CN104860858B

CN104860858B - 基于氨基酸修饰的维生素d2衍生物、合成及应用

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Publication number: CN104860858B
Application number: CN201510208594.XA
Authority: CN
Inventors: 方志杰; 戴焕然
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2035-04-28
Also published as: CN104860858A

Abstract

本发明公开了一种基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物、合成方法和应用。本发明以维生素D₂为原料，通过氧化还原反应制备了维生素D₂片段醇，然后再分别以维生素D₂及其片段醇为原料合成基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物。本发明的合成原料易得、反应条件温和，操作简单，且产率较高，新合成的维生素D₂衍生物对人体乳腺癌细胞MCF‑7具有很好的抑制能力，具有潜在的药用价值。

Description

基于氨基酸修饰的维生素D2衍生物、合成及应用

技术领域

本发明主要涉及一种基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物、合成及其应用，属于医药化学领域。

背景技术

维生素D₂作为维生素D类的一种重要的活性物质，其在人体内经血液输送到肝脏被25-位羟基化酶被代谢为25-羟基维生素D₃，进而在肾脏通过1α-位羟基化得到1α,25-双羟基维生素D₃，能够调节钙磷代谢，抑制癌细胞增殖、调节血压和免疫系统等。麦角固醇在紫外光作用下发生开环反应可以转化成维生素D₂。如下，化合物a与化合物b中的甾体的立体结构与维生素D₂具有高度的相似度，同样的，化合物c的维生素D₃结构与维生素D₂片段(CD环和支链部分)结构相似。根据药物设计的经典原理与方法中的相似性原理和拼合原理，对维生素D₂结构进行修饰，以期望得到具有抗增殖活性的氨基酸修饰的维生素D₂衍生物。而目前大量的关于维生素D衍生物的合成研究主要是以1α,25(OH)₂D₃为基本骨架对其侧链的修饰改造，而对于直接以维生素D₂为原料合成氨基酸修饰的衍生物并研究其在抗癌活性方面的工作少之又少，而且以氨基酸取代维生素D₂的A环的药物合成迄今未有报道过。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物、制备方法及其它在治疗癌症方面的应用。

本发明的原理：根据药物设计的经典原理与方法中的相似性原理和拼合原理，以维生素D₂为原料，通过氧化还原反应制备了维生素D₂片段醇，然后再分别以维生素D₂及其片段醇为原料合成了目标化合物Ⅰ和化合物Ⅱ，以期得到具有优良的抗癌等生物活性的药物。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：

一种式I结构的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，包括如下步骤：

步骤1、化合物4的合成：将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，加入DCC(二环己基碳二亚胺)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)，室温下搅拌均匀，加入化合物3，再在室温下继续搅拌反应约24小时以上，反应结束后，经萃取、提纯得到化合物4，其中，化合物3结构如下：

步骤2、目标化合物I的合成：将化合物4溶于二氯甲烷中，加入TFA(三氟乙酸)，室温下搅拌3小时以上，反应完全后，经萃取、提纯得到目标化合物I，其中化合物4的结构如下：

步骤1中，所述的N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸与化合物3的摩尔比均为2∶1；所述的DCC或DMAP与化合物3的摩尔比均为2∶1。

步骤2中，化合物4与三氟乙酸的摩尔比为1:30。

步骤1和步骤2中，萃取采用乙酸乙酯，提纯采用柱层析纯化，柱层析纯化采用的硅胶为300-400目，所用洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝10∶1。

一种式Ⅱ结构的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，包括如下步骤：

步骤1、化合物6的合成：将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，然后加入DCC(二环己基碳二亚胺)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)，室温下搅拌均匀，加入维生素D₂，然后室温下继续搅拌反应约24小时以上，反应结束后，经萃取、提纯得到化合物6；

步骤2、目标化合物Ⅱ的合成：将化合物6溶于二氯甲烷中，加入ZnBr₂，室温下搅拌6小时以上，反应完全后，经萃取、提纯得到目标化合物Ⅱ，其中，化合物6的结构如下：

步骤1中，所述的N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸与维生素D₂的摩尔比均为2∶1；所述的DCC、DMAP与维生素D₂的摩尔比均为2∶1。

步骤2中，化合物6与ZnBr₂的摩尔比为1∶15。

上述结构的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物在抑制人体乳腺癌细胞MCF-7上的应用。

本发明具有以下显著优点：(1)本发明成功合成了两种具有显著生理活性的维生素D₂衍生物；(2)首次公开了两类氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法；(3)合成原料易得、反应条件温和，操作简单，且产率较高。(4)初步的MTT实验表明该类化合物对MCF-7细胞具有很好的抑制作用，是一类很有潜力的用于抗癌的候选药物。

附图说明

图1化合物4的(¹H NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图2化合物4的(¹³C NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图3化合物5的(¹H NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图4化合物5的(¹³C NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图5化合物6的(¹H NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图6化合物6的(¹³C NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图7化合物7的(¹H NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图8化合物7的(¹³C NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

具体实施方式

下面结合实例和附图详细说明本发明氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法。

本发明维生素D₂衍生物的合成路线如下：

(一)式I结构维生素D₂衍生物(目标化合物5)的合成路线

(a)：二碳酸二叔丁酯，碳酸钠，THF/H₂O(1∶10)，室温；(b)：高锰酸钾，乙醇-水，-30℃--20℃；(c)：四乙酸铅，甲苯，常温；(d)：硼氢化钠，甲苯-甲醇，0℃-常温；(e)：DCC，DMAP，二氯甲烷，室温；(f)：ZnBr₂，二氯甲烷，室温。.

(二)式Ⅱ结构维生素D₂衍生物(目标化合物7)的合成路线

(a)：二碳酸二叔丁酯，碳酸钠，THF/H₂O(1∶10)，室温；(b)：DCC，DMAP，二氯甲烷，室温；(c)：TFA，二氯甲烷，室温。

实施例1

结合式I结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物1的合成：

于100mL三口烧瓶中分别加入维生素D₂(5.0g,12.6mmol)和50mL的乙醇，置于低温循环槽中，缓慢降温至-20℃以下，然后用20mL水溶解高锰酸钾(8.0g,50.4mmol)，逐滴加入到反应体系中(控制温度不超过-20℃)。滴加完毕后，维持温度在-30℃--20℃之间，继续搅拌反应2.5h。然后缓慢升温，控制温度在-17℃--15℃之间继续反应1.5h。之后自然升温至室温，再慢慢加热到45℃，继续反应10min。然后TLC监测反应(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶1)。反应结束后，冷却至室温，过滤，浓缩除去乙醇和水得到橘黄色固体粗品。通过柱层析(硅胶：200-300目，V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶1)进行纯化得化合物1的白色固体(2.02g,40.40％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.54(d,J＝9.7Hz,1H),5.22-5.11(m,2H),5.00(s,1H),4.89(d,J＝9.5Hz,2H),3.80(s,1H),2.56(dd,J＝12.4,3.1Hz,2H),2.44(dd,J＝8.9,4.6Hz,2H),2.23-2.15(m,2H),2.10-1.93(m,4H),1.87-1.75(m,5H),1.73-1.54(m,5H),1.47(td,J＝13.4,6.7Hz,4H),1.31-1.22(m,4H),1.20-1.05(m,5H),0.97(d,J＝6.6Hz,4H),0.92-0.88(m,5H),0.81(dd,J＝8.2,7.1Hz,11H).

实施例2

结合式I结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物2的合成：

于50mL双口烧瓶中分别加入化合物1(2.02g,4.69mmol)，四乙酸铅(8.07g,18.2mmol)迅速称取及10mL甲苯。然后通入氮气保护，于室温下继续搅拌反应5h。TLC监测反应(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶4)。反应完全后，过滤，减压浓缩得粗品化合物。此步无需纯化，直接进行下一步。

实施例3

结合式I结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物3的合成：

将上一步得到的粗产物浓缩干燥后称重(1.63g,5.90mmol)用10mL重蒸过的甲苯溶解，再加入5mL的乙醇。将反应置于低温循环槽中，缓慢降温至-10℃。然后边搅拌边缓慢加入硼氢化钠(0.47g,12.44mmol)。加毕，继续低温下搅拌反应15min，然后将反应移置室温下，继续搅拌反应2h。TLC监测反应进程(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)。反应完全后，在低温下缓慢加入适量水淬灭反应。然后加入100mL乙酸乙酯和100mL水，振荡分层后，分出有机层。有机层再用水洗(2×100mL)，饱和氯化钠溶液洗(2×100mL)，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得粗品。通过柱层析(硅胶：100-200目，V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)进行纯化，得纯品化合物3(1.1g,31.49％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.17(qd,J＝15.3,7.8Hz,2H),4.07(d,J＝2.3Hz,1H),2.00(ddd,J＝17.2,10.3,5.6Hz,2H),1.88-1.77(m,3H),1.68(ddd,J＝15.4,9.4,4.7Hz,1H),1.46(qdd,J＝12.0,11.2,4.8Hz,5H),1.37-1.20(m,3H),1.20-1.06(m,2H),0.99(d,J＝6.6Hz,3H),0.94(s,3H),0.91(t,J＝5.9Hz,3H),0.85-0.80(m,6H).

实施例4

结合式I结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物4的合成：

于50mL的圆底烧瓶中分别加入维生素D₂片段醇化合物3(100mg,0.36mmol)，N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(119mg,0.72mmol)，DCC(148g,0.72mmol)，DMAP(87.7mg,0.72mmol)，以及用五氧化二磷干燥过的二氯甲烷(15mL)，于室温下搅拌反应24h以上。TLC(V乙酸乙酯∶V石油醚＝10∶1)监测反应完全后，旋干溶剂，加入适量水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩，得到粗品化合物，通过柱层析(硅胶：300-400目，V乙酸乙酯∶V石油醚＝10∶1)纯化，得关键中间体化合物4(76mg,76％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.26(dd,J＝18.7,6.7Hz,4H),5.28–5.08(m,4H),5.02(dd,J＝29.4,7.6Hz,1H),4.59(s,1H),3.20–2.97(m,2H),2.10–1.92(m,3H),1.91–1.81(m,2H),1.79–1.52(m,5H),1.45(t,J＝16.4Hz,20H),1.32–1.06(m,8H),1.00(d,J＝2.3Hz,5H),0.91(t,J＝9.4Hz,5H),0.88–0.73(m,12H).，如图1所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ171.59,170.90,154.95,136.34,136.04,135.33,131.98,129.48,129.30,128.44,128.26,126.87,126.74,81.94,79.67,79.57,77.22,76.97,76.72,73.10,72.88,56.26,54.76,54.59,51.23,42.74,41.72,39.77,39.66,38.50,33.02,30.32,30.23,29.63,28.25,27.88,27.38,22.50,22.38,20.71,19.90,19.58,17.81,17.70,17.55,13.31.，如图2所示。

实施例5

结合式I结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物5的合成：

于50mL单口圆底烧瓶中分别加入化合物4(100mg,0.19mmol)，TFA(0.5mL,5.7mmol)，20mL的二氯甲烷，在室温下搅拌反应3h以上，TLC显示(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶1)反应完全后，旋去溶剂和TFA，加入适量的水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)得白色液体纯品化合物5(72.17mg,72.3％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.36–7.19(m,5H),5.27–5.11(m,3H),3.73(dt,J＝7.6,5.1Hz,1H),3.19–3.06(m,1H),2.87(m,1H),2.06–1.94(m,3H),1.86(dd,J＝13.5,6.8Hz,2H),1.81–1.72(m,1H),1.72–1.61(m,2H),1.56(ddd,J＝16.4,8.3,3.7Hz,1H),1.52–1.37(m,6H),1.37–1.07(m,6H),1.05–0.98(m,3H),0.95–0.76(m,14H).，如图3所示。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ174.73,174.59,137.27,135.35,131.99,129.22,128.51,126.73,77.23,76.97,76.72,72.33,56.27,55.98,51.33,42.74,41.75,41.20,39.77,39.72,33.01,30.37,27.38,22.50,20.72,19.89,19.57,17.82,17.55,13.46,13.33.，如图4所示。

实施例6

结合式Ⅱ结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物6的合成：

将维生素D₂(448mg，1.13mmol)，N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(372mg，2.26mmol)，DCC(465mg，2.26mmol)，DMAP(276.1mg.2.26mmol)，溶于无水二氯甲烷(20mL)中，于室温下搅拌24h，TLC(V乙酸乙酯∶V石油醚＝10∶1)监测反应完全后，加入适量水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化得到关键淡黄色液体中间体化合物6(120mg，39％),。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.26(dd,J＝18.7,6.7Hz,4H),5.28–5.08(m,4H),5.02(dd,J＝29.4,7.6Hz,1H),4.59(s,1H),3.20–2.97(m,2H),2.10–1.92(m,3H),1.91–1.81(m,2H),1.79–1.52(m,5H),1.45(m,20H),1.32–1.06(m,8H),1.00(m,5H),0.91(m,5H),0.88–0.73(m,12H).，如图5所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ171.23,155.00,144.29,142.28,136.08,135.55,133.86,133.78,131.87,129.33,128.37,126.84,122.66,117.45,112.80,79.62,77.32,77.07,76.82,72.88,56.39,54.45,45.73,42.76,41.95,41.84,40.36,38.36,33.04,32.03,31.94,31.76,29.65,28.99,28.25,27.86,27.75,23.51,22.15,21.08,19.93,19.61,17.55,12.20.，如图6所示。

实施例7

结合式Ⅱ结构维生素D₂衍生物的合成路线，化合物7的合成：

于50mL单口圆底烧瓶中分别加入化合物6(1.93g,3mmol)，溴化锌(10g,45mmol)，15mL的二氯甲烷，在室温下搅拌反应6h，TLC显示(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)反应完全后，旋去溶剂，加入适量的水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)，浓缩得白色液态纯品7(1.02g，62.96％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.25(d,J＝11.3Hz,1H),6.04(d,J＝11.3Hz,1H),5.22(dt,J＝14.5,7.3Hz,4H),5.07(s,3H),4.86(s,1H),3.98(s,1H),3.18(d,J＝9.9Hz,2H),3.03(s,2H),2.84(d,J＝12.8Hz,2H),2.59(d,J＝13.5Hz,2H),2.44–2.31(m,4H),2.27–2.13(m,4H),2.03(ddd,J＝25.7,14.3,9.0Hz,10H),1.91–1.80(m,5H),1.71(dd,J＝23.5,11.1Hz,9H),1.45(tdd,J＝19.4,16.0,9.1Hz,10H),1.39–1.20(m,23H),1.03(d,J＝6.6Hz,7H),0.97–0.76(m,26H),0.56(s,4H).，如图7所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ172.84,144.17,142.65,135.84,135.55,133.59,131.89,129.40,128.86,128.43,128.00,127.31,127.01,124.71,124.39,123.91,122.88,119.04,117.37,112.88,79.07,77.20,76.95,76.69,73.51,56.39,55.56,54.28,45.77,42.75,41.85,40.78,40.32,39.72,39.36,35.99,34.80,34.46,33.75,33.51,33.04,32.05,31.85,31.74,31.37,30.13,29.62,29.44,29.28,29.03,28.50,28.37,28.27,27.72,27.15,26.90,25.45,24.79,24.61,23.76,23.50,23.10,22.62,22.14,21.04,20.50,19.88,19.58,18.97,18.36,17.52,14.04,12.19,11.38,7.85,0.95,-0.08.，如图8所示。

细胞毒性试验：

为研究化合物对癌细胞(人体乳腺癌细胞MCF-7)的抑制能力，我们用化合物5和化合物7进行MTT实验，具体步骤如下：

(1)细胞培养:用10％胎牛血清的RMPI-1640培养MCF-7细胞，并制备悬浮液，然后置于37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。然后取对数期细胞进行MTT试验。

(2)浓度配置：本实验设置了样品组和对照组。其中样品组用PBS溶液溶解样品配置9个浓度：10^-10mol/L、5×0^-10mol/L、10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、10^-7mol/L、5×10^-7mol/L、10^-6mol/L，每个浓度设置3个平行孔；对照组只加培养液。

(3)MTT试验：(a)在96孔板加入细胞培养液100μL(约1×10⁴)，置37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h。(b)样品组加入适当浓度的受试化合物，每孔25μL，每种药物组合设三个平行孔，培养48h。对照组，只加入等量的PBS溶液。(c)将96孔板在37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育48小时。(d)将5×MTT用Dilution Buffer稀释成1×MTT。(e)每孔加50μL1×MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲臢。(f)吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲臢溶解，用平板摇床摇匀10分钟。(g)酶标仪在550nm波长处检测每孔的吸光值，通过吸光度值间接计算出受试化合物的半抑制浓度IC₅₀值。测试结果见表1。

(4)结果分析：

化合物对两种细胞的半抑制率(IC₅₀)值如表1所示，根据《新药(西药)临床前研究指导原则》中说明，当IC₅₀<10μg/mL时，化合物对癌细胞具有一定的抑制作用。从本发明实验数据结果看两种化合物作用人体乳腺癌细胞MCF-7均有不同程度的抑制作用，表明这两种维生素D₂衍生物对人体乳腺癌细胞均有很好的抗癌活性，可以作为潜在的抗癌药物。

表1 为化合物对两种细胞的半抑制率(IC₅₀)值

Claims

1.一种基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物，其特征在于，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：

2.如权利要求1所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、化合物4的合成：将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，加入DCC和DMAP，室温下搅拌均匀，加入化合物3，再在室温下继续搅拌反应约24小时以上，反应结束后，经萃取、提纯得到化合物4，其中，化合物3结构如下：

步骤2、目标化合物的合成：将化合物4溶于二氯甲烷中，加入TFA，室温下搅拌3小时以上，反应完全后，经萃取、提纯得到目标化合物I，其中化合物4的结构如下：

3.如权利要求2所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤1中，N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸与化合物3的摩尔比均为2∶1；DCC或DMAP与化合物3的摩尔比均为2∶1。

4.如权利要求2所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤2中，化合物4与三氟乙酸的摩尔比为1:30。

5.如权利要求2所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，萃取采用乙酸乙酯，提纯采用柱层析纯化，柱层析纯化采用的硅胶为300-400目，所用洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝10∶1。

6.一种如权利要求1所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、化合物6的合成：将N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，然后加入DCC和DMAP，室温下搅拌均匀，加入维生素D₂，然后室温下继续搅拌反应约24小时以上，反应结束后，经萃取、提纯得到化合物6；

步骤2、目标化合物的合成：将化合物6溶于二氯甲烷中，加入ZnBr₂，室温下搅拌6小时以上，反应完全后，经萃取、提纯得到目标化合物，其中，化合物6的结构如下：

7.如权利要求6所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤1中，N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸与维生素D₂的摩尔比均为2∶1；DCC或DMAP与维生素D₂的摩尔比均为2∶1。

8.如权利要求6所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤2中，化合物6与ZnBr₂的摩尔比为1∶15。

9.如权利要求6所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，萃取采用乙酸乙酯，提纯采用柱层析纯化，柱层析纯化采用的硅胶为300-400目，所用洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝10∶1。

10.如权利要求1所述的基于氨基酸修饰的维生素D₂衍生物在制备抑制人体乳腺癌细胞MCF-7药物中的应用。