CN104825436A

CN104825436A - 绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途

Info

Publication number: CN104825436A
Application number: CN201510123289.0A
Authority: CN
Inventors: 张洁; 黄望; 张亮
Original assignee: Sichuan Jiuzhang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Jiuzhang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2015-08-12
Also published as: WO2016150356A1

Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途。绿原酸在促进成纤维细胞增殖可达23%-789%，人牙龈组织成纤维细胞增殖率可达23%-469%；人皮肤组织成纤维细胞增殖率可达28%-789%间。

Description

绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途。

背景技术

绿原酸（英语：Chlorogenic acid）亦称咖啡鞣酸。即3-咖啡酰奎宁酸，一种提取自忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花,广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，主要丰在于忍冬科忍冬属（Lonicera）、菊科蒿属（Artemisia）植物中，其中含量较高的植物主要为杜仲、金银花、向日葵、继木、咖啡、可可树等。

绿原酸半水合物为针状结晶（水）。110 ℃变为无水化合物，熔点 208 ℃， [ α ]24D-35.2 ℃（ c=2.8）。25 ℃水中溶解度为 4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。

成纤维细胞是创面修复过程中的最主要的功能细胞，在伤口愈合过程中经过迁移、增殖、分泌大量的胶原纤维和基质成份，与新生毛细血管等共同构成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。

绿原酸已经被广泛应用于食品，保健品，化妆品和药品等多个领域，如: 心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等；但绿原酸其它作用还需要进一步的研究和探索，对能促进成纤维细胞增殖未作报道。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途。

本发明进一步提供所述绿原酸在制备对组织创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

所述绿原酸在制备对牙龈组织的创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

所述绿原酸在制备对皮肤组织的创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

所述药物是由绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。

所述药用赋形剂为乳糖、甘露醇、淀粉、糊精、羟丙纤维素一种或两种以上。

所述药物的单位制剂含绿原酸1-1000mg。

优选方案中所述单位制剂含绿原酸10-200mg。

所述药物的制剂是外用制剂、口服制剂或注射剂。

绿原酸通过调节肝素蛋白多糖的水平来诱导其受体二聚体化，激活FGFs／FGFRs信号传递，从而调节成纤维细胞的增殖与分化。

组织损伤后通过促进损伤修复细胞的补充和增殖以及通过趋化作用和促细胞迁移作用导致巨噬细胞、间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，从而启动创伤愈合过程。

绿原酸在促进成纤维细胞增殖分化中可达23%-789%的增值率，并在5%-40%浓度量效关系中呈浓度依赖型。其中，人牙龈组织成纤维细胞增殖率可达23%-469%；人皮肤组织成纤维细胞增殖率可达28%-789%；对组织创伤具有修复及促进愈合的作用。

附图说明

图1为本发明中不同浓度绿原酸促进牙龈组织成纤维细胞生长曲线图

图2为本发明中不同浓度绿原酸促进皮肤组织成纤维细胞生长曲线图

具体实施方式

实施例1

实施例1 用绿原酸制备冻干粉针剂

绿原酸的提取：

本实施例中所用的绿原酸原料药，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为99.52%。

绿原酸冻干粉针剂的制备

处方：纯度为99.52%的绿原酸（主药）30g、甘露醇（支撑剂）45g、亚硫酸氢钠（抗氧化剂）5g，将处方完全溶解于注射用水中，过滤后，再用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，调节pH后，按照无菌粉针剂的常规操作共制成2ml粉针剂1000支，每支含绿原酸30mg。

实施例2 用绿原酸制备丸剂

绿原酸的提取

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为99.06%。

绿原酸丸剂的制备

处方：纯度为99.06%的绿原酸（主药）1g，糖粉（稀释剂）50g，聚维酮K30（粘合剂）适量，无水乙醇（润湿剂）适量，

制法：取适量的聚维酮K30，用无水乙醇配制成溶液，再取处方量的绿原酸和糖粉采用等量稀释法混合均匀之后，加入糊精粉的乙醇溶液中，充分搅拌后制得软材，采用搓丸法制得绿原酸丸剂1000粒，每粒丸剂含绿原酸1mg。

实施例3 用绿原酸制备口服溶液剂

绿原酸的提取

本实施例中所使用的绿原酸，系由牛蒡叶中提取、纯化得到，纯度为99.25%。

绿原酸口服溶液剂的制备

处方：纯度为99.25%的绿原酸（主药）200g，亚硫酸氢钠（抗氧化剂）10g，注射用水（溶剂）100L，

制法：取处方量的绿原酸和亚硫酸氢钠，溶解100L注射用水中，按照口服液的常规制备工艺，过滤后，无菌灌装成1000支口服液，每支口服液为100mL，含绿原酸200mg。

实施例4 用绿原酸制备片剂

绿原酸的提取：

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到，纯度为98.38%。

绿原酸片剂的制备

处方：纯度为98.38%的绿原酸（主药）100g，糖粉（填充剂）100g，乳糖（填充剂）200g，羟丙甲纤维素（粘合剂）50g，硬脂酸镁（润滑剂）50g，

制法：本实施例采用制湿颗粒压片法制备绿原酸片剂。（1）按处方量取羟丙甲纤维素制成水溶液；（2）取处方量的绿原酸、糖粉和乳糖混合均匀后，加入羟丙甲纤维素水溶液，充分搅拌均匀后制成软材；（3）将制备好的软材按常规的湿法制粒的操作规程，过筛、干燥和整粒后得到大小均一的颗粒；（4）将制得的颗粒与硬脂酸镁混合均匀后压片，共制成1000片剂，每片含绿原酸100mg。

实施例5 用绿原酸制备胶囊剂

绿原酸的提取：

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为99.05%。

绿原酸胶囊剂的制备：

处方：纯度为99.05%的绿原酸100g，淀粉200g，

制法：取处方量的绿原酸和淀粉，混合均匀，加入80%乙醇溶液制成软材，干燥，整粒后按照胶囊剂的常规制备工艺制备2000粒胶囊，每粒胶囊含绿原酸50mg。

实施例6用绿原酸制备颗粒剂

绿原酸的提取

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为98.72%。

绿原酸颗粒剂的制备

处方：纯度为98.72%的绿原酸（主药）200g，甘露醇（稀释剂）100g，蔗糖（稀释剂）400g，聚维酮K30（粘合剂）适量

制法：取聚维酮K30，加入注射用水，制成溶液。取处方量的绿原酸、甘露醇和蔗糖混合均匀之后，加入聚维酮K30溶液，制成软材。按照颗粒剂的常规制备工艺，对软材进行过筛、干燥和整粒之后，得到颗粒剂。在无菌条件下分装颗粒剂，制备400袋颗粒剂，每袋颗粒剂含绿原酸500mg。

实施例7用绿原酸制备散剂

绿原酸的提取：

本实施例所用的绿原酸原料药，系由牛蒡叶中提取、纯化得到的，纯度为99.12%。

绿原酸散剂的制备：

处方：纯度为99.12%的绿原酸1000g

制法：取处方量绿原酸过筛后，按照散剂的常规制备工艺，无菌分装成含1000瓶/袋散剂，每瓶/袋散剂含绿原酸1000mg。

试验一

1. 材料

1）成纤维细胞，选择因正畸治疗需拔牙且牙龈健康的志愿者（知情同意），并于拔牙时切取其少量牙龈组织；按组织块培养法，用含200mL/L FBS的DMEM培养液，在37℃、5OmL/L CO₂、95%湿度条件下培养。

2）药品与试剂

高糖DMEM培养基（GiBico，美国）；胎牛血清、DMSO、MTT、ELISA试剂盒（天津灏洋生物制品科技有限公司）；绿原酸（四川九章生物科技有限公司提供，批号：130601）

2.实验方法

取生长良好的第4代成纤维细胞，制成密度为1×10⁴/mL的单细胞悬液，并以每孔200 L接种于96孔板，置于37℃，50mL/L CO₂细胞培养箱中进行培养。常规培养24h待细胞同步化后，吸弃培养液和未贴壁细胞，并将细胞随机分为8组，分别加人绿原酸浓度为0g／mL(阴性对照组)、1、5、10、20、40mg／mL的含2%FBS的高糖DMEM培养基(每孔200)继续培养（相当于均给药为200微升，绿原酸浓度为0g／mL(阴性对照组)、1、5、10、20、40mg／mL为给药剂量，以下相同）。分别于培养第24、48、72 h各时间点取各组细胞(每组5孔)，按MTT试剂盒说明进行相应处理后，用酶联免疫检测仪测各孔530nm波长的A值。

3. 统计学方法

所有数据均用SPSS 13.0统计软件处理，实验结果计量资料用 ±s表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。多样本均数比较采用方差分析。

4.结果见表1和图1：

表1 不同浓度的绿原酸对人牙龈组织成纤维细胞增殖的影响（±s）

与阴性组比较 * p＜0.05， ** p＜0.01

试验结果显示，1mg/ml的绿原酸浓度组，与对照组（阴性组）比较，无统计学意义；5mg/ml以上的绿原酸浓度组对照组（阴性组）比较，具有显著差异性（ p＜0.05或p＜0.01）；说明绿原酸在浓度大于5%对牙龈组织成纤维细胞具有明显的促进增殖作用；高剂量组优于低剂量组，在5%-40%浓度量效关系中呈浓度依赖型，说明绿原酸能够促进成纤维细胞的增殖，促进牙龈组织愈合的作用。单位剂型含量中绿原酸使人牙龈组织成纤维细胞增殖率可达23%-469%。

试验二

1. 材料

1）成纤维细胞，选择美容外科科的包皮环切术切除的包皮组织的健康的志愿者（知情同意）。将切取下的包皮组织立即放人有DMEM培养液的无菌小瓶中保存并尽快送人实验室。用含双抗(氨苄青霉素100u/ml和硫酸链霉素100/m1)的PBS漂洗3遍后，剔尽皮下脂肪。然后将组织剪成小块，加入适量0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)，放入37℃ CO₂孵箱中消化2h。揭去表皮。将剩余真皮组织剪碎成0.5-1.0mm³左右的小组织块；按组织块培养法，用含200mL/L FBS的DMEM培养液，在37℃、50mL/L CO2、95%湿度条件下培养。

2）药品与试剂

糖DMEM培养基（GiBico，美国）；胎牛血清、DMSO、MTT、ELISA试剂盒（天津灏洋生物制品科技有限公司）；氨苄青霉素(Amresco公司，USA)，硫酸链霉素(Am-resco公司，USA)。绿原酸（四川九章生物科技有限公司提供，批号：130601）

2.实验方法

取生长良好的第4代成纤维细胞，制成密度为1×10⁴/mL的单细胞悬液，并以每孔200L接种于96孔板，置于37℃，50mL/L CO₂细胞培养箱中进行培养。常规培养24h待细胞同步化后，吸弃培养液和未贴壁细胞，并将细胞随机分为8组，分别加人绿原酸浓度为0g／mL(阴性对照组)、1、5、10、20、40mg／mL的含2%FBS的高糖DMEM培养基(每孔200)继续培养。分别于培养第24、48、72 h各时间点取各组细胞(每组5孔)，按MTT试剂盒说明进行相应处理后，用酶联免疫检测仪测各孔530nm波长的A值。

3. 统计学方法

所有数据均用SPSS 13.0统计软件处理，实验结果计量资料用x±s表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。多样本均数比较采用方差分析。

5.结果：见表2和图2

表2 不同浓度的绿原酸对人皮肤组织成纤维细胞增殖的影响（x±s）

与阴性组比较 * p＜0.05， ** p＜0.01

试验结果显示，1mg/ml的绿原酸浓度组，与对照组（阴性组）比较，无统计学意义；5mg/ml以上的绿原酸浓度组对照组（阴性组）比较，具有显著差异性（ p＜0.05或p＜0.01）；绿原酸在浓度大于5%对皮肤组织成纤维细胞具有明显的促进增殖作用；高剂量组优于低剂量组，在5%-40%浓度量效关系中呈浓度依赖型，说明绿原酸能够促进成纤维细胞的增殖，促进皮肤组织愈合的作用。单位剂型含量中绿原酸使人牙龈组织成纤维细胞增殖率可达28%-789%。

Claims

1.绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途。

2.根据权利要求1所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述绿原酸在制备对组织创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

3.根据权利要求2中任一项所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述绿原酸在制备对牙龈组织的创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

4.根据权利要求2中任一项所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述绿原酸在制备对皮肤组织的创伤起着修复及促进愈合药物中的新用途。

5.根据权利要求1-3中任一项所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途，其特征在于：所述药物是由绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。

6.根据权利要求4所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的新用途，其特征在于：所述药用赋形剂为乳糖、甘露醇、淀粉、糊精、羟丙纤维素一种或两种以上。

7.根据权利要求4所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述药物的单位制剂中含绿原酸1-1000mg。

8.根据权利要求6所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述单位制剂含绿原酸10-200mg。

9.根据权利要求1或2或3所述绿原酸在制备促进成纤维细胞增殖药物中的用途，其特征在于：所述药物的制剂是外用制剂、口服制剂或注射剂。