CN104800095A - 一种生物溶菌酶复合制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物溶菌酶复合制剂，其制备方法是按配比将溶菌酶、氨基酸、蛋白水解酶、溶葡萄球菌酶、过氧化物酶溶于水，然后转移入混合釜，然后向混合釜中投入相应配比的山梨醇、水合硅石、氢氧化铝、甘油、月桂酰肌氨酸钠、食用香精、纤维素胶、卡拉胶、羟乙基纤维素、植酸钠、糖精钠、氯化锶、磷酸三钠、冰片、硼砂、朱砂、玄明粉、尿囊素，在38～42℃的恒温条件下，反应47～49小时，制成激活的生物溶菌酶复合制剂成品。该生物溶菌酶复合制剂属于非激素、非抗生素类型的新型蛋白功能制剂，具有很强的溶菌消炎、增强免疫能力、抵抗多种感染和促进康复等作用。

Description

一种生物溶菌酶复合制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抑菌、杀菌制剂，具体涉及一种生物溶菌酶复合制剂及其制备方法。

背景技术

传统对口腔疾病、慢性咽喉炎等炎性疾病的治疗主要是采用抗生素杀菌治疗，而抗生素只是对细菌细胞壁无选择的抑制细胞壁生长的杀菌机理，长时间使用后会使细菌产生耐药性与抗药性，进而逐渐降低药效，影响治疗效果。

开发非抗生素型的生物制剂来提高抑菌、杀菌效果，尽可能消除副作用是本领域技术人员需要解决的技术难题。申请号2013105597688的中国专利公开了一种复合溶菌酶口腔喷雾剂及其制备方法，该试剂由下列成分按重量百分比的成分组成：溶葡萄球菌酶3～7%，溶菌酶20～25%、茶多酚0.02～0.4%、橄榄油1.5～5%、维生素1～10%、山梨醇1～3%、卵磷脂0.8～2%、黄原胶0.01～0.07%、其余为纯水，各组分之和为百分之百。该发明的口腔喷雾剂作用显著，使用方便，不含酒精，所有成分都是天然产物提取，在复合溶菌酶、茶多酚、维生素C联合作用下能够清新口气、无毒副作用，且制备方法简洁有效，成本低廉，产品稳定性好。然而该试剂主要是针对口腔病灶，适应范围狭窄。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种生物溶菌酶复合制剂及其制备方法，通过改进溶菌酶复合制剂的组分，能够同时提高溶菌酶的稳定性，而且提高产品的抑菌、杀菌效果。

本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种生物溶菌酶复合制剂，其组分包括：山梨醇5～10(wt)％、水合硅石15～20(wt)％、氢氧化铝10～20(wt)％、甘油10～20(wt)％、月桂酰肌氨酸钠2～3(wt)％、食用香精1～1.3(wt)％、纤维素胶0.8～1.2(wt)％、卡拉胶0.3～0.6(wt)％、羟乙基纤维素0.3～0.5(wt)％、植酸钠0.5～1.2(wt)％、糖精钠0.15～0.3(wt)％、氯化锶0.3～0.5(wt)％、磷酸三钠0.1～0.3(wt)％、溶菌酶0.05～0.2(wt)％、氨基酸0.2～0. 5(wt)％、蛋白水解酶1～4ppm、溶葡萄球菌酶30～80ppm、过氧化物酶2～5ppm、冰片0.08～0.15(wt)％、硼砂0.1～0.15(wt)％、朱砂0.08～0.1(wt)％、玄明粉0.1～0.15(wt)％、尿囊素0.1～0.4(wt)％，余量为纯水。

优选地，所述溶菌酶的制备方法为，将玉米粉、蛋白粉、牛肉冻、氨基酸投入发酵罐，加水溶解，灭菌，冷却；然后接种培养，培养条件：温度35～40℃，搅拌速度500～600rpm，罐压0.02～0.03MPa，pH7.4～9.2,通气量：初期1︰0.5、2小时以后1︰1，培养时间6.5～8小时；放罐获得发酵液，放罐条件：酶产量接近800mg/L，酶产量与菌生长按OD595/OD600计，比值接近0.5，pH为8.5～8.8；发酵液离心去除菌体；取离心后的上层液，根据酶的等电点和分子量，利用离子交换层析法和/或筛层析法进行分离纯化，以获得活性较高的酶，最后将纯化后的溶菌酶液冷冻干燥，获得溶菌酶固体，并添加氨基酸作为保护剂。

上述生物溶菌酶复合制剂的制备方法为，按所述配比，将溶菌酶、氨基酸、蛋白水解酶、溶葡萄球菌酶、过氧化物酶溶于水，然后转移入混合釜，然后向混合釜中投入相应配比的山梨醇、水合硅石、氢氧化铝、甘油、月桂酰肌氨酸钠、食用香精、纤维素胶、卡拉胶、羟乙基纤维素、植酸钠、糖精钠、氯化锶、磷酸三钠、冰片、硼砂、朱砂、玄明粉、尿囊素，在38～42℃的恒温条件下，反应47～49小时，制成激活的生物溶菌酶复合制剂成品。

本发明生物溶菌酶复合制剂可广泛应用于口腔喷雾剂、牙膏、洗手液的制备，作为有效抑菌、杀菌成分。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

该生物溶菌酶复合制剂能够有效水解革兰氏阳性细菌细胞壁的聚肽糖，从而产生溶菌现象，达到彻底杀死细菌之目的，属于非激素、非抗生素类型的新型蛋白功能制剂，具有很强的溶菌消炎、增强免疫能力、抵抗多种感染和促进康复等作用，其杀菌、抑菌机理主要是，复合制剂中的溶菌酶和溶葡萄球菌酶之间相互配合，该酶分子结构中的第36-95位中心活性段中的第57位氨基酸与细菌细胞壁的ß1-4键结合，同时，溶菌酶与细菌细胞壁还有6个着落点A、B、C、D、E、F，从而实现对构成致病菌细胞壁的肽聚糖在ß1-4键进行有选择的切断，达到有效抑（杀）致病菌，具有更强的抑菌、杀菌作用。因此，本发明生物溶菌酶复合制剂与抗生素有着不同的杀菌机理，不会产生耐药性和抗药性。

本发明生物溶菌酶复合制剂具有较好的临床使用效果，制剂中的氨基酸，作为保护剂和加强剂，优选甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）组氨酸（His）天冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu）中的一种或几种的混合物。不仅有助于提高其稳定性而且加强了溶菌酶的活性，大量试验发现，溶菌酶的稳定性与其分子结构中的双硫键有关，而酶的活性取决于其中心活性段，因此，在固体条件下一定量的氨基酸能够保护溶菌酶的双硫键结构，提高其稳定性；而在溶解时氨基酸又能够促进溶菌酶中心活性段作用和着落，提高其对构成细菌细胞壁的肽聚糖在ß1-4键进行有效的切断。

本发明生物溶菌酶复合制剂的各组分设计合理，作为生物制剂，经过临床鉴定与检测，疗效确切、安全可靠，除具有强大的抑菌杀菌作用外还具有加快组织修复和提高机体免疫力的功能，不产生耐药性和抗药性，优于抗生素类制剂。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

一种生物溶菌酶复合制剂，其组分包括：山梨醇6(wt)％、水合硅石20(wt)％、氢氧化铝12(wt)％、甘油18(wt)％、月桂酰肌氨酸钠2 (wt)％、食用香精1.3(wt)％、纤维素胶0.8 (wt)％、卡拉胶0.4(wt)％、羟乙基纤维素0.3 (wt)％、植酸钠0.6 (wt)％、糖精钠0.3(wt)％、氯化锶0.3 (wt)％、磷酸三钠0.3(wt)％、溶菌酶0.1(wt)％、氨基酸0.3(wt)％、蛋白水解酶2ppm、溶葡萄球菌酶30ppm、过氧化物酶3ppm、冰片0.1(wt)％、硼砂0.15(wt)％、朱砂0.08 (wt)％、玄明粉0.12(wt)％、尿囊素0.4(wt)％，余量为纯水。

上述溶菌酶的的制备方法为，将玉米粉、蛋白粉、牛肉冻、氨基酸投入发酵罐，加水溶解，灭菌，冷却；然后接种培养，培养条件：温度37℃，搅拌速度600rpm，罐压0.03MPa，pH在发酵过程中明显变化，控制在7.4～9.2范围内，通气量：初期1︰0.5、2小时以后1︰1，由于该菌为好氧菌，培养过程中溶氧量不断下降，因此要适当增加通气量以利于菌的生长和产酶，培养时间6.5～8小时；在培养过程中定期取样以监测菌体生长和产酶量，当检测到：酶产量接近800mg/L，酶产量与菌生长按OD595/OD600计，比值接近0.5，pH为8.8时，放罐获得发酵液；然后离心去除发酵液中的菌体；取离心后的上层液，根据酶的等电点和分子量，利用离子交换层析法和筛层析法进行分离纯化，获得活性较高的酶，最后将纯化后的溶菌酶液冷冻干燥，获得溶菌酶固体，并添加相应量的氨基酸作为保护剂。

上述生物溶菌酶复合制剂的制备方法，按上述配比，将对应量的溶菌酶、氨基酸、蛋白水解酶、溶葡萄球菌酶、过氧化物酶溶于水，充分溶解后转移至混合釜，然后向混合釜中投入相应量的山梨醇、水合硅石、氢氧化铝、甘油、月桂酰肌氨酸钠、食用香精、纤维素胶、卡拉胶、羟乙基纤维素、植酸钠、糖精钠、氯化锶、磷酸三钠、冰片、硼砂、朱砂、玄明粉、尿囊素，在40℃的恒温条件下，反应48小时左右，制成激活的生物溶菌酶复合制剂成品。

实施例2

一种生物溶菌酶复合制剂，其组分包括：山梨醇10(wt)％、水合硅石18(wt)％、氢氧化铝20(wt)％、甘油10(wt)％、月桂酰肌氨酸钠3 (wt)％、食用香精1(wt)％、纤维素胶1.2(wt)％、卡拉胶0.6(wt)％、羟乙基纤维素0.5 (wt)％、植酸钠1.2 (wt)％、糖精钠0.15(wt)％、氯化锶0.5 (wt)％、磷酸三钠0.2(wt)％、溶菌酶0.2(wt)％、氨基酸0.5(wt)％、蛋白水解酶4ppm、溶葡萄球菌酶60ppm、过氧化物酶5ppm、冰片0.15(wt)％、硼砂0.1(wt)％、朱砂0.1(wt)％、玄明粉0.15(wt)％、尿囊素0.2(wt)％，余量为纯水。

上述溶菌酶的的制备方法为，将玉米粉、蛋白粉、牛肉冻、氨基酸投入发酵罐，加水溶解，灭菌，冷却；然后接种培养，培养条件：温度37℃，搅拌速度600rpm，罐压0.03MPa，pH在发酵过程中明显变化，控制在7.4～9.2范围内，通气量：初期1︰0.5、2小时以后1︰1，由于该菌为好氧菌，培养过程中溶氧量不断下降，因此要适当增加通气量以利于菌的生长和产酶，培养时间6.5小时；在培养过程中定期取样以监测菌体生长和产酶量，当检测到：酶产量接近800mg/L，酶产量与菌生长按OD595/OD600计，比值接近0.5，pH为8.8时，放罐获得发酵液；然后离心去除发酵液中的菌体；取离心后的上层液，根据酶的等电点和分子量，利用离子交换层析法和筛层析法进行分离纯化，获得活性较高的酶，最后将纯化后的溶菌酶液冷冻干燥，获得溶菌酶固体，并添加相应量的氨基酸作为保护剂。

上述生物溶菌酶复合制剂的制备方法，按上述配比，将对应量的溶菌酶、氨基酸、蛋白水解酶、溶葡萄球菌酶、过氧化物酶溶于水，充分溶解后转移至混合釜，然后向混合釜中投入相应量的山梨醇、水合硅石、氢氧化铝、甘油、月桂酰肌氨酸钠、食用香精、纤维素胶、卡拉胶、羟乙基纤维素、植酸钠、糖精钠、氯化锶、磷酸三钠、冰片、硼砂、朱砂、玄明粉、尿囊素，在40℃的恒温条件下，反应48小时左右，制成激活的生物溶菌酶复合制剂成品。

上述两组实施例中的生物溶菌酶复合制剂的主要技术、质量指标为

① 该制剂为白色粉末，溶于水，不溶于乙醚和丙酮；

② pI为11.0～11.35；

③ pH值5～10稳定；

④ 1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4；

⑤ 酶活性含量＞10000单位/毫克；

⑥ 达到《食品安全性毒理学评价程序与方法》GB15193-2003、《消毒技术规范》（2002年版）2.2.1.4，GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》、DB31/121-1993、GB/T16886.10-2005、《FE生物溶菌酶含量检测方法》 Q/320281NGS18-2014、《牙膏》GB8372-2008、《功效型牙膏》QB2966-2008 等指标要求。

本实施例中的生物溶菌酶复合制剂的抑(杀)菌试验表明，该制剂对革兰氏阳性菌族，如目前医学临床上最棘手的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和临床上常见的表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、D群肠球菌、四联球菌、产单核李斯特菌、链球菌以及口腔常见厌氧菌梭杆菌、牙龈类杆菌、韦革氏球菌、消化链球菌和二氧化碳嗜纤维菌以及胃幽门菌旋螺等均有明显的抑杀作用。对牙周病、牙龈出血、牙周脓肿、冠周炎和口腔溃疡有明显效果；对牙痛、牙龈红肿有明显的缓解作用；对慢性咽喉炎的部分症状，如咽痛、咽痒、咽充血及滤泡增生等均有一定疗效；可预防和缓解口腔溃疡；此外，对慢性扁桃腺炎也有消炎作用。能够广泛应用于医药、保健、日用化工等领域。

以生物溶菌酶复合制剂在牙膏上的应用为例，临床分析结果如下：

试验方法：对照组80人，实验组80人，6个月临床检查时，有6位受试者未能随访到，其中对照组3例，实验组3例。

对照组：选用空白牙膏、不含任何药物及生物溶菌酶复合制剂

实验组：选用生物复合酶牙膏（牙膏配方中加入生物溶菌酶复合制剂）

两组受试者使用牙膏前后各项牙周指数，见表1

表1

注：** 显著性差异

两组受试者使用牙膏后各项牙周指数的变化，见表2

表2

对照组77个受试者使用牙膏6个月后有23人（29.9%）菌斑指数减少，下降率为14.4%；而实验组77个受试者使用牙膏6个月后有72人（93.5%）菌斑指数减少，下降率为43.1%。 检测结果说明实验组受试者使用牙膏6个月后疗效明显优于对照组，实验组使用的牙膏能减少牙面菌斑、对牙龈出血、牙龈炎症有一定的疗效。

两组受试者使用6个月后疗效分析，见表3

表3

使用牙膏6个月后对照组的有效率为0%，实验组使用牙膏的有效率为53.2%，经卡方检验，实验组使用牙膏的有效率与对照组使用牙膏的有效率相比有高度显著性差异（P＞0.01）。

总结：含有生物溶菌酶复合制剂的牙膏能够有效水解口腔中革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖，从而产生溶菌现象，致使细菌死亡，干扰了细菌在牙面上的粘附，抑制了牙菌斑形成。临床检测还表明实验组受试者使用含有生物溶菌酶复合制剂的牙膏没有发生过敏、刺激性反应、恶心及其他不良反应，6个月后93.5%的人菌斑指数减少，菌斑的下降率为43.1%，同时有98.7%的人龈沟出血指数与牙龈指数均有下降，菌斑指数减少，牙龈炎症减轻，牙龈出血症状明显好转。

Claims (4)

1.一种生物溶菌酶复合制剂，其特征在于，其组分包括：山梨醇5～10(wt)％、水合硅石15～20(wt)％、氢氧化铝10～20(wt)％、甘油10～20(wt)％、月桂酰肌氨酸钠2～3(wt)％、食用香精1～1.3(wt)％、纤维素胶0.8～1.2(wt)％、卡拉胶0.3～0.6(wt)％、羟乙基纤维素0.3～0.5(wt)％、植酸钠0.5～1.2(wt)％、糖精钠0.15～0.3(wt)％、氯化锶0.3～0.5(wt)％、磷酸三钠0.1～0.3(wt)％、溶菌酶0.05～0.2(wt)％、氨基酸0.2～0. 5(wt)％、蛋白水解酶1～4ppm、溶葡萄球菌酶30～80ppm、过氧化物酶2～5ppm、冰片0.08～0.15(wt)％、硼砂0.1～0.15(wt)％、朱砂0.08～0.1(wt)％、玄明粉0.1～0.15(wt)％、尿囊素0.1～0.4(wt)％，余量为纯水。

2.根据权利要求1所述的生物溶菌酶复合制剂，其特征在于，所述溶菌酶的制备方法为，将玉米粉、蛋白粉、牛肉冻、氨基酸投入发酵罐，加水溶解，灭菌，冷却；然后接种培养，培养条件：温度35～40℃，搅拌速度500～600rpm，罐压0.02～0.03MPa，pH7.4～9.2,通气量：初期1︰0.5、2小时以后1︰1，培养时间6.5～8小时；放罐获得发酵液，放罐条件：酶产量接近800mg/L，酶产量与菌生长按OD595/OD600计，比值接近0.5，pH为8.5～8.8；发酵液离心去除菌体；取离心后的上层液，利用离子交换层析法和/或筛层析法进行分离纯化，最后将纯化后的溶菌酶液冷冻干燥，获得溶菌酶固体，并添加氨基酸作为保护剂加强剂。

3.一种制备如权利要求1或2所述生物溶菌酶复合制剂的方法，其特征在于，按所述配比，将溶菌酶、氨基酸、蛋白水解酶、溶葡萄球菌酶、过氧化物酶溶于水，然后转移入混合釜，然后向混合釜中投入相应配比的山梨醇、水合硅石、氢氧化铝、甘油、月桂酰肌氨酸钠、食用香精、纤维素胶、卡拉胶、羟乙基纤维素、植酸钠、糖精钠、氯化锶、磷酸三钠、冰片、硼砂、朱砂、玄明粉、尿囊素，在38～42℃的恒温条件下，反应47～49小时，制成激活的生物溶菌酶复合制剂成品。

4.根据权利要求1所述生物溶菌酶复合制剂在口腔喷雾剂、牙膏、洗手液上的应用。