CN104788375B - 8‑去氧刺乌头碱的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种8‑去氧刺乌头碱的分离方法，该方法包括如下步骤：（1）白喉乌头乙醇提取物用盐酸混悬，脱脂后调节pH至4，再用二氯甲烷萃取；（2）步骤（1）萃取后的二氯甲烷相过硅胶柱，用体积比为7:3:0.5的石油醚‑乙酸乙酯‑二乙胺混合液洗脱，收集洗脱液；（3）步骤（2）收集的洗脱液过硅胶柱，用体积比为8:2:0.5的石油醚‑乙酸乙酯‑二乙胺混合液洗脱，收集洗脱液；（4）步骤（3）收集的洗脱液浓缩至干，再用甲醇溶解，经高效液相色谱分离得到所述的8‑去氧刺乌头碱，色谱条件：波长252nm，流动相体积比为85:15:0.5的甲醇‑水‑三乙胺。得到的8‑去氧刺乌头碱为一新的天然产物，操作步骤简单。

Description

8-去氧刺乌头碱的分离方法
技术领域
本发明属于植物药成分提取领域，具体涉及从白喉乌头中分离纯化8-去氧刺乌头碱的方法。
背景技术
白喉乌头(学名：Aconitum leucostomum Worosch.)是草本植物，茎高约1米，基生叶约1枚，叶片形状与高乌头极为相似，叶柄长20-30厘米。总状花序长20-45厘米，有多数密集的花；基部苞片三裂，其他苞片线形，萼片淡蓝紫色，下部带白色，上萼片圆筒形，花丝全缘；心皮3，种子倒卵形，有不明显3纵棱，生横狭翅。7-8月开花。生海拔1400-2550米间山地草坡或山谷沟边。分布于哈萨克斯坦和中国新疆、甘肃。《哈萨克药志》记载白喉乌头具有祛风除湿、温经止痛的功能，用于风寒湿痹等疾患，为西北少数民族的常用民间草药之一。白喉乌头为剧毒药材，炮制后方能入药，其所含的乌头碱类成分，是抗炎镇痛的有效成分，因此，对白喉乌头中乌头碱类化合物的分离纯化对于其药物研究具有积极的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从白喉乌头中分离纯化8-去氧刺乌头碱的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
8-去氧刺乌头碱的分离方法，包括如下步骤：
(1)白喉乌头乙醇提取物用盐酸混悬，脱脂后调节pH至4，再用二氯甲烷萃取；
(2)步骤(1)萃取后的二氯甲烷相过硅胶柱，用体积比为7:3:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，收集洗脱液；
(3)步骤(2)收集的洗脱液过硅胶柱，用体积比为8:2:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，收集洗脱液；
(4)步骤(3)收集的洗脱液浓缩至干，再用甲醇溶解，经高效液相色谱分离得到所述的8-去氧刺乌头碱，色谱条件：波长252nm，流动相体积比为85:15:0.5的甲醇-水-三乙胺。
进一步，步骤(1)中所述白喉乌头乙醇提取物由白喉乌头经乙醇浸提得到。
进一步，所述盐酸的浓度为1-5wt％。
进一步，步骤(1)中混悬液用石油醚萃取脱脂。
进一步，步骤(4)采用制备型高效液相色谱进行分离。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
(1)取白喉乌头根(20.0kg)，粉碎(过20目筛)，95wt％乙醇冷浸提取3次，每次7天，合并提取液，经薄膜蒸发器浓缩后得到白喉乌头乙醇提取物。所得的白喉乌头乙醇提取物再用浓度为2wt％HCl混悬，用石油醚萃取脱脂，脱脂后剩余的水相用氨水调pH至4，再二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，得PH4部位。
(2)所得PH4部位拌样过硅胶(200～300目)柱色谱，用体积比为7:3:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，流速为20ml/min，以每次收集1000ml计，将第3～24次收集的洗脱液合并。
(3)将步骤(2)合并的洗脱液再次过硅胶(200～300目)柱色谱，用体积比为8:2:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，以每次收集500ml计，将第6～8次收集的洗脱液合并，浓缩至干，再用甲醇溶解，配制成50mg/ml溶液，再用高效液相色谱分离(制备HPLC，色谱柱：YMC-Pack ODS-A(5μm,内径：250×30mm))得到化合物WF-12(18mg)，色谱条件为：检测波长252nm，流动相体积比为85:15:0.5的甲醇-水-三乙胺。
化合物(WF-12)的结构鉴定
白色粉末，碘化铋钾反应呈阳性。mp.195～197℃。ESI/MS给出分子离子峰m/z:568[M]+，根据氮规则，推断该化合物中含有偶数个氮原子，结合核磁数据，推断其分子式为C32H44N2O7。计算其不饱和度为12。IR光谱显示有一邻二取代芳环(1619,1590,1562,753cm-1)和一个羟基(3470cm-1)的信号。
13C NMR显示了共32个碳信号的存在；5个含氧取代信号为75.64(C-9),78.53(C-16),82.87(C-1),84.15(C-4),90.12(C-14)，其中，3个甲氧基(δH 3.42,3H,s,δH 3.32,6H,s)，分别与C1、C14、C16存在相关峰；1H NMR谱显示有1个氮乙基1.17(3H，t，J＝17Hz，N-CH2CH3)信号。1H NMR信号δH:7.03、7.51(各1H,td,J＝7.5,1Hz,Ar-H),7.92(1H,dd,J＝7.5、1Hz,Ar-H),8.67(1H,d,J＝8.5Hz,Ar-H)也显示了邻二取代芳环的存在；1H NMR信号δH11.05(brs,1H)结合质谱，提示-NH的存在，且HMBC谱显示其和δ169.05的碳信号相关及芳环δ141.65的碳信号相关；一羰基碳信号167.41与芳环质子8.67相关；δH 2.23与羰基碳信号δ169.05相关，以上数据说明邻取代乙酰氨基苯甲酰的存在。碳谱信号在高场区给出了18个碳的信号，再结合以上波谱数据，说明该化合物为C18-二萜生物碱，与刺乌头碱(Lappaconitine)的结构类似，只是在其8位上少一个羟基。因此，该化合物鉴定为8-去氧刺乌头碱(8-deoxylappaconitine)，为新的天然产物，结构式如下：
多键碳氢关系(HMBC)如下：
ESI/MS([M]+,m/s 568)。IR㎝-1：3470(OH),3367(NHCOCH3),1716(C＝O),1689(C＝O),1619,1590,1562,753,(邻二取代芳环),1243,1123,1095(C-O)；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ:1.17(3H，t，J＝17Hz，N-CH2 CH 3 )，2.23(3H,s,NHCOCH 3 ),3.32(6H,s,2×-OCH 3 ),3.42(3H,s,-OCH 3 ),3.45(1H,d,J＝4.5Hz,14-βH),7.03、7.51(各1H,td,J＝7.5、1Hz,Ar-H),7.92(1H,dd,J＝7.5、1Hz,Ar-H),8.67(1H,d,J＝8.5Hz,Ar-H),11.05(1H,brs,NH)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:13.53(C-22),24.11(C-12),25.56(COCH 3 ),26.22(C-2),26.78(C-6),31.82(C-3),31.82(C-8),36.29(C-13),44.88(C-7),47.54(C-15),48.53(C-5),49.03(C-21),49.78(C-10),50.95(C-11),55.52(C-19),56.14(C-16'),56.56(C-14'),57.94(C-1'),61.54(C-17),75.64(C-9),78.53(C-16),82.87(C-1),84.15(C-4),90.12(C-14),115.73(C-1"),120.21(C-3"),122.32(C-5"),131.07(C-6"),134.40(C-4"),141.65(C-2"),167.41(ArCO),169.05(COCH3)。

Claims (5)

1. 8-去氧刺乌头碱的分离方法，包括如下步骤：
（1）白喉乌头乙醇提取物用盐酸混悬，脱脂后调节pH至4，再用二氯甲烷萃取；
（2）步骤（1）萃取后的二氯甲烷相过硅胶柱，用体积比为7:3:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，以每次收集1000 ml计，收集第3～24次收集的洗脱液；
（3）步骤（2）收集的洗脱液过硅胶柱，用体积比为8:2:0.5的石油醚-乙酸乙酯-二乙胺混合液洗脱，以每次收集500 ml计，收集第6～8次收集的洗脱液；
（4）步骤（3）收集的洗脱液浓缩至干，再用甲醇溶解，经高效液相色谱分离得到所述的8-去氧刺乌头碱，色谱条件：波长252nm，流动相 体积比为85:15:0.5的甲醇-水-三乙胺。
2.根据权利要求1所述8-去氧刺乌头碱的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述白喉乌头乙醇提取物由白喉乌头经乙醇浸提得到。
3.根据权利要求1所述8-去氧刺乌头碱的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述盐酸的浓度为1-5wt%。
4.根据权利要求1所述8-去氧刺乌头碱的分离方法，其特征在于，步骤（1）中混悬液用石油醚萃取脱脂。
5.根据权利要求1所述8-去氧刺乌头碱的分离方法，其特征在于，步骤（4）采用制备型高效液相色谱进行分离。
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