CN104815348A - 一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，主要包括由交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为1.5-2.5％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液与交联淀粉微球加水制成浓度为10-20％(W/V)的交联淀粉微球溶液按照体积比为5∶5，6∶4，7∶3或8∶2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡，在无菌条件下，在质量浓度为0.5％的NaOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在30～40摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。该止血复合微球平均直径600-900μm，平均孔径为50-100μm，比表面积高达720.8～810.2m2·g-1，可以吸收及降解生物材料并用于各种创伤和手术新鲜组织急性创面出血区的止血。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法。
背景技术
外科止血是手术技术的核心之一，良好的止血技术是保证手术成功的关键。随着各国医学界对止血材料有效性和安全性要求的提高，寻找自然界中优良的生物材料，开发出止血效果更佳、无毒副作用、无刺激性、易于加工成型的止血材料，势在必行。目前用于外科及外伤有血创面的可吸收性止血材料主要包括：
1.纤维蛋白胶
纤维蛋白胶又称纤维蛋白粘合剂，是一种从人血浆中提取的生物制品，主要由凝血酶和纤维蛋白原等制剂组成，作为创面止血黏接材料已在临床上广泛应用多年。
纤维蛋白胶由纤维蛋白原(含XVIII因子)、凝血酶、抑肽酶和氯化钙组成。纤维蛋白原在凝血酶和钙离子的作用下，形成稳定的不溶性纤维蛋白多聚体，多聚体形成后，通过以下机制发挥止血、封闭作用：①多聚体交织成网状，能吸附红细胞及血小板，形成血凝块。②纤维蛋白多聚体形成后，机械强度显著增强，可粘合组织及封闭缺损，同时能刺激毛细血管内皮细胞及纤维细胞生长，并以纤维蛋白网为支架形成肉芽组织，从而促进伤口愈合。
纤维蛋白胶有良好的止血、粘合性能和组织相容性，可减少术中出血量及输血量；适用于合并有凝血功能紊乱的实质器官出血，尤其适合于凹凸不平的深部创面止血。
使用纤维蛋白胶时必须注意，纤维蛋白胶属于生物蛋白制剂，在存放和使用时都应避免高温，以免发生变性，影响使用效果；另外对于大的创面出血，尤其是动脉出血，由于不能压迫止血，必须辅以其他材料。使用可吸收纤维蛋白胶时必须注意不能进入血管内，以防血栓形成。术区尽可能保持干燥，局部温度保持在37℃左右，使用该剂后局部应压迫3～5min，以免纤维蛋白胶在聚合前被血流冲走而影响止血效果。纤维蛋白胶不适用于动脉和较大静脉出血的止血。
该类材料不足之处是成本高，可能带来人体或动物血源性疾病感染、使用不便、止血速度慢，以及对大血管止血效果差。
2.氧化纤维素和氧化再生纤维素
氧化纤维素是一种可吸收性局部止血材料，作为纤维素衍生物的一种，具有良好的生物相容性、生物可降解性和无毒等特点。氧化再生纤维素是纤维素经氧化处理成为纤维素酸的薄纱状或棉布状可吸收止血材料，具有棉纱的外观和质地，易于包、敷、填塞等操作。其止血机制是通过材料吸水的特性而浓缩血液，启动凝血机制；同时，酸性羧基与血红蛋白Fe结合，使血液产生酸性高铁血红素，形成棕色胶块，封闭毛细血管末端而止血。目前临床上使用最广的是美国强生公司生产的可溶性止血纱布Surgicel，在国内又称速即纱，是一种含有凝血酶原的氧化再生纤维素编织纱块，属于羧甲基纤维素类止血材料。
Surgicel能降低损伤组织周围pH值，导致红细胞裂解，生成酸性高铁血红素，因此与血液接触后会形成棕色黏性胶块。这种高酸性环境还有一定的抗菌能力，对G+及G-菌效果明显。Surgicel产生的高酸性环境会通过一种弥漫性化学机制引起神经损伤，应避免对外围神经的直接大量使用。当两种或两种以上生物止血材料联合使用时，Surgicel的酸性环境可降低其他材料的止血效果。更有报道显示Surgicel能增强损伤组织周围炎症反应，使伤口愈合延迟，在骨腔及颅内由于吸收血液使体积膨胀而产生压迫神经症状。
3.天然生物多糖类止血材料
3.1壳聚糖类止血材料
壳聚糖，具有抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能，良好的组织相容性和较高的生物活性，且无毒、无刺激、能自然降解，可制成粉末、液体、纤维、凝胶及多孔材料用于各种类型的伤口止血，还可与一种或几种其它高分子材料复合，或是通过化学修饰制备衍生物增强其止血性能，促进伤口愈合。
壳聚糖的止血作用是因它能与红细胞表面交联而使红细胞产生黏附，在血液中发生某种再聚合反应，引起红细胞聚集，从而达到止血的目的。此外，壳聚糖及其衍生物对细菌、酵母、真菌等微生物都有很好的抑制作用。
但单纯使用壳聚糖制成的止血材料，其止血效果还是有限的，对于较大的出血，其止血效果不是很理想。因此国内外一般都采用与其他止血剂复合使用的方法来解决。复合使用的止血剂多数是凝血因子，也有胶原和氯化钙等。
3.2淀粉型多聚糖止血材料
来源于变性淀粉的可吸收性多聚糖止血材料，具有止血、防粘连、促进组织愈合等多方面的功能。其代表产品PerClotTM(Starch Medical Inc公司)可在体内降解，有良好的相容性，同时能在局部迅速形成凝血块、并在局部发挥机械屏障作用，在动物腹部手术实验中观察到其在术中止血的同时又能有效的预防术后肠粘连。
由美国Medafor公司生产的AristaTM是一种以马铃薯淀粉为基质的止血材料，其有效成分是多微孔多聚糖。这种多微孔多聚糖是从天然植物淀粉中提取的，无毒害、具有生物相容性的微球，微球表面的微孔起到分子筛的作用，具有强吸水性，可在瞬间吸收血液中的水分，将血液中的有形成分(血小板、凝血因子、纤维蛋白等)聚集在颗粒表面，产生“即时凝胶”，起到机械性封堵血管破口的作用，同时由于局部凝血因子的浓度增大，加快了内源性凝血，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，固化血凝块，达到牢固可靠止血。但这种有效止血材料的止血效果方面还存在不足，其吸水性不够强，吸水倍数低，从而影响止血的效果。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足之处，提供一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，利用该制备方法得到的复合微球可用于各种创伤和手术新鲜组织急性创面出血区的止血，并可以吸收及降解生物材料。
本发明通过下述技术方案得以解决：
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为4万～12万Da，脱乙酰度85％-95％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为5.0～0.5％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为20～60微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为5.0～0.5％的溶液体积之比为1g∶2～5ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为4000-8000r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌10～30分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为75～95％乙醇溶液体积比1g∶4～8ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为75～95％乙醇溶液中，在30～90r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理30～60min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数75～95％乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用碱性溶液调节pH为8.5～10.5，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶50～20ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应60～90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备植物淀粉微球：
首先将植物淀粉与水混合，配制质量百分浓度为20～70％的植物淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在1000～5000转/分的搅拌转速下，升温至40～80摄氏度，配制质量百分浓度2～15％的增稠剂溶液，将上述植物淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至65～80摄氏度，恒温搅拌10-30分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到植物淀粉微球；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的植物淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用碱性溶液调节pH为8.5～10.5，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与植物淀粉微球体积比为1g∶50～20ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应60～90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为1.5-2.5％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为10-20％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为5∶5，6∶4，7∶3或8∶2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的NaOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在30～40摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
在一种优选实施方式中，步骤(4)中碱性溶液为稀氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
在一种优选实施方式中，步骤(7)中碱性溶液为稀氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
在一种优选实施方式中，所述植物淀粉为马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉或绿豆淀粉。
在一种优选实施方式中，该止血用复合微球由权利要求1-4任一所述的制备方法制作而成。
本发明的上述用于临床手术中止血用复合微球的制备方法具有反应条件温和，制备步骤简单，操作便利，无有害物质产生等优点，并具有良好的生物降解性能及耐酸碱性能，制备的止血复合微球平均直径600-900μm，平均孔径为50-100μm，比表面积高达720.8～810.2m2·g-1，产率后质量计达到93.7～98.5％，可以吸收及降解生物材料并用于各种创伤和手术新鲜组织急性创面出血区的止血。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，其原理在于：游离氨基是衡量交联几丁糖微球功能性质的重要指标，因此制备交联几丁糖微球应尽量避免消耗氨基。溶液在离心力作用下分散成微球状质点，将几丁糖-固体氯化石蜡粉末混合后高速分散于碱性溶液中，由于几丁糖的凝胶点在pH 6.4附近，因此，在碱性条件下，几丁糖凝固成微球；氯化石蜡溶解乙醇，用乙醇溶解几丁糖微球中的氯化石蜡，形成多孔几丁糖微球；在碱性条件下，羧基可与环氧基团反应，形成醚键而几丁糖分子的基本组成单位氨基葡萄糖存在多个游离羧基，因此，可用1，2-环己二醇二缩水甘油醚进行交联，形成醚化物，于是就制备出多孔交联几丁糖微球。植物提取植物淀粉如马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉或绿豆淀粉通过醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐时进行交联，于是交联淀粉微球。
实施例1
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为4万Da，脱乙酰度85％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为0.5％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为20微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为0.5％的溶液体积之比为1g∶2ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为4000r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌10分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为75％乙醇溶液体积比1g∶4ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为75％乙醇溶液中，在30r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理30min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数75％.乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60摄氏度，再用稀NaOH溶液调节pH为8.5，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶20ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应60分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备马玲薯淀粉微球：
首先将马玲薯淀粉与水混合，配制质量百分浓度为20％的马玲薯淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在1000转/分的搅拌转速下，升温至40摄氏度，配制质量百分浓度2％的增稠剂溶液，将上述马玲薯淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至65摄氏度，恒温搅拌10分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到马玲薯淀粉微球；进一步的，也可以用玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉或绿豆淀粉等来替代马玲薯淀粉来制作微球，也可以取得同样的效果；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的马玲薯淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60摄氏度，再用稀NaOH溶液调节pH为8.5，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与马玲薯淀粉微球体积比为1g∶20ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应60分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为1.5％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为10％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为5∶5的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的NaOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在30摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
制备的止血复合微球平均直径600μm，平均孔径为50μm，比表面积高达720.8～m2·g-1，产率后质量计达到93.7％，
实施例二
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为12万Da，脱乙酰度95％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为5.0％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为60微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为5.0％的溶液体积之比为1g∶5ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为8000r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌30分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为95％乙醇溶液体积比1g∶8ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为95％乙醇溶液中，在90r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理60min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数95％.乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用稀KOH溶液调节pH为10.5，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶50ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备马玲薯淀粉微球：
首先将马玲薯淀粉与水混合，配制质量百分浓度为70％的马玲薯淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在5000转/分的搅拌转速下，升温至80摄氏度，配制质量百分浓度15％的增稠剂溶液，将上述马玲薯淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至80摄氏度，恒温搅拌30分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到马玲薯淀粉微球；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的马玲薯淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用稀KOH溶液调节pH为10.5，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与马玲薯淀粉微球体积比为1g∶50ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为2.5％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为20％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为6∶4的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的NaOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在40摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
制备的止血复合微球平均直径900μm，平均孔径为100μm，比表面积高达810.2m2·g-1，产率后质量计达到98.5％
实施例三
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为8万Da，脱乙酰度90％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为3.0％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为40微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为3.0％的溶液体积之比为1g∶4ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为6000r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌20分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为85％乙醇溶液体积比1g∶6ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为85％乙醇溶液中，在60r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理40min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数85％.乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至80摄氏度，再用稀NaOH溶液调节pH为9.5，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶40ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应70分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备马玲薯淀粉微球：
首先将马玲薯淀粉与水混合，配制质量百分浓度为50％的马玲薯淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在3000转/分的搅拌转速下，升温至60摄氏度，配制质量百分浓度5％的增稠剂溶液，将上述马玲薯淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至70摄氏度，恒温搅拌20分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到马玲薯淀粉微球；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的马玲薯淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至70摄氏度，再用稀NaOH溶液调节pH为9.5，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与马玲薯淀粉微球体积比为1g∶40ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应80分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为2.0％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为15％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为7∶3的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的NaOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在35摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
制备的止血复合微球平均直径700μm，平均孔径为70μm，比表面积高达770.4m2·g-1，产率后质量计达到95.5％
实施例四
一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为10万Da，脱乙酰度95％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为1.5％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为50微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为1.5％的溶液体积之比为1g∶4ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为5500r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌25分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为95％乙醇溶液体积比1g∶7ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为95％乙醇溶液中，在70r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理50min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数95％.乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至85摄氏度，再用稀KOH溶液调节pH为10.0，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶35ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应82分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备马玲薯淀粉微球：
首先将马玲薯淀粉与水混合，配制质量百分浓度为55％的马玲薯淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在3500转/分的搅拌转速下，升温至65摄氏度，配制质量百分浓度11％的增稠剂溶液，将上述马玲薯淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至76摄氏度，恒温搅拌10-30分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到马玲薯淀粉微球；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的马玲薯淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至70～90摄氏度，再用稀KOH溶液调节pH为10.0，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与马玲薯淀粉微球体积比为1g∶35ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应75分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为2.0％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为15％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为8∶2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的KOH溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在30～40摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
制备的止血复合微球平均直径800μm，平均孔径为90μm，比表面积高达790.1m2·g-1，产率后质量计达到97.7％
采用本发明制备而得的止血用复合微球的止血疗效如下：
试验1中华田园犬脾出血模型止血试验：
动物及材料健康成年中华田园犬10只，雌雄各半，体重17±1公斤；止血用复合微球，按实施例1方法制备，灭菌后使用。
方法：中华田园犬用3％戊巴比妥钠耳静脉麻醉后，将动物腹部剪毛并用碘尔康溶液消毒后，沿左侧肋缘下切口，进入腹腔，从肋缘下找到脾脏，在脾脏的平坦面，沿长轴先后划出长1cm、深1mm的两条对称性伤口，其中一条用本发明制备方法而得的止血用复合微球，另一条随机化原则用国产和进口的止血粉，观察创面止血情况，记录完成止血的时间，并观察止血粉末与创面的粘合情况，结果表明，本发明制备而得的止血用复合微球平均止血时间为9.8秒，和进口止血粉止血时间相当，优于国产止血粉的止血时间(平均止血时间为42秒)。
试验2中华田园犬脾出血模型止血试验：
动物及材料健康成年中华田园犬10只，雌雄各半，体重19±1公斤；止血用复合微球，按实施例2方法制备，灭菌后使用。
方法：中华田园犬用3％戊巴比妥钠耳静脉麻醉后，将动物腹部剪毛并用碘尔康溶液消毒后，沿左侧肋缘下切口，进入腹腔，从肋缘下找到脾脏，在脾脏的平坦面，沿长轴先后划出长1.5cm、深1.2mm的两条对称性伤口，其中一条用本发明制备方法而得的止血用复合微球，另一条随机化原则用国产和进口的止血粉，观察创面止血情况，记录完成止血的时间，并观察止血粉末与创面的粘合情况，结果表明，本发明制备而得的止血用复合微球平均止血时间为8.7秒，和进口止血粉止血时间相当，优于国产止血粉的止血时间(平均止血时间为42秒)。
试验3中华田园犬脾出血模型止血试验：
动物及材料健康成年中华田园犬10只，雌雄各半，体重20±1公斤；止血用复合微球，按实施例3方法制备，灭菌后使用。
方法：中华田园犬用3％戊巴比妥钠耳静脉麻醉后，将动物腹部剪毛并用碘尔康溶液消毒后，沿左侧肋缘下切口，进入腹腔，从肋缘下找到脾脏，在脾脏的平坦面，沿长轴先后划出长1.3cm、深1.2mm的两条对称性伤口，其中一条用本发明制备方法而得的止血用复合微球，另一条随机化原则用国产和进口的止血粉，观察创面止血情况，记录完成止血的时间，并观察止血粉末与创面的粘合情况，结果表明，本发明制备而得的止血用复合微球平均止血时间为10.2秒，和进口止血粉止血时间相当，优于国产止血粉的止血时间(平均止血时间为42秒)。
试验4中华田园犬脾出血模型止血试验：
动物及材料健康成年中华田园犬10只，雌雄各半，体重21±1公斤；止血用复合微球，按实施例4方法制备，灭菌后使用。
方法：中华田园犬用3％戊巴比妥钠耳静脉麻醉后，将动物腹部剪毛并用碘尔康溶液消毒后，沿左侧肋缘下切口，进入腹腔，从肋缘下找到脾脏，在脾脏的平坦面，沿长轴先后划出长1.5cm、深1.0mm的两条对称性伤口，其中一条用本发明制备方法而得的止血用复合微球，另一条随机化原则用国产和进口的止血粉，观察创面止血情况，记录完成止血的时间，并观察止血粉末与创面的粘合情况，结果表明，本发明制备而得的止血用复合微球平均止血时间为9.1秒，和进口止血粉止血时间相当，优于国产止血粉的止血时间(平均止血时间为42秒)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)制备几丁糖溶液：
在搅拌条件下分子量为4万～12万Da，脱乙酰度85％-95％几丁糖粉末溶解于稀盐酸中，制备几丁糖质量分数为0.5～5.0％的溶液；
(2)制备几丁糖微球：
向步骤(1)制得的几丁糖溶液中加入粒径为20～60微米的固体氯化石蜡粉末，固体氯化石蜡粉末质量与几丁糖质量分数为0.5～5.0％的溶液体积之比为1g∶2～5ml，搅拌均匀后泵入喷雾离心机，控制离心机转速为4000-8000r/min进行喷雾完成后，用电动搅拌机缓慢搅拌10～30分钟，然后进行过滤，收集的滤渣即为几丁糖微球；
(3)制备多孔几丁糖微球：
步骤(2)完成后，按照几丁糖微球质量与体积分数为75～95％乙醇溶液体积比1g∶4～8ml的比例，将步骤(2)中收集到的几丁糖微球分散于体积分数为75～95％乙醇溶液中，在30～90r/min的速度下进行第一次搅拌以溶解氯化石蜡粉末，搅拌处理30～60min后，过滤并收集滤渣，在滤渣中加入体积分数75～95％乙醇溶液进行第二次搅拌并溶解氯化石蜡粉末，加入的乙醇溶液体积及处理条件与第一次溶解氯化石蜡粉末相同，第二次溶解氯化石蜡粉末处理完成后进行过滤，所得到的滤渣即为多孔几丁糖微球；
(4)制备交联几丁糖湿球微球：
步骤(3)完成后，将步骤(3)制备的多孔几丁糖微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用碱性溶液调节pH为8.5～10.5，按照1，2-环己二醇二缩水甘油醚质量与多孔几丁糖微球体积比为1g∶50～20ml，加入1，2-环己二醇二缩水甘油醚，进行交联反应60～90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联几丁糖湿球微球；
(5)制备多孔交联几丁糖微球：
步骤(4)完成后，将步骤(4)制备的交联几丁糖微球湿球微球送入真空干燥，得到多孔交联几丁糖微球；
(6)制备植物淀粉微球：
首先将植物淀粉与水混合，配制质量百分浓度为20～70％的植物淀粉乳液；然后将增稠剂与水混合，在1000～5000转/分的搅拌转速下，升温至40～80摄氏度，配制质量百分浓度2～15％的增稠剂溶液，将上述植物淀粉乳液加入增稠剂溶液，调整温度至65～80摄氏度，恒温搅拌10-30分钟，静置，自然冷却下，弃上清液，洗涤、喷雾干燥，得到植物淀粉微球；
(7)制备交联淀粉微球：
步骤(6)完成后，将步骤(6)制备的植物淀粉微球分散于水溶液中，在搅拌条件下先升温至60～90摄氏度，再用碱性溶液调节pH为8.5～10.5，按照醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐质量与植物淀粉微球体积比为1g∶50～20ml，加入醋酸酐/己二酸-琥珀酸酐，进行交联反应60～90分钟，反应完成后过滤，再用纯净水反复洗涤滤渣，直至洗涤液pH值为中性时停止，然后进行过滤，收集滤渣为交联淀粉微球；
(8)将步骤(4)制备的交联几丁糖湿球微球加水制成浓度为1.5-2.5％(W/V)的交联几丁糖湿球微球溶液；
(9)将步骤(7)制备的交联淀粉微球加水制成浓度为10-20％(W/V)的交联淀粉微球溶液；
(10)将步骤(8)中交联几丁糖湿球微球溶液和步骤(9)中交联淀粉微球溶液混合成复合溶液按照体积比为5∶5，6∶4，7∶3或8∶2的比例混合，用超声波超声使溶液混合均匀，然后用高速离心机离心30min，脱泡；
(11)制备止血用复合微球：
在无菌条件下，将步骤(10)中得到的混合溶液，在质量浓度为0.5％的碱性溶液中固化，然后用酒精脱水，利用注射用水洗涤，在30～40摄氏度下烘干至半烘干状态，脱水、洗涤、固化喷雾烘干，包装灭菌，经钴60灭菌，制得止血用复合微球。
2.根据权利要求1所述的用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中碱性溶液为稀氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
3.根据权利要求1所述的用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，其特征在于：步骤(7)中碱性溶液为稀氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于临床手术中止血用复合微球的制备方法，其特征在于：所述植物淀粉为马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉或绿豆淀粉。
5.一种用于临床手术中止血用复合微球，其特征在于：该止血用复合微球由权利要求1-4任一所述的制备方法制作而成。
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