CN104830988A - 鼠伤寒沙门氏菌特异性lamp引物组及lamp检测方法 - Google Patents

鼠伤寒沙门氏菌特异性lamp引物组及lamp检测方法 Download PDF

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Abstract

一种特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物、试剂盒，以及利用LAMP引物和试剂盒检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法，所述LAMP引物及检测方法针对鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因的片段。所述LAMP方法特异性好、灵敏度高、检测要求的设备条件低、结果直观、肉眼可视，能够快速准确的鉴定兽医临床样本中的鼠伤寒沙门氏菌感染。

Description

鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP引物组及LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测沙门氏菌(Salmonella)的LAMP试剂盒，属于微生物检测领域。
背景技术
沙门氏菌属(Salmonella)是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一，也是肠杆菌科中最复杂的菌属，属革兰氏阴性菌。目前全世界已分离出2523个血清型，我国已发现216个。沙门氏菌的多种血清型可以引起中毒，以鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌和肠炎沙门菌最常见。沙门氏菌中毒的症状主要由急性肠胃炎为主，潜伏期一般为四至四十八小时，短期是数小时，长期是两天至三天，前期症状有恶心、头疼，全身乏力和发冷等，主要症状有呕吐、腹泻、腹疼，粪便以黄绿色水样便，有时带脓血和黏液，一般发热的温度在三十八摄氏度至四十摄氏度，重病人出现打寒战、惊厥、抽搐和昏迷的症状。
传统检测沙门氏菌的培养方法，需要分离、培养和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般检测周期为4～6d，费时费力，且灵敏度低、特异性差。PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，已有较多应用于沙门氏菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此急待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床病原微生物检验方法。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新的等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果、反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点，特别适合病原微生物的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确、特异性高地检测鼠伤寒沙门氏菌。为了解决该技术问题，本发明提供一种特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组、试剂盒，以及利用LAMP引物和试剂盒检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法。
为解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：
本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，具体地，所述引物组包括两条外引物和两条内引物，所述引物组能够扩增鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因。
本发明所述的鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，其特征在于所述引物的序列如下：
F3：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG
B3：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
FIP：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC
BIP：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC。
另一方面，本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，具体地，所述试剂盒包含本发明所述引物组。
进一步地，所述试剂盒包括Bst DNA聚合酶大片段、LAMP 10×buffer、6mol/L甜菜碱、4mol/L dNTP、SYBR-Green染料。
进一步地，所述试剂盒中还包括阴性对照和/或阳性对照。
进一步地，所述阴性对照为PET28空载体质粒，所述阳性对照为插入了鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因的重组T载体。
再一方面，本发明提供一种使用所述引物组或试剂盒特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法。
进一步地，本发明提供一种使用所述引物组或试剂盒特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的非诊断且非治疗目的的LAMP方法。
进一步地，所述LAMP反应体系中dNTP的终浓度为0.2-0.6mol/L、甜菜碱的终浓度为0.4-1.2mmol/L，优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.4-1.2mmol/L，更优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.6-0.8mol/L，最优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.6mol/L。
进一步地，所述LAMP反应在60-65℃恒温下进行45-75min，优选地，在63℃恒温下反应45-75min，更优选地，在63℃恒温下反应50-65min，最优选地，在63℃恒温下反应60min。
本发明提供的快速检测沙门氏菌LAMP试剂盒可对沙门氏菌进行检测，适应于在基层兽医疾病防控机构或普通养殖场推广。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
灵敏度高、特异性好，能够快速准确的鉴定样本中的鼠伤寒沙门氏菌。
检测要求的设备条件低，结果直观，肉眼观察即可判断。
附图说明
图1：最佳水浴温度的优化。各泳道分别为：1、2000bpDNA Marker 2、60℃；3、61℃；4、62℃；5、63℃；6、64℃；7、65℃；8、阴性对照。当水浴温度在63℃时条带最亮。
图2：最佳dNTPs浓度的优化。各泳道分别为：1、2000bpDNA Marker；2、0.2mmol/L；3、0.4mmol/L；4、0.6mmol/L；5、0.8mmol/L；6、1.0mmol/L；7、阴性对照。dNTPs浓度在0.4mmol/L时扩增条带最亮。
图3：适宜反应时间的优化。各泳道分别为：1、2000bpDNA Marker；2、15min；3、30min；4、45min；5、60min；6、75min；7、阴性对照。水浴时间为60min时条带最亮。
图4：甜菜碱最佳终浓度的优化。各泳道分别为：1、2000bpDNA Marker；2、0.2mol/L；3、0.4mol/L；4、0.6mol/L；5、0.8mol/L；6、1.0mol/L；7、1.2mol/L；8、阴性对照。betaine浓度在0.6mol/L时扩增条带最亮。
图5；本发明LAMP方法与PCR检测灵敏度对比：图5A为LAMP检测结果，泳道1为2000bpDNA Marker，泳道2-11是将模板分别稀释100-109，泳道12为阴性对照；图5B为PCR检测结果，泳道1为2000bpDNA Marker，泳道2-11是将模板分别稀释100-109泳道12为阴性对照。
图6：LAMP产物加入SYBR-Green I的荧光检测结果。管1-10为模板分别稀释100-109；管11为阴性对照。
图7：特异性试验。各泳道分别为：1、2000bpDNA Marker；2、鼠伤寒沙门氏菌；3、绿脓杆菌；4、金黄色葡萄球菌；5、副猪嗜血杆菌；6、副鸡嗜血杆菌；7、巴氏杆菌；8、乳酸杆菌；9、阴性对照。说明发明所述方法特异性好，能够从兽医临床常见的致病菌中特异性检测出鼠伤寒沙门氏菌。
具体实施方式
以及结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1：模板提取、引物设计、LAMP扩增条件。
提取鼠伤寒沙门氏菌DNA，其中提取的样品DNA，其DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
根据鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因序列(如SEQ ID NO:9)，设计两组LAMP引物，序列如下：
第一组(SEQ ID NO:1-4)：
F3-1：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG
B3-1：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
FIP-1：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC
BIP-1：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC
第二组(SEQ ID NO:5-8)：
F3-2：GGATATGGTACTGAGGCTAA
B3-2：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
FIP-2：GCACTCCGGTTGTAAACCATTAT-CACCACTAGTAAAGCTAAGTGT
BIP-2：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC
合成上述两组LAMP引物，每组设三个重复，利用常规LAMP程序进行扩增。
扩增体系如下所示：
鼠伤寒沙门氏菌LAMP反应体系(25μL)
两组LAMP引物均能扩增出LAMP条带，但第一组扩增的条带更亮，三个重复管亮度更接近。由于第一组LAMP引物的敏感性和可重复性更好，选择第一组进行后续的条件优化等研究。
鼠伤寒限制酶II基因的序列:(SEQ ID NO:9)
ttaaataatctccggtgcattgccggtaatggctttcacatccgccagcagatcgccaaacttaccgtagttaaccttaacgccgtcgtcgagatcaatactgattctcatatcagcatagtggcgcaggcgatcgtcgaagctgcgcagttcgttgaattttttgctcaggctatcacgctcacgtttcagacgggtggcttcgccgcctgaggctccatcgacctgttcgttcaggcgatcgatattggcctgatagcgcgccagcagcggcactacatattcggtacgcattctcgccagcgtcgcatcgttgtagcgatgcagatagaccaggcactcaaacgctttctctttaccggagctgaacagccagtatatcggacgctttttatacatcttcatatgatctttccagaactgagtggaaagatagcggcggatggtatccagcgcagattcgcctttttttggttttatcgcgtataaacagaggctttcggcgataaattcgagattttcctgcaagtgttcttcgccccaaacggtgcgaacaaactctttgacgcgagaggtaacgtcatcgtcaaaccactcgtcatccatcagcggcaggataccgtcattgtcagccgggaaggttttgtacgcgtcttcagcgaccagttcggcaaagcctttattgccttcatgggcatagaccagtccttcgcgatcgagggagtagcggcccatcatgcagccgatgatgtagcttaagatatctatagtgatatcagtgtaatacttattggttagatcggtatgatcttgaatatttttatatcgatagtttggattacatagtagagttatttcactttgcaatacagctttaattatagttttgtcaagttgtaatttatctataaaaatattatttatagtattttctattaggagaagtgtttcgactaacttgatatttgtattgattttttgtttgtagatattccgtagcaattgagttgaattgtgttcaagcaatggtgaacaaacataatcccatgattgctcttgagagtcccagtcatttttagctatttcaatagcattggtgactaattcgataatttcatcttcaatttctggatatggtactgaggctaattcaccactagtaaagctaagtgtgggggctagtattgataaataatggtttacaaccggagtgcacattaatcccgcagcgtaaagcaactcatttttgttatttgaaaagccgcaacggcctgtatcatcaaaaacaaacccttttggacgatatctcacgcaaaaattaccttggcttatttttgaccatgttatgccttctctaaagtaatactcatcatttcttacggcagagcgagttttgccattctcaaatttaaaatttcgtatttcgtaaccattattttcccaatttacaactatttcgttattaccataccactttcgatattcacctccactactacaaggaaaccatttgatattatgaatgtcgatttttgtatttgattctttatttgtgataagggttttttttattgaaacctcgtaccaatatctttgaaatttaatattgtcaccggtggacatgcctgcttttaatgctattttttctccaagttttttatggtggcgaaaagataatagactcggtaagtctatccaatatgctattggcattcctggtatgtttttaaaatcatgctgtgtaaatttatcaaatatatttttccttagaagtagatcgcttttctttacttcttccctaccatctataagtctaaaaaatacaggttggtaacgttcggagtgttggtttttaatcacccaggcagttgtctgtacaacctctccagaaatttgcccaaaagcccgagctcccaaatgtgccatcgtaataaatgttttattgtccaataaccagttacgtagtgcttcataacttgacaaaaacatccatgattgcatattgacttgagcattaaacccattttctttaagcaaagaaaatgcattctgcataaacattgcaaacaaatcagctttactatccgggaagttatttttggcaaactctttcagctcactattcattcccttgccacccatatacggcggattcgccactaccgcatcataccgctgcgccaggatccacgcctgctgaatatacggaataaacgctttcgccgctgccttctgctggaaatcgccttcctgctccatgcgatatagcgcttcgagaaacgccttcagttccgcctcttcttcctgtggcacctggatcagcgagcccagcgttttggcgttcacaaagcgcttcagcgtgcgcatcagcagctgatattctgcgctgtcggtatgggctaatgctgtattttcggcaaacatatcccccatgctaccagtctggttctgctggtggaagttcagctgctgccacagcttagcaatatccagatgcaggctctcctgcagggagacaatattcagacgcacgtcgcgggtgaatatccggcggtcatcctgacgggccatcattaataaggcaaagccggaaagctgggcagcacggtcgtcaatgtcgagaccaaaaatattattttccagaattagctgtggaatatcgcgggcgcgatagccgcgctcttcatagatatttttcagcacattatagacttcaatcagaatatgcccggagccgcaggccgggtcgagtactttgatgctttccggttcaatactggcaggtgtaatggcggccagctgcgcctgcacttctggcgtctgttcggctggctcaatgtagtagtccattttgcctttcagcggcgaatccgggtaggtctgcaaccactggcggccgacggagttctgtaccagatactgcacaatccagtttggggtaaacagctgggtggcggcaggaatatcttcgctcttcaccaccttaccgataaccgcatcttttttctcagagatatagaactgatacagccagccgataacctcaacttcttgccagtcttcttccggaataccgtccaccagaccgcgtagaatggagtcggtgcgggtcaggttatccggcagcagtagttcagcttcatcgtccacagcttcaaacaggaacggcatcgcgcggtgcagggcgtggcactgggccagcagcagttcacggtagatggcttcgtcctggttgccggaaagcttcatctcgaccagctgcgcctttttctctggtagtaatgcttccgcgacttccggtacgtggtccagcacttcaaagcctgtcgggttatccgggtgcgagagcatgtggaagccgtggtcaagataaccgtggatttccatataacgaatggcgcacaggcggttgaaccaggtgtaggcacagtgctcaaccagcacgtcaaagccctgctcgcgggcgcgttttaccagacgatcgcggcgggtgagggtggatttggggtagtcgaactgaccatagcgcatggtttcgccgacgagctcggcatccgcaatttgcagattgccttttttatcagcggaaatccccagcgtggttagcttttggatcaccgcatcgcggaactggttacgggcctgtggagcgtattttttgatgttattggtattcat
第一组LAMP引物扩增的序列为(SEQ ID NO:10)：
cgataatttcatcttcaatttctggatatggtactgaggctaattcaccactagtaaagctaagtgtgggggctagtattgataaataatggtttacaaccggagtgcacattaatcccgcagcgtaaagcaactcatttttgttatttgaaaagccgcaacggcctgtatcatcaaaaacaaacccttttggacgatatctcacg
实施例2：反应条件的优化
采用第一组LAMP引物，在保持其它LAMP扩增参数不变的情况下，分别对水浴温度、最佳dNTPs浓度、最适反应时间、甜菜碱最佳浓度，进行单因素条件优化。如图1-4所示，所述LAMP反应的适宜水浴温度为60-65℃，优选63℃；适宜dNTPs浓度为0.2-0.6mmol/L，优选0.4mmol/L；适宜的反应时间为45-75min，优选60min；适宜的甜菜碱浓度为0.4-1.2mmol/L，更优选0.6-0.8mol/L，最优选0.6mol/L。
实施例3：LAMP方法与PCR检测灵敏度对比
设计PCR检测引物序列如下：
P1：5’-TCG CAC CGT CAA AGG AAC CGT AAA GC-3’(SEQ ID NO:11)
P2：5’-GCA TTA TCG ATC AGT ACC AGC CGT CT-3’(SEQ ID NO:12)
PCR反应体系如下：50μL的反应体系，在0.2mL的反应管中，Premix Taq缓冲液25μL，模板4μL，浓度为20μmol/L的上下游引物各1μL，去离子水19μL。
PCR反应程序为：94℃预变性2min，30个循环，94℃变性1min，58.4℃退火40s，72℃延伸30s；72℃终延伸7min后4℃保存。
PCR引物扩增序列如下(SEQ ID NO:13)：
TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGCTGGCTTTCTCTTTCCAGTACGCTTCGCCGTTCGCGCGCGGCATCCGCATCAATAATACCGGCCTTCAAATCGGCATCAATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAATCGGGCCGCGACTTCCGCGACGCGTTCTGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTGGACCACGGTGACAATAGAGAAGACAACAAAACCCACCGCCAGGCTATCGCCAATAACGAATTGCCCGAACGTGGCGATAATTTCACCGGCATCAGCTTCAATCAAGATAAGACGGCTGGTACTGTCCGATAATGC
采用实施例1所提取的待检DNA样品进行10倍比梯度稀释，同时按照实施例2优化的条件和参数进行LAMP检测、以及上述PCR检测，结果如附图5所示。
由附图5可知：本申请建立的LAMP检测方法的最低检测限为106，常规PCR检测方法的最低检测限为103，本申请建立的LAMP方法灵敏度比常规PCR方法高3个数量级。
实施例4：LAMP方法的可视化
将模板进行10倍比稀释，按照实施例2优化的条件和参数进行LAMP反应，反应结束后在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化。所述的显色剂为10％的荧光染料SYBR GREENI。
结果如图6所示，将模板稀释至106，仍能观察到绿色荧光。
实施例4：特异性检验
分别以临床常见的微生物绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、副鸡嗜血杆菌、巴氏杆菌、乳酸杆菌为模板，对本发明建立的LAMP方法的特异性进行检验。图7表明本发明建立的LAMP方法特异性好，能够从兽医临床常见的微生物中特异性的检测出鼠伤寒沙门氏菌。

Claims (9)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，其特征在于所述引物组包括两条外引物和两条内引物，所述引物组能够扩增鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因。
2.如权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，其特征在于所述引物组的序列为：
F3-1：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG
B3-1：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
FIP-1：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC
BIP-1：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC。
3.一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含所述引物组。
4.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶大片段、LAMP 10×buffer、6mol/L甜菜碱和4mol/L dNTP。
5.如权利要求3或4所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括阴性对照和/或阳性对照，优选地，所述试剂盒中还包括荧光染料。
6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于所述阴性对照为PET28空载体质粒，所述阳性对照为插入了鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因的重组T载体，所述荧光染料为SYBR GREENI。
7.一种使用权利要求1-2所述引物组或权利要求3-6所述试剂盒特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法。
8.如权利要求7所述特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法，其特征在于所述LAMP反应体系中dNTP的终浓度为0.2-0.6mol/L、甜菜碱的终浓度为0.4-1.2mmol/L，优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.4-1.2mmol/L，更优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.6-0.8mol/L，最优选地，dNTP的终浓度为0.4mmol/L，甜菜碱浓度为0.6mol/L。
9.如权利要求7或8所述特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法，其特征在于60-65℃恒温下反应45-75min，优选地，在63℃恒温下反应45-75min，更优选地，在63℃恒温下反应50-65min，最优选地，在63℃恒温下反应60min。
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