KR20150053793A - 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법 - Google Patents

단클론성 세포 콜로니의 선택 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150053793A
KR20150053793A KR1020157008860A KR20157008860A KR20150053793A KR 20150053793 A KR20150053793 A KR 20150053793A KR 1020157008860 A KR1020157008860 A KR 1020157008860A KR 20157008860 A KR20157008860 A KR 20157008860A KR 20150053793 A KR20150053793 A KR 20150053793A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell culture
cell
culture space
light
evaluation
Prior art date
Application number
KR1020157008860A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102072458B1 (ko
Inventor
쥴리안 프란시스 버크
크리스토퍼 죤 만
알라스데어 맥밀란 로버트슨
Original Assignee
몰레큘라 디바이스 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몰레큘라 디바이스 엘엘씨 filed Critical 몰레큘라 디바이스 엘엘씨
Publication of KR20150053793A publication Critical patent/KR20150053793A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102072458B1 publication Critical patent/KR102072458B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

다수의 세포 배양 공간을 제공하는 관심의 생성물을 분비하는 단클론성 세포 콜로니를 선택하는 방법; 각각의 세포 배양 공간은 평가면 상에 고정된 첫 번째 결합제를 가지는 각각의 평가면을 가진다. 세포는 세포의 복제를 위해 세포 배양 공간의 성장 배지에서 인큐베이션된다. 적어도 일부의 세포는 관심의 생성물을 분비한다. 두 번째 결합제는 세포 배양 공간에 제공된다. 초기에, 두 번째 결합제는 고정되지 않는다. 첫 번째 및 두 번째 결합제는 각각 관심의 생성물에 결합하여서 세포 배양 공간 중 어느 하나에서 세포에 의한 관심의 생성물의 분비는 첫 번째 결합제, 관심의 생성물 및 두 번째 결합제를 가지는 복합체가 세포 배양 공간의 해당 평가면에서 형성되는 것을 유도한다.

Description

단클론성 세포 콜로니의 선택 방법{METHOD OF SELECTING A MONOCLONAL CELL COLONY}
본 출원은 2012년 9월 14일에 출원된 유럽 특허 출원 일련 번호 12184418.7호의 유익을 주장하며, 그것의 내용은 본원에 전체적으로 참조로 포함된다.
본 발명은 관심의 생성물을 분비하는 단클론성 세포 폴로니의 선택 방법에 관한 것이다.
공지된 방법에서, 세포의 이종성 혼합물로부터의 세포는 다중-웰 플레이트의 웰에 제한 희석을 사용하여 플레이팅된다. 단클론성 세포 콜로니의 형성은 웰의 세포의 백색광 영상화에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 관심의 생성물의 분비의 평가는 각 웰로부터 획득되고 관심의 생성물에 대해 분석되어야 할 각각의 분액을 필요로 한다. 분액의 획득 및 분석은 방법을 바람직하지 않게 복잡하게 만든다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 관심의 생성물을 분비하는 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법이 제공되는데, 그 방법은 다수의 세포 배양 공간을 제공하는 단계, 이때 각각의 세포 배양 공간은 각각의 평가면(assessment surface)을 가지고; 각각의 상기 평가면에 그 평가면상에서 고정되는 첫 번째 결합제를 제공하는 단계; 적어도 일부의 세포 배양 공간이 단일 생존성 세포로 플레이팅되도록 다수의 세포 배양 공간에 세포 현탁액을 플레이팅하는 단계; 세포를 세포 배양 공간의 성장 배지에서 인큐베이션하여 세포 복제를 유발하는 단계, 이때 적어도 일부의 세포는 관심의 생성물을 분비하며; 세포 배양 공간에 두 번째 결합제를 제공하는 단계, 이때 두 번째 결합제는 고정되지 않고; 첫 번째 및 두 번째 결합제는 각각 관심의 생성물에 결합하여 세포 배양 공간의 어느 것에서 세포에 의한 관심의 생성물의 분비가 상기 하나의 세포 배양 공간의 해당하는 평가면에서 첫 번째 결합제, 관심의 생성물 및 두 번째 결합제를 포함하는 복합체의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하며; 세포 배양 공간의 적어도 일부의 각각을 세포 배양 공간의 평가면에서 두 번째 결합제의 존재에 대해 평가하는 단계; 세포 배양 공간의 적어도 일부의 각각에 대해 세포 배양 공간이 단일 세포로부터 유도되는 단일 세포 콜로니를 함유하는지의 여부를 측정하는 단계; 및 상기 평가 및 상기 측정을 사용하여 관심의 생성물을 분비하는 단일 단클론성 세포 콜로니를 함유하는 세포 배양 공간을 선택하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 것과 같은 용어 "단클론성"은 세포 복제에 의해 단일 조상 세포로부터 유도되는 다수의 배양된 세포를 말한다. 바람직하게는, 세포는 진핵생물 세포이겠지만, 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이 "선택하는"은 선택하는 것을 의미하고 세포 배양 공급원으로부터 단클론성 세포 콜로니의 제거를 필요로 하지 않는다. 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "분비하다"는 세포에 의한 생성 및 어떠한 메커니즘에 의한 관심의 생성물의 세포외 공간으로의 방출을 포함한다. 일반적으로 메커니즘은 세포를 죽이지 않고 관심의 생성물을 분비하는 능력을 계속 가지고 있는 생존성 세포를 남기는 것일 것이다. 예를 들어 세포가 진핵생물의 것인 경우에, 관심의 생성물은 조면 소포체, 골지체 및 분비 소포를 포함하는 고전적인 분비 경로에 의해 분비될 수 있다. 또는 달리, 관심의 생성물은 어떠한 공지된 또는 미지의 비-고전적인 분비 메커니즘에 의해 분비될 수 있다.
관심의 생성물은 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 이 경우에 폴리펩티드 또는 단백질은 글리코실화되거나 및/또는 어떠한 다른 번역-후 변형이 진행될 수 있다. 보다 바람직하게는, 관심의 생성물은 항체 또는 항체의 단편이다.
세포 배양 공간은 세포 배양 공간의 성장 배지가 어떠한 다른 세포 배양 공간의 성장 배지와 유체 소통되지 않는다는 점에서 상호 독립적이다. 바람직하게는 세포 배양 공간은 각각 다중-웰 배양 플레이트의 웰이다. 예를 들어 세포 배양 공간은 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트의 웰일 수 있다. 또는 다르게는, 세포 배양 공간은 각각의 별도의 배양관에 의해 제공될 수 있다.
각각의 세포 배양 공간에 대해, 관련된 평가면은 세포의 인큐베이션 중에 그 세포 배양 공간에서 사용되는 성장 배지와 접촉한다. 각각의 평가면은 바람직하게는 관련된 세포 배양 공간을 제공하는 세포 배양관의 인티그랄 표면(integral surface)이다. 또는 다르게는, 평가면은 배양관에 위치한 관심의 표면일 수 있다. 세포 배양 공간은 다중-웰 플레이트의 웰이고, 각각의 평가면은 바람직하게는 관련된 웰 바닥의 위쪽을 향하여 바라보는(upwardly-facing) 표면이다. 이 경우 바닥 표면은 평평하고, 위를 향하여 바라보는 수평면이다. 특히 바람직한 구체예에서, 각 세포 배양 공간은 다중-웰 플레이트의 웰이고 각각의 평가면은 바닥의 위를 향한 면의 오목한 표면이다. 세포가 오목한 바닥 표면을 가지는 웰에 위치할 때, 바닥 표면의 오목한 형상은 세포가 바닥 표면의 가장 낮은 지점인 바닥 표면의 중간을 향하게 하는 경향이 있다. 이것은 바닥 표면의 가장자리에 있을 때와 비교하여 웰의 바닥 표면의 중간에 위치한 세포 또는 세포들을 가시화 또는 영상화하는 것이 더 쉽기 때문에 유익하다. 오목한 바닥 표면을 가지는 다중-웰 플레이트는 상업적으로 이용할 수 있고 때로 U-자형 웰을 가지는 것으로서 언급된다.
평가면은 그 표면에서 두 번째 결합제의 존재가 평가되는 표면이다. 평가면은 표면 형상 또는 형태의 변화를 포함하는 가장자리(예컨대 웰의 바닥 표면과 원주형 측면 사이의 가장자리) 또는 가장자리들에 의해 한정될 필요가 없고, 평가면의 크기는 평가의 공간적 크기에 의해 간단하게 측정될 수 있다. 실례로, 세포 배양 공간은 다중-웰 플레이트의 벽이고, 평가면은 예를 들면 바닥 표면의 전부가 아닌 부분일 수 있으며, 또는 다르게는, 평가면은 전체 바닥 표면 더하기 원주형 측면의 인접한 영역일 수 있다. 물론, 다르게는 평가면은 단순히 웰의 바닥 표면의 크기에 해당할 수 있다.
세포 배양 공간은 다른 표면을 가질 수 있다. 예를 들어 세포 배양 공간이 다중-웰 플레이트의 웰인 경우에, 평가면은 웰의 바닥 표면일 수 있고, 그러면 웰의 수직으로 뻗어 있는 원주형 측면은 또 다른 표면이다.
첫 번째 결합제는 바람직하게는 세포가 관련된 세포 배양 공간에 플레이팅되기 전에 평가면상에 고정된다. 그러나, 이것은 사례화될 필요는 없으며 첫 번째 결합제가 그 위에 고정되어 있는 평가면은 세포의 플레이팅 후에 세포 배양관의 성장 배지 안으로 삽입될 수 있는 삽입물에 의해 제공될 수 있다. 그러나, 고정된 첫 번째 결합제는 적어도 일부, 바람직하게는 전체 인큐베이션 중에 성장 배지와 접촉될 필요가 있고, 그로써 관심의 생성물이 세포에 의해 평가면상에 위치할 성장 배지 안으로 분비되는 것이 가능해야 한다.
그러므로 청구범위 1에서 열거되는 방법의 단계들은 반드시 그것들이 열거되는 순서대로 수행될 필요는 없다.
첫 번째 결합제는 관심의 생성물에 결합할 수 있는 어떠한 제제일 수 있는 한편, 첫 번째 결합제는 평가면상에 고정되어 평가면에 관심의 생성물이 위치할 수 있다. 일반적으로 표현하자면, 첫 번째 결합제에의 결합에 의해 평가면에 위치하게 되는 분비된 관심의 생성물의 백분율은 가능한 높아야 한다. 바람직하게는 첫 번째 결합제는 관심의 생성물에 충분히 선택적으로 결합함으로써 첫 번째 결합제와 성장 배지의 다른 성분들 사이의 결합이 평가면에서의 관심의 생성물의 정위를 유의미하게 간섭하지 않는다. 첫 번째 결합제는 관심의 생성물에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어 첫 번째 결합제는 관심의 생성물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 다르게는, 만약 관심의 생성물이 항체 또는 항체 단편 자체라면, 첫 번째 결합제는 관심의 생성물이 결합하는 에피토프를 포함할 수 있다.
첫 번째 결합제는 평가면상에 어떠한 적당한 방식으로든지 고정될 수 있다. 많은 고정 방법이 알려져 있고 생화학 또는 면역학 교재에 기술된다. 일반적으로, 첫 번째 결합제는 평가면상에 표면에 코팅됨으로써 고정될 것이다. 코팅을 형성하기에 적당한 키트들이 상업적으로 활용가능하고 코팅을 형성하기 위한 많은 방법들이 생화학 또는 면역학 교재에 기술되어 있다.
바람직하게는, 첫 번째 결합제는 세포 배양 공간의 어떠한 다른 표면을 덮지 않으면서 전체 평가면을 덮기 위해 고정되어야 한다. 그러나 이것은 필수적인 것은 아니고 방법은 여전히 일부의 평가면만이 고정된 첫 번째 결합제로 덮이거나, 또는 다르게는 평가면 외에 세포 배양 공간의 다른 표면에 고정된 첫 번째 결합제가 제공되더라도 만족스럽게 수행될 수 있다. 실례로, 세포 배양 공간이 다중-웰 플레이트의 웰이고 평가면이 웰의 바닥 표면인 경우에, 본 발명은 만약 고정된 첫 번째 결합제가 웰의 바닥 표면을 덮고 있는 것 외에, 첫 번째 결합제가 또한 웰의 측면의 원주형 표면의 더 낮은 부분을 덮고 있어도 여전히 만족스럽게 수행될 수 있다. 이 경우 관심의 생성물은 바닥 표면과 또한 원주형 측면 둘 다에 결합할 수 있지만, 평가는 원주형 측면이 아닌 바닥 표면에서만 두 번째 결합제를 검출할 수 있다. 이것은 평가면에 위치한 분비된 관심의 생성물의 총량의 감소가 평가의 민감성을 감소시킬 수 있기 때문에 이상적이지 않다. 그러나, 방법은 여전히 이런 상황들에서도 유용하다. 웰의 바닥 표면상의 두 번째 결합제의 양은(그것이 검출가능한 것으로 가정할 때) 여전히 성장 배지 안으로 분비된 관심의 생성물의 양을 나타내는 것일 것이다.
일반적으로, 세포 현탁액은 세포의 이종성 믹스(mix)의 현탁액일 것이다. 전부일 필요가 없는, 적어도 일부의 세포는 적절한 조건 하에서 배양될 때 관심의 생성물을 생성할 수 있을 것이다. 예를 들어 단일특이적 항체의 제조에서, 골수종 세포는 비장 세포와 융합되어 하이브리도마 세포가 형성된다. 융합 과정은 상대적으로 작은 백분율의 이종성 믹스만이 필요한 단일특이적 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포가 되는 세포의 이종성 믹스를 초래한다. 본 발명의 방법은 골수종 세포의 비장 세포와의 융합으로부터 생성되는 이종성 세포 혼합물에 적용될 수 있다. 이런 경우 그 방법은 필요한 단일특이적 항체를 분비할 수 있는 단클론성 세포 콜로니의 선택을 가능하게 한다.
다르게는, 본 발명의 방법은 형질전환 과정으로부터 생성하는 세포의 이종성 혼합물에 적용될 수 있다. 관련없는 핵산으로 세포를 형질전환하여 원하는 생성물을 분비할 수 있는 셀라인을 생성하는 것이 자주 요구된다. 형질전환 과정은 단지 상대적으로 작은 백분율의 이종성 믹스만이 필요한 생성물을 형성할 수 있게 되는 세포의 이종성 믹스를 초래한다. 이 경우에 본 발명의 방법은 필요한 생성물을 분비할 수 있는 단클론성 세포 콜로니의 분비를 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 구절 "단일 생존성 세포"는 하나 및 단지 하나의 생존성 세포를 의미하지만, 하나 또는 더 많은 비-생존성 세포의 존재를 배제하지 않는다. 용어 "생존성"은 인큐베이션 중에 세포가 경험하는 배양 조건 하에서 생존하고 복제할 수 있는 세포를 말하며, "비-생존성 세포"는 이런 능력이 없는 세포이다.
세포 배양 공간에서 단일 생존성 세포의 플레이팅을 이루기 위해 세포를 플레이팅하는 방법은 알려져 있고 자주 제한 희석으로서 언급된다. 그런 방법은 현탁액 중의 세포의 예정된 농도(즉 현탁액의 단위 부피당 생존성 및 비-생존성 세포의 예정된 수)를 이루기 위하여 세포 현탁액을 준비하는 것을 포함한다. 각각의 세포 배양 공간에 플레이팅될 현탁액의 부피는 알려져 있다. 현탁액 중의 세포의 필요한 농도는 각각의 세포 배양 공간으로 플레이팅될 현탁액의 부피를 고려하여, 통계학적으로 각각의 세포 배양 공간이 단일 생존성 세포를 수용하거나 또는 전혀 생존성 세포가 없는 것이 가능하겠지만, 매우 적은 세포 배양 공간이 하나 이상의 생존성 세포를 수용하도록 계산된다. 현탁액 중의 세포의 생존성은 예정된 농도를 계산할 때 고려될 수 있어서 만약 상대적으로 큰 백분율의 세포가 비-생존성이라면, 총 세포의 예정된 농도는 저수준의 생존성을 고려하기 위해 증가될 수 있다. 둘 또는 더 많은 생존성 세포가 세포 배양 공간에 플레이팅되는 경우, 두 개의 단클론성 콜로니 또는 혼합된 콜로니가 세포 배양 공간에서 발생할 수 있고, 그런 세포 배양 공간은 보통 선택으로부터 제외될 것이다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 다수의 세포 배양 공간에 세포 현탁액을 플레이팅하는 것은 세포 배양 공간의 적어도 일부에 한 가지 세포 및 한 가지 세포만으로 - 한 가지 세포가 생존성이거나 비생존성이거나에 관계 없이- 플레이팅되는 것을 보장하기 위해 이루어질 것이다. 이것은 각각의 세포 배양 공간에 플레이팅될 현탁액의 부피를 유념하여, 현탁액 중의 (생존성 및 비-생존성) 세포의 적절한 농도를 선택함으로써 이루어질 수 있다. 이것의 목적은 비-생존성 세포 없이 오로지 단일 생존성 세포만으로 플레이팅될 세포 배양 공간에서 생성된 단클론성 세포 콜로니를 선택할 수 있도록 하는 것이다. 만약 세포 배양 공간에, 예를 들면 하나의 생존성 세포와 하나의 비-생존성 세포가 플레이팅된다면, 생존성 세포는 그 세포 배양 공간에서 복제되어 단클론성 세포 콜로니를 생성할 것이 가능하다. 비-생존성 세포는 복제하지 못할 것이고 죽을 것이다. 그런 세포 배양 공간으로부터 생성된 단클론성 세포 콜로니는 어떤 용도에서는 유용할 수 있다. 그러나, 많은 상황에서, 하나의 세포 및 하나의 세포만이 플레이팅된(즉 하나의 생존성 세포 및 비-생존성 세포는 없는) 세포 배양 공간에서 생성된 단클론성 세포 콜로니를 선택하는 것이 바람직하다. 이것은 관심의 생성물의 규제 승인을 얻기 위한 일부 용도에 필요할 것이다.
제한 희석을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 세포는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 세포 배양 공간에 단일 생존성 세포를 플레이팅하기 위해 플레이팅될 수 있다.
성장 배지는 어떠한 적당한 성장 배지일 수 있다. 성장 배지는 배양된 세포에 생존 및 복제에 필요한 모든 것을 제공할 수 있다. 또한, 어떠한 특정 화합물이 관심의 생성물을 분비할 수 있는 세포가 실제로 관심의 생성물을 분비하기 위해 필요하다면, 그 화합물은 대개는 성장 배지에 포함될 것이다. 바람직하게는, 성장 배지는 액체 성장 배지일 것이다. 그러나 다른 유형의 성장 배지, 예를 들면 반-고체 성장 배지도 사용될 수 있다.
세포는 비-점착성이거나 또는 세포 배양 공간의 표면에 점착할 수 있다.
액체 성장 배지가 사용되고 세포가 점착성인 경우, 배지는 인큐베이션 과정 중에 대체되거나 부분적으로 대체될 수 있다. 그러나, 세포 배양 공간에서 대체 없이 동일한 성장 배지를 유지하는 것이 바람직한데, 그것이 가능하다면 그로써 분비된 관심의 생성물의 잠재적인 손실과 세포에 대한 잠재적인 파괴를 피할 수 있기 때문이다. 성장 배지를 세포 배양 공간에 유지시키면서 평가를 수행하는 것이 바람직하다. 추가로, 성장 배지를 세포 배양 공간에 유지시키면서 측정을 수행하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 세포는 평가 동안 세포 배양 공간에 유지된다.
두 번째 결합제는 관심의 생성물에 특이적으로 결합함으로써 두 번째 결합제의 평가면에서의 존재는 평가면에서의 관심의 생성물의 존재를 나타낸다(관심의 생성물은 첫 번째 결합제에 결합된다). 바람직하게는, 평가면에서 결합된 두 번째 결합제의 양은 표면에서 결합된 관심의 생성물의 양을 나타낸다. 두 번째 결합제의 양과 관심의 생성물 사이의 관계는 예를 들면 포지티브 선형 비례 관계일 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, 두 번째 결합제는 관심의 생성물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 다르게는, 만약 관심의 생성물 자체가 항체 또는 항체 단편이라면, 두 번째 결합제는 관심의 생성물이 결합하는 에피토프를 포함할 수 있다.
두 번째 결합제는 성장 배지의 세포 배양 공간에 첨가되거나 또는 성장 배지의 첨가 전이나 후에 성장 배지와 별도로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 두 번째 결합제는 성장 배지에서 세포가 인큐베이션되는 적어도 일부 동안에 성장 배지에 존재하고, 보다 바람직하게는 두 번째 결합제는 전체 인큐베이션 동안 성장 배지에 존재한다.
적어도 초기에, 두 번째 결합제는 대체로 성장 배지 중에 용액으로(또는 다르게는 가능한 현탁액으로) 존재하며 고정되지 않는다. 만약 관심의 생성물이 세포 배양 공간에서 세포에 의해 생성된다면, 관심의 생성물은 첫 번째 및 두 번째 결합제에 모두 결합하여 복합체를 형성하고 이런 방식으로 두 번째 결합제는 평가면에 결합될 것이다. 관심의 생성물은 첫 번째 및 두 번째 결합제에 어떠한 순서로든지 결합될 수 있다.
바람직하게는, 첫 번째 및 두 번째 결합제는 관심의 생성물에 대한 어느 하나의 결합이 다른 하나의 관심의 생성물에의 결합을 방해하지 않도록 선택된다. 예를 들어 만약 관심의 생성물이 IgG 항체라면, 첫 번째 및 두 번째 결합제 중 하나는 관심의 생성물의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있고, 다른 하나의 결합제는 관심의 생성물에 대한 에피토프를 포함할 수 있다. 다르게는, 첫 번째 및 두 번째 결합제는 각각이 관심의 생성물 상의 각각의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있고, 그 에피토프들은 충분한 거리만큼 서로 떨어져 있어서 입체적 방해를 피한다. 다른 많은 배치들도 가능하다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 방법은 세포 배양 공간의 평가면에서 두 번째 결합제의 존재에 대해 세포 배양 공간을 평가하는 것을 포함한다. 평가면들 중 하나에서 두 번째 결합제의 존재는 관련된 세포 배양 공간에서 세포에 의한 관심의 생성물의 생성을 나타낸다.
바람직하게는, 세포 배양 공간의 평가면에서 두 번째 결합제의 존재는 두 번째 결합제와 관련된 표지의 검출에 의해 평가된다. 표지는 쉽게 검출될 수 있는 어떠한 제제일 수 있다. 바람직한 실례는 형광 표지이다. 바람직한 한 구체예에서, 표지는 두 번째 결합제의 통합 부분이다. 예를 들면, 표지는 특이한 결합제에 결합되거나 연결되어 두 번째 결합제를 형성하는 형광제일 수 있다. 보다 구체적인 실례로, 두 번째 결합제는 필요한 특이한 결합 용량을 제공하기 위하여 항체 또는 항체 단편, 및 형광 표지, 예컨대 플루오레신을 포함할 수 있다. 형광 표지는 어떠한 적당한 방식으로든지, 예컨대 직접 공유 결합에 의해 또는 형광제와 항체 또는 항체 단편 둘 다에 결합하는 결합제를 사용함으로써 항체 또는 항체 단편에 결합 또는 연결될 수 있다. 형광 표지된 항체는 상업적으로 이용할 수 있다.
바람직한 다른 구체예에서, 표지는 두 번째 결합제의 통합 부분은 아니지만 두 번째 결합제에 특이적으로 결합할 수 있다. 이 경우에 표지는 바람직하게는 특이한 결합 부분, 예컨대 두 번째 결합제에 특이한 결합을 가능하게 하는 항체 또는 항체 단편, 및 또한 검출가능한 부분, 예컨대 형광제를 포함한다. 결합 부분 및 검출가능한 부분은 어떠한 편리한 방식으로, 예를 들면 직접 공유 결합에 의해 또는 두 부분에 모두 결합하는 결합제에 의해 함께 결합될 수 있다. 구체적인 실례로, 만약 두 번째 결합제가 특정 동물 종의 IgG 항체라면, 표지는 그 동물 종의 IgG에 결합하는 항체를 형광제와 같은 검출가능한 부분과 함께 포함할 수 있다.
표지가 두 번째 결합제의 통합 부분이 아닌 경우, 표지는 그것이 두 번째 결합제에 결합하는 것을 가능하게 하기에 충분한 방식으로 평가에 앞서 첨가되는 한, 평가 전 어떠한 편리한 시간에 세포 배양 공간에 첨가될 수 있다.
표지가 평가를 위해 사용되는 경우에, (미결합 표지가 제거되지 않는 한) 세포 배양 공간의 표지의 총량은 세포 배양 공간의 평가면(및 가능한 다른 표면)에서 결합하게 되는 두 번째 결합제의 양 및 표지의 양과 관계없이 동일하게 유지될 것임이 인지될 것이다. 이것은 표지가 두 번째 결합제의 통합 부분일 때 및 또한 표지가 두 번째 결합제와는 별개지만 두 번째 결합제에 특이적으로 결합할 수 있을 때 모두 적용된다. 그러므로, 만약 상대적으로 많은 양의 관심의 생성물이 세포 배양 공간에서 세포에 의해 생성된다면, 이것은 세포 배양 공간의 평가면(및 가능하게는 다른 표면)에서 결합되는 상대적으로 많은 양의 두 번째 결합제 및 표지를 초래할 것이다. 성장 배지에 자유롭게 남아있는 표지의 양은 상대적으로 적다. 역으로, 만약 상대적으로 적은 양의 관심의 생성물이 생성되면, 평가면(및 가능하게는 다른 표면)에 결합된 표지의 양은 상대적으로 적을 것이고 성장 배지에 자유롭게 남아있는 표지의 양은 상대적으로 높다. 그러나, 두 가지 경우 모두(동일한 양의 표지가 첨가되는 것으로 가정할 때) 결합된 표지 더하기 미결합 표지의 총량은 동일하다.
대부분의 경우에, 세포 배양 공간으로부터 미결합 표지를 제거하는 일 없이 세포 배양 공간의 평가면에 결합된 표지를 검출할 수 있는 것이 바람직하다(보다 바람직한 것은 결합된 표지의 양의 표식을 얻는 것이다). 성장 배지가 액체 성장 배지이고 세포가 평가면(또는 세포 배양 공간의 다른 표면)에 점착되는 경우에, 성장 배지의 제거 및 계속해서 성장 배지 중의 미결합 표지의 제거는 가능할 수 있지만, 이것은 자주 바람직하지 못한데 그것이 세포를 제거하거나, 세포를 손상시키거나 또는 세포 성장을 파괴할 위험이 있기 때문이다. 그것은 또한 방법, 및 조작이 추가로 복잡해지는 것을 포함하는데, 그것들은 둘 다 바람직하지 못하다. 세포 배양 공간에서 미결합 표지의 제거를 바라는 것은, 동일한 이유로 가능하면 언제든지 피해야 한다. 그러므로 평가가 두 번째 결합제와 관련된 표지를 검출함으로써 수행되는 경우, 평가는 바람직하게는 표지의 검출방법을 포함하고, 그 방법은 평가면에 결합된 표지에 민감하지만, 성장 배지에서 자유롭게 남아있는 표지에는 덜 민감하거나 완전히 무감각하다.
특히 바람직한 본 발명의 구체예에서, 평가면에서 두 번째 결합제의 존재에 대해 평가되는 각각의 세포 배양 공간에 대해, 평가는 광학 초점 장치 및 광검출 장치를 사용한다. 광학 초점 장치는 광검출 장치에 의해 빛을 검출하기 위해 세포 배양 공간의 평가면으로부터 광검출 장치로 빛을 초점화한다. 초점화된 빛은 세포 배양 공간의 평가면에 존재하는 두 번째 결합제의 양을 나타낸다. 광학 초점 장치는 렌즈 또는 광학 요소의 어레이(렌즈 또는 다른 광학 요소)일 수 있다. 빛은 가시광, 자외선 또는 적외선일 수 있다. 빛은 레이저 빛일 수 있다. 검출 장치는 빛을 검출할 수 있는 어떠한 장치일 수 있고, 예를 들면 CCD 검출기, CMOS 검출기 또는 sCMOS 검출기를 포함할 수 있다. 다르게는, 검출 장치는 광전자 증배관(PMT)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 광검출 장치는 평가되는 각각의 세포 배양 공간에 대해, 평가면으로부터 수용된 빛의 세기를 나타내는 각각의 신호를 생산한다. 그 세기는 바람직하게는 평가면에서 두 번째 결합제의 양을 나타낸다. 빛은 바람직하게는, 상기에서 논의된 것과 같이, 두 번째 결합제의 통합 부분일 수 있거나 두 번째 결합제와 별개이면서 그것에 특이적으로 결합할 수 있는 표지에 의해 방출된다. 특히 바람직한 구체예에서, 표지는 형광 표지이다. 이 경우에 평가는 형광 표지를 자극할 수 있는 자극광으로 세포 배양 공간을 비추는 것을 포함한다. 형광 표지에 의해 방출된 형광 빛은 광검출 장치에 의해 검출된다. 방출된 형광 빛의 세기는 표지의 양의 표식을 제공하고, 간접적으로 두 번째 결합제의 양 및 평가면에서의 관심의 생성물의 양을 나타낸다.
보다 더 바람직하게는, 광학 초점 장치의 광학 특성은 평가면으로부터 떨어져 있는 위치의 세포 배양 공간의 다른 곳으로부터의 빛이 (비록 그것이 광학 초점 장치를 통과할 수는 있지만) 광검출 장치에서 광학 초점 장치에 의해 초점화되지 않도록 하는 것이다. 이 방식으로, 광검출 장치는 세포 배양 공간의 다른 곳으로부터 방출된 빛, 예컨대 성장 배지 중의 미결합 표지에 의해 방출된 빛에 덜 민감하거나 그것을 전혀 검출하지 못한다.
바람직하게는, 평가는 두 번째 결합제의 양 및 평가면에 존재하는 관심의 생성물의 양의 정량적 지표를 제공한다.
평가면에서의 두 번째 결합제의 존재에 대해 모든 세포 배양 공간을 평가하는 것은 필요하지 않다. 예를 들어 만약 세포 배양 공간이 하나보다 많은 세포 콜로니를 함유하는 것으로 측정된다면, 그 세포 배양 공간은 무시되거나 평가될 필요가 없다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 방법은 적어도 일부의 세포 배양 공간에 대해, 세포 배양 공간이 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니를 함유하는 지의 여부를 측정하는 것을 포함한다. 용어 "단일 세포 콜로니"는 하나 및 오로지 하나의 세포 콜로니를 의미하기 위해 사용된다. 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니는 단일 생존성 세포로 및 하나 또는 더 많은 비-생존성 세포로 플레이팅된 세포 배양 공간에서, 또는 다르게는, 비-생존성 세포 없이 단일 생존성 세포 단독으로 플레이팅된 세포 배양 공간에서 생성될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이들 두 가지 가능성을 구별하기 위하여, 측정은 바람직하게는 세포 배양 공간이 하나의 세포 및 하나의 세포 단독으로(즉 생존성 세포) 플레이팅되었는지 여부를 측정하는 것을 포함한다.
측정은 바람직하게는 인큐베이션 중에 다수의 시점에서 세포 배양 공간의 세포를 현미경으로 가시화함으로써 수행된다. 예를 들어 액체 성장 배지가 사용되는 경우, 세포는 세포가 플레이팅된 후에(전형적으로는 플레이팅 후 약 1시간 후에) 세포 배양 공간의 바닥 표면상에 정착되자마자 가시화될 수 있다. 또한 세포는 예를 들면 플레이팅된 후 1, 2, 4 및 8일 후에 가시화될 수 있다. 가시화는 바람직하게는 적절한 카메라 및 영상 처리 수단을 사용하여 자동 장치에 의해 수행된다. 적당한 장치는 상업적으로 이용할 수 있다. 인큐베이션 전 과정에 걸쳐 세포 배양 공간의 일련의 영상들을 분석함으로써, 세포 배양 공간에서 생성된 세포 콜로니가 단일 세포로부터 유도되었는지 여부와, 또한 세포 배양 공간이 하나의 세포 및 하나의 세포 단독으로 플레이팅되었는지 여부를 측정하는 것이 가능하다. 가시화는 투과광 현미경검사, 예컨대 명시야, 상대비 및 Nomarsky를 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게도, 측정은 각각의 세포 배양 공간에 대해 각각의 일련의 영상을 얻고 저장하는 자동 장치에 의해 수행된다. 각각의 영상 시리즈는 인큐베이션 동안 상이한 시점의 영상들을 포함한다. 장치는 바람직하게는 상기에서 논의된 것과 같이, 평가면에서 두 번째 결합제에 대해 평가가 이루어질 때까지 영상들을 분석하지 않는다. 그로써 평가면에서 두 번째 결합제의 상대적으로 높은 수준을 나타내는 세포 배양 공간에 속한 영상들의 시리즈만을 분석하는 것이 가능하다. 평가면의 고수준의 두 번째 결합제는 관련된 세포 배양 공간이 관심의 생성물을 고수준으로 생성하는 세포를 함유하는 것을 나타낸다. 자주 관심의 세포는 바로 단지 이들 "고 생성자" 세포이다. 바람직한 실례에서, 방법은 두 번째 결합제의 평가를 위한 임계치를 정의하는 것과 관련된 세포 배양 공간이 그 임계치를 초과하는 그런 일련의 영상들만을 분석하는 것을 포함한다.
방법은 평가 및 측정을 사용하여 세포 배양 공간을 선택하는 것을 포함한다. 선택된 세포 배양 공간은 관심의 생성물을 분비하는 단일 단클론성 세포 콜로니를 함유한다. 그러므로 일반적으로, 선택된 세포 배양 공간은 평가중에 평가면에서 두 번째 결합제의 상대적으로 높은 수준을 증명할 것이고, 그것은 관심의 생성물의 고수준의 생성을 나타낸다. 측정은 세포 배양 공간이 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니를 함유하는 것을 드러낼 것이다. 바람직하게도, 세포 배양 공간은 하나의 세포 및 하나의 세포 단독으로 플레이팅될 것이다.
바람직하게도, 방법은, 세포 배양 공간의 적어도 일부에 대해, 세포 배양 공간에서 세포 성장 속도의 표식을 얻는 것을 포함한다. 그 표식은 세포 배양 공간의 선택에 사용된다. 선택된 세포 배양 공간은 예정된 임계치보다 위의 세포 성장 속도를 가질 수 있다. 다르게는, 선택된 세포 배양 공간은 다른 세포 배양 공간에서의 세포의 성장 속도에 비교하여 상대적으로 높은 세포 성장 속도를 가질 수 있다. 세포 성장 속도의 표식은 인큐베이션 중에 다수의 시점에서 세포 배양 공간의 세포를 가시화함으로써 얻어질 수 있다. 표식은 적용 중에 다양한 시점에서 백분율 세포 집밀도의 추정치를 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 두 번째 측면에 따르면, 본 발명의 첫 번째 측면에 따르는 방법을 수행하기 위한 자동 장치가 제공되고, 그 장치는 광학 초점 장치; 광검출 장치; 다중-웰 플레이트를 유지하기 위한 홀더; 홀더와 광학 초점 장치 및 광검출 장치 사이의 상대적인 이동을 위한 번역 메커니즘; 및 본 발명의 첫 번째 측면의 방법을 수행하기 위해 구성된 조절기를 포함한다.
다음은 실례에 의하여 본 발명의 구체예를 보다 상세하게 설명한 것으로, 첨부된 개략적인 도면을 참조하였다.
도 1은 각각이 평가면을 가지는 세 개의 웰을 보여주는, 다중-웰 배양 플레이트의 부분의 단면도이다.
도 2는 모두 본 발명의 방법의 첫 번째 구체예인 평가면, 첫 번째 결합제, 관심의 생성물 및 두 번째 결합제를 도시한다.
도 3은 모둔 본 발명의 방법의 두 번째 구체예인 평가면, 첫 번째 결합제, 관심의 생성물, 두 번째 결합제 및 별도의 표지를 도시한다.
도 4는 모두 본 발명의 방법의 세 번째 구체예인 평가면, 첫 번째 결합제, 관심의 생성물 및 두 번째 결합제를 도시한다.
도 5는 상대적으로 많은 양의 바람직한 단일특이적 IgG 항체를 분비하는 세포 클러스터의 백색광 영상 및 형광 영상을 도시한다.
도 6은 단일 세포로부터의 단클론성 세포 콜로니의 발달을 보여주는 백색광 영상의 순서도이다.
도 7은 본 발명의 방법을 수행하기에 적당한 장치를 나타내는 다이아그램이다.
평가면에서의 복합체
도 1은 다중-웰 플레이트(12)의 세 개의 웰(10)을 도시한다. 각 웰(10)은 평가면(14)으로서 작용하는 본 발명의 방법의 목적에 대한 각각의 바닥 표면(14)을 가진다. 도 1에서 도시된 것과 같이, 각 웰은 성장 배지(16)를 함유한다. 웰 중 2개는 세포 콜로니(18)를 가지는 것으로 도시된다.
도 2 내지 4는 평가면(14)에서 형성되는 상이한 유형의 복합체의 다양한 실례를 나타낸다. 평가면(14)은 예를 들면 도 1에 도시된 바닥 표면들(14) 중 어느 하나일 수 있다.
도 2에 도시된 첫 번째 구체예에서, 평가면(14)은 항-IgG 항체(20)인 첫 번째 결합제(20)로 코팅된다. 표현의 단순성을 위해, 첫 번째 결합제(20)의 단지 한 분자만이 도시되지만, 첫 번째 결합제(20)의 많은 분자들이 평가면(14)에 결합되고 그것을 덮을 것임이 인지될 것이다. 이 구체예에서 관심의 생성물(22)은 IgG 항체(22)이고 첫 번째 결합제(20)는 관심의 생성물(22)의 Fc 영역에 특이하게 결합한다. 두 번째 결합제(24)는 형광 표지(28)에 공유 연결된 항-IgG 항체(26)를 포함한다. 두 번째 결합제(24)의 항-IgG 항체(26)는 또한 관심의 생성물(22)의 Fc 영역에 특이하게 결합한다. 첫 번째 결합제(20) 및 두 번째 결합제(24)는 관심의 생성물(22) 상에 거리를 두고 위치한 상이한 에피토프들에 결합한다.
모든 구체예에서, 첫 번째 결합제에 두 번째 결합제가 직접적으로 결합해서는 안된다는 것이 인지될 것이다. 그러므로 도 2에 도시된 첫 번째 구체예에서, 첫 번째 결합제(20) 및 두 번째 결합제(24)의 항-IgG 항체(26)는 그것들이 서로 결합하지 않도록 선택된다. 예를 들어 만약 관심의 생성물(22)이 마우스 IgG라면, 첫 번째 결합제(20)와 두 번째 결합제(24)의 항-IgG 항체(26)는 상이한 동물 종으로부터의 항-마우스 IgG 항체일 수 있다.
도 3에 도시된 두 번째 구체예에서, 평가면(14)은 에피토프를 가지는 단백질(30)인 첫 번째 결합제(30)로 코팅된다. 표현의 단순성을 위해서, 첫 번째 결합제(30)의 단지 한 분자만이 도시되지만, 첫 번째 결합제(30)의 많은 분자들이 평가면(14)에 결합되고 그것을 덮을 것임이 인지될 것이다. 이 구체예에서 관심의 생성물(32)은 IgG 항체(32)이고 첫 번째 결합제(30)의 에피토프는 관심의 생성물(32)에 특이하게 결합한다. 두 번째 결합제(34)는 항-IgG 항체(34)이다. 두 번째 결합제(34)는 관심의 생성물(32)의 Fc 영역에 특이하게 결합한다. 이 구체예에서, 표지(36)는 두 번째 결합제(34)와는 별개이고 그것의 통합 부분이 아니다. 표지(36)는 형광 분자(40)에 공유 연결된 항-IgG 항체(38)를 포함한다. 표지(36)의 항-IgG 항체(38)는 두 번째 결합제(34)의 Fc 영역에 특이하게 결합한다.
도 4에 도시된 세 번째 구체예에서, 평가면(14)는 항체(42)인 첫 번째 결합제(42)로 코팅된다. 표현의 단순성을 위해, 첫 번째 결합제(42)의 단지 한 분자만이 도시되지만, 첫 번째 결합제(42)의 많은 분자들이 평가면(14)에 결합되고 그것을 덮을 것임이 인지될 것이다. 이 구체예에서 관심의 생성물(44)은 단백질(44)이다(그러나 항체는 아니다). 첫 번째 결합제(42)는 관심의 생성물(44)에 특이하게 결합한다. 두 번째 결합제(46)는 형광 분자(50)에 공유 연결된 항체(48)를 포함한다. 두 번째 결합제(46)의 항체(48)는 또한 관심의 생성물(44)에 특이하게 결합한다. 첫 번째 결합제(42) 및 두 번째 결합제(46)는 관심의 생성물(44) 상의 거리를 두고 위치한 상이한 에피토프들에 결합한다.
도 2 내지 4에 의해 증명된 것과 같이, 복합체의 정확한 성질은 변할 수 있다. 작동 원리는 첫 번째 결합제(20, 30, 42)가 관심의 생성물(22, 32, 44)(존재하는 경우)을 평가면(14)에 위치시킨다는 것이다. 평가면(14)에서의 관심의 생성물(22, 32, 44)의 존재는 평가면에서의 두 번째 결합제(24, 34, 46)와 표지(28, 36, 50)의 결합을 유발한다.이런 방식으로 평가면(14)에서의 표지(28, 36, 50)의 존재는 관심의 생성물의 생성을 나타낸ㄷ.
방법의 첫 번째 구체적인 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 방법이 세포의 이종성 혼합물로부터 출발하여 충분한 성장 속도를 가지고, 상대적으로 많은 양의 원하는 단일특이적 IgG 항체를 분비하는 단클론성 세포 콜로니를 생성하고 이어서 선택하는 방법을 증명한다.
단일특이적 IgG 항체는 약학적 제품의 제조에 사용될 수 있다.
본 실시예에서 사용된 세포는 원하는 단일특이적 IgG 항체를 생성하도록 형질전환된 차이니즈 햄스터 난소 DG44(CHO-DG44) 세포이다. 원하는 단일특이적 항체는, 이 실시예에서 인간 항체이다. 보다 구체적으로, 세포는 두 개의 벡터로 형질전환되었는데, 하나는 원하는 IgG 항체의 경쇄를 코딩하고, 다른 하나는 원하는 IgG 항체의 중쇄를 코딩한다. 벡터들 중 하나(또는 가능한 둘 다)는 또한 효소 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩한다.
형질전환 과정은 세포의 이종성 혼합물을 초래한다. 단지 소수의 세포만이 충분한 성장 속도와 원하는 IgG 항체의 상대적으로 높은 분비의 원하는 특성을 가진다. 본 실시예에 사용된 것은 바로 이 세포의 이종성 혼합물이다.
먼저, 96 웰 플레이트를 방법에 사용하기 위해 제조한다. 이것은 플레이트의 웰에 첫 번째 결합제로서 작용하기 위한 재조합 항-인간 IgG 항체의 코팅이 제공될 것을 필요로 한다. 항-인간 IgG 항체의 코팅 용액(15㎍/ml)은 여과된 1× 코팅 완충액에서 제조한다. 코팅 완충액은 ImmunoChemistry Technologies LLC(Bloomington, MN, USA)로부터 카탈로그 번호 6245로 상업적으로 이용할 수 있는 완충액이다. 이 실시예에서, 96 웰 플레이트의 웰은 오목한 바닥 표면을 가지는 U-자형 웰이다. 100㎕ 분액의 코팅 용액을 플레이트의 각 웰에 넣는다. 이것은 오목한 바닥 표면과 또한 원주형 측면의 작은 하부 영역을 덮기에 충분하다. 코팅 용액을 웰에 2시간 동안 실온에서 놓아둔다. 그런 다음 웰을 PBS로 3회 세척한다.
동물 기원의 재료에 의한 가능한 오염을 피하기 위하여, 예를 들면 한 동물 종에서 발생된 다클론성 항-인간 IgG 항체보다는 재조합 항-인간 IgG 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
96 웰 플레이트를 제조한 후에, 세포의 이종성 혼합물의 현탁액을 성장 배지에서 제조한다. 이 실시예에서 사용된 성장 배지는 Life Technologies로부터 이용가능한 화학적으로 정의된 배지인 Gibco CD OptiCHOTM이다. 세포 혼합물을 0.5 내지 1.5 세포/ml의 희석률로 성장 배지에 현탁한다.
형질전환에 대해 사용된 CHO-DG44 셀라인은 DHFR을 내생적으로 발현하지 않는다. 그 결과로서, 세포는 CD OptiCHOTM 배지에서 그것들이 DHFR 코딩 벡터(또한 IgG 사슬 중 하나를 코딩함)로부터 DHFR을 발현하지 않는 한 성장하거나 복제되지 않을 것이다. 이것은 첫 번째 선택 라인으로서 작용한다. 두 번째 선택 방법으로서, 메쏘트렉세이트가 사용될 수 있다. 메쏘트렉세이트는 DHFR의 억제제이고, 그것이 DHFR을 증폭시키려 하고 또한 동일한 벡터 상에 포함된 IgG 유전자를 증폭시키려 하기 때문에 성장 배지에 포함된다.
또한, 형광 표지에 연결된 재조합 항-인간 IgG 항체로 이루어진 포합체가 두 번째 결합제로서 세포 현탁액에 첨가된다. 두 번째 결합제의 항-인간 IgG 항체는 첫 번째 결합제에 대해 사용된 것과 같은 항체이지만, 이 경우에는 플루오레신과 같은 적당한 형광 표지에 연결된다. 적당한 포합체는 Molecular Devices, LLC(Sunnyvale, CA, USA)로부터 이용할 수 있는 재조합 CloneDetectTM 인간 IgG(Fc) 특이적 포합체이다. 포합체를 세포 현탁액에 1㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고 그 현탁액을 부드럽게 섞어준다.
동일한 재조합 항-인간 IgG 항체가 첫 번째 결합제 및 또한 두 번째 결합제의 특이한 결합 부분에 대해 모두 사용되기 때문에, 첫 번째와 두 번째 결합제 사이에 직접적인 결합은 없다.
그런 다음 세포를 96 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액의 200㎕의 분액을 두 번째 결합제와 함께 피펫팅함으로써 각 웰에 플레이팅한다. 만약 세포 농도가 1.0세포/ml이라면, 이것은 웰당 평균 0.2 세포가 될 것이다. 그러므로 많은 웰은 세포를 전혀 갖지 않을 것이다. 상당수가 하나의 세포만을 가질 것이고 단지 소수의 웰(있다면)만이 두 개의 세포 또는 그 이상을 가질 것이다.
플레이팅 후에 96 웰 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션한다.
약 한 시간 후에, 세포는 웰의 바닥에 정착할 것이고, 그 때 각 웰을 Molecular Devices, LLC(Sunnyvale, CA, USA)로부터 이용할 수 있는 ImageXpres® Micro 고속 영상화 현미경을 사용하여 영상화한다. 각 웰에 대해 현미경은 투과된 백색광을 사용하여 첫 번째 영상 및 두 번째 형광 영상을 포착한다. 형광 영상에 대해, 470nm의 자극광을 사용하고 535nm의 방출광을 검출한다. 영상들을 분석을 위해 보관한다.
96 웰 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 8일 동안 인큐베이션하고, 각 웰을 상기 초기 1시간 시점에 대해서 설명한 것과 같이, 1, 2, 4 및 8일에 영상화한다.
8일간의 인큐베이션 중에 세포 복제에 의해, 하나 또는 더 많은 생존 세포들로 플레이팅된 웰에서 세포 콜로니가 형성된다. 단지 하나의 단일 생존성 세포만이 플레이팅된 어떠한 웰에서든지, 그 웰에서 형성되는 어떠한 콜로니는 단클론성 세포 콜로니이다.
일부 콜로니는 원하는 단일특이적 IgG 항체를 분비한다. 분비된 단일특이적 항체는 두 번째 결합제(즉 항-인간 IgG 항체-플루오레신 포합체) 및 고정된 첫 번째 결합제에 모두 결합한다. 그러므로 원하는 단일특이적 IgG 항체가 분비되는 각 웰에서, 첫 번째 결합제, 분비된 IgG 항체 및 두 번째 결합제를 포함하는 복합체가 첫 번째 결합제로 코팅된 웰의 표면 영역에서 형성된다.
형광 영상들의 목적은 형광 표지(및 따라서 복합체)를 검출하고 정량하는 것이다. 형광의 세기는 상기에서 설명된 것과 같이 복합체에 결합된 형광 표지의 양을 나타낸다. 형광 영상은 세포의 고도로 생산성인 클러스터에 대한 백색광 영상과 함께 도 5에 도시된다.
ImageXpres® Micro 현미경의 광학은 바람직하게는 각 웰에 대한 형광 영상이 웰의 적어도 바닥의 오목한 표면을 덮도록 설정된다. 영상들은 또한 첫 번째 결합제로 코팅된 원주형 측면 영역을 덮을 수 있지만, 이것이 반드시 필요하지는 않다. 형광 영상들을 덮는 크기는 평가면의 크기를 결정한다.
인큐베이션이 끝나갈 때에, 원하는 IgG 항체를 상당한 양으로 분비할 수 있는 세포 콜로니가 발생된 어떠한 웰이든지 평가면에서 형광에 대해 형광 영상들을 분석함으로써 검출될 수 있다. 이 분석은 또한 웰을 분비된 원하는 IgG 항체의 양과 관련하여 등급화하는 것을 허용한다.
그런 다음 상대적으로 높은 수준의 분비된 IgG 항체를 나타내는 가장 높은 수준의 형광을 가지는 웰을, 그 웰이 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니를 함유하는 지를 알아보기 위해 평가한다. 이것은 의문의 각 웰에 대해 백색광 영상을 분석함으로써 이루어진다. 시간 순서대로, 8일 영상부터 1시간 영상까지 영상들을 거꾸로 봄으로써, 그리고 각 영상의 세포 수를 평가함으로써, 웰이 단일 세포로부터 유도된 단일 콜로니(즉 단클론성 세포 콜로니)를 가지고 있는지 여부를 측정하는 것이 가능하다. 도 6은 단일 세포로부터(플레이팅 후 1시간 후에 취한 왼손 영상 참조) 세포 콜로니의 발달(인큐베이션이 끝날 때 취한 오른손 영상 참조)을 보여주는 단일 웰의 백색광 영상을 차례로 보여준다.
마지막으로 하나 또는 더 많은 웰을 선택한다. 각각의 선택된 웰은 단일 단클론성 세포 콜로니로부터 원하는 IgG 항체의 상대적으로 높은 분비를 가지는 것을 토대로 선택한다. 바람직하게는 각각의 선택된 웰은 그 안에 플레이팅된 단지 하나의 세포만을 가졌다(하나의 생존성 세포 더하기 하나 또는 더 많은 비생존성 세포보다는). 세포 성장 속도 또한 인큐베이션의 상이한 시점에서 취한 영상의 세포 수를 평가함으로써 평가할 수 있고, 선택은 세포 성장의 만족할만한 속도를 나타내는 웰을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
8일간의 인큐베이션 후에, 선택된 단클론성 콜로니는 더 큰 웰로 재플레이팅될 수 있다. 원하는 IgG 항체의 생성 및 성장 속도는 상기에서 클론 안정성을 확인하기 위해 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 모니터될 수 있다.
단백질 G가 재조합 항-인간 IgG 항체 대신 사용될 수 있었다. 이 경우에, 단백질 G는 첫 번째 결합제로서 평가면상에 코팅될 수 있을 것이다. 두 번째 결합제에 대해서는, 단백질 G가 형광 표지와 포합될 수 있을 것이다.
방법의 두 번째 구체적인 실시예
다음의 실시예는 본 방법이 세포의 이종성 혼합물로부터 출발하여 충분한 성장 속도를 가지고, 관심의 단백질에 대한 특이성을 가지는 단일특이적 IgG 항체를 분비하는 단클론성 세포 콜로니를 생성하고 이어서 선택하는 방법을 증명한다.
본 실시예에 사용된 세포는 골수종 세포와 마우스 비장 세포의 융합에 의해 생성된 하이브리도마 세포이다. 융합 과정은 세포의 이종성 혼합물을 제공하는데, 그것의 상대적으로 적은 비율만이 관심의 단백질에 대해 원하는 특이성을 가지는 항체를 생성한다.
먼저, 방법에 사용하기 위해 96 웰 플레이트를 제조한다. 이것은 플레이트의 웰에 원하는 항체가 결합하는 단백질(항원)의 코팅이 제공될 것을 필요로 한다. 단백질의 코팅 용액(15㎍/ml)은 여과된 1× 코팅 완충액에서 제조한다. 코팅 완충액은 ImmunoChemistry Technologies LLC(Bloomington, MN, USA)로부터 카탈로그 번호 6245로 상업적으로 이용할 수 있는 완충액이다. 이 실시예에서, 96 웰 플레이트의 웰은 오목한 바닥 표면을 가지는 U-자형 웰이다. 100㎕ 분액의 코팅 용액을 플레이트의 각 웰에 넣는다. 이것은 오목한 바닥 표면과 또한 원주형 측면의 작은 하부 영역을 덮기에 충분하다. 코팅 용액을 웰에 2시간 동안 실온에서 놓아둔다. 그런 다음 웰을 PBS로 3회 세척한다.
96 웰 플레이트를 제조한 후에, 세포의 이종성 혼합물의 현탁액을 성장 배지 중에서 제조한다. 이 실시예에서 사용한 성장 배지는 20% 우태아 혈청이 첨가된 IMDM이다. 세포 혼합물을 성장 배지에 0.5 내지 1.5 세포/ml의 희석률로 현탁한다.
또한, 형광 표지에 연결된 항-IgG 항체로 이루어진 포합체를 세포 현탁액에 두 번째 결합제로서 첨가한다. 포합체의 항체는 마우스 IgG에 특이적이다. 적당한 포합체는 Molecular DevicesLLC(Sunnyvale, CA, USA)로부터 이용할 수 있는 CloneDetect 마우스 IgG 특이적이다. 포합체를 세포 현탁액에 1㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고 현탁액을 부드럽게 섞어준다.
그런 다음 세포를 96 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액의 200㎕의 분액을 두 번째 결합제와 함께 피펫팅함으로써 각 웰에 플레이팅한다. 만약 세포 농도가 1.0세포/ml이라면, 이것은 웰당 평균 0.2 세포가 될 것이다. 그러므로 많은 웰은 세포를 전혀 갖지 않을 것이다. 상당수가 하나의 세포만을 가질 것이고 단지 소수의 웰(있다면)만이 두 개의 세포 또는 그 이상을 가질 것이다.
플레이팅 후에 96 웰 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션한다.
약 한 시간 후에, 세포는 웰의 바닥에 정착할 것이고, 그때 각 웰을 Molecular Devices, LLC(Sunnyvale, CA, USA)로부터 이용할 수 있는 ImageXpres® Micro 고속 영상화 현미경을 사용하여 영상화한다. 각 웰에 대해 현미경은 투과된 백색광을 사용하여 첫 번째 영상 및 두 번째 형광 영상을 포착한다. 형광 영상에 대해, 470nm의 자극광을 사용하고 535nm의 방출광을 검출한다. 영상들을 분석을 위해 보관한다.
96 웰 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 8일 동안 인큐베이션하고, 각 웰을 상기 초기 1시간 시점에 대해서 설명한 것과 같이, 1, 2, 4 및 8일에 영상화한다.
8일간의 인큐베이션 중에 세포 복제에 의해, 하나 또는 더 많은 생존 세포들로 플레이팅된 웰에서 세포 콜로니가 형성된다. 단지 하나의 단일 생존성 세포만이 플레이팅된 어떠한 웰에서든지, 그 웰에서 형성되는 모든 콜로니는 단클론성 세포 콜로니이다.
일부 콜로니는 원하는 단일특이적 IgG 항체를 분비한다. 분비된 항체는 두 번째 결합제의 항-IgG 항체 부분 및 고정된 단백질 항원에 모두 결합한다. 그러므로 원하는 IgG 항체가 분비되는 각 웰에서, 단백질 항원, 분비된 IgG 항체 및 두 번째 결합제를 포함하는 복합체가 웰의 코팅된 표면 영역에서 형성된다.
첫 번째 실시예에 대해서와 같이, 형광 영상들의 목적은 형광 표지(및 따라서 복합체)를 검출하고 정량하는 것이다. ImageXpres® Micro 현미경의 광학은 바람직하게는 각 웰에 대한 형광 영상이 웰의 바닥의 오목한 표면을 덮도록 설정된다. 형광 영상들을 덮는 크기는 평가면의 크기를 결정한다.
인큐베이션이 끝나갈 때에, 원하는 특이성을 가지는 항체를 분비하는 세포 콜로니가 발생된 어떠한 웰이든지 평가면에서 형광에 대해 형광 영상들을 분석함으로써 검출될 수 있다. 이 분석은 또한 웰을 분비된 원하는 IgG 항체의 양과 관련하여 등급화하는 것을 허용한다.
그런 다음 원하는 특이성을 가지는 IgG 항체의 존재를 나타내는, 형광 신호를 가지는 그런 웰들을, 그 웰이 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니를 함유하는지를 알아보기 위해 평가한다. 이것은 의문의 각 웰에 대해 백색광 영상을 분석함으로써 이루어진다.
마지막으로 하나 또는 더 많은 웰을 선택한다. 각각의 선택된 웰은 단일 단클론성 세포 콜로니로부터 항원-특이적 IgG 항체를 분비하는 것을 토대로 선택한다. 바람직하게는 각각의 선택된 웰은 그 안에 플레이팅된 단지 하나의 세포만을 가졌다(하나의 생존성 세포 더하기 하나 또는 더 많은 비생존성 세포보다는). 세포 성장 속도 또한 인큐베이션의 상이한 시점에서 취한 영상의 세포 수를 평가함으로써 평가할 수 있고, 선택은 세포 성장의 만족할만한 속도를 나타내는 웰을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
방법을 수행하기에 적당한 장치
도 7은 본 발명을 수행하기에 적당한 장치를 도시한다.
장치는 다중-웰 플레이트(64)를 유지하는 것으로 보이는 플레이트 홀더(60)를 포함한다. 플레이트 홀더(60)는 X 및 Y 방향으로, 즉 말하자면 수평면에서 직각 방향으로 플레이트 홀더(60)를 움직이는 XY 스테이지(62) 상에 장착된다. 이 방식으로 다중-웰 플레이트(64)의 어떠한 웰이든지 장치에 의해 선택될 수 있고 영상화될 수 있다.
장치는 또한 백색광 영상화를 위한 첫 번째 백색광원(66), 형광 영상화를 위한 두 번째 광원(68) 및 카메라(70)를 포함한다. 카메라(70)는 백색광 및 형광 영상화 중에 모두 빛을 검출하고 영상을 생성한다.
카메라는 영상을 컴퓨터(72)로 옮겨서 영상들을 저장하고 분석한다. 컴퓨터(72)는 또한 장치의 작동을 제어한다.
백색광 영상화 중에, 빛은 첫 번째 광원(66)에 의해 방출되고, 첫 번째 거울(74)에 의해 반사된 후 다중-웰 플레이트(64)의 선택된 웰을 통과한다. 빛은 두 번째 거울(78) 위로 10× 렌즈 어레이에 의해 초점화되고 카메라(70) 위로 빛을 반사시켜서 바닥 표면상에 존재하는 어떠한 세포든지 포함하여 선택된 웰의 바닥 표면의 영상을 생성한다.
형광 영상화 동안, 빛은 두 번째 광원(68)(방출된 빛이 적절한 자극 파장을 갖도록 필터를 포함한다)에 의해 광학 블록(80)으로 방출된다. 광학 블록(80)은 빛을 다중-웰 플레이트(64)의 선택된 웰의 바닥 표면 위에 초점화시키는 렌즈 어레이(76)를 통과하도록 한다. 자극광은 선택된 웰의 바닥 표면에 위치한 어떠한 형광 표지든지 자극한다. 형광 표지에 의해 방출된 형광 빛은 렌즈 어레이(76)를 통해 되돌아가서 광학 블록(80)을 통해 두 번째 거울(78)로 통과하여 카메라(70)로 빛을 반사하여 거기에서 영상이 생성된다. 방출된 형광 빛은 또한 도시하지 않은 필터에 의해 적당히 여과된다.
형광 영상화 동안에 렌즈 어레이(76)는 자극 및 방출광을 둘 다 초점화시켜서 장치가 선택된 웰의 바닥 표면에 위치한 형광 표지로부터 실질적으로 단지 빛만을 검출하게 된다. 비록 미결합 표지가 웰의 성장 배지 중에 존재하겠지만, 장치는 미결합 표지에 대해서는 매우 둔감하다.

Claims (15)

  1. 다수의 세포 배양 공간을 제공하는 단계, 이때 각각의 세포 배양 공간은 각각의 평가면을 가지고;
    상기 평가면에 그 평가면상에서 고정되는 첫 번째 결합제를 제공하는 단계;
    적어도 일부의 세포 배양 공간이 단일 생존성 세포로 플레이팅되도록 다수의 세포 배양 공간에 세포 현탁액을 플레이팅하는 단계;
    세포를 세포 배양 공간의 성장 배지에서 인큐베이션하여 세포 복제를 유발하는 단계, 이때 적어도 일부의 세포는 관심의 생성물을 분비하며;
    세포 배양 공간에 두 번째 결합제를 제공하는 단계, 이때 두 번째 결합제는 고정되지 않고;
    첫 번째 및 두 번째 결합제는 각각 관심의 생성물에 결합하여 세포 배양 공간의 어느 것에서 세포에 의한 관심의 생성물의 분비가 상기 하나의 세포 배양 공간의 해당하는 평가면에서 첫 번째 결합제, 관심의 생성물 및 두 번째 결합제를 포함하는 복합체의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하며;
    세포 배양 공간의 적어도 일부의 각각을 세포 배양 공간의 평가면에서 두 번째 결합제의 존재에 대해 평가하는 단계;
    세포 배양 공간의 적어도 일부의 각각에 대해 세포 배양 공간이 단일 세포로부터 유도되는 단일 세포 콜로니를 함유하는지의 여부를 측정하는 단계; 및
    상기 평가 및 상기 측정을 사용하여 관심의 생성물을 분비하는 단일 단클론성 세포 콜로니를 함유하는 세포 배양 공간을 선택하는 단계
    를 포함하는, 관심의 생성물을 분비하는 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 평가되는 적어도 일부의 세포 배양 공간의 각각에 대해, 상기 두 번째 결합제의 존재에 대한 평가는 광학 초점 장치 및 광검출 장치를 사용하고, 광학 초점 장치는 세포 배양 공간의 평가면으로부터 광검출 장치에 의한 빛의 검출을 위한 광검출 장치 위로 빛을 초점화시키며, 초점화된 빛은 상기 세포 배양 공간의 표면에 존재하는 두 번째 결합제의 양을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 평가면으로부터 떨어져 있는 세포 배양 공간의 위치로부터의 빛은 광검출 장치에서 광학 초점 장치에 의해 초점화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 광 방출 표지는 두 번째 결합제와 관련되고, 상기 광 방출 표지는 광학 초점 장치에 의해 초점화된 상기 빛을 방출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 광 방출 표지는 두 번째 결합제와 관련되고, 상기 두 번째 결합제의 존재에 대해 평가면을 평가하는 것은 평가면에서 결합된 표지에 의해 방출된 빛을 측정하는 것을 포함하며, 그 표지의 일부는 평가면에서 결합되지 않고 평가면으로부터 떨어진 세포 배양 공간에 위치하며, 평가는 그 표지의 일부에 의해 방출된 빛에 대해 덜 민감하거나 완전히 둔감한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 광 방출 표지는 형광 빛을 방출하고 그 방법은 자극광으로 광 방출 표지를 자극하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 수행되는 상기 적어도 일부의 세포 배양 공간의 각각에 대하여, 상기 측정은 세포 배양 공간이 하나의 세포 및 하나의 세포 단독으로 플레이팅 되었는지의 여부를 측정하는 것을 포함하고, 이때 상기 선택된 세포 배양 공간은 하나의 세포 및 하나의 세포 단독으로 플레이팅된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 수행되는 상기 적어도 일부의 세포 배양 공간의 각각에 대하여, 상기 측정은 상기 인큐베이션 동안 다수의 시점에서 세포 배양 공간의 세포의 현미경에 의한 가시화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 공간은 각각 다중-웰 배양 플레이트, 바람직하게는 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트의 웰인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 두 번째 결합제의 존재에 대하여 상기 표면의 평가를 토대로 세포 배양 공간의 하위세트를 포함하고, 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 방법이 각각의 세포 배양 공간에 대하여, 시간에 따른 각각의 일련의 영상을 얻고 그 일련의 영상들을 저장하는 것을 포함하며, 이때 상기 세포 배양 공간이 단일 세포로부터 유도된 단일 세포 콜로니를 함유하는 지의 측정은 그 하위세트의 각각의 세포 배양 공간으로부터의 일련의 영상을 분석하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 적어도 일부의 세포 배양 공간의 각각에 대해, 세포 배양 공간의 세포 성장 속도의 표식을 얻는 것을 포함하고, 그 표식은 상기 세포 배양 공간의 상기 선택에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하기 위한 자동 장치로서, 그 장치는
    광학 초점 장치;
    광검출 장치;
    다중-웰 플레이트를 유지하기 위한 홀더;
    홀더와 광학 초점 장치 및 광검출 장치 사이의 상대적인 이동을 위한 번역 메커니즘;
    제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위해 배치된 조절기를 포함하는 자동 장치.
  14. 제 13항에 있어서, 다중-웰 플레이트가 홀더에 위치할 때, 광학 초점 장치는 광검출 장치에서 다중-웰 플레이트의 웰의 바닥 표면으로부터의 빛을 초점화시킬 수 있는 한편, 광검출 장치에서 웰의 다른 위치로부터의 빛은 초점화시키지 못하는 것을 특징으로 하는 자동 장치.
  15. 제 14항에 있어서, 광검출 장치는 형광 방출광을 검출하고, 장치는 형광 자극광을 생성하기 위한 광원 및 홀더에 위치한 다중-웰 플레이트의 웰에 자극광을 전파하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 자동 장치.
KR1020157008860A 2012-09-14 2013-09-13 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법 KR102072458B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12184418.7A EP2708890B1 (en) 2012-09-14 2012-09-14 Method of selecting a monoclonal cell colony
EP12184418.7 2012-09-14
PCT/US2013/059758 WO2014043532A1 (en) 2012-09-14 2013-09-13 Method of selecting a monoclonal cell colony

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150053793A true KR20150053793A (ko) 2015-05-18
KR102072458B1 KR102072458B1 (ko) 2020-02-03

Family

ID=46851858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157008860A KR102072458B1 (ko) 2012-09-14 2013-09-13 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9581602B2 (ko)
EP (1) EP2708890B1 (ko)
JP (2) JP6266623B2 (ko)
KR (1) KR102072458B1 (ko)
CN (1) CN104838012B (ko)
WO (1) WO2014043532A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014220306B3 (de) * 2014-10-07 2015-09-03 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum
TWI588259B (zh) * 2015-03-06 2017-06-21 Methods for screening antigen-specific fusion tumor cells
JP7099951B2 (ja) * 2015-07-24 2022-07-12 セファイド 組織試料からのｄｎａ及びｒｎａ抽出のための組成物及び方法
CN111788297A (zh) * 2017-06-02 2020-10-16 分子装置有限公司 细胞菌落挑取系统
EP3810749A4 (en) * 2018-06-19 2022-04-20 Stemcell Technologies Canada Inc. SYSTEMS, METHODS AND DEVICE FOR AUTOMATED CULTIVATION OF CELLS
JP2022509201A (ja) * 2018-11-30 2022-01-20 アムジエン・インコーポレーテツド クローン選択を容易にするためのシステム及び方法
US20220356435A1 (en) 2019-09-26 2022-11-10 Kyocera Corporation Cell detector and cell detection method
CN113376079A (zh) * 2021-05-31 2021-09-10 上海碧博生物医药科技有限公司 利用CountStar Rigel系统结合细胞染色来分析转染效率的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005045396A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Trellis Biosciences, Inc. Use of particulate labels in bionalyte detection methods
JP2009034047A (ja) * 2007-08-02 2009-02-19 Toyama Prefecture 細胞のスクリーニング方法
US7598093B2 (en) * 2003-07-23 2009-10-06 Ctl Analyzers, Llc Nanoparticle and microparticle based detection of cellular products
EP2166511A1 (en) * 2008-09-18 2010-03-24 Genetix Limited Colony detection
EP2437057A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-04 Genetix Limited Method

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0195088B1 (en) 1984-09-18 1992-12-09 Sumitomo Electric Industries Limited Apparatus for sorting cells
US6806058B2 (en) * 2001-05-26 2004-10-19 One Cell Systems, Inc. Secretions of proteins by encapsulated cells
AU2002332595A1 (en) 2001-08-22 2003-03-10 Steven Kessler Methods for screening antibody-producing cells on heterogenous antigen substrates
JP2005055411A (ja) 2003-08-07 2005-03-03 Bios Ikagaku Kenkyusho:Kk モノクローナル抗体の自動スクリーニング方法および自動スクリーニング装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7598093B2 (en) * 2003-07-23 2009-10-06 Ctl Analyzers, Llc Nanoparticle and microparticle based detection of cellular products
WO2005045396A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Trellis Biosciences, Inc. Use of particulate labels in bionalyte detection methods
JP2009034047A (ja) * 2007-08-02 2009-02-19 Toyama Prefecture 細胞のスクリーニング方法
EP2166511A1 (en) * 2008-09-18 2010-03-24 Genetix Limited Colony detection
EP2437057A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-04 Genetix Limited Method

Also Published As

Publication number Publication date
US9581602B2 (en) 2017-02-28
JP2017184762A (ja) 2017-10-12
WO2014043532A1 (en) 2014-03-20
JP6266623B2 (ja) 2018-01-24
JP2015528311A (ja) 2015-09-28
CN104838012A (zh) 2015-08-12
US20150268249A1 (en) 2015-09-24
KR102072458B1 (ko) 2020-02-03
EP2708890B1 (en) 2015-11-18
CN104838012B (zh) 2017-03-29
EP2708890A1 (en) 2014-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102072458B1 (ko) 단클론성 세포 콜로니의 선택 방법
JP6971219B2 (ja) 横断組織切片のユーザー定義領域における複数のタンパク質の同時定量
JP6971218B2 (ja) 横断組織切片のユーザー定義領域における遺伝子発現の同時定量
Macháň et al. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems
Helma et al. Direct and dynamic detection of HIV-1 in living cells
Truong Quang et al. Membrane microdomains: from seeing to understanding
US20080038755A1 (en) Cellspot applications
JP4748719B2 (ja) 生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法
Tas et al. Small peptide–protein interaction pair for genetically encoded, fixation compatible peptide-PAINT
Presley Imaging the secretory pathway: the past and future impact of live cell optical techniques
Šuštar et al. Visualization and quantitative analysis of the actin cytoskeleton upon B cell activation
Kläsener et al. Study B cell antigen receptor nano-scale organization by in situ Fab proximity ligation assay
Nethercott et al. Immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells
JP2018526625A (ja) 血液細胞の細胞表面受容体の評価方法
Schrum Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry
Barr et al. Super-resolution analysis of TCR-dependent signaling: Single-molecule localization microscopy
Mehta et al. Reusable glycan microarrays using a microwave assisted wet-erase (MAWE) process
Miyoshi et al. Fast-dissociating but highly specific antibodies are novel tools in biology, especially useful for multiplex super-resolution microscopy
Murray et al. Assay of Rab4‐dependent trafficking on microtubules
Listek et al. Comment on “Monoclonal Antibody Discovery Based on Precise Selection of Single Transgenic Hybridomas with an On-Cell-Surface and Antigen-Specific Anchor”
Marsh et al. A simple approach for bioactive surface calibration using evanescent waves
Evans Methods of Measuring Internalization of G Protein–Coupled Receptors
Ghafari et al. Macromolecular binding and kinetic analysis with optically sectioned planar format assays
WO2023218071A1 (en) Methods and substrates for immobilizing leukocytes for single-molecule fluorescence imaging
JP2022527030A (ja) マイクロキャピラリーアレイを使用したスクリーニングのための方法およびシステム

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant