正規化するためのツールとして利用することができることを実証している。標的RNAが存在しないもの(NTC)では、シグナルは検出されない。全ての増幅反応を3回実施し、平均Ct値を算出した。
Claims (15)
- 試料中の定量化される核酸の数量を、
(i)前記試料中の核酸の総数量、または
(ii)前記試料中の特定のクラスの核酸の総数量
に対して正規化するための方法であって、
(a)定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、
(b)1種以上の第1の核酸プローブを、前記第1の核酸プローブ(複数可)の少なくとも末端領域が前記試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で前記試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブ(複数可)が、1種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
(c)ハイブリダイズした後の3’末端および5’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ(複数可)の任意の2つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、前記試料中の前記ハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、
(d)前記第1の核酸プローブ(複数可)の限定された領域と実質的に相補的な第2のプローブまたは挿入dsDNA特異的蛍光色素を使用してステップ(c)からのライゲーション産物を定量化することによって、核酸の総量または前記特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、
(e)前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第3のプローブまたは挿入dsDNA特異的蛍光色素を使用して、前記定量化される核酸を定量化するステップと、
(f)前記定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または前記特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、前記定量化される核酸の数量を正規化するステップと
を含む方法。 - 前記定量化される核酸がRNAであり、前記特定のクラスの核酸がRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記定量化されるRNAが、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、マイクロRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスRNAからなる群から選択されるRNAであり、RNAの総数量が、RNAの総数量、mRNAの総数量、rRNAの総数量、tRNAの総数量、nRNAの総数量、siRNAの総数量、snRNAの総数量、snoRNAの総数量、scaRNAの総数量、マイクロRNAの総数量、dsRNAの総数量、リボザイムの総数量、リボスイッチの総数量、ウイルスRNAの総数量からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記定量化されるRNAがmRNAであり、前記特定のクラスの核酸がmRNAである、請求項3に記載の方法。
- 前記特異的な結合部位がmRNAに対して特異的である、ホモポリマーの配列である、またはポリA配列もしくはポリA尾部である、請求項4に記載の方法。
- 前記定量化される核酸がDNAであり、前記特定のクラスの核酸がDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記定量化されるDNAが、cDNA、dsDNA、ssDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、染色体DNA、ウイルスDNAおよびmtDNAからなる群から選択されるDNAであり、DNAの総数量が、DNAの総数量、cDNAの総数量、dsDNAの総数量、ssDNAの総数量、プラスミドDNAの総数量、コスミドDNAの総数量、染色体DNAの総数量、ウイルスDNAの総数量およびmtDNAの総数量からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記定量化されるDNAがcDNAであり、前記特定のクラスの核酸がcDNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記特異的な結合部位がポリT配列またはポリT尾部である、請求項8に記載の方法。
- 定量化が、定量的リアルタイムPCRまたは定量的リアルタイム等温増幅を含む、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションステップの後に、前記試料中のRNAおよび/または前記特定のクラスのRNAの逆転写を可能にする条件下で、前記試料中のRNAを逆転写酵素と接触させるステップをさらに含む、請求項2から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションされる2つの末端領域が、別々の核酸プローブの一部である、または同じ核酸プローブ上にある、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸プローブおよび第3の核酸プローブが、1種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
(a)前記試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な1種以上の第1の核酸プローブであって、1種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて1つのプローブ結合部位を含む第1の核酸プローブと、
(b)リガーゼと、
(c)前記第1の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第2の核酸プローブまたはdsDNA特異的蛍光色素と
を含むキット。 - 特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、または遺伝子発現解析のための、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法または請求項14に記載のキットの使用。
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