CN104877917A - 一种牛樟芝诱变菌株及培育方法 - Google Patents

一种牛樟芝诱变菌株及培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株牛樟芝诱变菌株，已于2015年5月3日保藏《中国典型培养物保藏中心》，一种命名为：牛樟芝AC09；Antrodiacamphorata AC09，保藏号为：CCTCC NO：M2015274。该诱变菌株的菌丝体干重、腺苷、三萜化合物及多糖的含量均有明显提高，其中菌体干重较原出发菌提高了63.00%；腺苷含量提高了41.7％；三萜化合物含量提高了74.9%；多糖含量提高了53.1%。

Description

一种牛樟芝诱变菌株及培育方法
技术领域：
本发明公开的一种牛樟芝诱变菌株，为一种新的菌株品种，其菌丝体干重及有效成分腺苷、多糖和三萜化合物的产量和原始菌株相比具有显著提高，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术：
樟芝（Antrodiacamphorata），又名牛樟芝或牛樟菇，属于担子菌纲、非褶菌目、多孔科、多年生担子菌，只生长在台湾地区的牛樟树腐朽树干的内壁。牛樟芝在台湾中医药界己使用多年,普遍认为其气芳香味辛苦、平。认为具有温中散结、祜风行气、活血化疲、解毒消肿、镇静止痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提升免疫力的效果;针对腹湾、胃肠疼痛、食物毒蕈中毒、糖尿病、脂肪肝、酒精性肝硬化、肝癌等有独特的功效。牛樟芝有许多的活性成分,如多糖体、超氧歧化酶、三萜类化合物、腺苷、免疫蛋白、微量元素、维生素、核酸、凝集素、纤维素、氨基酸等。其中以三萜类化合物高达200种以上使得牛樟芝具有抗癌、保肝等功效。
发明内容：
本发明的目的是提供一种牛樟芝诱变菌株，为一种新的菌株，其菌丝体干重及有效成分腺苷、多糖和三萜化合物的产量和原始菌株相比具有显著提高。
本发明公开了上述菌的培育方法。
本发明还提供了牛樟芝诱变菌株培养工艺条件优化。
本发明公开的牛樟芝诱变菌株，命名为：牛樟芝AC09；Antrodiacamphorata. AC09，该诱变菌株已于2015年5月3日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO：M 2015274，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于非褶菌目，多孔菌科，薄孔菌属，多年生覃菌类。
本发明所述的高产牛樟芝诱变菌株AC09，其有以下方法诱变选育而制得，以牛樟芝（ATCC200183）为出发菌株，采用化学诱变处理技术，选育出高产牛樟芝高产突变菌株AC09。
牛樟芝诱变菌株AC09的特征为：菌丝体干重、腺苷、三萜化合物及多糖的含量均有明显提高，其中菌体干重较原出发菌提高了63.00 %；腺苷含量提高了41.7％；三萜化合物含量提高了74.9%；多糖含量提高了53.1%。
本发明所述的牛樟芝诱变菌株的诱变方法，包括以下步骤完成：
1) 将牛樟芝菌株ATCC200183，以5%接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为：葡萄糖15.2471g/L，蛋白胨8.3179g/L，酵母浸粉9.7392g/L，MgSO4·7H2O
0.0237g/L和VB10.0310g/L。26℃恒温摇床中120rpm培养7天，无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液；
2) 在无菌条件下取1mL步骤1)中得到的孢子悬液加入10mLNTG（10mg/mL）中，分别于诱变0、10、15、20min后，取0.3mL孢子悬液于2.7mL无菌蒸馏水中并逐级稀释，涂布于种子培养基平板上培养7天，将菌株于96孔板保存；
3）将培养好的突变株用接种针逐个接种至种子培养基中进行活化，于26℃恒温摇床中150rpm培养7天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和三萜化合物含量，以筛选高产突变株。采用HPLC法测定菌丝体中腺苷和三萜化合物含量；采用蒽铜－硫酸法测定总糖含量。
本发明的积极效果在于：通过诱变得到的新牛樟芝菌株，其菌丝体干重及有效成分腺苷、多糖和三萜化合物的产量和原始菌株相比具有显著提高。
附图说明
图1为原出发菌株与突变株的有效成分比较；
图2为葡萄糖浓度和酵母浸粉浓度对D值影响的响应面和等高线图。
具体实施方式
实施例1
牛樟芝诱变株AC09的诱变和选育方法
本发明所述获得高产牛樟芝诱变菌株AC09的诱变方法为亚硝基胍诱变。
将牛樟芝菌株ATCC200183，以5%接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为：葡萄糖15.2471g/L，蛋白胨8.3179g/L，酵母浸粉9.7392g/L，MgSO4·7H2O
0.0237g/L和VB10.0310g/L。26℃恒温摇床中120rpm培养7天，无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液；
2) 在无菌条件下取1mL步骤1)中得到的孢子悬液加入10mLNTG（10mg/mL）中，分别于诱变0、10、15、20min后，取0.3mL孢子悬液于2.7mL无菌蒸馏水中并逐级稀释，涂布于种子培养基平板上培养7天，将菌株于96孔板保存；
3）将培养好的突变株用接种针逐个接种至种子培养基中进行活化，于26℃恒温摇床中150rpm培养7天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和三萜化合物含量，以筛选高产突变株。采用HPLC法测定菌丝体中腺苷和三萜化合物含量；采用蒽铜－硫酸法测定总糖含量。
共得到4株高产菌株分别命名为AC03、AC09、AC32和AC49，其中AC09的干重、腺苷、多糖和三萜化合物含量均高于出发菌株，这四株突变株与出发菌株的有效成分比较见图1。选取AC09为高产突变株，命名为：牛樟芝AC09（Antrodiacamphorata. AC09），该诱变菌株已于2015年5月3日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO:M 2015274，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株菌株属于非褶菌目，多孔菌科，薄孔菌属，多年生覃菌类。
实施例2
牛樟芝诱变株AC09与出发菌株（ATCC200183）比较及遗传稳定性考察
将原出发菌株（ATCC200183）与诱变菌株AC09分别再种子培养基（葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO40.25g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，维生素B10.01g/L）中，于26℃，150rpm，培养7d进行发酵培养，牛樟芝诱变菌株菌丝体干重、腺苷、三萜化合物及多糖的含量均有明显提高，其中，菌体体干重达10.3g/L，较原出发菌提高了63.00%；腺苷含量可达0.152g/L，较原出发菌提高了41.7％；三萜化合物含量可达0.126g/L，较原出发菌提高了74.9%；多糖含量可达31.3mg/kg，较原出发菌提高了53.1%。
表1 原出发菌株与诱变菌株AC09有效成分含量比较
为了研究诱变菌株的高生产性能遗传特性是否稳定，采用群体传代的方法考察了诱变菌株AC09的遗传稳定性，菌株连续传接十代，每一代分别接种到种子培养基中，于26℃，150rpm，培养7d进行发酵培养，发酵结束后测有效成分的产量。
表2 诱变菌株AC09遗传稳定性考察
。
实施例3
牛樟芝诱变株AC09发酵培养基的筛选
①期望函数的建立
分别以菌体干重，胞内多糖，腺苷，胞内三萜化合物为考察指标，对诱变菌株AC09发酵工艺进行优化，采用期望函数将多个考察指标综合为一个考察指标期望值（D），每一个考察指标（响应值）均按式（1）转换成无量纲的期望值，期望函数的平衡尺度d范围为0～1，d=0时说明响应值严重偏离目标值，d=1说明响应值与目标值接近。d随着所期望的响应值增加而增加。
为第i个考察指标的响应值，Li为第i个考察指标期望不能低于该响应值；Ei第i个考察指标期望的最高响应值。
wi为第i个指标的权重值，牛樟芝发酵的考察指标和期望最低响应值，期望最高响应值及权重值如表3
表3指标和期望最低响应值，最高响应值及权重值
②牛樟芝诱变株AC09发酵碳源筛选
以种子培养基为初始培养基。分别考察以葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘油、淀粉作为碳源，碳源浓度为20g/L其它成分固定，进行发酵培养，筛选出20g/L葡萄糖为最优碳源。发酵条件为：种龄为5d，接种量为10%，装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温度26℃，摇床转速为150rpm，培养时间为57d。
③牛樟芝菌诱变株AC09发酵氮源筛选
以20g/L葡萄糖碳源，分别采用15g/L乙酸胺、多价蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、酵母浸粉和酵母膏，而其它成分不变进行发酵培养，筛选出15g/L酵母浸粉为最适氮源，蛋白胨次之。
④PB试验筛选牛樟芝诱变株AC09发酵培养基中影响显著的成分
在以上试验的基础上，进行BP试验筛选葡萄糖、酵母浸粉及无机盐对诱变菌株AC09发酵影响显著的成分。结果其中的葡萄糖（X 1）、酵母浸粉（X 2）、KH2PO4（X 7）为显著项。因此，选用葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4进一步优化。
表4变菌株AC09培养基筛选的PB试验的因素水平表
⑤爬坡试验逼近影响显著成分的最优浓度
在BP试验的基础进行爬坡试验设计，使影响显著成分的浓度接近最优区域。
⑥牛樟芝诱变株AC09发酵中心组合设计试验
在以上试验的基础上进行中心组合试验，葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4以期精确优化牛樟芝发酵培养基，分别采用多元二次回归模型（RSM），对试验结果进行相应的分析并搜寻最优培养基方案。对RSM拟合的模型进行统计分析，图2显示葡萄糖和酵母浸粉的交互作用对期望值D的影响，从图中可以看出葡萄糖的浓度和KH2PO4的浓度对期望值D影响显著，交互作用显著。统计学分析方法得到的最佳培养基配方为：葡萄糖浓度为22.15g/L，蛋白胨11.24g/L，酵母浸粉为10.38g/L；KH2PO40.34g/L；MgSO4·7H2O0.2g/L；VB10.02g/L。在培养条件为：150rpm，26℃，培养5d。
⑦牛樟芝诱变株AC09发酵验证试验
用最优的培养基方案进行3次平行发酵试验，以确定模型和优化方法的可靠性和准确性。
表5樟芝诱变株AC09发酵验证试验结果
试验号 干重/g·L-1 腺苷/g·L-1 三萜化合物/g·L-1 多糖/mg·kg-1
1 13.15 0.157 0.127 30.3
2 13.12 0.150 0.123 30.8
3 13.20 0.149 0.126 31.4

Claims (2)

1.一株牛樟芝诱变菌株，该诱变菌株已于2015年5月3日保藏《中国典型培养物保藏中心》，命名为：牛樟芝AC09；Antrodia camphorata AC09，保藏号为：CCTCC NO:M 2015274。
2. 权利要求 1 所述牛樟芝诱变菌株的诱变方法，包括以下步骤完成：
1) 将牛樟芝菌株ATCC200183，以5%接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为：葡萄糖15.2471g/L，蛋白胨8.3179g/L，酵母浸粉9.7392g/L，MgSO4·7H2O 0.0237g/L和VB10.0310g/L；26℃恒温摇床中120rpm培养7天，无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液；
2) 在无菌条件下取1mL步骤1)中得到的孢子悬液加入10mLNTG（10mg/mL）中，分别于诱变0、10、15、20min后，取0.3mL孢子悬液于2.7mL无菌蒸馏水中并逐级稀释，涂布于种子培养基平板上培养7天，将菌株于96孔板保存；
3）将培养好的突变株用接种针逐个接种至种子培养基中进行活化，于26℃恒温摇床中150rpm培养7天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和三萜化合物含量，以筛选高产突变株。
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