CN101138656A - 一种壳聚糖复合神经导管的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医用生物材料技术领域,近十几年来国内外学者已经证实了神经支架替代自体移植来修复神经缺损的可行性,但单一成分的壳聚糖导管弹性差、易碎裂、神经断端无法在管中固定。本发明的目的是提供一种拉伸强度大,在体内可维持较长时间,可降解吸收的壳聚糖复合神经导管的制备方法。本发明通过胶原蛋白和壳聚糖的酸性溶液以适当体积配比混合成复合液,然后将复合液在模具上进行层层固化制得。本发明经动物实验和临床研究发现可进行神经缺损断端的桥接,拉伸强度大,体内维持时间长,并可促进神经的再生。本发明工艺简单,价格低廉可替代传统的神经缝接方法,在周围神经缺损的临床治疗中有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域,具体涉及一种可以生物降解的壳聚糖复合神经导管的制备方法,该神经导管特别适合在进行周围神经缺损的治疗时作为神经桥接管使用。
背景技术
周围神经缺损修复一直是困扰临床的一个难题。传统的修复方法如外膜缝合其疗效优良率仅为50%,在创伤外科领域,神经损伤修复是靠神经端端缝合,但由于周围神经是混合神经,而目前还缺乏在手术中能快速而准确地辨别神经断端感觉神经和运动神经纤维的科学鉴别方法,即使应用精细的显微外科技术行束膜缝合,也难以避免在神经端端缝合后,因感觉、运动神经纤维的错向对接,而影响神经缝合的疗效,影响神经功能的恢复。近年来,有学者主张在神经断端间留2~3mm的间隙,由于神经的趋化作用,有利于使近端感觉神经纤维和运动神经纤维分别与远端相应神经纤维对接,从而提高神经修复效果。用于桥接周围神经缺损的材料主要非神经组织、非生物降解材料和可生物降解材料。非神经组织材料主要包括静脉管、动脉管、羊膜管、骨骼管、肌膜管等,这些材料主要的特点是含有基底膜与雪旺细胞细胞基底膜相似为雪旺细胞迁入提供条件,但这些材料在缺血后容易塌陷、再生不良、形成锁疤痕组织、增生及粘连等;非生物降解材料主要有硅胶管、碳纤维管、聚酯纤维管等,此类导管本身具有一定的毒性,管壁压缩神经,需二次手术取出导管等弊端;可生物降解导管如聚乳酸管等,其酸性降解产物不利于神经再生。
因此理想的导管材料应该具备以下特点:首先可以生物降解,导管在体内移植部位能存在很长的时间,神经再生完成后发生降解,不需二次手术取出,其次所用材料必须具备低细胞毒性,轻微的局部组织不良反应等。近十几年来国内外学者已经证实了神经支架替代自体移植来修复神经缺损的可行性。
壳聚糖是几丁质部分脱乙酰化的产物,大量的相关研究证明壳聚糖是一种生物相容性好、可生物降解吸收以及无毒副作用的天然多糖,它资源丰富是海洋渔业的下游产品因而价格低廉,是一种新型、优良的医用生物材料。胶原是组成胶原纤维的蛋白质,约占哺乳动物总蛋白质的1/3,其在皮肤和结缔组织中含量丰富。但单一成分的壳聚糖导管弹性差,易碎裂,神经断端无法在管中固定。
以胶原蛋白为基材的胶原神经导管不仅可以起到支架桥接作用,而且具有神经营养的作用,可以较好的促进神经的再生。但胶原神经导管的研制大都采用冻干成型法制得,耗能大、生产效率低。
因此制备生物相容性好、具有良好生物力学、可拉伸及在体内可降解吸收的导管在临床上具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种拉伸强度大,在体内可维持较长时间,可降解吸收的壳聚糖复合神经导管的制备方法。
本发明提供一种壳聚糖复合神经导管的制备方法,该神经导管的主要成分是壳聚糖和胶原,通过壳聚糖和胶原在模具上进行层层固化制得的,具体包括以下步骤:
A.制备酸性条件下的浓度为1.5-2.5%(W/V)的壳聚糖溶液;
B.制备酸性条件下的浓度为1-1.5%(W/V)的胶原蛋白溶液;
C.制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为5∶5、6∶4、7∶3或8∶2的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡;
D.制备神经导管:在无菌环境下,将上述壳聚糖-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为0.5~1.6mm的模具上,涂层均匀后,在0.5%的氢氧化钠溶液中固化,然后用酒精脱水,注射用水洗涤,在30~40℃下烘至半干燥状态,然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程,直至导管壁厚达到150-200μm,然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min,脱模,用注射用水洗涤,自然晾干,包装后灭菌。
上述神经导管的制备方法,更具体的操作步骤如下:
A.制备壳聚糖溶液:取新鲜虾壳,去除头、脚和尾,用清水洗净,分别用5%HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白,洗至中性、烘干、磨粉得到粉末几丁质,取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100℃以上脱乙酰反应24h以上,然后中和,用注射用水洗涤至中性,酒精脱水,最后真空干燥得脱乙酰度为85-95%的壳聚糖,将该壳聚糖溶解在2%(V/V)的醋酸中,使最终壳聚糖溶液浓度为1.5%(W/V);
B.制备胶原蛋白溶液:以牛跟腱为原料,进行脱脂处理和清洗后,冷冻,切片,用高速组织捣碎机捣碎,洗提,离心;取沉淀用2%(V/V)醋酸抽提,用胃蛋白酶消化,牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100∶1,提取72小时,过滤,高速离心30min;取上清液加入氯化纳至最终浓度为2.5mol/l,进行盐析,去除杂蛋白,高速离心30min,取沉淀溶解在2%(V/V)醋酸,使最终胶原蛋白的浓度为1.5%(W/V);
C.制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为5∶5、6∶4、7∶3或8∶2的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。
D.制备神经导管:在无菌环境下,将上述壳聚糖-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为0.5~1.6mm的模具上,涂层均匀后,在0.5%的氢氧化钠溶液中固化,然后用酒精脱水,注射用水洗涤,在30~40℃下烘至半干燥状态,然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程,直至导管壁厚达到150-200μm;然后,将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min,脱模,用注射用水洗涤,自然晾干;采用双层无菌包装后,进行60Co辐照灭菌。
上述导管的长度可以根据临床应用要求裁剪成各种规格。
在制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液中,胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为7∶3的比例混合,效果最佳。
本发明在以壳聚糖为基质复合胶原蛋白的神经导管的制备过程中,通过调节胶原和壳聚糖的适合体积配比,将二者的优势结合起来。相关文献已证明壳聚糖与雪旺氏细胞有着良好的组织相容性,此外壳聚糖有抑制成纤维细胞的生长并可以减少神经断端间疤痕的形成利于神经轴索的生长,胶原蛋白对神经有营养作用,可以很好的促进神经的再生。
本发明经周围神经缺损动物模型的电生理和组织学观察结果发现可以进行神经缺损断端的桥接,拉伸强度大,体内维持时间长,并可以促进神经的再生,神经轴突可沿导管生长。本发明也得到临床研究的验证。本发明的制备工艺特点是工艺简单、成本价格低廉、可替代传统的神经缝接方法,在周围神经缺损的临床治疗中有较好的应用前景。
具体实施方式
现结合实施例,对本发明作详细描述。
实施例1:本发明的壳聚糖复合神经导管的制备
第一步壳聚糖溶液的制备
取新鲜虾壳,去除头、脚和尾,用清水洗净,分别用5%HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白,洗至中性、烘干、磨粉得到粉末几丁质。取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100℃以上脱乙酰反应24h以上,然后中和,用注射用水洗涤至中性,酒精脱水,最后真空干燥得脱乙酰度为85-95%的壳聚糖。将该壳聚糖溶解在2%(V/V)的醋酸中,使最终壳聚糖溶液浓度为1.5%(W/V)。
第二步胶原蛋白溶液的制备
以牛跟腱为原料,进行脱脂处理和清洗后,冷冻,切片,用高速组织捣碎机捣碎,洗提,离心。取沉淀用2%(V/V)醋酸抽提,用胃蛋白酶(牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100∶1)消化,提取72小时,过滤,高速离心30min;取上清液加入氯化纳至最终浓度为2.5mol/l,进行盐析,去除杂蛋白,高速离心30min,取沉淀溶解在2%(V/V)醋酸,使最终胶原蛋白的浓度为1.5%(W/V)。
第三步壳聚糖-胶原蛋白复合溶液的制备
将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为5∶5的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。第四步模制多层复合神经导管的制备
在无菌环境下,将上述壳聚糖-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为1.2mm的不锈钢模具上,涂层均匀后,在0.5%的氢氧化钠溶液中固化,然后用酒精脱水,注射用水洗涤,在30~40℃下烘至半干燥状态,然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程,得到长2-3cm,内径1.2mm,壁厚200μm的导管。然后,将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min,脱模,用注射用水洗涤,自然晾干。采用双层无菌包装后,进行60Co辐照灭菌。
实施例2:本发明的壳聚糖复合神经导管的制备
第一步壳聚糖溶液的制备和第二步胶原蛋白溶液的制备同实例1。
第三步壳聚糖-胶原蛋白复合溶液的制备
将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为6∶4的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。
第四步模制多层复合神经导管的制备同实例1。
实施例3:本发明的壳聚糖复合神经导管的制备
第一步壳聚糖溶液的制备和第二步胶原蛋白溶液的制备同实例1。
第三步壳聚糖-胶原蛋白复合溶液的制备
将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为7∶3的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。
第四步模制多层复合神经导管的制备同实例1。
实施例4:本发明的壳聚糖复合神经导管的制备
第一步壳聚糖溶液的制备和第二步胶原蛋白溶液的制备同实例1。
第三步壳聚糖-胶原蛋白复合溶液的制备
将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为8∶2的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。
第四步模制多层复合神经导管的制备同实例1。
实施例5:本发明制备的神经导管桥接周围神经缺损的电生理研究
Wistar大白鼠30只,体重250~300g,随机分为3组。将坐骨神经切断后,采用实施例1的壳聚糖复合神经导管桥接,神经断端间距分别为2、4、6mm。术后第8周出现小腿三头肌收缩,采用Dentec公司生产的Cantata牌多道肌电图测定仪进行神经电生理测试,记录到复合肌肉动作电位(m波)。术后第12周,测得坐骨神经传导速度NCV为21.00±1.31(m/s),诱发电位最大波幅A为29.10±3.25(mv),而导管中神经断端间隙在4mm组神经再生较为理想。
实施例6:本发明的神经导管桥接周围神经缺损的组织学研究
雄性Wistar大鼠12只,体重200-250g,将右侧坐骨神经切除6mm,采用长1.2cm,内径1.6mm,壁厚200μm的导管桥接,左侧坐骨神经为正常对照组,术后16周处死动物。
结果:组织学检查低倍镜下可见再生的神经纤维排列整齐通过神经导管,导管变薄,但仍可见,且神经与周围组织间粘连轻。高倍镜见再生神经纤维密集、形态正常。8周末辣根过氧化物酶(HRP)检查,在脊髓腰膨大灰质前角中可见HRP标记阳性的运动神经元,细胞集中在L5、L6及骶神经段。本发明可降解神经导管拉伸强度大,在体内维持时间长,神经轴突可沿导管生长。
实施例7:本发明的神经导管桥接周围神经缺损的临床研究
病例介绍:虞××,女,40岁,摔倒后右手腕尺侧被玻璃割伤2个半月,伤时在当地医院清创缝合,伤口一期愈合。
检查:右手尺侧一个半指感觉消失,爪状畸形。肌电图检查尺神经完全损伤。术中发现尺神经完全离断,切除神经瘤后测量神经缺损3.5cm。以本发明的神经导管桥接修复,4个月后右手尺侧感觉恢复,5个半月后爪形手消失。
Claims (3)
1.一种壳聚糖复合神经导管的制备方法,该神经导管的主要成分是壳聚糖和胶原,其特征在于该方法包括以下步骤:
A.制备酸性条件下的浓度为1.5-2.5%(W/V)的壳聚糖溶液;
B.制备酸性条件下的浓度为1-1.5%(W/V)的胶原蛋白溶液;
C.制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为5∶5、6∶4、7∶3或8∶2的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡;
D.制备神经导管:在无菌环境下,将上述壳聚糖-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为0.5~1.6mm的模具上,涂层均匀后,在0.5%的氢氧化钠溶液中固化,然后用酒精脱水,注射用水洗涤,在30~40℃下烘至半干燥状态,然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程,直至导管壁厚达到150-200μm,然后将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min,脱模,用注射用水洗涤,自然晾干,包装后灭菌。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖复合神经导管的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
A.制备壳聚糖溶液:取新鲜虾壳,去除头、脚和尾,用清水洗净,分别用5%HCl和10%的NaOH浸泡去除钙和蛋白,洗至中性、烘干、磨粉得到粉末几丁质,取粉末几丁质在50%的NaOH溶液中100℃以上脱乙酰反应24h以上,然后中和,用注射用水洗涤至中性,酒精脱水,最后真空干燥得脱乙酰度为85-95%的壳聚糖,将该壳聚糖溶解在2%(V/V)的醋酸中,使最终壳聚糖溶液浓度为1.5%(W/V);
B.制备胶原蛋白溶液:以牛跟腱为原料,进行脱脂处理和清洗后,冷冻,切片,用高速组织捣碎机捣碎,洗提,离心;取沉淀用2%(V/V)醋酸抽提,用胃蛋白酶消化,牛跟腱与胃蛋白酶的重量比为100∶1,提取72小时,过滤,高速离心30min;取上清液加入氯化纳至最终浓度为2.5mol/l,进行盐析,去除杂蛋白,高速离心30min,取沉淀溶解在2%(V/V)醋酸,使最终胶原蛋白的浓度为1.5%(W/V);
C.制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为5∶5、6∶4、7∶3或8∶2的比例混合,用超声波超声使溶液混合均匀,然后用高速离心机离心30min,脱泡。
D.制备神经导管:在无菌环境下,将上述壳聚糖-胶原蛋白复合溶液涂层在外径为0.5~1.6mm的模具上,涂层均匀后,在0.5%的氢氧化钠溶液中固化,然后用酒精脱水,注射用水洗涤,在30~40℃下烘至半干燥状态,然后重复上述涂层、固化、脱水、洗涤和烘干过程,直至导管壁厚达到150-200μm;然后,将带模具的多层导管在注射用水中浸泡5min,脱模,用注射用水洗涤,自然晾干;采用双层无菌包装后,进行60Co辐照灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖复合神经导管的制备方法,其特征在于其中C.制备壳聚糖-胶原蛋白复合溶液:将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液按照体积比为7∶3的比例混合。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080312 |