CN104789448B - Lamp用加样反应容器及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LAMP用加样反应容器和使用方法。其中，LAMP用加样反应容器包括加样器和反应器两部分，加样器由吸帽和吸管组成，吸管两端开口，其中一端与吸帽密封连接且相通；反应器由封闭部件、反应部分和加样部分组成，其中反应部分的两端为开放式结构，反应部分的一端开口与封闭部件活动连接，另一端开口与加样部分连通，加样器吸管能够从与反应器封闭部件活动连接的一端开口内适配插入，将加样器中的液体转移至反应器反应部分和/或加样部分内。本发明的LAMP用加样反应容器，使用方便、操作简单，可有效避免传统LAMP反应在配液和点样过程中病原微生物等气溶胶的泄露和污染，以及后续LAMP实验结果假阳性风险，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的实验耗材，特别涉及LAMP实验领域的一种加样反应容器及其使用方法。
背景技术：
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即“环介导等温扩增技术”，其英文名称为LAMP(Loop-mediatedisothermal amplification)。短短几年，该技术受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中。近十几年，环介导等温扩增技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP技术具有如下优点：(1)灵敏度高，比传统的PCR方法高2～5个数量级；(2)反应时间短，30～60分钟就能完成反应；(3)无需特殊的仪器(试剂盒或实验方法研发阶段除外)；(4)操作简单，不论是DNA还是RNA，检测步骤均为：将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60分钟，肉眼观察结果。
由于LAMP技术特异性和灵敏度高、操作简单且对仪器设备要求低、检测简单等优点，特别适合基层食品安全快速检测、基层防疫部门和环保部门病原微生物快速检测、医院临床病原微生物的快速检测和基层科研机构或个人的研发需要等。
LAMP技术同时也存在如下缺点：(1)由于LAMP技术灵敏度高，由于目前国内大多数实验条件所限，LAMP实验多采用普通移液器和普通PCR管(板)或Eppendorf管等常规分子生物学耗材和设备，在配液、反应和点样过程中，很容易造成待检测样本气溶胶泄露至移液器枪管中，或因受热导致PCR管或EP管管盖密封不严导致待测样本泄漏致水浴锅、恒温箱或加样区域空气中，带来病原微生物等污染风险并导致后续LAMP实验结果假阳性率升高；(2)LAMP快速检测试剂盒的研发实验涉及到引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化，其实验结果仅通过肉眼观察定性结果是不够的，这就需要对实验结果进行量化分析，常用的分子生物学移液加样方法同样会增加病原微生物等泄露和污染风险，以及后续LAMP实验结果假阳性风险。
针对上述不足，需要提供一种结构简单，使用方便的LAMP加样反应容器，避免LAMP反应在配液和点样过程中病原微生物等气溶胶的泄露和污染，以及后续LAMP实验结果假阳性风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种LAMP加样反应容器及其使用方法，可有效避免LAMP反应在配液和点样过程中病原微生物等气溶胶的泄露和污染，以及后续LAMP实验结果假阳性风险。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
LAMP用加样反应容器包括加样器和反应器两部分，加样器由吸帽和吸管组成，吸管两端开口，其中一端与吸帽密封连接且相通；反应器由封闭部件、反应部分和加样部分组成，其中反应部分的两端为开放式结构，反应部分的一端开口与封闭部件活动连接，另一端开口与加样部分连通，加样器吸管能够从与反应器封闭部件活动连接的一端开口内适配插入，将加样器中的液体转移至反应器反应部分和/或加样部分内。
优选地，加样器的吸帽为乳胶材质，为了方便观察移液动作，避免误操作发生，吸管选用透明或半透明材质，优选透明有机玻璃或透明塑料材质；吸管整体为圆柱形或者吸管主体为圆柱形、末端为尖嘴，其中，优选吸管末端为尖嘴的设计，因为尖嘴嘴部与接触容器之间的接触面积较小可有效减少挂壁；另外，为满足LAMP常用反应体系的需要，吸帽和吸管的容积设计为30-80μl。
优选地，反应器反应部分包括圆柱形或圆台形颈部和反应部，其中所述颈部与封闭部件活动连接，所述反应部与加样部分连接。本领域技术人员可以理解，反应器封闭部件可以选用任意一种可与反应器颈部密封活动连接的部件。为确保密封效果，该封闭部件优选密封橡胶塞或密封乳胶塞等弹性部件，优选地，该封闭部件分两层，内层为密封橡胶塞或密封乳胶塞等弹性部件，外层为铝箔等加固部分，加固部分中央为可去除的供所述加样器吸管顺利通过的同心圆结构，加样器吸管能够从中适配插入并与其密封结合。使用时，只需将加固部分中央同心圆结构去除，将加样器吸管从中适配插入将液体转移至反应器反应部分和/或加样部分内，同时吸管与乳胶塞等弹性部件内层同心圆结构形成密封结合，该技术方案可有效减少气溶胶的泄露和污染。
为了增大LAMP反应液与反应部外壁接触面积，提高LAMP反应效率，反应器反应部分外壁呈弧形，反应器选用导热性能良好的材质，尤其是，为了方便观察移液动作，避免误操作发生，反应器优选透明导热塑料或透明有机玻璃材质，另外，为满足LAMP常用反应体系的需要，反应部分弧形反应部厚度为0.05-0.15mm，体积为50-200μl。
优选地，反应器加样部分分为缓冲区、刻度区、尾部，其中缓冲区、刻度区、尾部依序连接，且刻度区上设置有刻度，同时尾部的末端通过密封结构使尾部末端形成封闭式结构，避免加样部分内的液体随意流出。为了方便LAMP反应结束后定量检测点样，加样部分轴线与反应部分颈部轴线之间夹角为θ，30°≤θ≤90°，其中，优选夹角为直角的设计，直角的设计在进行加样时操作性更加友好。
为满足LAMP常用反应体系的需要，加样部分中间刻度区直径设计为1-2mm，体积为20-50μl；为了方便检测点样，加样部分密封尾部于刻度终止处设有可整齐去除的磨砂环或可移除的密封盖或密封塞。
本发明还公开了前述LAMP用加样反应容器的使用方法，包括如下步骤：1)取下反应器封闭部件，使用加样器吸取配制好的LAMP反应液，加样器吸管通过与反应器封闭部件活动连接的一端开口将配制好的LAMP反应液加入到反应器反应部；2)将反应器放入温控设备中进行LAMP反应，温控范围60℃-65℃，反应时间15min-60min；3)LAMP反应完毕后，将反应器加热至94℃-100℃，灭活反应液中活性物质；4)灭活完成后，取出反应器，观察荧光或浊度，进行定性判定；5)通过加样器向反应器中加入2-5μl上样缓冲液并混匀，通过加样部分加样电泳，定量分析LAMP反应产物。
采用上述加样器取代移液器可有效解决因使用移液器所造成的在前实验样本气溶胶对在后实验的影响，有效减少在后实验的假阳性率。
目前，实验室LAMP反应体系构建过程中用到的标准的加样器和反应容器组合为“移液器+吸头+PCR反应管”，由于在配液、反应和点样过程中，尤其是后续的电泳定量检测操作步骤中，需要反复打开PCR管盖，因此非常容易在移液器及环境中产生的气溶胶污染，从而造成在后反应的假阳性率增高。为此，本发明针对上述问题设计的LAMP专用加样反应容器，结构简单，使用方便，而且，本发明的反应部位和加样部为结合在一起最大程度上解决了LAMP反应容易造成环境和移液器气溶胶污染和在后实验假阳性率高的问题。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述
图1为本发明的结构示意图
具体实施方式
实施例1
以下将结合附图对本发明进行详细说明，在附图所提供的结构中标示了产品的具体长度、大小和规格，这仅仅是示意性的，并非对本发明构成特别限制。本领域技术人员在理解和掌握本发明实质精神的基础上所进行的改变、替换依旧属于本发明的保护范围。
如图所示：本发明分两部分，分别为加样器和反应器。
加样器用于吸取试剂加到反应器底部进行LAMP反应液配制或直接吸取已经配制好的LAMP反应液加入到反应器底部。吸帽1为乳胶材质，直径为6mm(π×R3≈3.14×33＝84.78＞25，)，吸管2为有机玻璃，直径为1mm，长度为40mm(π×R2×h≈3.14×0.5×0.5×40＝31.4＞25)。(注：1mm3＝1μl)
反应器用于LAMP溶液的反应。反应器分为3各部分，分别为封闭部件3-密封橡胶塞、反应部4及加样部5。密封胶塞为LAMP的封闭部件，为两层，内层为乳胶赛，直径为4mm，厚度为2mm。外层为铝箔加固部分，铝箔中央为可轻松去除的直径为2mm同心圆，加反应液前去除后加样器可通过；反应部分上下两部分，上部分为圆柱形，直径4mm，高度为8mm。下部分为球形，直径为6mm(π×R3≈3.14×33＝84.78＞25)；加样部5为圆柱形，直径1mm，长度为50mm。加样部5分三部分，中间部分为刻度区52，长度为32mm(π×R2×h≈3.14×0.5×0.5×32＝25.12≈25)，用于电泳鉴定时加样的定量。尾部53为可去除部位，于25μl处为磨砂环，稍用力可整齐去除，长度为10mm。反应部于刻度区之间部位设置缓冲区51，长度为8mm。
实施例2
LAMP用加样反应容器使用方法，包括如下步骤：
1)取下所述反应器封闭部件3，使用所述加样器吸取配制好的LAMP反应液，加样器吸管2通过与反应器封闭部件3活动连接的一端开口将配制好的LAMP反应液加入到反应器反应部，加样器吸管2与反应器封闭部件3活动连接的端口适配密封结合后保留在该端口上，或者移液完成后迅速将加样器吸管2移走灭活，同时迅速将反应器封闭部件3重新复位密封；
2)将反应器放入温度设置好的水浴锅中进行LAMP反应，温控：63℃，反应时间30min-60min，反应完毕后将反应器放入第二个水浴锅(94℃)中进行灭活5min；
3)取出灭活完成的反应器，在紫外线观察荧光或日光下观察浊度，进行定性判定；
4)如果需要进行电泳定量分析，用加样器向反应器中加入一定量的上样缓冲液，混匀，取下反应器中加样部分可去除密封尾部，直接加样进行电泳，定量分析LAMP反应产物。
Claims (4)
1.一种LAMP用加样反应容器，包括加样器和反应器两部分，所述加样器由吸帽（1）和吸管（2）组成，所述吸管（2）两端开口，其中一端与吸帽（1）密封连接且相通，所述反应器由依序连接的封闭部件（3）、反应部分（4）和加样部分（5）组成，其特征在于：反应部分（4）的两端为开放式结构，反应部分（4）的一端开口与封闭部件（3）活动连接，另一端开口与加样部分（5）连通，加样器吸管（2）能够从与反应器封闭部件（3）活动连接的一端开口内适配插入，将加样器中的液体转移至反应器反应部分（4）和/或加样部分（5）内，其中反应器的反应部分（4）中有一段外凸弧形部分，加样部分（5）为一段直管，加样部分（5）的末端为可移除的密封端，所述反应器采用透明导热塑料或透明有机玻璃材质，反应部分（4）与加样部分（5）之间形成夹角θ为30°≤ θ ≤ 90°，所述加样部分（5）的末端为密封盖或密封塞构成可移除的密封端（53），加样部分（5）设置有刻度。
2.根据权利要求1所述的LAMP用加样反应容器，其特征在于反应器的反应部分（4）与加样部分（5）之间形成夹角θ为90°。
3.根据权利要求1或2所述的LAMP用加样反应容器，其特征在于所述加样部分（5）的密封端（53）设有能够整齐去除的磨砂环。
4.如权利要求1-3任一项所述LAMP用加样反应容器的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取下所述反应器封闭部件（3），使用所述加样器吸取配制好的LAMP反应液，加样器吸管（2）通过与反应器封闭部件（3）活动连接的一端开口将配制好的LAMP反应液加入到反应器反应部，加样器吸管（2）与反应器封闭部件（3）活动连接的端口适配密封结合后保留在该端口上，或者移液完成后迅速将加样器吸管（2）移走灭活，同时迅速将反应器封闭部件（3）重新复位密封； 2）将反应器放入温控设备中进行LAMP反应，温控范围60℃-65℃，反应时间15min-60min；3）LAMP反应完毕后，将反应器加热至94℃-100℃，灭活反应液中活性物质；4）灭活完成后，取出反应器，观察荧光或浊度，进行定性判定；5）通过加样器向反应器中加入上样缓冲液并混匀，通过所述加样部分（5）加样电泳，定量分析LAMP反应产物。
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