CN104833643A - 一种基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，可有效解决火麻仁质量控制评价的问题，方法由以下步骤实现：制备火麻仁供试药物、制备梯度药物培养基、细菌培养、菌液最大吸收波长筛查、梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较、效价测定与计算，所述的火麻仁油剂量的线性量效范围为0.0075g?mL^-1～0.0625g?mL^-1，果聚糖剂量的线性量效范围为0.0030g?mL^-1～0.0120g?mL^-1，相关系数R＞98%，本发明从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的技术途径，易操作，实用性强，应用面广，是中药质量控制和评价上的创新。

Description

一种基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制评价，特别是一种基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法。

背景技术

当前中药的质量控制方法是主要测定其所含的一种或两种化学成分，所测定的化学成分称为指标性成分，通过对指标性成分的定性或定量测定以反应该中药合格与否或评价质量优劣。由于目前绝大多数中药药效物质不明确，所测定指标性成分并不能直接关联其药效，所以对于这类中药来说这种模式难以关联或反映其临床使用的安全性和有效性。《中国药典》2010年版编制大纲明确指出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化。由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》(一部)2010年版附录收载。

对于成分复杂的中药，《中国药典》提倡建立与其功效相关的生物活性测定方法，将生物活性测定法(又称生物检定bioassay)引入中药质量控制和评价体系，对于成分多样、结构复杂、理化方法不能表征其含量、理化测定不能反映生物活性和疗效的中药能凸显其优越性。

当前，一种新的研究日益受到重视：很多疾病的发生发展与肠道菌群结构失调有密切关系，许多中药就是通过改善肠道菌群结构来发挥疗效的。如近日研究发现,中药黄连治疗糖尿病机制是黄连中的小檗碱在穿过肠道时,可能会改善肠道菌群的结构,消灭“有害菌”催生“有益菌”,减少内毒素入血,减轻慢性炎症,从而达到治疗或者预防糖尿病等代谢疾病的目的。

传统中药火麻仁(Semen Cannabis)为桑科植物大麻(Cannabis stativa L.)的干燥成熟种子,具有润肠通便，滋养补虚的功效，常用治疗老年虚性便秘和习惯性便秘。据报道，世界五大长寿地区之一，我国广西巴马瑶族自治县百岁以上老人，其长寿原因除环境因素之外，均有独特的常年食用火麻仁油的生活习惯，他们的心血管疾病及老年性便秘的发病率极小。同时，有研究表明这些长寿老人肠道内的益生菌群比例比其他地区的要高。上述研究结果提示火麻仁可能是通过调整肠道菌群而有益于人体健康。虽然火麻仁为常用中药，但是当前尚缺乏相应的生物活性测定方法用于火麻仁质量控制评价。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，可有效解决火麻仁质量控制评价的问题。

本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现：

(1)制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，115-125℃炒制13-17分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

(2)制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基16-20g，加入蒸馏水950-1050mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基中加入同体积培养基溶液(如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基再加入1mL的培养基溶液)，如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，120-125℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

(3)细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤(2)制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，35-39℃厌氧培养26-30小时；

所述的乳酸菌为保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的一种；

(4)菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

(5)梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X＝实验组OD-背景OD；Y＝对照组OD-背景OD

E＝X-Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T＝[(X-Y)/Y]×100％

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

(6)效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤(1)-(5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55％，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价；

所述的火麻仁油剂量的线性量效范围为0.0075g·mL^-1～0.0625g·mL^-1，果聚糖剂量的线性量效范围为0.0030g·mL^-1～0.0120g·mL^-1，相关系数R＞98％。

本发明首次建立以药效为基础的火麻仁质量生物测定技术，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的技术途径，易操作，实用性强，应用面广，是中药质量控制和评价上的创新。

附图说明

图1为本发明的火麻仁体外促进乳酸杆菌的研究与测定的工艺路线图。

图2为本发明的菌液最大吸收波长筛查的结果示意图。

图3为本发明的不同培养液中细菌相对数量的测定与比较实验的具体加样设计图。

图4为本发明的不同培养液中细菌相对数量的测定与比较实验的结果示意图。

图5为本发明的供试品与工作对照品的量效关系曲线图。

图6为本发明的16个批次的火麻仁样品的促菌活性检测结果的SPSS19.0聚类分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，由以下步骤实现：

(1)制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，120℃炒制15分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

(2)制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基18g，加入蒸馏水1000mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基中加入同体积培养基溶液(如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基再加入1mL的培养基溶液)，如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用；

(3)细菌培养：

分别取保加利亚乳杆菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤(2)制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，37℃厌氧培养28小时；

(4)菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

(5)梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X＝实验组OD-背景OD；Y＝对照组OD-背景OD

E＝X-Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T＝[(X-Y)/Y]×100％

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

(6)效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤(1)-(5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55％，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。

实施例2

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

(1)制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，117℃炒制16分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

(2)制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基17g，加入蒸馏水960mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基中加入同体积培养基溶液(如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基再加入1mL的培养基溶液)，如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，122℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

(3)细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤(2)制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，36℃厌氧培养29小时；

(4)菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

(5)梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X＝实验组OD-背景OD；Y＝对照组OD-背景OD

E＝X-Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T＝[(X-Y)/Y]×100％

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

(6)效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤(1)-(5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55％，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。

实施例3

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

(1)制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，123℃炒制14分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

(2)制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基19g，加入蒸馏水1040mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基中加入同体积培养基溶液(如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5％的液体培养基再加入1mL的培养基溶液)，如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，124℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

(3)细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤(2)制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，38℃厌氧培养27小时；

(4)菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

(5)梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X＝实验组OD-背景OD；Y＝对照组OD-背景OD

E＝X-Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T＝[(X-Y)/Y]×100％

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

(6)效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤(1)-(5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55％，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。

营养肉汤(北京双旋微生物培养基制品厂)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(本单位微生物室提供)、全波段酶标仪(THERMO Multiskan GO，Thermo Fisher Scientific公司)、细菌浊度仪(WGZ-2-XJ，上海昕瑞仪器仪表有限公司)，高压灭菌锅(DSX-280，上海申安医疗器械厂)、恒温培养箱(Innova co-170，New Brunswick Scientific公司)、果寡糖：(Fructooligosaccharides from chicory，Sigma公司)。

火麻仁药材，购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂药店(大栅栏店),亳州药材市场，以及采自国内多省份产地，经河南中医学院陈随清教授鉴定均为桑科植物大麻(Cannabisstativa L.)的干燥成熟种子，系《中国药典》(2010版一部)收载的正品火麻仁药材。

由上述可以看出，本发明火麻仁为对象，发现火麻仁在体内、外能够促进乳酸杆菌生长，并建立了相关实验与检测方法。乳酸菌为公认的益生菌，以火麻仁体外促进乳酸杆菌生长的活性强弱可以反映其对人体健康的补益作用，进而也可以反映其质量。

在制备工艺上采用火麻仁→提取火麻仁油→观察体外对益生菌生长的影响→建立体外促菌活性检测方法→采用《中国药典》规定的“生物检定统计”设计、优化、规范检测实验→采用“中国药典生物检定统计程序BS2000”对检测结果进行统计处理→对多批火麻仁生物活性(促菌活性)进行定量的检测。

1：火麻仁供试药物制备

火麻仁药材净选去皮后120℃炒制15分钟，用压榨法榨油，收率为21.5％，所得油状物呈透明黄绿色，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用。

2：药物培养基制备

称取营养肉汤培养基18g，加入蒸馏水1000mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，在培养基中加入火麻仁油，使配成含火麻仁油浓度为12.5％的液体培养基，并在此基础上，进行倍比稀释，即，取一定体积含12.5％火麻仁油的液体培养基再加入同体积培养基溶液，如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用。

每一浓度分8只培养管，每管2mL,同时以2mL/管无火麻仁油的培养基(火麻仁油浓度为0％，调至ph7.20)做对照组。

3：细菌培养

将保加利亚乳杆菌复活后，调整菌浓度至0.5麦氏浊度，取20uL的纯菌液接种于按实施例2法制备的不同培养管内，37℃厌氧培养28小时。

4：菌液最大吸收波长筛查

采用分光光度法测定菌液中细菌的相对数量，需筛选出合适的测定波长。选选取生长良好的保加利亚乳杆菌培养管，混匀后取菌液200uL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长。图2显示，菌液在570nm处有最大吸收。

5：不同培养液中细菌相对数量的测定与比较

每管混匀后的菌液各取200ul加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200ul加入96孔板(作为背景扣除)，图3具体加样设计说明：

孔A(1-8)所加菌液来源于火麻仁油浓度为12.5％(最高浓度)培养基；

孔A(9-11)加火麻仁油浓度为12.5％的无菌培养基(所得吸光度作为孔A(1-8)的背景扣除)；

孔B(1-8)所加菌液来源于火麻仁油浓度为12.5％倍比稀释后(最高浓度一半)的培养基；

孔B(9-11)加最高浓度一半火麻仁油浓度的无菌培养基(作为孔B(1-8)的背景扣除)；

以此类推，以下各行所加样品来源于火麻仁油再次倍比稀释的培养基：

孔G(1-8)所加菌液来源于最低火麻仁油浓度的培养基；

孔G(9-11)加含最低火麻仁油浓度的无菌培养基；

孔H(1-8)所加菌液来源于火麻仁油浓度为0％(不含火麻仁油)的培养基；

孔H(9-11)加不含火麻仁油的无菌培养基；

孔A—孔G为实验组，孔H为对照组。

加样结束后，将96孔板放入酶标仪，调整合适波长，自动振摇5秒后测吸光度(OD值，即optical density)，由于每个浓度培养管分8只，因此所测每组菌液的OD值取8个测定值的平均数；无菌培养基OD值取3个复孔的平均数。

令:X＝实验组OD-背景OD；Y＝对照组OD-背景OD

E＝X-Y；E﹥0,表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值。

令:T＝[(X-Y)/Y]100％

T的意义：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌。

570nm波长测定各样品吸光度值，结果如表1：

表1：各样品吸光度值

与对照组(H组)相比，**P<0.01；*P<0.05。

结果分析：培养基中加入不同浓度火麻仁油后，相对于不加火麻仁油组，保加利亚乳杆菌浓度表现出不同程度升高。经统计学分析A、B、C、D组相对于H组表现出极其显著性升高(P<0.01)；E组相对于H组表现出显著性升高(P<0.05)；F、G组表现出一定的升高趋势，无统计学意义。此结果说明：采用本实验方法及统计学方法可以发现一定浓度的火麻仁油表现出促进保加利亚乳杆菌生长的作用，其中火麻仁油在营养肉汤培养基中达12.5％含量时促菌率达88.50％(其余：6.25％含量时促菌率为72.93％；3.125％含量时促菌率为59.68％；1.56255％含量时促菌率为50.20％；0.78125％含量时促菌率为43.61％；0.390625％含量时促菌率为23.221％；0.195313％含量时则无明显促菌作用)。不同浓度火麻仁油促菌作用的趋势见图4。

6：基于促菌活性的火麻仁效价测定

具体方法与步骤同本发明实施例1-5所列的样品制备与测定方法，为效价计算的方便，需根据预实验与对待测样品(火麻仁)的效价估计，对样品与工作对照品(果聚糖)的加样量进行必要调整，保证反应强度围绕促菌率(T)在50％上下，并保证供试品与工作对照品反应的量效关系曲线平行，如图5，可以看出在火麻仁油在0.0075g·mL-1～0.0625g·mL-1剂量范围内，果聚糖在0.0030g·mL-1～0.0120g·mL-1剂量范围内，其量效关系均呈现良好的线性(R＞98％)。待测样品与工作对照品在线性范围内反应曲线呈良好的平行关系(符合生物检定统计法基本要求)。可以进行效价的比对与计算。

待测样品与工作对照品的剂量、促菌率、工作对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入“中国药典生物检定统计程序BS2000”进行计算，结果需通过可靠性检验(即直线回归、剂间P<0.01,偏离平行P>0.05,平均可信限率(FL％)在15％以内)。如下是一样品测定结果的可靠性检验示例：

样品名称	火麻仁油
		S大剂量	120
T大剂量	156.25
		T估计效价	2.5U
剂间比	0.5

可靠性测验结果

变异来源	df	差方和	方差	F值	P值
						试品间	1	0.0018	0.0018	35.994	<0.01
回归	1	0.0512	0.0512	1023.8	<0.01
						偏离平行	1	0.0002	0.0002	3.9993	>0.05
剂间	3	0.0532	0.017733	354.61	<0.01
						误差	4	0.00020003	5.0008E-5
总	7

效价及可信限计算结果如下

sm＝0.0096094

测得效价PT＝2.1865U

测得效价的可信限率为FL＝6.1409％

测得效价的可信限范围为2.0541～2.3226U

结果表明，该批样品效价值是2.1865U·mg^-1，可信限率为FL＝6.1409％，结果能够通过可靠性检验。

7：方法学考察

1)精密度

按上述条件,取同一份样品的供试液(0.015g·mL^-1),连续进行5次吸光度测定并计算促菌率,分别为：50.1％、51.2％、53.6％、47.7％、52.4％，结果的变异系数RSD为4.43％，说明精密度好。

2)重复性

同一批样品分5次榨油,制成供试品溶液,按上法分别与工作对照品溶液进行对比检定,计算效价分别为：2.24U·mg^-1、1.95U·mg^-1、2.23U·mg^-1、2.17U·mg^-1、1.93U·mg^-1。5次测定的效价RSD为7.24％,表明该方法具有好的重复性。

3)稳定性考察

分别于0、1、2、3和4h将保存于4℃的同一供试品溶液进行效价检测,结果分别为：2.21U·mg^-1、2.03U·mg^-1、2.12U·mg^-1、2.21U·mg^-1、2.08U·mg^-1。其RSD为3.74％,表明供试品溶液在4℃条件下保存4h是稳定的。

4)方法适用性考察

依据上述方法对16批火麻仁样品进行检测，结果如表2：

表2：样品效价测定结果

采用SPSS19.0软件包中的系统聚类分析程序，以16批火麻仁样品检测结果为变量，根据最远邻距离的大小进行聚类分组，最远邻距离越小者，最先聚为一类，图6为树形图。

可见：当样品间最远邻距离小于5时，第3、4批，6、9、10、16批样品，聚为一类；第11、12、13、14批样品聚为一类，第7、15、1、5、2、8批样品聚为一类。能聚为一类的样品，表明差异较小。其中3、4批为采自黑龙江哈尔滨地区样品，6、9、10批为采自吉林长春地区样品，16批为购自北京同仁堂药店产品，均为当年采摘新品，按常规鉴别方法，品质较好；第11、12、13、14批为仓库放置多年产品，按常规鉴别为不合格品；其余为购自亳州药材市场(统货)样品。

上述不同批次样品显示出不同效价值。如果以体外促菌活性为指标进行效价计算，并用以表征火麻仁质量，可以对不同产地不同批次火麻仁样品进行定量的检测。说明方法的适用性较好、方法可行。

本发明中发现细菌浓度随培养基中火麻仁油浓度增加而变大。本发明在此基础上建立的方法，即采用含有不同浓度火麻仁油的培养基培养保加利亚乳杆菌，采用分光光度法测定菌浓度，可以发现并测定火麻仁油具有促进益生菌生长的作用，并通过量效关系曲线，对不同浓度火麻仁油促菌情况进行评价和比较。本发明的生物活性(体外促菌活性)测定法可以用于中药火麻仁的质量控制。

还要指出的是，细菌培养是在一定条件下使细菌生长繁殖的技术。培养时根据细菌种类选择培养方法、培养基，制定培养条件(温度、pH值、时间，对氧的需求与否等)。培养基常用牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液或者牛奶等和某些细菌所需的特殊物质配制而成，根据培养方式不同，培养基有液体、半固体、固体等形式。一般细菌可在有氧条件下，37℃中放18～24小时生长。培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。

关于细菌的计数，一般采用平板计数法、浊度法以及测细菌的特异性代谢产物的含量来推算细菌数量等。也可以根据细菌在液体培养基中生长，在满足细菌对营养需求的条件下，细菌数量越多，则菌液浓度越大，透光率就越小，吸光度也越大的原理，通过对菌液吸光度值的测定估计细菌的数量。采用分光光度法(测吸光度值)对菌液中的细菌计数的研究业已广见报道。本研究发现试验中所培养的乳酸菌菌液在570nm的波长处有最大的吸收，因此本方法采用全波段酶标仪，调570nm波长测定96孔板中菌液吸光度值，用以表征细菌的相对数量。

样品具有生物活性，在满足一定试验条件情况下，该样品的效价值可以通过与具有同质性(相同生物反应)的对照品对比得出。其中《中国药典》2010版.二部附录ⅪⅤ生物检定统计法中规定的“量反应的平行线测定法(2·2)”法便是得到专业认可的药品效价测定方法。该方法依据平行线测定原理，即待测样品与对照品在一定条件下的生物活性测定中“量—效关系曲线”保持平行，再对二者剂量与效应值进行统计学处理，便可得出被测样品的效价值。本发明研究表明火麻仁油具有体外促进乳酸杆菌生长的活性，且在一定浓度范围内具有明显量效关系。果寡糖(Fructooligosaccharides)是当前公认的具有促进乳酸杆菌生长的物质。本研究中以果寡糖为对照品(或称工作对照品)，为计算需要，在此约定工作对照品的效价值(PS)为10.0U·mg^-1。

本发明的受试对象细菌的选择不局限于保加利亚乳杆菌，对照品的选择不局限于果聚糖，本发明实施例仅是用于说明本发明的具体实施情况，而不是限制本发明的保护范围，凡是在技术上无论采用什么样的等同或等效的替换(替代)，其技术方案本质和所达到的技术目的与本发明本质上相同，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，115-125℃炒制13-17分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

（2）制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基16-20g，加入蒸馏水950-1050mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基中加入同体积培养基溶液（如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基再加入1mL的培养基溶液），如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，120-125℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

（3）细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤（2）制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，35-39℃厌氧培养26-30小时；

所述的乳酸菌为保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的一种；

（4）菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

（5）梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X=实验组OD-背景OD；Y=对照组OD-背景OD

E= X -Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T=[(X-Y)/Y]′100%

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

（6）效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤（1）-（5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55%，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价；

所述的火麻仁油剂量的线性量效范围为0.0075g·mL^-1～0.0625 g·mL^-1，果聚糖剂量的线性量效范围为0.0030g·mL^-1～0.0120 g·mL^-1，相关系数R＞98%。

2.根据权利要求1所述的基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，120℃炒制15分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

（2）制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基18g，加入蒸馏水1000mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基中加入同体积培养基溶液（如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基再加入1mL的培养基溶液），如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用；

（3）细菌培养：

分别取保加利亚乳杆菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤（2）制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，37℃厌氧培养28小时；

（4）菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

（5）梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X=实验组OD-背景OD；Y=对照组OD-背景OD

E= X -Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T=[(X-Y)/Y]′100%

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

（6）效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤（1）-（5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55%，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。

3.根据权利要求1所述的基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，117℃炒制16分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

（2）制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基17g，加入蒸馏水960mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基中加入同体积培养基溶液（如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基再加入1mL的培养基溶液），如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，122℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

（3）细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤（2）制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，36℃厌氧培养29小时；

（4）菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

（5）梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X=实验组OD-背景OD；Y=对照组OD-背景OD

E= X -Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T=[(X-Y)/Y]′100%

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

（6）效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤（1）-（5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55%，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。

4.根据权利要求1所述的基于生物活性检测的火麻仁质量控制评价方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备火麻仁供试药物：

火麻仁净选去皮，123℃炒制14分钟，榨油，得火麻仁油，即为火麻仁供试药物，密封于棕色玻璃瓶内，避光、4℃保存备用；

（2）制备梯度药物培养基：

称取营养肉汤培养基19g，加入蒸馏水1040mL，搅拌加热煮沸溶解成培养基溶液，在培养基溶液中加入火麻仁供试药物，制成火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基，再进行倍比梯度稀释，方法是，在火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基中加入同体积培养基溶液（如1mL的火麻仁油体积浓度为12.5%的液体培养基再加入1mL的培养基溶液），如此多次稀释，共呈7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基，用0.1M的HCL分别调pH7.20，124℃高压灭菌15min，冷至常温，备用；

（3）细菌培养：

分别取乳酸菌浓度为0.5麦氏浊度的菌液20μL，接种于步骤（2）制备的7个浓度梯度的含火麻仁油的梯度液体培养基中，38℃厌氧培养27小时；

（4）菌液最大吸收波长筛查：

采用分光光度计测定菌液中乳酸菌的相对数量和波长，取菌液200μL加入96孔板，加3个复孔，用多个波段扫描，绘制吸光度与波长关系图，确定最大吸收波长；

（5）梯度液体培养基中细菌相对数量的测定与比较：

将每梯度浓度的梯度液体培养基菌液各取200μL加入96孔板，同时对应取含相同浓度火麻仁油培养基各200μL加入96孔板作为背景扣除，然后将96孔板放入酶标仪，调整至菌液最大吸收波长，振摇5秒，测吸光度OD差值；

实验组吸光度差值为X，对照吸光值差值Y，即：

X=实验组OD-背景OD；Y=对照组OD-背景OD

E= X -Y；E﹥0，表示对细菌增值，E﹤0表示对细菌无增值；

T=[(X-Y)/Y]′100%

T：促菌率或抑菌率，正值是促菌，负值为抑菌；

（6）效价测定与计算：

选择果寡糖为对照品，供试药物效价测定步骤同步骤（1）-（5)，为效价计算方便，根据预实验与对供试药物的效价估计，对供试药物与对照品的加样量要保证反应时促菌率T在45-55%，并保证供试药物与对照品反应的量效关系曲线平行；当对照品效价值为10.0U·mg^-1，根据平行线测定原理，依照2010版《中国药典》二部附录XIV生物检定统计法项下规定的量反应平行线测定法中的2.2法，进行供试药物与对照品效价的对比检定，实现对火麻仁质量控制评价。