CN1048488C - 抗病毒新化合物去氢柯子次酸甲酯及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗病毒新化合物去氢柯子次酸甲酯，以叶下珠全草为原料，通过粉碎、脱脂、甲醇提取、硅胶柱低压层析，以氯仿-甲醇-水梯度洗脱，制得粗品，并用甲醇-氯仿重结晶后得到去氢柯子次酸甲酯纯品。实验证明该化合物具有显著的抗病毒活性。本发明为开发新的抗病毒新药奠定了化学的和生物学的基础，并可直接用于开发抗病毒新药。
Description
本发明涉及一种抗病毒活性化合物去氢柯子次酸甲酯及其制备方法。
乙型肝炎是危害人类健康的主要传染病之一，国内约有10％的人口携带乙肝表面抗原。目前治疗乙肝的药物及其乙肝疫苗的研究虽有进展，但至今仍无良好的特效药。为了研究治疗乙型肝炎的药物，世界各国都投入了很大的人力、财力。美国费城癌症研究中心的布仑伯博士(Dr.B.Blumberg)采用植物药粗筛，发现叶下珠粗提物，抑制乙肝表面抗原的活性达82％，但均属粗提取物。
本发明的目的在于提供一种具有抗病毒活性的新化合物，以及从叶下珠中提取这种新化合物的方法。
本发明自叶下珠中分离、纯化得到的这种抗病毒活性化合物为去氢柯子次酸甲酯(Methyl Ester Dehydrochebulic acid)，其结构式为：
该化合物可作为制备抗病毒新药。
用化学反应、紫外、红外、核磁共振和质谱等现代波谱方法对提取的新化合物的结构进行了鉴定。在结构鉴定中还采用了二维核磁共振及其1H-1H COSY、13C-1H COSY、远程18C-1H COSY及DEPT、INEPT等新技术、新方法，鉴定结果如下：
去氢柯子次酸甲酯为白色结晶m.p.204-206℃(甲醇-氯仿)，高分辨质谱给出分子式C17H16O11(M396.0692，计算值396.0693)，三氯化铁反应阳性，溴甲酚绿反应阴性。
IR(Vmax kbvCm-1)：3395，3260(OH)，1761，1753，1732，1711四个酯羰基的吸收信号。1648(与羰基共轭的双键的吸收)。1609，1496(芳环骨架振动)。
13C-NMR(δ，ppm)：115.30(S)，107.94(d)，138.15(S)，145.24(S)，142.93(S)，117.84(S)。六个芳香碳的吸收信号与短叶苏木酚酸甲酯的六个芳香碳的吸收信号相近，提示二者芳环取代式可能相似。
1H-NMR(δ.ppm)：8.43(3H，b)为三个酚羟基吸收信号，7.14(1H，S)孤立芳氢吸收信号，6.82(1H，S)芳羟或烯氢吸收信号。13C-1HCOSY表明δ7.14的芳氢连于δ107.94的芳碳上，在远程13C-1H COSY中其与δ115.30，δ117.84，δ138.15，δ145.24的芳碳均有远程偶合，而δ6.82的氢不与任何芳碳有远程偶合，证明其不是芳氢信号，而为烯氢信号。
另外，δ7.14的芳氢还与δ162.99的酯羰基有远程偶合，表明该酯羰基连于苯环上，位于孤立芳氢的邻位
以上数据表明，本品芳环的取代形式与短叶苏木酚酸甲酯芳环取代形式相同，即结构中存在以下碎片
13C-1H COSY表明，δ5.42(1H，d，j＝2HZ)的氢连于δ34.576(d)的碳上，δ5.27(1H，d，j＝2HZ)的氢连于δ78.469(d)的碳上，远程13C-1H COSY中，δ5.42的氢与δ117.84，δ142.93的芳碳有远程偶合，说明δ34.576(d)的碳连于芳环上，而δ5.27的氢与δ162.99的酯羰基有远程偶合，而且从化学位移上推测δ78.469(d)的碳与氧相连，故推得以下结构碎片(碎片A)。
13C-NMR中，还有两个吸收信号δ129.10(d)，142.08(S)，应为三取代的烯碳吸收信号，即有以下碎片
除了A与B之外，13C-NMR，13C-1H COSY远程13C-1H COSY表明存在三个-COOCH3基团。
碎片A、B及-COOCHa基团元素组成之和等于分子式。
远程13C-1H COSY中，δ142.08和129.10两个碳均与δ5.42的氢有远程偶合，而δ166.23的酯羰基碳同时与δ6.82的氢和δ5.42的氢有远程偶合，推知δ142.08的碳与δ166.23的酯羰基碳和δ34.576的碳相连。得到以下碎片。
远程13C-1H COSY还显示δ169.77的酯羰基碳同时与δ5.27的氢和δ5.42的氢有远程偶合。由此推知，该酯羰基碳连于δ78.469的碳上，而δ78.469的碳与δ34.576的碳相连。1H-NMR和1H-1HCOSY谱也显示δ5.27和δ5.42两个氢有偶合关系，从而也证实两个碳相连。以上基团还余一个COOCH3连于双键上，推得本品的结构为：
该化合物为一新化合物，命名为去氢柯子次酸甲酯(Methgle Est-er Dehgdrochebulic Acid)。其13C-NMRG归属及13C-1H相关见表-1
去氢柯子次酸甲酯的质谱裂解规律见图1。
去氢柯子次酸甲酯的高分辨质谱碎片组成见表2。
去氢柯子次酸甲酯的1H-1H COSY谱见图2，13C-1HCOSY谱见图3，远程13C-1HCOSY谱见图4，DEPT谱见图5。
| 表1 去氢柯子次酸甲酯的碳谱及13碳-1H相关谱数据 | |||
| 碳原子 | 化学位移 | 1H，13C相关 | 1H，13C远程偶合 |
| 1344a56788a1′2′3′4′3″1″4″3 | 162.99(s)78.469(d)34.576(d)115.84(s)142.93(s)145.22(s)138.15(s)107.94(d)117.30(s)166.23(s)142.08(s)129.10(d)165.38(s)169.77(s)52.140(q)51.698(q)52.455(q) | H-3(δ5.27)H-4(δ5.42)H-8(δ7.14)H-3′(δ6.82)δ3.63(OCH3)δ3.63(OCH3)δ3.63(OCH3) | H-8，H-3H-8，H-4H-4H-8H-8H-8，H-3，H-4H-3′，H-4，OCH3(δ3.63)H-4OCH3(δ3.67)H-3，H-4，OCH3(δ3.67) |
| 表2 去氢子柯次酸甲酯的高分辨质谱碎片组成 | |||
| 碎 片 | 重 | 归 属 | |
| 测定值 | 计算值 | ||
| C17H16O11C16H12O10C15H13O9C15H8O9C14H9O8C14H7O7C13H9O7C13H5O7C13H9O6C12H9O6C12H6O6C12H10O5C11H6O5C10H6O4C9H6O3C8H6O2C8H4OC7H5O | 396.0692364.0432337.0510332.0097305.0264287.0203277.0352273.0017261.0407249.0396246.0161234.0175218.0227190.0227162.O312134.0379116.0249105.0364 | 396.0693364.0430337.0560332.0168305.0264287.0192277.0348273.0035261.0399249.0399246.0164234.0528218.0215190.0266162.0317134.0368116.0262105.0341 | M+M+-CH3OHM+-CH3OH-CO+HM+-2CH3OHM+-2CH3OH-CO+HM+-2CH3OH-CO2-HM+-2CH3OH-2CO+HM+-3CH3OH-CO+HM+-2CH3OH-CO-CO2+HM+-2CH3OH-3CO+HM+-3CH3OH-2CO+2HM+-2CH3OH-2CO-CO2+2HM+-3CH3OH-3CO+2HM+-3CH3OH-4CO+2HM+-3CH3OH-5CO+2HM+-3CH3OH-6CO+2HM+-3CH3OH-6CO-H2O+2HM+-3CH3OH-7CO+3H |
进一步测定了新化合物去氢柯子次酸甲酯的抗病毒活性。
按通常测定药物抗病毒活性的方法，以人宫颈癌Hela细胞测定药物对细胞毒性(TO50)，再观察药物对人单纯疱诊病毒HSV-1 STAKER株和HSV-2 SAR株的抗病毒作用，测定ED50，并计算其保护指数(PI)。阳性对照药物采用病毒唑(三氮唑核苷，virazole)，结果如表3、4、5、6、7所示。
表3，人单纯疱诊病毒Hsv-1，Hsv-2致Hela细胞病变记录(CPE)
| 病毒感染量 | 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 |
| HSV-1SHV-2 | ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + +++ ++ ++ ++ ++ ± ± ± |
| 注： -无明显细胞病变 --细胞病变＜50％--出现可疑细胞病变 --细胞病变＜75％--细胞病变＜25％ --细胞病变＞80％ | |
表4 人单纯细胞病毒HSV-1、HSV-2对Hela细胞致死作用
及TCID50(MTT法)
| 病毒感染 量 | 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 TCID50 |
| 细胞死亡率(％) | |
| HSV-1HSV-2 | 100.0 96.0 80.0 65.0 25.0 18.0 4.5×1096.2 76.0 20.0 0 0 0 3.80×10 |
表5 不同浓度药物对Hela细胞的杀伤率(％)及TD50
| 药物浓度(μg) | 7.88 1.95 4.8×10-11.2×10-13.0×10-27.5×10-31.8×10-34.6×10-4TD50 |
| 细胞死亡率(％) | |
| 去氢柯子次酸甲酯 | 100.0 76.0 27.0 3.0 0 0 0 --- 9.13×10-4 |
| 药物浓度(μg) | 1.25 1.25×10-1 1.25×10-2 1.25×10-3 1.25×10-4 1.25×10-5TD50 |
| 细胞死亡率(％) | |
| 病毒唑 | 83.4 44.0 24.0 20.0 0 0 9.92×10-2 |
表6 去氢柯子次酸甲酯抗HSV-1病毒作用(ED50)
及保护指数(PI)
| 药物名称 | TD50 ED50 PI |
| 去氢柯子次酸甲酯病毒唑 | 0.899 0.0009 998.00.0992 0.000625 158.0 |
表7 去氢柯子次酸甲酯抗HSV-2病毒作用(ED50)及
保护指数(PI)
| 药物名称 | TD50 ED50 PI |
| 去氢柯子次酸甲酯病毒唑 | 0.913 0.12 7.600.0992 0.000125 793.60 |
表3-7结果表明，去氢柯子次酸甲酯对人单纯疱疹都HSV-1有肯定的显著的抗病毒活性。
本发明所述的去氢柯子次酸甲酯是从叶下珠中提取、分离、纯化得到的新化合物。叶下珠为大戟科油柑属植物，本发明所用的叶下珠均采自福建武夷山区，提取这种新化合物主要包括以下几个步骤：
1、取干燥叶下珠全草粉碎到适当细度；
2、先用石油醚脱脂，并分离出脱脂液；
3、分离出的药渣用甲醇充分提取；
4、用减压蒸馏浓缩甲醇提取液，得到一种甲醇浸膏；
5、加水混悬，浸膏并依次以氯仿及正丁醇分配；
6、分离出正丁醇分配相，再进行浓缩；
7、以硅胶低压柱层析并以氯仿-甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，每份250毫升，在第6份起得到去氢柯子次酸甲酯粗品；
8、二次用硅胶柱层析纯化；
9、用甲醇-氯仿重结品，得到纯去氢柯子次酸甲酯。
以下对附图作一说明：
附图1为本发明去氢柯子次酸甲酯的质谱裂解图；
附图2为本发明去氢柯子次酸甲酯的1H-1HCOSY谱图。
附图3为本发明去氢柯子次酸甲酯的13C-1HCOSY谱图。
附图4为本发明去氢柯子次酸甲酯的远程13C-1HCOSY谱图。
附图5为本发明去氢柯子次酸甲酯的DEPT谱图。
下面再用一个实际例子对本发明自叶下珠中提取去氢柯子次酸甲酯的方法作进一步描述，取干燥叶下珠全草，打成粗粉，置入索氐提取器中，先加石油醚脱脂后，把药渣凉干，再用甲醇充分提取。分出甲醇提取液，用减压蒸馏浓缩甲醇提取液，得到甲醇浸膏。将此浸膏加适量水混悬，依次以氯仿及正丁醇分配，将正丁醇取出减压浓缩后，以硅胶及硅藻土拌料，硅胶低压柱层析，用氯仿-甲醇-水作梯度洗脱，分别收集洗脱液，每份250毫升，在第6份起得到去氢柯子次酸甲酯粗品。该粗制品再经过硅胶柱二次纯化，用甲醇-氯仿重结晶，即得到纯去氢柯子次酸甲酯。
本发明以叶下珠中提取的这种去氢柯子次酸甲酯，经实验证实这种新化合物具有显著的抗病毒活性，从而为开发这一新的抗病毒新药奠定了化学的和生物学的基础，并可直接用于开发抗病毒新药。
Claims (2)
1、一种从叶下珠提取的抗病毒活性化合物，其特征在于所说的抗病毒活性化合物为去氢柯子次酸甲酯(Methyl Ester Dehydrochebulic Acid)，其结构式为：
该化合物可作为制备抗病毒新药。
2、按照权利要求1所述的抗病毒活性化合物的提取方法，其特征在于包括以下提取步骤：
2-1、粉碎干燥的叶下珠全草；
2-2、用石油醚脱脂，分离脱脂液；
2-3、浸取渣以甲醇充分提取；
2-4、减压蒸馏浓缩甲醇提取液，得甲醇浸膏；
2-5、浸膏加水混悬；
2-6、依次以氯仿及正丁醇分配；
2-7、分离出正丁醇分配相，并浓缩；
2-8、以硅胶低压柱层析；
2-9、以氯仿-甲醇-水梯度洗脱，分别收集洗脱液，每份250毫升，在第6份起取得去氢柯子次酸甲酯粗品；
2-10、二次用硅胶柱层析纯化；
2-11、以甲醇-氯仿重结晶，得到纯去氢柯子次酸甲酯。
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| CN93115183A CN1048488C (zh) | 1993-10-30 | 1993-10-30 | 抗病毒新化合物去氢柯子次酸甲酯及其制备方法 |
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| CN1093361A CN1093361A (zh) | 1994-10-12 |
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| CN (1) | CN1048488C (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018493A1 (de) * | 1991-04-11 | 1992-10-29 | Dr. Willmar Schwabe Gmbh & Co. | Benzopyranone, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
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1993
- 1993-10-30 CN CN93115183A patent/CN1048488C/zh not_active Expired - Fee Related
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| WO1992018493A1 (de) * | 1991-04-11 | 1992-10-29 | Dr. Willmar Schwabe Gmbh & Co. | Benzopyranone, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
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