CN104838012B - 选择单克隆细胞集落的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种选择出分泌所关注的产物的单克隆细胞集落的方法，该方法包括：提供多个细胞培养空间；每个细胞培养空间都具有各自的评估表面，该评估表面具有固定在该评估表面上的第一结合试剂。在所述细胞培养空间中，在生长培养基中孵育细胞以使细胞复制。至少一些所述细胞分泌所关注的产物。在所述细胞培养空间中提供第二结合试剂。起初，所述第二结合试剂是不固定的。所述第一结合试剂和所述第二结合试剂均与所述所关注的产物结合，使得在任意一个细胞培养空间中，细胞对所关注的产物的分泌导致在该细胞培养空间的相应评估表面上形成具有所述第一结合试剂、所关注的产物和所述第二结合试剂的复合物。

Description

选择单克隆细胞集落的方法

本申请要求于2012年9月14日提交的欧洲专利申请序列号12184418.7的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。

本发明涉及选择出分泌所关注的产物的单克隆细胞集落的方法。

在已知的方法中，采用有限稀释将得自细胞的异源混合物的细胞接种于多孔板的孔中。可以通过对孔中的细胞进行白光成像来评估单克隆细胞集落的形成。但是，对分泌所关注的产物的评估需要从各孔中拾取各等分试样并对其分析所关注的产物。拾取和分析等分试样都不利地使所述的方法复杂化。

根据本发明的第一个方面，提供了一种选择出分泌所关注的产物的单克隆细胞集落的方法，所述方法包括：提供多个细胞培养空间，每个细胞培养空间都具有各自的评估表面；向各个所述的评估表面提供第一结合试剂，该第一结合试剂被固定在所述的评估表面上；将细胞悬液接种于所述的多个细胞培养空间中，使得至少一些所述的细胞培养空间接种有单一活细胞；在所述的细胞培养空间中，在生长培养基中孵育所述的细胞，从而使所述的细胞复制，其中至少一些所述的细胞分泌所关注的产物；在所述的细胞培养空间中提供第二结合试剂，该第二结合试剂是非固定的；其中所述的第一结合试剂和所述的第二结合试剂均与所述的所关注的产物结合，使得在任意一个所述的细胞培养空间中，细胞对所述所关注的产物的分泌导致在该细胞培养空间的相应评估表面上形成包含所述第一结合试剂、所述所关注的产物和所述第二结合试剂的复合物；对至少一些所述细胞培养空间中的每一个进行评估以确定所述细胞培养空间的所述评估表面上的所述第二结合试剂的存在情况；针对至少一些所述细胞培养空间中的每一个，测定该细胞培养空间是否包含衍生自单一细胞的单一细胞集落；以及使用所述的评估和所述的测定来选择细胞培养空间，所选择的细胞培养空间包含分泌所关注的产物的单一的单克隆细胞集落。

如本文所用，术语“单克隆”是指通过细胞复制而衍生自单一祖细胞的多个所培养的细胞。优选的是，所述细胞为真核细胞，但是所述方法可用于其他的细胞类型。如本文所用，“选择出”是指挑选，并且不需要从细胞培养空间中移除单克隆细胞集落。如本文所用，术语“分泌”包括细胞通过任何机制产生所关注的产物并将其释放至细胞外空间中。通常，所述的机制为不会杀死细胞并使活细胞具有持续分泌所关注的产物的能力的机制。例如，当所述细胞为真核细胞时，所关注的产物可以通过经典分泌途径来分泌，所述经典分泌途径涉及粗糙型内质网、高尔基复合体和分泌小泡。可供选择地，所关注的产物可以通过任何已知的或未知的非经典分泌机制来分泌。

所关注的产物优选为多肽或蛋白质。在这种情况下，所述的多肽或蛋白质可以是糖基化的和/或可以经历任何其他的翻译后修饰。更优选的是，所关注的产物为抗体或抗体的片段。

细胞培养空间彼此独立，其意义在于一个细胞培养空间中的生长培养基与任何其他的细胞培养空间中的生长培养基不是流体联通的。优选的是，细胞培养空间分别为多孔培养板的孔。例如，细胞培养空间可以为96孔板或384孔板的孔。可供选择地，所述的细胞培养空间可以通过各个分开的培养容器来提供。

对于各细胞培养空间而言，在细胞的孵育过程中，相关的评估表面与该细胞培养空间中所使用的生长培养基相接触。各评估表面优选为提供相关的细胞培养空间的细胞培养容器的整个表面。可供选择地，评估表面可以为被放置在培养容器中的插入物的表面。在细胞培养空间为多孔板的孔的情况下，各评估表面优选为相关孔的底部面向上的表面。在这种情况下，底部表面可以为平坦的、面向上的水平表面。在特别优选的实施方案中，各细胞培养空间为多孔板的孔，并且各评估表面为底部面向上的凹形表面。当将细胞接种于具有凹形底部表面的孔中时，底部表面的凹形形状往往引导细胞向着底部表面的中央，其为底部表面的最低点。这是有利的，因为与位于底部表面的边缘的细胞相比，更容易使位于孔的底部表面中央的一个或多个细胞可视化或成像。具有凹形底部表面的多孔板是市售可得的，并且有时被称为具有U型孔的多孔板。

评估表面为用于评估第二结合试剂在该表面上的存在情况的表面。评估表面不需要由一个或多个与改变表面形状或构造有关的边缘(例如孔的底部表面与圆筒形侧表面之间的边缘)来限定，并且评估表面的范围可以简单地通过评估的空间范围来确定。例如，当细胞培养空间为多孔板的孔时，评估表面可以为(例如)部分但不是全部的底部表面，或者可供选择地，评估表面可以为整个底部表面加上圆筒形侧表面的邻近区域。当然，可供选择地，评估表面的范围可以简单地相当于孔的底部表面。

细胞培养空间可以具有其他的表面。例如，在细胞培养空间为多孔板的孔的情况下，评估表面可以为孔的底部表面，而孔的垂直延伸的圆筒形侧表面则为另一个表面。

第一结合试剂优选在细胞被接种于相关的细胞培养空间中之前被固定在评估表面上。但是，不必一定是这种情况，评估表面(其上固定有第一结合试剂)可以通过插入物来提供，该插入物可以在接种细胞之后插入到细胞培养容器中的生长培养基中。但是，所固定的第一结合试剂需要与生长培养基接触至少孵育过程的一部分过程，优选全部过程，从而使由细胞分泌至生长培养基中的所关注的产物定位于评估表面上。

因此，权利要求1所述的方法的步骤不必以它们被叙述的顺序来实施。

第一结合试剂可以为能够与所关注的产物结合的任何试剂，第一结合试剂被固定在评估表面上，从而使所关注的产物定位于评估表面上。一般而言，定位在评估表面上(通过与第一结合试剂结合)的所关注的分泌产物的百分比应该尽可能地高。优选的是，第一结合试剂以足够的选择性与所关注的产物结合，由此第一结合试剂与生长培养基中的其他成分之间的结合不会显著地干扰所关注的产物定位在评估表面上。第一结合试剂可以特异性地与所关注的产物结合。例如，第一结合试剂可以包含能够与所关注的产物结合的抗体或抗体片段。可供选择地，如果所关注的产物本身为抗体或抗体片段，那么第一结合试剂可以包含所关注的产物与其结合的表位。

第一结合试剂可以以任何合适的方式固定在评估表面上。许多固定方法是已知的，并且在生物化学或免疫学的教科书中有所描述。通常，第一结合试剂通过包被在评估表面上而被固定在该表面上。适用于形成包被层的试剂盒是市售可得的，并且用于形成包被层的许多方法在生物化学或免疫学的教科书中有所描述。

优选的是，第一结合试剂应当被固定为覆盖整个评估表面，并且不覆盖细胞培养空间的任何其他的表面。但是，这不是必须的，并且如果仅部分评估表面被固定化的第一结合试剂覆盖，或者可供选择地，如果除了评估表面以外，细胞培养空间的其他表面也提供有固定化的第一结合试剂，所述的方法仍可以满意地实施。例如，在细胞培养空间为多孔板的孔并且评估表面为孔的底部表面的情况下，如果固定化的第一结合试剂除了覆盖孔的底部表面以外，该第一结合试剂还覆盖了孔的圆筒形侧面的下方部分，本发明仍可以满意地实施。在这种情况下，所关注的产物可以与底部表面结合，也可以与圆筒形侧表面结合，尽管所述评估可能只能够检测底部表面上的第二结合试剂而不能检测圆筒形侧表面上的第二结合试剂。由于减少定位在评估表面上的所关注的分泌产物的总量会降低评估的敏感性，因此这是不理想的。但是，所述方法在这些情况中仍是有用的。孔的底部表面上的第二结合试剂的量(假设其是可检测到的)仍表明分泌至生长培养基中的所关注的产物的量。

通常，细胞悬液为细胞异源混合物的悬液。这些细胞中的至少一些(但不必是所有的细胞)在合适的条件下培养时能够产生所关注的产物。例如，在单特异性抗体的生产中，骨髓瘤细胞与脾细胞融合，从而形成杂交瘤细胞。融合过程产生细胞的异源混合物，而只有较少百分比的异源混合物为能够分泌所需的单特异性抗体的杂交瘤细胞。本方法可应用于由骨髓瘤细胞与脾细胞融合而得到的异源细胞混合物。在这种情况下，所述的方法使得能够选择出能够分泌所需的单特异性抗体的单克隆细胞集落。

可供选择地，本方法可应用于由转染工艺得到的细胞的异源混合物。通常，需要使用外源核酸来转染细胞，从而产生能够分泌所需产物的细胞系。转染工艺产生这样的细胞的异源混合物：只有较少百分比的异源混合物能够分泌所需产物。在这种情况下，本方法使得能够选择能够分泌所需产物的单克隆细胞集落。

如本文所用，短语“单一活细胞”是指有且仅有一个活细胞，但是不排除存在一个或多个非活细胞的情况。术语“活的”是指在细胞孵育过程中所经历的培养条件下能够生存并复制的细胞，“非活细胞”是指不具有这种能力的细胞。

将单一活细胞接种于细胞培养空间中的细胞接种方法是已知的，并且通常是指有限稀释。此类方法涉及制备细胞悬液，从而得到在悬液中的预定浓度的细胞(即每单位体积悬液中，预定数量的活细胞和非活细胞)。待接种于各细胞培养空间中的悬液的体积是已知的。计算悬液中所需细胞的浓度，并且要考虑到待接种(即分配)于各细胞培养空间中的悬液的体积，从而实现这样的统计学可能性：各细胞培养空间获得单一的活细胞或根本无活细胞，而极少的细胞培养空间获得多于一个的活细胞。在计算预定浓度的过程中，可以考虑悬液中细胞的活力，这样，如果较高百分比的细胞是非活的，那么考虑到低水平的活力，可以提高总细胞的预定浓度。在两个或更多个活细胞被接种于细胞培养空间中的情况中，在细胞培养空间中会出现两个单克隆集落或混合的集落，通常会从选择中剔除这样的细胞培养空间。

在本发明非常优选的实施方案中，将细胞悬液接种于多个细胞培养空间中，从而确保至少一些细胞培养空间接种有且仅有1个细胞(无论这1个细胞是活的还是非活的)。这可以通过选择合适的悬液中的细胞(活的和非活的)浓度而实现(记住待接种于各细胞培养空间中的悬液的体积)。其目的是能够在仅接种有单一的活细胞并且不具有非活细胞的细胞培养空间中选择出已经产生的单克隆细胞集落。如果细胞培养空间接种有(例如)1个活细胞以及1个非活细胞，那么该活细胞可以在细胞培养空间中复制，从而生产单克隆细胞集落。该非活细胞将不会复制，并且会死亡。由这样的细胞培养空间中产生的单克隆细胞集落在一些应用中可以是有用的。然而，在许多情况下，理想的是在接种有且仅有1个细胞(即，1个活细胞，并且没有非活细胞)的细胞培养空间中选择出已经生产的单克隆细胞集落。这可能是某些应用为了获得所关注的产物的管理批准所需要的。

作为使用有限稀释的另一种选择，可以使用荧光活性细胞分选术来接种细胞，从而将单一活细胞接种于细胞培养空间中。

生长培养基可以是任何合适的生长培养基。生长培养基可以向培养的细胞提供生存和复制所必需的各种物质。此外，如果需要任何特定的化学品来使能够分泌所关注的产物的细胞实际上分泌所关注的产物，则这种化学品通常将包含在生长培养基中。优选的是，生长培养基为液体生长培养基。然而，可以使用其他类型的生长培养基，例如半固体生长培养基。

所述细胞可以是非附着的，或者它们可以附着在细胞培养空间的表面上。

在使用液体培养基并且细胞是附着的情况下，在孵育的过程中可以更换培养基或更换部分培养基。但是，优选的是在细胞培养空间中保持相同的生长培养基而不进行更换，因为这可以避免所分泌的所关注的产物的潜在损失以及对细胞的潜在干扰。优选的是，在细胞培养空间中保留有生长培养基时进行评估。此外，优选的是在细胞培养空间中保留有生长培养基时进行测定。优选的是，在评估过程中使细胞保留在细胞培养空间中。

第二结合试剂与所关注的产物特异性地结合，这样，在评估表面上存在有第二结合试剂则表明在评估表面上存在有所关注的产物(所关注的产物被结合至第一结合试剂)。优选的是，结合在评估表面上的第二结合试剂的量指示结合在该表面上的所关注的产物的量。第二结合试剂的量与所关注的产物的量之间的关系可以为(例如)线性正比例关系。在一个优选的实施方案中，第二结合试剂包含与所关注的产物特异性结合的抗体或抗体片段。可供选择地，如果所关注的产物本身为抗体或抗体片段，那么第二结合试剂可以包含所关注的产物与其结合的表位。

可以将第二结合试剂加入到细胞培养空间的生长培养基中，或者其可以在加入生长培养基之前或之后与生长培养基分开加入。优选的是，至少在细胞在生长培养基中孵育的部分过程中，第二结合试剂存在于生长培养基中，并且更优选的是，在整个孵育过程中，第二结合试剂存在于生长培养基中。

至少在最初，第二结合试剂通常溶解(或者可能悬浮)在生长培养基中，并且是未固定的。如果所关注的产物是由细胞在细胞培养空间中产生的，则所关注的产物与第一和第二结合试剂结合，从而形成复合物，按照这种方式，第二结合试剂将结合在评估表面上。所关注的产物可以以任何顺序与第一和第二结合试剂结合。

优选的是，选择第一和第二结合试剂，使得第一和第二结合试剂的任一者与所关注的产物的结合不会阻碍另一者与所关注的产物的结合。例如，如果所关注的产物为IgG抗体，则第一和第二结合试剂中的一者可以包含与所关注的产物的Fc区特异性结合的抗体，并且结合试剂中的另一者可以包含针对所关注的产物的表位。可供选择地，第一和第二结合试剂可以各自包含与所关注的产物上的各个不同的表位结合的抗体，其中所述表位彼此间隔足够的距离以避免空间位阻。许多其他的设置是可行的。

如上文所述，所述的方法包括评估细胞培养空间以确定第二结合试剂在细胞培养空间的评估表面上的存在情况。在一个评估表面上存在第二结合试剂表明，细胞在相关的细胞培养空间中产生了所关注的产物。

优选的是，通过检测与第二结合试剂相连的标签来评估第二结合试剂在细胞培养空间的评估表面上的存在情况。所述的标签可以为容易检测到的任何试剂。优选的实例为荧光标签。在一个优选的实施方案中，所述的标签为第二结合试剂的组成部分。例如，标签可以为结合或连接到特定的结合试剂从而形成第二结合试剂的荧光试剂。例如更具体的实例，第二结合试剂可以包含抗体或抗体片段(从而提供所需的特异性结合能力)以及荧光标签，例如荧光素。所述的荧光标签可以以任何合适的方式与抗体或抗体片段结合或连接，例如通过直接共价结合，或者通过使用与荧光试剂和抗体或抗体片段两者结合的连接剂。荧光标记的抗体是市售可得的。

在另一个优选的实施方案中，所述的标签并非为第二结合试剂的组成部分，但是能够与第二结合试剂特异性地结合。在这种情况中，标签优选包含能够与第二结合试剂特异性结合的特异性结合部分，例如抗体或抗体片段，并且还包含可检测部分，例如荧光试剂。结合部分和可检测部分可以以任何方便的方式结合在一起，例如通过直接共价结合，或者通过与所述的两个部分结合的连接剂。例如具体的实例，如果第二结合试剂为特定动物物种的IgG抗体，则标签可以包含与动物物种的IgG结合的抗体，以及可检测部分，例如荧光试剂。

在标签不为第二结合试剂的组成部分的情况中，可以在评估之前在任何方便的时间将标签加入至细胞培养空间中，只要其在评估之前足够的时间加入以使标签能够在评估前与第二结合试剂结合即可。

在标签用于评估的情况中，应当理解的是(除非去除了未结合的标签)，无论结合在细胞培养空间的评估表面(以及可能的其他表面)上的第二结合试剂的量和标签的量是多少，细胞培养空间中的标签的总量保持不变。这在以下两种情况中均适用：标签为第二结合试剂的组成部分，以及标签与第二结合试剂分开但能够与第二结合试剂特异性结合。因此，如果细胞在细胞培养空间中产生了较大量的所关注的产物，那么将会导致较大量的第二结合试剂和标签与细胞培养空间的评估表面(以及可能的其他表面)结合。生长培养基中保持游离状态的标签的量较低。因此，如果产生较少量的所关注的产物，那么结合在评估表面(以及可能的其他表面)上的标签的量会较低，并且在生长培养基中保持游离状态的标签的量会较高。然而，在这两种情况中(假设加入等量的标签)，结合的加上未结合的标签的总量是不变的。

在大多数情况中，理想的是能够检测与细胞培养空间的评估表面结合的标签(更优选的是获得其数量指示)，而无需由细胞培养空间中除去未结合的标签。在生长培养基为液体生长培养基并且细胞附着在评估表面(或者细胞培养空间的另一个表面)上的情况中，可以除去生长培养基由此除去生长培养基中未结合的标签，但这通常是不理想的，因为其具有移动细胞、损伤细胞或干扰细胞生长的风险。这还涉及方法和操作的额外复杂性，这都是不希望的。鉴于上述原因，应该尽可能避免洗涤细胞培养空间以除去未结合的标签。因此，在通过检测与第二结合试剂结合的标签来进行评估的情况中，评估优选地包括检测标签的方法，该方法对与评估表面结合的标签是敏感的，但是对游离在生长培养基中的标签是较不敏感的或完全不敏感的。

在本发明特别优选的实施方案中，对于评估第二结合试剂在评估表面上的存在情况的各细胞培养空间而言，所述的评估使用了光学聚焦装置和光检测装置。光学聚焦装置将从细胞培养空间的评估表面得到的光聚焦在光检测装置上，从而通过该光检测装置进行光的检测。聚焦的光指示在细胞培养空间的评估表面上存在的第二结合试剂的量。光学聚焦装置可以为透镜、或者光学元件(透镜或其他光学元件)的阵列。所述的光可以是可见光、紫外光或红外光。所述的光可以是激光。所述的检测装置可以为能够检测光的任何装置，并且可以包括例如CCD检测器、CMOS检测器或sCMOS检测器。可供选择地，检测装置可以包括光电倍增管(PMT)。优选的是，对所评估的各细胞培养空间而言，光检测装置产生分别指示由评估表面接收的光的强度的信号。该强度优选标示在评估表面上的第二结合试剂的量。所述的光优选由标签发出，如上文所述，所述的标签可以为第二结合试剂的组成部分，或者可以与第二结合试剂分开并且能够与第二结合试剂特异性结合。在特别优选的实施方案中，标签为荧光标签。在这种情况中，评估包括使用能够激发荧光标签的激发光来使细胞培养空间发光。由荧光标签发出的荧光可以通过光检测装置检测。所发出的荧光的强度为标签的量提供了指示，并且间接地为评估表面上的第二结合试剂的量和所关注的产物的量提供了指示。

甚至更优选地，光学聚焦装置的光学性质使得来自细胞培养空间中的其他位置(与评估表面具有一定距离的位置处)的光不会被光学聚焦装置聚焦到光检测装置中(尽管其可以通过光学聚焦装置)。以这种方式，光检测装置对细胞培养空间的其他位置发出的光(例如由生长培养基中未结合的标签发出的光)是较不敏感的，或者根本不能检测。

优选的是，评估为存在于评估表面上的第二结合试剂的量以及所关注的产物的量提供定量指示。

不必对所有的细胞培养空间进行评估以确定评估表面上的第二结合试剂的存在情况。例如，如果确定了某细胞培养空间包含多于1个的细胞集落，那么可以排除该细胞培养空间而不必进行评估。

如上文所述，所述的方法包括，针对至少一些细胞培养空间来测定是否细胞培养空间包含衍生自单一细胞的单一细胞集落。术语“单一细胞集落”是指有且仅有1个细胞集落。应当理解的是，衍生自单一细胞的单一细胞集落可以在接种有单一活细胞并具有一个或多个非活细胞的细胞培养空间中产生，或者可供选择地，在仅接种有单一活细胞且不具有非活细胞的细胞培养空间中产生。为了区分这两种可能性，所述测定优选包括测定细胞培养空间是否接种有且仅有1个细胞(即，活细胞)。

所述的测定优选通过在孵育过程中在多个时间点显微观察细胞培养空间中的细胞来实施。例如，在使用液体生长培养基的情况下，只要细胞在接种后(通常在接种后的大约1小时)停留在细胞培养空间的底部表面上，便可以观察细胞。此外，例如可以在接种后的第1、2、4和8天观察细胞。所述的观察优选通过采用合适的照相机和图像处理装置的自动化设备来实施。合适的设备是市售可得的。通过分析孵育过程中细胞培养空间的一系列图像，可以确定在细胞培养空间中产生的细胞集落是否衍生自单一细胞，并且还可以确定细胞培养空间是否接种有且仅有1个细胞。所述的观察可以使用透射光显微镜来实施，例如明视野显微镜、相差显微镜和Nomarsky显微镜。

优选的是，所述的测定是通过自动化仪器来实施的，该仪器获得并储存各细胞培养空间的各系列图像。各系列图像包括在孵育过程中在不同时间点下的图像。优选的是，如上文所述，所述仪器直到对评估表面上的第二结合试剂进行评估时才分析图像。这样，可以只分析那些属于在评估表面上显示出具有较高水平的第二结合试剂的细胞培养空间的系列图像。评估表面上高水平的第二结合试剂表明相关的细胞培养空间包含产生高水平的所关注的产物的细胞。通常，仅这些“高产者”细胞是受到关注的。在优选的实例中，所述的方法包括限定用于评估第二结合试剂的阈值，并且仅分析相关细胞培养空间超过该阈值的那些系列图像。

所述的方法包括利用所述评估和所述测定来选择细胞培养空间。所选择的细胞培养空间包含分泌所关注的产物的单一的单克隆细胞集落。因此通常，所选择的细胞培养空间被证明了在评估过程中在评估表面上具有较高水平的第二结合试剂，这表明产生了高水平的所关注的产物。所述的测定表明细胞培养空间包含衍生自单一细胞的单一细胞集落。优选的是，细胞培养空间接种有1个细胞并且是单独的1个细胞。

优选的是，所述的方法包括，对至少一些细胞培养空间，获得细胞在该细胞培养空间中的生长速率的指示。所述的指示用于选择细胞培养空间。所选择的细胞培养空间可以具有高于预定阈值的细胞生长速率。可供选择地，与其他的细胞培养空间中的细胞生长速率相比，所选择的细胞培养空间可以具有较高的细胞生长速率。细胞生长速率的指示可以通过在孵育过程中在多个时间点观察细胞培养空间中的细胞来获得。所述的指示可以包括，比较在应用过程中的不同的时间点的细胞融合百分比的估值。

根据本发明的第二个方面，提供了用于实施根据本发明的第一个方面的方法的自动化仪器，所述仪器包括：光学聚焦装置；光检测装置；用于保持多孔板的保持件；用于使所述保持件、所述光学聚焦装置和所述光检测装置之间相对移动的移动机构；以及被构造为用于实施本发明的第一个方面的方法的控制器。

下文中，参照所附的示意性附图，通过实例更详细地描述本发明的实施方案，其中：

图1为多孔培养板的一部分的横截面图，其示出了均具有各自的评估表面的三个孔；

图2示出了本发明方法的第一实施方案的评估表面、第一结合试剂、所关注的产物和第二结合试剂；

图3示出了本发明方法的第二实施方案的评估表面、第一结合试剂、所关注的产物、第二结合试剂和独立的标签；

图4示出了本发明方法的第三实施方案的评估表面、第一结合试剂、所关注的产物和第二结合试剂；

图5示出了分泌较大量的所需的单特异性IgG抗体的细胞簇的白光图像和荧光图像；

图6为示出由单一细胞发展为单克隆细胞集落的一系列白光图像；以及

图7为适合实施本发明的方法的仪器的图示。

评估表面上的复合物

图1示出了多孔板12的三个孔10。每个孔10都具有各自的底部表面14，就本发明方法的目的而言，底部表面14用作评估表面14。如图1所示，每个孔都包含生长培养基16。其中的2个孔显示具有细胞集落18。

图2至图4示出了在评估表面14上形成的各种类型的复合物的多种例子。评估表面14可以为(例如)图1所示出的底部表面中的任意一个。

在图2所示的第一个实施方案中，评估表面14包被有第一结合试剂20，其为抗IgG抗体20。为了方便展示，仅示出1个分子的第一结合试剂20，但是应该理解的是许多分子的第一结合试剂20将与评估表面14结合并覆盖该评估表面14。在该实施方案中，所关注的产物22为IgG抗体22，并且第一结合试剂20与所关注的产物22的Fc区特异性地结合。第二结合试剂24包含与荧光标签28共价连接的抗IgG抗体26。此外，第二结合试剂24的抗IgG抗体26还与所关注的产物22的Fc区特异性地结合。第一结合试剂20和第二结合试剂24与所关注的产物22上的不同的且空间分开的表位结合。

应该理解的是，在所有的实施方案中，第二结合试剂与第一结合试剂应该不是直接结合。因此，在图2所示的第一实施方案中，对第一结合试剂20、以及第二结合试剂24的抗IgG抗体26进行选择，使得它们不会彼此结合。例如，如果所关注的产物22为小鼠IgG，则第一结合试剂20、以及第二结合试剂24的抗IgG抗体26可以为得自不同动物物种的抗小鼠IgG抗体。

在图3所示的第二实施方案中，评估表面14包被有第一结合试剂30，其为具有表位的蛋白质30。为了方便展示，仅示出1个分子的第一结合试剂30，但是应该理解的是，许多分子的第一结合试剂30将与评估表面14结合并覆盖该评估表面14。在该实施方案中，所关注的产物32为IgG抗体32，并且第一结合试剂30的表位与所关注的产物32特异性地结合。第二结合试剂34为抗IgG抗体34。第二结合试剂34与所关注的产物32的Fc区特异性地结合。在该实施方案中，标签36独立于第二结合试剂34，不为第二结合试剂34的组成部分。标签36包含与荧光分子40共价连接的抗IgG抗体38。标签36的抗IgG抗体38与第二结合试剂34的Fc区特异性地结合。

在图4所示的第三个实施方案中，评估表面14包被有第一结合试剂42，其为抗体42。为了方便展示，仅示出1个分子的第一结合试剂42，但是应该理解，许多分子的第一结合试剂42将与评估表面14结合并覆盖该评估表面14。在该实施方案中，所关注的产物44为蛋白44(但不是抗体)。第一结合试剂42与所关注的产物44特异性地结合。第二结合试剂46包含与荧光分子50共价连接的抗体48。第二结合试剂46的抗体48也与所关注的产物44特异性地结合。第一结合试剂42和第二结合试剂46与所关注的产物44上的不同的且空间分开的表位结合。

如图2至图4所表明的，可以改变复合物的精确性质。操作原则为，第一结合试剂20、30、42将所关注的产物22、32、44(如果存在的话)定位在评估表面14上。评估表面14上所存在的所关注的产物22、3、44导致第二结合试剂24、34、46和标签28、36、50结合在评估表面上。按照这种方式，标签28、36、50在评估表面14上的存在表示产生了所关注的产物。

所述方法的第一具体实施例

以下实施例示出本发明的方法如何可以用来从细胞的异源混合物开始产生单克隆细胞集落，并且随后对具有足够生长速率并分泌较大量的所需的单特异性IgG抗体的单克隆细胞集落进行选择。

单特异性IgG抗体用于生产药物产品。

在本施实例中使用的细胞为中国仓鼠卵巢细胞DG44(CHO-DG44)，该细胞经转染以产生所需的单特异性IgG抗体。在该实施例中，所需的单特异性抗体为人抗体。更具体而言，所述的细胞转染有两种载体，1种载体编码所需的IgG抗体的轻链，另1种载体编码所需的IgG抗体的重链。载体中的一种(或者可以两种)还编码二氢叶酸还原酶(DHFR)。

转染过程得到了细胞的异源混合物。仅少数细胞具有足够的生长速率以及对所需的IgG抗体分泌较高等所需的特征。正是这种细胞异源混合物用于本实施例中。

首先，准备96孔板以用于所述的方法中。这要求平板的孔设置有重组抗人IgG抗体的包被物作为第一结合试剂。在过滤的1x包被缓冲液中制备抗人IgG抗体的包被液(15μg/ml)。所述的包被缓冲液为得自ImmunoChemistry Technologies LLC公司(伯明顿,MN,USA)的、货号为No.6245的市售可得的缓冲液。在该实施例中，96孔板的孔为具有凹形底部表面的U形孔。将100μl包被液的等分试样放置在平板的各孔中。这足以覆盖凹形底部表面，并且还覆盖了圆筒形侧表面的少量下部区域。在室温下，将包被液在孔中放置2小时。然后，使用PBS将孔洗涤3次。

理想的是使用重组抗人IgG抗体，而不是(例如)在动物物种中产生的多克隆抗人IgG抗体，从而避免动物来源的物质所造成的可能的污染。

在准备96孔板后，在生长培养基中制备细胞异源混合物的悬液。在该实施例中使用的生长培养基为得自Life Technologies公司的Gibco CD OptiCHO^TM合成培养基(chemically defined medium)。将细胞的混合物悬浮在生长培养基中以得到介于0.5至1.5个细胞/ml之间的稀释物。

用于转染的CHO-DG44细胞系不内源表达DHFR。因此，细胞不会在CD OptiCHO^TM培养基中生长和复制，除非它们由编码DHFR的载体(还编码IgG链中的一条)表达DHFR。这为选择的第一条路线。作为第二种选择方法，可以使用氨甲喋呤。氨甲喋呤为DHFR的抑制剂，并且当将要扩增DHFR基因以及在相同载体上所包含的IgG基因时，氨甲喋呤包含在生长培养基中。

此外，将由重组抗人IgG抗体与荧光标签连接而组成的缀合物作为第二结合试剂加入至细胞悬液中。第二结合试剂的抗人IgG抗体为用于第一结合试剂的相同的抗体，但是在此情况中，与合适的荧光标签连接，例如荧光素。合适的缀合物为特定得自MolecularDevices,LLC(森尼韦尔,CA,US)的Recombinant CloneDetect^TM人IgG(Fc)。将所述的缀合物加入到细胞悬液中至最终浓度为1μg/ml，并且将悬液温和地混合。

由于相同的重组抗人IgG抗体用于第一结合试剂和第二结合试剂的特异性结合部分，所以在第一结合试剂与第二结合试剂之间不存在直接的结合。

随后，将200μl细胞悬液的等分试样(具有第二结合试剂)移液到各孔中，从而将细胞接种于96孔板的孔中。如果细胞的浓度为1.0个细胞/ml，那么随后将得到平均0.2个细胞/孔。因此，许多孔根本不具有细胞。大量的孔仅具有1个细胞，仅很少的孔(如果有的话)具有2个细胞或更多。

在接种后，将96孔板在37℃、5％CO₂下孵育。

在大约1小时后，细胞将停留在孔的底部，在此时，使用得自Molecular Devices,LLC(森尼韦尔,CA,USA)的高速成像显微镜使各孔成像。对于各孔，显微镜使用透射白光捕获第一图像、以及第二荧光图像。就荧光图像而言，使用470nm的激发光，并检测535nm的发射光。储存图像用于分析。

将96孔板在37℃、5％CO₂下孵育8天，并如上文所述，在最初1小时的时间点，以及在第1、2、4和8天使各孔成像。

在8天的孵育过程中，在这些孔中，通过细胞复制形成了细胞集落，其中所述孔接种有1个或多个活细胞。在其中仅接种有单一活细胞的任意孔中，在该孔中形成的任何集落为单克隆细胞集落。

一些集落分泌所需的单特异性IgG抗体。所分泌的单特异性抗体与第二结合试剂(即，抗人IgG抗体-荧光素缀合物)和固定的第一结合试剂结合。因此，在其中分泌有所需的单特异性IgG抗体的各孔中，在孔的表面区域上形成包含第一结合试剂、分泌的IgG抗体和第二结合试剂的复合物，其中所述的孔包被有第一结合试剂。

荧光图像的目的是检测和定量荧光标签(并因此检测和定量复合物)。荧光的强度表明了在上文所述的复合物中结合的荧光标签的量。高产细胞簇的荧光图像和白光图像一起示于图5中。

显微镜的光学性质被优选地设置为使得对于各孔而言，荧光图像至少覆盖孔的底部凹形表面。所述的图像还可以覆盖圆筒形侧壁的包被有第一结合试剂的那些区域，但是这是不必要的。荧光图像的覆盖范围决定了评估表面的范围。

在接近孵育结束时，可以通过分析评估表面上的荧光图像的荧光来检测其中发展成能够分泌大量的所需IgG抗体的细胞集落的任意孔。该分析还允许根据所分泌的所需IgG抗体的量来对各孔进行评级。

然后，对具有最高水平的荧光的那些孔(表明分泌IgG抗体的水平较高)进行评估，以确定这些孔是否包含由单一细胞衍生的单一细胞集落。这是通过分析所需考察的各孔的白光图像来实现的。以倒置的时间顺序(由第8天的图像至第1小时的图像)观察图像，并评估各图像中细胞的数量，可以确定孔是否具有由单一细胞衍生的单一集落(即单克隆细胞集落)。图6示出了单一孔的一系列白光图像，其示出了由单一细胞(参见左手侧的拍摄于接种后1小时的图像)至细胞集落(参见右手侧的拍摄于孵育结束时的图像)的发展。

最后选择1个或多个孔。每个所选择的孔都是基于以下标准来选择的：具有由单一单克隆细胞集落分泌的较高水平的所需的IgG抗体。优选的是，每个所选的孔都仅具有1个接种于其中的细胞(而不是1个活细胞加上1个或多个非活细胞)。还可以通过评估在孵育的不同时间点所拍摄的图像中的细胞数量来评估细胞的生长速率，并且所述的选择可以包括选择表现出满意的细胞生长速率的孔。

在8天的孵育后，可以将所选择的单克隆集落再次接种于更大的孔中。可以使用上文所述的相同的方法来监测所需IgG抗体的产生、以及生长速率，从而证实克隆的稳定性。

可以使用蛋白G来替代重组抗人IgG抗体。在这种情况下，将蛋白G包被在评估表面上作为第一结合试剂。就第二结合试剂而言，可以将蛋白G与荧光标签缀合。

所述方法的第二具体实施例

以下实施例示出本发明的方法如何可以用来从细胞的异源混合物开始产生单克隆细胞集落，并且随后对具有足够生长速率并分泌对所关注的蛋白具有特异性的单特异性IgG抗体的单克隆细胞集落进行选择。

在本实施例中使用的细胞为通过将骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合而生成的杂交瘤细胞。融合过程提供了细胞的异源混合物，其中只有较少比例的细胞产生对所关注的蛋白具有所需特异性的抗体。

首先，准备96孔板用于所述的方法中。这要求平板的孔设置有所需的抗体与之结合的蛋白(抗原)包被物。在过滤的1x包被缓冲液中制备蛋白的包被液(15μg/ml)。所述的包被缓冲液为得自ImmunoChemistry Technologies LLC公司(伯明顿,MN,USA)的、货号为No.6245的市售可得的缓冲液。在该实施例中，96孔板的孔为具有凹形底部表面的U形孔。将100μl包被液的等分试样放置在平板的各孔中。这足以覆盖凹形底部表面，并且还覆盖了圆筒形侧表面的少量下部区域。在室温下，将包被液在孔中放置2小时。然后，使用PBS将孔洗涤3次。

在准备96孔板后，在生长培养基中制备细胞异源混合物的悬液。在该实施例中使用的生长培养基为具有20％胎牛血清的IMDM。将细胞的混合物悬浮在生长培养基中以得到介于0.5至1.5个细胞/ml之间的稀释物。

此外，将由抗IgG抗体与荧光标签连接而组成的缀合物作为第二结合试剂加入至细胞悬液中。缀合物的抗体对小鼠IgG具有特异性。合适的缀合物为特定得自MolecularDevices,LLC(森尼韦尔,CA,US)的CloneDetect小鼠IgG。将所述的缀合物加入到细胞悬液中至最终浓度为1μg/ml，并且将悬液温和地混合。

随后，将200μl细胞悬液的等分试样(具有第二结合试剂)移液到各孔中，从而将细胞接种于96孔板的孔中。如果细胞的浓度为1.0个细胞/ml，那么随后将得到平均0.2个细胞/孔。因此，许多孔根本不具有细胞。大量的孔仅具有1个细胞，仅很少的孔(如果有的话)具有2个细胞或更多。

在接种后，将96孔板在37℃、5％CO₂下孵育。

在大约1小时后，细胞将停留在孔的底部，在此时，使用得自Molecular Devices,LLC(森尼韦尔,CA,USA)的高速成像显微镜使各孔成像。对于各孔，显微镜使用透射白光捕获第一图像、以及第二荧光图像。就荧光图像而言，使用470nm的激发光，并检测535nm的发射光。储存图像用于分析。

将96孔板在37℃、5％CO₂下孵育8天，并如上文所述，在最初1小时的时间点，以及在第1、2、4和8天使各孔成像。

在8天的孵育过程中，在这些孔中，通过细胞复制形成了细胞集落，其中所述孔接种有1个或多个活细胞。在其中仅接种有单一活细胞的任意孔中，在该孔中形成的任何集落为单克隆细胞集落。

一些集落分泌所需的单特异性IgG抗体。所分泌的抗体与第二结合试剂的抗IgG抗体部分结合，并且还与固定的蛋白抗原结合。因此，在其中分泌有所需的IgG抗体的各孔中，在孔的包被表面区域上形成了包含蛋白抗原、分泌的IgG抗体和第二结合试剂的复合物。

就第一个实施例而言，荧光图像的目的是检测和定量荧光标签(并因此检测和定量复合物)。显微镜的光学性质被优选地设置为使得对于各孔而言，荧光图像覆盖孔的底部凹形表面。荧光图像的覆盖范围决定了评估表面的范围。

在接近孵育结束时，可以通过分析评估表面上的荧光图像的荧光来检测其中发展为分泌具有所需特异性的抗体的细胞集落的任意孔。该分析还允许根据所分泌的所需IgG抗体的量来对各孔进行评级。

然后对具有荧光信号的那些孔(表明存在具有所需特异性的IgG抗体)进行评估，从而确定这些孔是否包含由单一细胞衍生的单一细胞集落。这是如第一实施例所述的通过分析所需考察的各孔的白光图像来实现的。

最后选择1个或多个孔。每个所选择的孔都是基于以下标准来选择的：由单一单克隆细胞集落分泌抗原特异性IgG抗体。优选的是，每个所选的孔都仅具有1个接种于其中的细胞(而不是1个活细胞加上1个或多个非活细胞)。还可以通过评估在孵育的不同时间点所拍摄的图像中的细胞数量来评估细胞的生长速率，并且所述的选择可以包括选择表现出满意的细胞生长速率的孔。

适用于实施所述的方法的仪器

图7示出了适用于实施本发明的仪器。

该仪器包括培养板保持件60，显示出其保持有多孔板64。培养板保持件60安装在XY台62上，其使培养板保持件60沿着X和Y方向移动；换言之，在水平面上沿着正交方向移动。按照这种方式，可以选择多孔板62的任何孔，并且通过所述的仪器成像。

此外，所述的仪器还包括用于白光成像的第一白光源66，用于荧光成像的第二光源68，以及照相机70。照相机70在白光和荧光成像的过程中检测光并产生图像。

照相机将图像传输至计算机72中，其储存并分析图像。计算机72还控制仪器的操作。

在白光成像的过程中，光由第一光源66发出，在被第一镜子74反射后，传输通过多孔板64的所选的孔。光被10x透镜阵列76聚焦在第二镜子78上，其将光反射至照相机70上，用于生成所选孔的底部表面的图像，该孔包含在底部表面上存在的任何细胞。

在荧光成像过程中，第二光源68(其包括滤波器，这样所发出的光具有合适的激发波长)发出光至光学组件(optical block)80。光学组件80使光定向通过透镜阵列76，该透镜阵列76将光聚焦在多孔板64的所选择的孔的底部表面上。激发光激发了位于所选择的孔的底部表面上的任何荧光标签。由荧光标签发出的荧光返回通过透镜阵列76，并通过光学组件80到达第二镜子78，其将光反射至照相机70，用于生成图像。此外，所发出的荧光还经过滤波器(未示出)进行合适的滤波。

在荧光成像的过程中，透镜阵列76起到聚焦激发光和发射光的作用，从而使仪器基本上仅检测由位于所选择的孔的底部表面上的荧光标签所发出的光。尽管未结合的标签存在于孔的生长培养基中，但是所述的仪器对未结合的标签基本上是不敏感的。

Claims (11)

1.一种选择出分泌所关注的产物的单克隆细胞集落的方法，所述方法包括：

提供多个细胞培养空间，每个细胞培养空间都具有各自的评估表面，其中所述细胞培养空间为各个分开的培养容器；

向各个所述的评估表面提供第一结合试剂，该第一结合试剂被固定在所述的评估表面上；

将细胞悬液接种于所述的多个细胞培养空间中；

在所述的细胞培养空间中，在生长培养基中孵育所述的细胞，从而使所述的细胞复制，其中至少一些所述的细胞分泌所关注的产物；

在所述的细胞培养空间中提供第二结合试剂，该第二结合试剂是非固定的；

其中所述的第一结合试剂和所述的第二结合试剂均与所述的所关注的产物结合，使得在任意一个所述的细胞培养空间中，细胞对所述所关注的产物的分泌导致在该细胞培养空间的相应评估表面上形成包含所述第一结合试剂、所述所关注的产物和所述第二结合试剂的复合物；

对至少一些所述细胞培养空间中的每一个进行评估以确定所述细胞培养空间的所述评估表面上的所述第二结合试剂的存在情况；和所述细胞悬液在所述的多个细胞培养空间中的接种使得至少一些所述的细胞培养空间接种有且仅有一个细胞，

通过针对至少一些所述细胞培养空间中的每一个，测定该细胞培养空间是否包含衍生自单一细胞的单一细胞集落；其中对于实施所述的测定的所述至少一些细胞培养空间中的每一个而言，所述的测定包括，通过在所述的孵育过程中的多个时间点，对所述细胞培养空间中的细胞进行显微观察，而测定是否细胞培养空间接种有且仅有一个细胞；以及

通过使用所述的评估和所述的测定来选择细胞培养空间，所选择的细胞培养空间包含分泌所述所关注的产物的单一的单克隆细胞集落，且其中所选择的细胞培养空间接种有且仅有一个细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养空间为多孔培养板的孔。

3.根据权利要求1所述的方法，其中对于所评估的所述至少一些细胞培养空间中的每一个，所述的对所述第二结合试剂的存在情况的评估使用了光学聚焦装置和光检测装置，所述的光学聚焦装置将由所述的细胞培养空间的所述评估表面上得到的光聚焦到所述的光检测装置上，从而通过所述的光检测装置来检测所述的光，所聚焦的光表示存在于所述细胞培养空间的所述表面上的第二结合试剂的量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中从所述细胞培养空间的与所述评估表面具有一定间隔的位置处得到的光不被所述的光学聚焦装置聚焦到所述的光检测装置。

5.根据权利要求3所述的方法，其中发光标签与所述第二结合试剂结合，所述发光标签发出被所述光学聚焦装置聚焦的光。

6.根据权利要求1所述的方法，其中发光标签与所述的第二结合试剂结合，并且所述的对所述评估表面进行评估以确定所述第二结合试剂的存在情况包括，检测结合在所述评估表面上的标签所发出的光，其中一部分的所述标签未与所述评估表面结合，并且位于所述细胞培养空间中远离所述评估表面的位置，并且其中所述的评估对该部分的标签所发出的光不敏感。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述的发光标签发出荧光，并且所述的方法包括使用激发光激发所述发光标签。

8.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞培养空间为96孔板或384孔板的孔。

9.根据权利要求1或3所述的方法，其包括基于对所述表面的第二结合试剂的存在情况的评估来确定所述细胞培养空间的子集，与不是该子集中的一部分的那些细胞培养空间相比，该子集的细胞培养空间具有更高水平的存在于所述评估表面上的所述第二结合试剂，并且其中所述的测定所述细胞培养空间是否包含衍生自单一细胞的单一细胞集落仅在所述子集的细胞培养空间上实施。

10.根据权利要求9所述的方法，其包括，对于各细胞培养空间，随时间各获得一系列图像并储存该系列图像，并且其中所述的测定所述细胞培养空间是否包含衍生自单一细胞的单一细胞集落包括，分析由各所述子集的细胞培养空间得到的一系列图像。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其包括，对于所述至少一些细胞培养空间中的每一个，获得细胞在该细胞培养空间中的生长速率的指标，所述指标用于选择所述细胞培养空间。