CN104862400B - 一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法，该方法包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，所述酶切目标核酸序列所采用的试剂包括上、下游的定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明方法具有简单、特异性高、灵敏度高和通用性强等优势，彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题，降低了目前等温扩增方法中引物设计的难度，有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法。
背景技术
核酸体外扩增技术是目前临床化学中发展最为迅速的技术领域之一。对核酸的扩增检测无论在操作上还是时效上均比其他检测技术更为实用，因此颇受研究者和仪器开发商的青睐。聚合酶链式反应(PCR)作为核酸扩增的革命性技术经过三十多年的发展已牢牢占据领导地位，并涌现多种衍生技术如逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR(Real-time PCR)、多重PCR(Multiplex PCR)、巢式PCR(Nested PCR)等。然而，这些技术严重依赖于温度循环来实现核酸链的变性、退火和延伸三步骤，均属于变温核酸扩增技术。
近年来，等温核酸扩增技术已悄然兴起，并得以迅猛发展，不仅丰富了核酸扩增技术的内容，还代表着核酸扩增技术发展的新趋势。目前，等温核酸扩增技术有基于核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、RNA的信号介导扩增技术(Signal mediated amplification of RNA technology，SMART)、链置换扩增技术(Strand displacement amplification，SDA)、滚环扩增技术(Rolling circleamplification，RCA)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、单引物等温扩增技术(Single primer isothermal amplification，SPIA)、解旋酶依赖型扩增技术(Helicase-dependent amplification，HDA)和基因组指数扩增反应(Genome exponential amplification reaction，GEAR)等。这些等温扩增技术能在较短的时间内实现目标核酸序列的指数扩增，且无需特定的温度循环，比变温扩增技术具备更强的现场和床旁检测应用潜能。
然而，尽管这些技术均有其十分独特的优势，但同时也存在各自的局限。为了实现目标核酸序列以及新生成的反义序列的循环利用，常常需要复杂的引物设计，例如LAMP需要针对目标核酸序列的6个区域设计至少4条引物，这不仅要依赖于专业的设计软件，还要求设计者具有丰富的经验。SDA等虽然具有相对简单的反应机理，但由于内切酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖，其通用性受到了很大挑战。为了在目标核酸中引入内切酶的识别序列，也不得不诉诸于复杂的引物设计，这不仅大大增加了非特异性扩增的严重程度，同时加大了扩增失败的风险。另一方面，这些技术几乎都是从引物的延伸来启动扩增反应的，即首先由引物(含特定碱基序列的寡核苷酸链)来识别目标核酸序列，并在聚合酶作用下沿目标核酸序列延伸，紧接着该延伸产物从目标核酸序列脱离以实现循环扩增。采用这种方式来启动扩增反应的主要缺点在于缺乏有效的手段来抑制非特异性扩增反应，这是目前绝大多数等温指数扩增方法尚未解决的难题。因此，亟需进一步发展更加简单、通用、高灵敏、高特异性的核酸等温指数扩增方法。
发明内容
本发明提供了一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法，该方法不仅能够克服内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决目标核酸序列任意剪切继而引发扩增反应的难题，还能降低引物设计的难度，同时提高方法的通用性、灵敏度与特异性。
一种核酸等温扩增方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，酶切目标核酸序列所采用的试剂包括上、下游的定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。
上述方法中内切酶与所述的定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链的识别区与目标核酸序列进行杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的精确剪切。
上述核酸等温扩增方法是在现有链置换扩增技术(Strand displacementamplification,SDA)的基础上做的重要改进，该方法的整个反应体系中，主要包括以下组分：目标核酸序列，具有链置换活性的核苷酸聚合酶(简称聚合酶)，上、下游引物，上、下游定位探针，内切酶，反应缓冲液，dNTPs和镁离子；其中，上、下游引物至少包含3’端的保护结构(即：终止剂或垂悬序列)，可与目标核酸序列特异性杂交的目标核酸识别序列，可供内切酶结合的内切酶识别序列。
该方法的具体反应原理，如下：
a)反应体系中，上游定位探针与目标核酸序列的上游序列(位于目标核酸序列的3’端)特异性结合后，内切酶与上游定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸上游序列的特定位点进行剪切；
b)被剪切后的目标核酸序列与上游定位探针分离，转而与上游引物结合，并在聚合酶的作用下，以上游引物为模板，沿上游引物的5’端进行延伸，延伸的核酸序列与上游引物序列形成双链的内切酶识别区域；
c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对上游引物上的内切酶剪切位点进行剪切，形成切口；接着，聚合酶以该切口为起始点，以目标核酸序列为模板，沿目标核酸序列的5’端进行延伸，不仅置换掉原有的部分引物序列，而且延伸获得目标核酸序列的反义序列(该反义序列仅包含目标核酸序列5’末端到内切酶剪切位点之间的互补序列)；然后，内切酶再次剪切上述上游引物的内切酶剪切位点，形成切口，在聚合酶的作用下进行引物延伸、置换掉所述的反义序列，形成新的反义序列，通过上述过程的不断重复，反应体系中，形成了大量的目标核酸序列的反义序列；
d)再以上述反义序列为目标核酸序列，下游定位探针会与反义序列(位于反义序列的3’端)特异性结合，然后，内切酶与下游定位探针的双链结合区结合，并对反义序列的特定位点进行剪切；
e)被剪切后的反义序列与下游定位探针分离，转而与下游引物结合，并在聚合酶的作用下，以下游引物为模板，沿下游引物的5’端进行延伸，延伸的核酸序列与下游引物序列形成双链的内切酶识别序列；
f)内切酶与e)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对下游引物上的内切酶剪切位点进行剪切，形成切口；接着，聚合酶以该切口为起始点，以反义序列为模板，沿反义序列的5’端进行延伸，不仅置换掉原有的部分引物序列，而且延伸获得目标核酸序列的同义序列(该同义序列仅包含目标核酸序列5’端和3’端剪切后剩余的序列)；然后，内切酶再次剪切上述下游引物的内切酶剪切位点，形成切口，在聚合酶的作用下进行引物延伸、置换掉所述的同义序列，形成新的同义序列，通过上述过程的不断重复，反应体系中，形成了大量的目标核酸序列的同义序列；
g)通过上述过程，可以获得大量的目标核酸序列的待扩增部分序列(即f)中的同义序列)，然后，再通过上、下游引物进行指数扩增，即：上述同义序列与上游引物结合，并以上游引物为模板进行延伸，形成双链内切酶识别序列；上游引物被剪切后，以该同义序列为模板进行延伸，获得该同义序列的反义序列，不断重复此过程可以生成越来越多的该反义序列。同理，该反义序列与下游引物又可以继续生成上述的同义序列，最终实现从目标核酸序列中待扩增部分序列的指数扩增。
核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来确定。
本发明所述的“靠近”是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位点间的核苷酸数量来确定。
作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。
理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：
所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。
若以两条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补区域中至少包含一段与目标核酸序列互补的识别区，当然，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来定。说明书附图1B中提供的即为两条核苷酸链形式的核酸定位探针中的一种具体形式，图中3’侧臂和5’侧臂位于双链的同侧，且均含有一段识别区，该结构的核酸定位探针有助于提高核酸定位探针与目标核酸序列结合的稳定性，提高剪切效率。为了提高核酸定位探针的稳定性，双链中非内切酶识别序列的长度可依据所需退火温度进行调整；增加两单链识别区的序列长度也可以促进核酸定位探针双链结合区的形成与稳定。
若以单条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针中应有两段互补的序列，并杂交形成带单链环的茎环结构，上述茎环结构能够提高核酸定位探针的稳定性。上述单链环的核苷酸数≥0，≤50；单链环的核苷酸数为0时，是指互补区域的一端通过最末两个核苷酸之间的磷酸二酯键连接。当然，该核酸定位探针的未互补区域也应具有至少一段与目标核酸序列互补的识别区。作为优选，上文所述定位探针的3’末端处具有保护结构，例如：3’终止剂或3’悬垂序列，其中，3’悬垂序列的核苷酸数目为0～5，3’终止剂包括：Inverted-dT、3’-propyl phosphate、dideoxyC。
作为优选，扩增采用的引物包括依次连接的目标核酸识别序列、连接序列和内切酶识别序列，引物3’端设有终止序列或垂悬序列。其中，3’悬垂序列的核苷酸数目为0～5，3’终止剂包括Inverted-dT、3’-propyl phosphate、dideoxy C。连接序列用于调节剪切位点。更优选，扩增采用的引物包括依次连接的目标核酸识别序列、连接序列、内切酶识别序列和稳定序列，引物3’端设有终止序列或垂悬序列。
上述定位探针和引物的3’末端均连接有保护结构，其作用在于，既可以防止引物先沿目标核酸序列延伸而致定位探针不能与目标核酸序列结合，又可以防止定位探针沿目标核酸序列延伸而致剪切后的目标核酸序列不能离去，二者均使扩增反应不能被启动。另一方面，终止剂作为3’保护结构还可以防止引物二聚体作用，以降低非特异性扩增。
所述的内切酶为切口内切酶，包括：Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、N.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI。
所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。
所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的核苷酸聚合酶，包括Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)聚合酶、Klenow DNA聚合酶。
本发明还提供了一种核酸等温扩增试剂盒，包括：具有链置换活性的核苷酸聚合酶，上、下游引物，内切酶；此外，还包括定位探针；所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性结合的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。该试剂盒中还包含扩增所需的基本原料，如dNTPs、镁离子等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法利用含内切酶双链识别序列的上、下游定位探针，含内切酶单链识别序列的上、下游引物，内切酶和DNA聚合酶在等温条件下对目标核酸序列进行指数式扩增。该方法具有简单、灵敏度与特异性高、通用性强等优势，彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题，降低了等温扩增方法中引物设计的难度，有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围，是对目前核酸分子检测技术手段的重要改进和补充，可应用于微生物检测、肿瘤标志物鉴定和转基因成分筛查等方面。
附图说明
图1为本发明定位探针的结构示意图(阴影部分为内切酶识别区域)；
A为茎环结构的核酸定位探针，B为由两条寡核苷酸链杂交形成的非茎环结构的核酸定位探针；阴影部分为内切酶识别序列区域；圆点代指3’保护结构(以3’终止剂作为保护结构为例)。
图2为本发明引物的结构示意图，圆点代指3’保护结构(以3’终止剂作为保护结构为例)。
图3为本发明方法的反应原理示意图(以茎环结构定位探针和3’终止剂作为保护结构为例)；
P11表示上游定位探针；P21表示下游定位探针；P12表示上游引物；P22表示下性引物。
图4为实施例1中验证扩增产物的琼脂糖凝胶(3％)电泳结果图；
其中，阳性道电泳物来自含浓度为1pM目标核酸序列的实验组，阴性道电泳物来自不含目标核酸序列的空白组。
图5为实施例2中验证本发明扩增特异性的实时荧光变化曲线图；
a为不含目标核酸序列的空白对照组(None)；b为含与定位探针/引物完全配对的目标核酸序列(T2)的实验组；c,d,e均为含有一个错配碱基的目标核酸序列(T3,T4,T5)的实验组，但各自的错配碱基所在位置不同。
图6为实施例3中验证本发明扩增灵敏度的实时荧光变化曲线图；
a为不含目标核酸序列的空白对照组(None)；b为含10-18M浓度目标核酸序列的实验组；c为含10-16M浓度目标核酸序列的实验组；d为含10-14M浓度目标核酸序列的实验组；e为含10-12M浓度目标核酸序列的实验组；f为含10-10M浓度目标核酸序列的实验组。
图7为实施例4中利用分子信标探针对扩增产物进行检测的实时荧光变化图；1fM指含浓度为1fM目标核酸序列的实验组，NTC指不含目标核酸序列的空白组。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例具体说明本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明的反应体系主要包括目标核酸序列，上、下游定位探针(如图1)，上、下游引物(如图2)，内切酶和具链置换活性的DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTPs和镁离子；其反应原理如图3所示；具体的扩增反应过程如下：
a)上游定位探针P11与目标核酸序列的上游序列(位于目标核酸序列的3’端)特异性结合后，内切酶与上游定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸上游序列的特定位点进行剪切；
b)被剪切后的目标核酸序列与上游定位探针P11分离，转而与上游引物P12结合，并在聚合酶的作用下沿上游引物P12延伸，形成双链的内切酶识别序列；
c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，对上游引物P12进行剪切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列的反义序列T0；
d)反义序列T0与下游定位探针P21结合，被内切酶剪切；
e)被剪切后的反义序列与下游定位探针P21分离，转而与下游引物P22结合，并在聚合酶的作用下沿下游P22引物延伸，形成双链的内切酶识别序列；
f)内切酶绑与e)中形成的双链的内切酶识别序列结合，对下游引物P22进行剪切以形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的同义序列T1；
g)同义序列T1与上游引物P12结合，在聚合酶的作用下沿上游引物P12延伸，形成双链的内切酶识别序列；
h)内切酶与g)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对上游引物P12进行剪切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的反义序列T2；
i)反义序列T2与下游引物P22结合，在聚合酶的作用下沿下游引物P22延伸，形成双链的内切酶识别序列；
j)内切酶绑与i)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对下游引物P22进行剪切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸过程不断重复，生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的同义序列T1；
k)步骤g到j不断重复，整个过程进入指数反应阶段。
随着扩增反应不断进行，将生成大量的序列T1和序列T2，由于二者为互补序列，可杂交成双链，因而将使双链特异性荧光染料SYBR Green I的荧光信号逐渐增强，从而实现对目标核酸序列的扩增检测。此外，也可以用序列特异性荧光探针，如用分子信标探针，进行信号检测。
实施例1
在该实施列中，使用人工合成的目标核酸序列来验证该方法的可行性。根据目标核酸序列的剪切位点和长度要求设计相应的定位探针和引物，使用琼脂糖凝胶(3％)电泳来分析扩增产物。反应原理参见图3，具体步骤如下：
(1)取2个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mMNaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，0.1μLBst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1μLdNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、0.25μL上游定位探针P1(浓度为10μM)、0.25μL下游定位探针P2(浓度为10μM)、0.25μL上游引物L1(浓度为10μM)、0.25μL下游引物L2(浓度为10μM)和12.8μL水，标号a、b；
(2)取2.5μL浓度为10pM的目标核酸序列T1加入a管，使管内目标核酸序列的终浓度为1pM，另取2.5μL无核酸酶水加入b管；
(3)往上述2管内均加入0.5μL SYBR Green I(浓度为25×)。
(4)将上述2管溶液置于55℃温育40分钟；
(5)取出反应液进行琼脂糖凝胶(3％)电泳，记录电泳图。
上述目标核酸序列T1的序列如下：
T1：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTCCTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.1)(下划线部分为最终大量产生的37bp的序列部分)。
上游定位探针P1序列如下：
P1：5’-GAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAGCAATACGAC-(Inverted dT)-3’(SEQ ID No.2)(3’端采用Inverted dT终止修饰，下同)；
下游定位探针P2序列如下：
P2：5’-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACTCCTGTAAG-(InverteddT)-3’(SEQ ID No.3)；上游引物L1序列如下：
L1：5’-ATGCATGCATGAGTCAGGAGCAATACGAC-(InverteddT)-3’(SEQ ID No.4)；
下游引物L2序列如下：
L2：5’-ATGCATGCATGAGTCGCACACTCCTGTAAGG-(InverteddT)-3’(SEQ ID No.5)；
实验结果如图4所示，阳性道电泳物来自含浓度为1pM目标核酸序列的实验组，阴性道电泳物来自不含目标核酸序列的空白组。电泳结果显示，含有1pM目标核酸分子的实验组所在泳道(即图中阳性道)有明显的目标条带(本验证例子中为37bp)，而空白组所在泳道(即图中阴性道)则无明显的该目标条带条带，说明本方法能产生符合设计预期的扩增子，证明了本方法的反应机理。
实施例2
本实施例用于验证本发明方法的扩增特异性。在该实施列中，待测物为人工合成的目标核酸序列(与定位探针/引物完全匹配)和错配核酸序列(只有一个碱基错配)，根据目标序列的剪切位点和长度要求设计相应的上下游定位探针和上下游引物，使用依赖双链DNA的特异性荧光染料SYBR Green I来显示信号变化。检测原理参见图3，具体步骤如下：
(1)取5个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mMNaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，0.1μLBst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1μLdNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、0.25μL上游定位探针P3(浓度为10μM)、0.25μL下游定位探针P4(浓度为10μM)、0.25μL上游引物L3(浓度为10μM)、0.25μL下游引物L4(浓度为10μM)和12.8μL水，标号a、b、c、d、e；
(2)取2.5μL浓度为10fM的目标核酸序列T2、T3、T4、T5分别加入b、c、d、e、管，使每管内目标核酸序列的终浓度均为1fM，另取2.5μL无核酸酶水加入a管；
(3)往上述5个管内均加入0.5μL SYBR Green I(浓度为25×)；
(4)将上述5个管溶液置于55℃温育90分钟，测定各管溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
T2：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTCCTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.1，与实施例1的T1相同)；
T3：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTCATCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.7)(下划线处的碱基与上游定位探针P1对应位置的碱基错配，下同)；
T4：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTACTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.8)；
T5：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCACCTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.9)。
上游定位探针P3序列如下：
P3：5’-GAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAGCAATACGAC-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.2，与实施例1的P1相同)(3’端采用Inverted dT终止修饰，下同)；
下游定位探针P4序列如下：
P4：5’-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACTCCTGTAAG-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.3，与实施例1的P2相同)；
上游引物L3序列如下：
L3：5’-ATGCATGCATGAGTCAGGAGCAATACGAC-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.4，与实施例1的L1相同)；
下游引物L4序列如下：
L4：5’-ATGCATGCATGAGTCGCACACTCCTGTAAGG-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.5，与实施例1的L2相同)；
实验结果如图5所示，a为不含目标核酸序列的空白对照组(None)；b为含目标核酸序列(T2)的实验组；c,d,e均为含有一个错配碱基的错配核酸序列(T3T4,T5)的实验组，但各自的错配碱基所在位置不同。图中结果显示，目标核酸序列实验组的荧光起峰时间均早于错配核酸序列实验组以及空白对照组，说明本发明方法用于核酸分子扩增检测时具有高特异性。
实施例3
本实施例用于验证本发明方法的扩增灵敏度。在该实施列中，使用人工设计、合成的目标序列来检测该方法的检测灵敏度。根据目标序列的剪切位点和长度要求设计相应的定位探针和引物，使用依赖双链DNA的特异性荧光染料SYBR Green I来显示信号变化。检测原理参见图3，具体步骤如下：
(1)取6个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mMNaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，0.1μLBst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1μLdNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、0.25μL上游定位探针P5(浓度为10μM)、0.25μL下游定位探针P6(浓度为10μM)、0.25μL上游引物L5(浓度为10μM)、0.25μL下游引物L6(浓度为10μM)和12.8μL水，标号a、b、c、d、e、f；
(2)取2.5μL浓度为10-18M、10-16M、10-14M、10-12M和10-10M的目标核酸序列T6分别加入b、c、d、e、f管，另取2.5μL无核酸酶水分别加入a管；
(3)往上述5个管内均加入0.5μL SYBR Green I(浓度为25×)；
(4)将上述6个管的溶液置于55℃温育90分钟，测定各管溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
上述目标核酸序列T6的序列如下：
T6：5‘-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTCCTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.1，与实施例1的T1相同)(下划线部分为最终大量产生的序列部分，下同)。
上游定位探针P5序列如下：
P5：5’-GAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAGCAATACGAC-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.2，与实施例1的P1相同)；
下游定位探针P6序列如下：
P6：5’-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACTCCTGTAAG-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.3，与实施例1的P2相同)；
上游引物L5序列如下：
L5：5’-ATGCATGCATGAGTCAGGAGCAATACGAC-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.4，与实施例1的L1相同)；
下游引物L6序列如下：
L6：5’-ATGCATGCATGAGTCGCACACTCCTGTAAGG-(Invert dT)-3’(SEQ ID No.5，与实施例1的L2相同)；
实验结果如图6所示，a为不含目标核酸序列的空白对照组(None)；b为含10-18M浓度目标核酸序列的实验组；c为含10-16M浓度目标核酸序列的实验组；d为含10-14M浓度目标核酸序列的实验组；e为含10-12M浓度目标核酸序列的实验组；f为含10-10M浓度目标核酸序列的实验组。图中结果显示，5个浓度梯度的目标核酸序列可以很好地按出峰时间顺序区分开，且与空白组的阴性曲线的出峰时间相距较远。说明本发明方法具有很高的灵敏度，可检测低至10-18M低浓度的目标核酸序列。
实施例4
在该实施列中，使用人工合成的目标核酸序列来检测该方法的检测灵敏度。根据目标核酸序列的剪切位点和长度要求设计相应的定位探针和引物，使用分子信标探针来显示信号变化。反应原理参见图3，具体步骤如下：
(1)取6个EP管，各加入2.5μL反应缓冲液(100mMNaCl、50mM Tris-HCl、60μg/mLBSA)，0.6μL内切酶Nt.BstNBI(浓度为10U/μL)，0.1μLBst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)，1μLdNTPs(浓度为10mM)，4μL MgCl2(浓度为25mM)、0.25μL上游定位探针P7(浓度为10μM)、0.25μL下游定位探针P8(浓度为10μM)、0.25μL上游引物L7(浓度为10μM)、0.25μL下游引物L8(浓度为10μM)和12.8μL水，标号a、b、c、d、e、f；
(2)取2.5μL浓度为10fM的目标核酸序列T7分别加入a、b、c管，使每管内目标核酸序列的终浓度均为1fM，另取2.5μL无核酸酶水分别加入d、e、f管；
(3)往上述6个管内均加入0.5μL分子信标探针MB(浓度为10μM)；
(4)将上述6个管的溶液置于55℃温育60分钟，测定各管溶液的荧光随时间的变化，采集时间间隔为1分钟。
上述目标核酸序列T7的序列如下：
T7：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAACGTCGTATTGCTCCTCTGGTCTCTC-3’(SEQ ID No.1，与实施例1的T1相同)。
上游定位探针P7序列如下：
P7：5’-GAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAGCAATACGAC-(Invert ed dT)-3’(SEQ ID No.2，与实施例1的P1相同)；
下游定位探针P8序列如下：
P8：5’-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACTCCTGTAAG-(Invert eddT)-3’(SEQ ID No.3，与实施例1的P2相同)；
上游引物L7序列如下：
L7：5’-ATGCATGCATGAGTCAGGAGCAATACGAC-(InverteddT)-3’(SEQ ID No.4，与实施例1的L1相同)；
下游引物L8序列如下：
L8：5’-ATGCATGCATGAGTCGCACACTCCTGTAAGG-(Inverted:dT)-3’(SEQ ID No.5，与实施例1的L2相同)；
分子信标探针MB序列如下：
MB：5’-FAM-CGTCACAGATGATGGGATGGTTAGGTGACG-Dabcyl-3’(SEQ ID No.6)(下划线部分和目标核酸序列的下划线部分完全互补)。
实验结果如图7所示，1fM指含浓度为1fM目标核酸序列的实验组，NTC指不含目标核酸序列的空白组。图中结果显示，含目标核酸序列的实验组中分子信标探针荧光显著增强，而空白组的荧光无变化，说明本发明方法能够产生与分子信标互补的扩增产物，证明了本方法应用分子信标探针进行高灵敏检测的可行性。
Claims (7)
1.一种核酸等温扩增方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，其特征在于，所述核酸等温扩增方法所采用的试剂包括上、下游的定位探针、内切酶、具有链置换活性的核苷酸聚合酶和上、下游引物；所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区；所述定位探针的3’端设有终止剂或垂悬序列；所述上、下游引物包括依次连接的目标核酸识别序列、连接序列和内切酶识别序列；所述上、下游引物的3’端还设有终止序列或垂悬序列；所述内切酶为切口内切酶；
所述核酸等温扩增的过程，包括：
a)上游定位探针与目标核酸序列的上游序列特异性结合后，内切酶与上游定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸上游序列的特定位点进行剪切；
b)被剪切后的目标核酸序列与上游定位探针分离，转而与上游引物结合，并在聚合酶的作用下，以上游引物为模板，沿上游引物的5’端进行延伸，延伸的核酸序列与上游引物序列形成双链的内切酶识别区域；
c)内切酶与b)中所述内切酶识别区域结合，并对上游引物上的内切酶剪切位点进行剪切，形成切口；聚合酶以该切口为起始点，以目标核酸序列为模板，获得目标核酸序列的反义序列；
d)以所述反义序列为目标核酸序列，下游定位探针与反义序列特异性结合，内切酶与下游定位探针的双链结合区结合，并对反义序列的特定位点进行剪切；
e)被剪切后的反义序列与下游定位探针分离，转而与下游引物结合，并在聚合酶的作用下，以下游引物为模板，沿下游引物的5’端进行延伸，延伸的核酸序列与下游引物序列形成双链的内切酶识别序列；
f)内切酶与e)中所述内切酶识别序列结合，并对下游引物上的内切酶剪切位点进行剪切，形成切口；聚合酶以该切口为起始点，以反义序列为模板，获得目标核酸序列的同义序列；
g)通过a)～f)获得大量反义序列和同义序列，再通过上、下游引物进行指数扩增。
2.如权利要求1所述的核酸等温扩增方法，其特征在于，所述定位探针包含两段单链，两段单链连接于双链的同一端。
3.如权利要求1所述的核酸等温扩增方法，其特征在于，所述定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
4.如权利要求3所述的核酸等温扩增方法，其特征在于，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。
5.如权利要求1所述的核酸等温扩增方法，其特征在于，所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。
6.如权利要求1所述的核酸等温扩增方法，其特征在于，所述定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。
7.一种核酸等温扩增试剂盒，包括：具有链置换活性的核苷酸聚合酶，上、下游引物，内切酶，其特征在于，所述内切酶为切口内切酶；还包括定位探针；所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区；所述内切酶与所述双链结合区进行结合，并通过识别区与目标核酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，完成对目标核酸序列的剪切。
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