CN104784464A - 一种中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物及在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用，所述中药组合物由如下质量配比的原料组成：仙灵脾1份、党参1～5份、黄芪1～5份、丹参1～5份、当归1～5份、熟地1～5份、麦冬1～5份、广地龙1～5份、桔梗1～5份和甘草1～5份；本发明中药组合物能有效防治肺血管新生及重构，有效减轻气道重塑；在长期的临床经验中发现此方有较好的镇咳、祛痰、抗炎，预防肺气肿、肺心病，改善体质、生活质量的作用；无咽喉不适、声嘶、口咽部念珠菌感染、皮疹、接触性皮炎等副反应。

Description

一种中药组合物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种中药组合物，特别涉及一种用于治疗慢性阻塞性肺病的中药组合物及其应用。

(二)背景技术

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是中老年人群的常见病和多发病，因病死率高，社会经济负担繁重，已成为人类继心血管疾病、肿瘤、中风之后第四大死亡原因，预计到2020年将上升为第三位。

现代医学认为，COPD是一种气流受限持续存在的，呈进行性发展的肺部疾病。其主要病理基础即小气道的重塑。大多数观点认为，小气道的重塑与慢性炎症的反复刺激密切相关。主要病理改变为呼吸道粘膜-纤毛排送系统受损，并发生鳞状上皮化生，粘膜下腺体增生肥大和浆液性上皮发生粘液腺化生，导致粘液分泌增多；管壁充血水肿，淋巴细胞、浆细胞浸润；管壁平滑肌断裂、萎缩，软骨变形、萎缩。

近些年来，又有专家学者提出新生血管机制，认为人体气道的血管系统具有较强的可塑性和延伸性。指出气道在有毒有害物质、感染等各种因素刺激下，会增加血管壁通透性和体液的渗出，从而引起气道管壁结构的变化，包括气道上皮组织化生、基底膜增厚、粘膜下新血管的形成、血管重塑等，进一步导致气管壁增厚、气道狭窄而气流受限。

治疗上，现代医学首选采用氧疗、支气管扩张剂、糖皮质激素或抗炎等治疗为主。虽然目前吸入制剂有了较大程度的研发，能选择不同类型的药物及剂量来满足不同疾病程度的患者，但有部分患者使用不当，且某些制剂长期使用后的局部及全身作用尚不明确，另其对于改善患者体质，减少急性发作方面的作用仍然欠佳，因此如何寻求中医中药来控制疾病发展，延缓肺功能下降及呼吸衰竭已成为呼吸系统疾病诊治的研究热点。

COPD从中医来说，可归属于“咳嗽”、“喘证”、“肺胀”等范畴。肺者，相傅之官，主人体呼吸运动的调节、一身气机的升降及津液的代谢。若肺系疾患迁延失治，日久可致肺气亏虚，升降不利，子耗母气，则脾失健运，肺脾两虚。肺为气之主，肾为气之根，若久病肺虚及肾，金不生水，致肺脾肾三脏虚损，病久进而由气病及血，由肺及心。同时，在疾病进展过程中，由于肺虚久病，卫外不固，六淫外邪每易乘袭，诱使本病急性发作；肺虚不能化津，脾虚不能转输，肾虚不能蒸化，致痰浊潴留；久延阳虚阴盛，气不化津，痰从阴化为饮为水留于上焦；肺虚不能治理心血运行，加之肺脾气虚，气不摄血，故血脉不利而生瘀血。即外邪、痰浊、水饮、瘀血等病理产物相互搏结，阻塞气道，可导致肺气郁滞、肺失通降。因此，COPD的病机总是脾肺肾三脏脏气的亏损和痰瘀阻滞。缓解期以补肺、健脾、益肾为主，急性期则以温化痰饮、活血祛瘀为主，均需标本兼治。

近十余年，中医中药从现代药理研究出发，结合其“辨证论治”、“整理观念”的特色出发，以实验为基，临床为验，进行了大量COPD气道重塑的研究，展示了良好的前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种疗效肯定、性效稳定，质优价廉、应用广泛的，可用于缓解期慢性阻塞性肺疾病患者的药物，以此调理体质，减少其急性发作次数，延缓肺功能下降及呼吸衰竭的中药组方，以及此方在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种中药组合物，所述中药组合物由如下质量配比的原料组成：仙灵脾1份、党参1～5份、黄芪1～5份、丹参1～5份、当归1～5份、熟地1～5份、麦冬1～5份、广地龙1～5份、桔梗1～5份和甘草1～5份。

更进一步，本发明最优选所述中药组合物由如下质量配比的原料组成：仙灵脾1份、党参3份、黄芪3份、丹参1.5份、当归1.2份、熟地1.5份、麦冬1.2份、广地龙1.5份、桔梗1份和甘草0.6份。

本发明还涉及一种所述中药组合物在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用。

进一步，所述药物的剂型为下列之一：(1)颗粒剂、(2)片剂、(3)口服液或(4)胶囊剂。

进一步，所述中药组合物的用量为8g生药量/kg体重。

本发明所述中药组合物按下述方法制成颗粒剂：将配方量的原料加水浸没，室温(25℃)浸渍0.5～1小时，煎煮2次，每次1～2小时，合并两次煎煮液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.12，冷却后加无水乙醇至乙醇体积含量为60％，充分搅拌，4℃冷藏静置至析出沉淀，通常静置12小时以上，优选12－72小时，取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度为1.34～1.40，获得清膏，取清膏加入质量为清膏质量1.5～2.0倍的淀粉，搅匀、制粒、干燥、整粒，混匀，即得所述颗粒剂。

本发明配方中以黄芪、党参为君。前者甘温，善入脾胃，为补中益气之要药；后者性味甘平，善健运中气，润肺生津。两药配伍，相须为用，大补脾肺之气。熟地甘微温，入肝肾而功专养血滋阴，填精益髓，为养血补虚之要药。当归甘辛温，长于补血和血，为补血之圣药。麦冬味甘柔润，长于养阴生津。这三味药同为甘润之品，合用善滋养肺肾之阴血，再配伍辛甘之仙灵脾，兼顾阴阳，共为臣药。“一味丹参，功同四物”，丹参性微寒而缓，善祛瘀生新，配合搜风走窜之虫类药地龙，有通行剔络之效。此外，丹参、当归配伍黄芪、当归等补气活血药，正符合“气虚血瘀”之本。桔梗辛散苦泄，为肺部之引经，其与甘草合用，乃仲景桔梗汤，善利咽止咳，配合“主咳逆上气”之当归，宣肺、利咽、止咳之效更加，为佐药。甘草味甘，善入中焦，能“助参芪成气虚之功”，此处甘草主要乃调和药性之用。

结合现代药理学显示：黄芪具有增强单核巨噬细胞吞噬活性、促进自然杀伤细胞释放免疫活性物质及诱生干扰素、白介素等来达到抗菌作用；党参能降低血粘度、抑制血栓形成，能明显对抗常压缺氧、明显延长小鼠存活时间及能增强巨噬细胞吞噬力。熟地具有强心、利尿、抗真菌、抗炎、抗缺氧等作用。当归抑制血小板聚集、抗血栓，增强动物腹腔巨噬细胞吞噬功能。麦冬能增强网状内皮系统吞噬能力、垂体肾上腺皮质系统作用及，耐缺氧能力，提高机体免疫力及适应性。仙灵脾具有镇咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒、抗炎、抗缺氧等多种作用。丹参能显著延长小鼠耐缺氧时间，抑制血小板聚集，并具有抗菌作用。桔梗、甘草均具有镇咳、祛痰、抗炎、解热等作用。

诸药配伍，此方被称为保肺定喘汤，系由浙江省中医院国家级名老中医王会仁主任所创。它能较好的补益脾肺肾三脏，并能兼顾痰、瘀等病理产物。这十分符合慢性阻塞性肺疾病“脾肺肾亏虚”的本和“痰、瘀”等病理产物阻滞的标。即肺气不利、痰瘀互结，从而引起气流阻塞、气道增厚、微循环紊乱，这与现代医学的气流受限、血管新生、气道重塑似乎不谋而合。因此可用此方益气活血、行滞通络，兼顾脾肾、清肺化痰，使气行血行，痰瘀同化，最终达到扶正固本、祛邪通络的作用。

本发明所述的中药组合物(即保肺定喘汤)有益效果主要体现在：(1)能有效防治肺血管新生及重构；(2)能有效减轻气道重塑；(3)在长期的临床经验中发现此方有较好的镇咳、祛痰、抗炎，预防肺气肿、肺心病，改善体质、生活质量的作用；(4)无咽喉不适、声嘶、口咽部念珠菌感染、皮疹、接触性皮炎等副反应。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

(1)中药原料配方：黄芪30g、党参30g、熟地15g、当归12g、麦冬12g、仙灵脾10g、丹参15g、广地龙15g、桔梗10g、甘草6g。

(2)浸膏：将配方量的中药原料加水浸没，室温浸渍0.5-1小时，煎煮2次，每次1小时，合并两次煎煮液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.12，冷却后加无水乙醇至乙醇体积含量为60％，充分搅拌，4℃冷藏静置12小时以上至沉淀析出，取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度为1.34～1.40，获得保肺定喘汤浸膏。

实施例2：镇咳、祛痰、抗炎作用的实验研究

一、实验方法：

1.分组与给药：

选取50只ICR小鼠，随机分为5组(大剂量组、中剂量组、小剂量组、对照组和空白组)，每组10只：大、中、小剂量组分别予实施例1方法制备的浸膏16g/kg、8g/kg、4g/kg灌胃qd；对照组予桂龙咳喘宁胶囊(购自华东医药股份有限公司)1.3g/kg灌胃qd；空白组予生理盐水2g/kg灌胃qd。

2.试验内容：

(1)小鼠镇咳试验：试验前3天给药，末次给药半小时后将小鼠置于玻璃钟罩内，用WM-2型空气压缩泵通过玻璃喷雾头以400mmHg恒压将25％的氨水均匀喷入钟罩内，持续4秒钟后停止，继续观察2分钟，观察指标为开始咳嗽时间(咳嗽潜伏期)、2分钟内咳嗽次数及咳嗽抑制率。公式：咳嗽抑制率＝[(空白组咳嗽次数-受试组咳嗽次数)÷空白组咳嗽次数]×100％。

(2)小鼠酚红祛痰试验：实验前24小时禁食不禁水。给药半小时后，腹腔注射5g/dl酚红生理盐水0.1ml/10g，总量为500mg/kg。半小时后脱颈处死，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分叉处的一段气管，放入盛有2ml生理盐水的试管中浸洗半小时，再加质量浓度10％NaOH水溶液0.1ml，用721型分光光度计在波长546nm处测光密度(OD)值，根据标准曲线计算酚红含量(μg/ml)。所述标准曲线是将酚红用蒸馏水配制成每毫升含酚红100μg的溶液，然后依次稀释，分别配制成每毫升含1、2、3、4、5、6、7、8、9μg酚红的溶液，在546nm处测光密度(OD)值，以酚红浓度为横坐标，以OD值为纵坐标制备的标准曲线。

(3)小鼠耳肿胀试验：实验前3天给药，末次给药1小时后，左耳涂二甲苯20μl/只，15分钟后脱颈处死，取左、右耳片用电子天平精密称取重量，计算肿胀度。公式：耳肿胀度(mg)＝左耳片重量(mg)-右耳片重量(mg)。

二、实验结果

1.镇咳作用：保肺定喘汤大剂量组和桂龙咳喘宁组2分钟内咳嗽次数明显减少，与空白组比较有显著性意义(P<0.05)，但保肺定喘汤3个剂量组及桂龙咳喘宁组的咳嗽潜伏期与空白组比较无显著性差异(P>0.05)；保肺定喘汤3个剂量组和桂龙咳喘宁组比较同样无显著性差异(P>0.05)(见表1)。

表1 各组的镇咳效果

注：与空白组比较，^△P<0.05

2.祛痰作用：保肺定喘汤大剂量组、桂龙咳喘宁组酚红祛痰作用明显优于空白组(P<0.05-0.01)，但中、小剂量组与空白组无显著性差异(P>0.05)(见表2)。

表2 各组的祛痰效果

注：与空白组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01

3.小鼠耳肿胀度的影响：保肺定喘汤大剂量组、中剂量组的耳肿胀度与空白组比较明显减轻(P<0.05)，其余各组与空白组比较无显著性差异(P>0.05)。

表3 各组小鼠耳肿胀度的变化

注：与空白组比较，^△P<0.05,与桂龙咳喘宁组比较也无显著性差异(P>0.05)

三、结论：

保肺定喘汤治疗组2分钟咳嗽次数减少、酚红分泌量增加和耳肿胀抗炎指标均明显优于空白组，表明保肺定喘汤具有镇咳、祛痰及较强的抗炎作用。由于药物组成的不同，保肺定喘汤的即刻止咳祛痰作用略不及桂龙咳喘宁，但抗炎作用明显优于后者，由此推测其长期止咳祛痰作用将会明显增强。

实施例3：对肺气肿大鼠病理的影响

一、材料与方法

1.造模：

采用双因素刺激造模。将大鼠置入一固定木箱中，每日予200ppmSO₂气体定量刺激，3min/d，共15天，造成慢支模型。然后再将大鼠置入与超声雾化器相连的玻璃钟罩内，通过雾化管向钟罩内喷入0.5％木瓜蛋白酶溶液(生理盐水稀释)10ml，隔日1次，共5次。停止刺激后继续观察，至第50天处死大鼠。

2.分组与给药：

取健康SD大鼠60只，体重180±20g，雌雄各半。随机分成六组，即健康组、模型组、保肺定喘汤高、中、低剂量组、桂龙咳喘宁组，每组10只。健康组正常饲养，其余五组于SO₂刺激结束后开始给药。健康组、模型组给常水，保肺定喘汤高、中、低剂量组(实施例1制备)给药浓度分别为12.4g/kg、6.2g/kg、3.1g/kg，桂龙咳喘宁组给药浓度为1.5g/kg。每日1次，每次<3ml，灌胃喂服，共25天。

3.检测指标：

(1)肺总容量/体重比、肺灌注后排除/灌注体积比：戊巴比妥钠腹腔麻醉，打开胸腔，取出肺脏，通过气管插管常压下向肺脏恒压缓慢注入10％甲醛溶液，以肺脏不再增大为止，记录肺总容量(TVL)，排出、灌入量，观察常压下肺弹性回缩力。

(2)单位面积肺泡数和平均肺泡面积：将肺脏放入10％福尔马林液中固定，应用图文分析仪观察每例肺切片。每例标本选2个切片，每切片取5个视野，以10个视野的单位面积肺泡数和平均肺泡面积的均值作为该标本的相应指标。单位面积肺泡数＝肺泡数/视场面积×106；平均肺泡面积＝目标总面积/肺泡数(单位：μm²)。

(3)血浆内皮素(ET-1)测定：摘眼球取血3ml，离心沉淀，分离血清，进行放射免疫法直接测定。

(4)病理形态观察：每组大鼠随机取3只肺脏，经10％福尔马林固定6小时，95％、100％酒精各脱水2次，分别为1小时和30min。二甲苯透明20min，浸蜡60℃4小时，切片厚4μm，HE染色，光镜下观察肺病理变化，并作图像比较。

二、实验结果：

1.肺容量(TVL)/体重比、肺灌注后排除/灌注体积比：

保肺定喘汤各剂量组TVL/体重比减小，肺灌注后排除/灌注体积比增大，与模型组比较，差异有显著性意义，与健康组比较差异无显著性(见表4)。

表4 TVL/体重比、肺灌注后排除/灌注体积比

与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与健康组比较，*P<0.05

2.各组大鼠单位面积肺泡数和平均肺泡面积结果：

保肺定喘汤各剂量组大鼠单位面积肺泡数增加，平均肺泡面积减少，与模型组比较差异有显著性意义；与健康组比较虽有改变倾向，但无统计学意义(见表5)。

表5 各组大鼠单位面积肺泡数和平均肺泡面积

与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01

3.各组大鼠血浆ET-1测定结果：

实验前各组间ET-1测定差异无显著性意义，实验后保肺定喘汤各剂量组明显低于模型组，但各药物组较健康组仍明显增高(见表6)。

表6 各组大鼠给药前后血浆ET-1含量

与模型组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与健康组比较，*P<0.05，**P<0.01

4.各组大鼠病理形态观察结果：

大体解剖见健康组大鼠肺脏红润，弹性好，表面光洁。模型组大鼠肺脏颜色灰白，体积膨大，表面有肋痕。各药物治疗组大鼠肺脏介于健康组和模型组之间。其中保肺定喘汤高、中剂量组较接近健康组，低剂量组大鼠肺脏颜色变淡，体积较大。镜下见健康组大鼠肺泡壁完整，大小基本正常，偶见泡腔融合，肺组织间有少量炎性细胞浸润；模型组大鼠肺泡间隔断裂，泡腔融合，肺泡明显增大；并可见气管内大量炎症细胞浸润。模型组死亡大鼠可见肺泡内充血、出血、水肿、泡腔融合；各药物组的病理改变介于两者之间，其中以保肺定喘汤高、中剂量组较接近于健康组，可见肺泡壁基本完整，大小正常，中间有少量的肺泡间隔断裂，有部分炎症细胞浸润；低剂量组的肺泡间隔断裂较高、中剂量组明显增加，泡腔融合明显，炎症细胞浸润较为明显。桂龙咳喘宁组的病理形态介于三个药物组之间。

三、结论：

保肺定喘汤能明显改善致模因素对大鼠肺脏造成的病理损害，其治疗肺气肿的作用机理，可能与增强机体免疫力、降低血粘度、改善肺局部血液循环、抑制炎性渗出等有关，这可能与ET-1的拮抗作用相关。

实施例4：对肺心病大鼠病理形态学影响的实验研究

一、材料与方法

1.分组：

健康成年雄性SD大鼠60只，随机分为6组：正常对照组、模型组、保肺定喘汤高、中、低剂量组和硝苯地平组，每组10只。

2.造模与给药：

用乙醇和生理盐水混合液配1％MCT溶液，按60mg/kg体重腹腔注射1次造模，正常对照组则给予同等剂量乙醇和生理盐水混合液。造模后第2天开始灌胃，空白组、模型组每天生理盐水灌胃8mL/kg，保肺定喘汤高、中、低剂量组(实施例1制备)每天给药量分别为12.4g/kg、6.2g/kg、3.1g/kg，硝苯地平组每天剂量10mg/kg，每只大鼠每天均灌胃2次，连续给药28天，在末次给药后1h采集标本。

3.检测指标：

RV和LV+S重量，计算右心肥厚指数(RV/LV+S)，右下肺行HE染色、Masson染色及免疫组织化学染色观察肺小动脉病理改变。

二、结果：

1.右心肥厚指数：

模型组大鼠右心肥厚指数比正常对照组明显增加，各治疗组右心肥厚指数与模型组比较均明显降低(见表7)。

表7 各组大鼠右心肥厚指数比较

注：与正常对照组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01

2.病理形态学的变化：

(1)HE染色图像分析：光镜下见模型组肺小动脉管腔变小、不规则，部分呈裂隙状，平滑肌细胞增生肥厚明显，内皮细胞变性肿胀，突向血管腔内，甚至坏死脱落，各治疗组大鼠肺小动脉血管壁较正常对照组稍增厚、管腔略有变窄，模型组与正常对照组比较肺小动脉管壁增厚，管腔狭窄，WT％、WA％均明显增大，LA％则明显减小；各治疗组均能在一定程度上减轻肺血管重构，其中硝苯地平组和保肺定喘汤高剂量组尤为明显，与正常对照组无差异，但各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表8)。

表8 各组大鼠肺动脉WT、WA、LA比较

注：与正常对照组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：**P<0.01。

(2)Masson染色结果图像分析：正常对照组胶原纤维少量表达，分布在血管、气管的基底膜及其周围，模型组胶原纤维表达弥漫性增加，血管壁内增加则尤为明显；各治疗组胶原纤维表达与模型组比较均有所减少。各组大鼠肺小动脉管壁胶原纤维占总面积百分比结果比较见表9，模型组血管壁内胶原纤维百分比表达显著增加；各治疗组与模型组比较其胶原纤维百分比均有不同程度降低，但仍高于正常对照组，各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表9)。

表9 各组大鼠肺小动脉管壁胶原纤维百分比结果比较

注：与正常对照组比较：^△△P<0.01；与模型组比较**P<0.01

(3)免疫组化A-SMA图像分析：光镜下见正常对照组在肺小动脉管壁内A-SMA阳性细胞少量表达；模型组大鼠肺血管壁内A-SMA阳性细胞表达明显增加，而且在肺组织的实质内亦可见散在分布A-SMA阳性细胞；各治疗组肺血管壁内A-SMA阳性细胞表达较模型组明显减少。各组大鼠肺小动脉管壁内A-SMA平均光密度比较见表4，模型组大鼠肺血管壁内A-SMA平均光密度比正常对照组显著增加；各治疗组与模型组相比其血管壁内ASMA平均光密度均有不同程度的降低，但各治疗组仍高于正常对照组，各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表10)。

表10 各组大鼠肺小动脉管壁α-SMA平均光密度比较

注：与正常对照组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01

三、结论：

1.保肺定喘汤能明显减轻肺心病大鼠的肺血管重构，从而有效降低肺动脉压，改善右心功能，其作用机制可能与抑制A-SMA和胶原纤维在肺小动脉管壁内的表达有关。2.根据中医“气血学说”及“从瘀论治”的观点，保肺定喘汤在防治呼吸系统疾病导致的肺血管重构方面可能有深远意义。

实施例5：对大鼠肺心病防治作用的实验研究

一、材料与方法：

1.造模：健康成年雄性SD大鼠60只，随机分为6组，即正常对照组，模型组，保肺定喘汤高、中、低剂量组和硝苯地平组，每组10只。用乙醇和生理盐水混合液配制1％MCT溶液一次性腹腔注射造模，正常对照组则给予同等剂量乙醇和生理盐水混合液。

2.给药：

造模后第2天开始灌胃，空白组、模型组每天生理盐水灌胃8ml/kg，保肺定喘汤高、中、低剂量组(实施例1制备)每天给药量分别为12.4g/kg、6.2/kg、3.1g/kg，硝苯地平组每天剂量10mg/kg，每只大鼠每天均灌胃两次，连续给药28天，在末次给药后1小时采集标本。

3.检测指标：

(1)右心肥厚指数测定：心脏置于10％中性甲醛溶液中固定1周，称取右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)的重量，并以RVP(LV+S)比值作为右心肥厚指数。

(2)血浆ET-1、TXB2、6-keto-PGF1A水平测定:采用放免法测定。

(3)血清NO含量测定：酸还原酶法测定。

(4)肺组织ET-1mRNA表达的测定每组随机选取8个标本，采用RT-PCR检测。

(5)肺小动脉观察：取右下肺置于10％中性甲醛溶液中固定1周，HE染色。病理图文分析系统采集图像，测量肺小动脉管壁厚度、血管直径、管腔面积、血管总面积，然后计算管壁厚度与血管半径百分比WT(％)、管壁面积与血管总面积百分比WA(％)、管腔面积与血管总面积百分比LA(％)。

二、实验结果：

1.各组大鼠右心肥厚指数、血TXB2、6-keto-PGF1A、ET-1水平、NO含量及肺组织ET-1mRNA表达的比较(见表11)：

表11 各组大鼠右心肥厚指数、血TXB2、PGF及NO、ET-lmRNA表达的比较

注：与正常对照组比较：^△P<0.05,^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01

2.各组大鼠肺小动脉病理形态学的变化：正常组大鼠肺小动脉管壁菲薄，内皮细胞扁平连续，厚薄较一致。模型组在细支气管周围或其它部位的小动脉管腔变小、不规则，部分呈裂隙状，平滑肌细胞增生肥厚明显，内皮细胞变性肿胀，突向血管腔内，甚至坏死脱落。各治疗组大鼠肺小动脉血管壁稍增厚、管腔略有变窄(见表12)。

表12 各组大鼠肺小动脉WT％、WA％、LA％测定结果的比较

注：与正常对照组比较：^ΔP<0.05,^ΔΔP<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01

三、结论：

1.保肺定喘汤则能逆转NO和ET-1这对血管舒缩调节因子平衡的失调，从而改善肺血管的舒缩功能。

2.保肺定喘汤则能调节TXB2和6-keto-PGF1A的水平，以维持血管张力和血小板正常生理功能，进而改善血液的高凝状态，防止肺血管内原位血栓的形成。

3.保肺定喘汤能抑制肺组织ET-1mRNA生成与表达，降低右心肥厚指数，减轻肺血管重构，从而降低肺动脉压，在一定程度上防治肺心病。

实施例6：对慢性阻塞性肺疾病大鼠VEGF表达的影响

一、实验方法：

1.分组：

将40只健康雄性SD大鼠，随机分为4组，即正常对照组、模型组、保肺定喘汤预防组和治疗组，每组10只。

2.造模：

正常对照组每天在自制吸烟染毒箱内以相同时间呼吸正常空气，并于造模第1、28天每只大鼠气道内滴入0.2mL生理盐水。3组COPD模型大鼠在自制吸烟染毒箱内被动吸烟30支(绿西湖香烟)，每天2次，每次间隔10h，共70天；造模第1、28天每只大鼠气道内滴入脂多糖(LPS)0.2mL。

3.用药：

保肺定喘汤预防组和治疗组分别从造模前7天、造模第29天开始每日胃饲受试药物(实施例1制备的浸膏)9.3g/kg，加生理盐水配制成2mL；正常对照组及模型组每日胃饲2mL的生理盐水。

4.标本处理：

实验结束后断颈处死大鼠，取右下叶肺组织用10％甲醛固定，分别作HE染色、Masson三色染色和免疫组化检测。右肺中叶放入管液氮速冻，将予提取总RNA，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGFmRNA的表达。

二、结果：

1.病理形态学检测：

(1)各组大鼠单位面积肺泡数和平均肺泡面积：模型组大鼠单位面积肺泡数明显减少，平均肺泡面积显著增大；保肺定喘汤预防组和治疗组平均肺泡面积比模型组明显减小，但仍比正常对照组显著扩大(见表13)。

表13 各组大鼠单位面积肺泡数和平均肺泡面积

注：与正常对照组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01

(2)各组大鼠基底膜单位长度管壁厚度：模型组大鼠中小气道管壁增厚明显；保肺定喘汤预防组进行早期干预后可以明显抑制中小气道管壁的增厚，而保肺定喘汤治疗组对中等气道管壁的增厚已有明显抑制作用，但对小气道管壁增厚无明显抑制作用(见表14)。

表14 各组大鼠基底膜单位长度管壁厚度(WAt/Pbm)

注：与模型组比较：^△△P<0.01

2.Masson染色

Masson染色可见模型组中小气道和肺动脉胶原较正常对照组明显增多，保肺定喘汤预防和治疗两组则可明显抑制中小气道胶原的增加(见表15)。

表15 各组大鼠基底膜单位长度胶原面积(WAt/Pbm)

注：与模型组比较：^△P<0.05,^△△P<0.01；与正常对照组比较，*P<0.05

3.免疫组化VEGF蛋白质表达

模型组在中、小气道和肺动脉VEGF蛋白质表达较正常对照组明显增高；中药干预两组在中、小气道VEGF蛋白质表达与正常对照组相比无明显差异，在肺动脉VEGF蛋白质表达较正常对照组明显增高，而与模型组相比在中、小气道和肺动脉VEGF蛋白质表达均减低(见表16、17)。

表16 各组大鼠中小气道VEGF免疫组化阳性面积占管壁面积的百分数

注：与模型组比较：^△P<0.05,^△△P<0.01

表17 各组大鼠肺动脉VEGF免疫组化阳性面积占管壁面积的百分数

注：与模型组比较：^△P<0.05,^△△P<0.01；与正常对照组比较**P<0.01

4.支气管肺组织VEGFmRNA基因表达检测

与正常对照组相比，模型组支气管肺组织VEGFmRNA表达显著增高。运用中药保肺定喘汤进行干预治疗则可明显减低VEGFmRNA的表达，效果以保肺定喘汤预防组更为理想，与正常对照组相比，保肺定喘汤预防组VEGFmRNA表达无显著增高；而保肺定喘汤治疗组较正常对照组VEGFmRNA表达明显增高(见表18)。

表18 各组大鼠支气管肺组织VEGF mRNA吸光度比值

注：与模型组比较：^△△P<0.01；与正常对照组比较*P<0.05

三、结论：

保肺定喘汤具有一定的减轻气道重构的作用，其机制可能与减低VEGF的表达有关。

实施例7：对野百合碱诱发肺血管重构大鼠VEGF表达影响

一、材料与方法：

1.分组：健康成年雄性SD大鼠60只，随机分为6组：正常对照组、模型组、保肺定喘汤高、中、低剂量组和硝苯地平组，每组各10只。

2.造模：用乙醇和生理盐水混合液配1％MCT溶液，按60mg/kg体重腹腔注射1次造模。

3.用药：正常对照组则给予同等剂量乙醇和生理盐水混合液。造模后第2天开始灌胃，空白组、模型组每天生理盐水灌胃8mL/kg，保肺定喘汤高、中、低剂量组每天给药量分别为12.4g/kg、6.2g/kg、3.1g/kg，硝苯地平组每天剂量10mg/kg，每只大鼠每天均灌胃两次，连续给药28天，在末次给药后1h采集标本。

4.检测指标：

(1)血清VEGF测定：采用ELISA法测定血清中VEGF水平。

(2)RT-PCR测定肺组织VEGFmRNA表达：每组随机选取8个标本，提取右肺中叶总RNA，RT-PCR检测VEGFmRNA的表达，扩增产物为694bp，每一样本以基因B-actin作为内参照，电泳结果用Syngene成像分析系统进行扫描及灰度分析，每一样本以目的条带B-actin条带灰度的比值作为样本的表达。

(3)病理切片制作及图像分析：取右下肺置于10％中性甲醛溶液中固定1周，常规石蜡制片行HE及VEGF免疫组化染色。光学显微镜下切片，病理图文分析系统采集图像，HE染色测量肺小动脉管壁厚度、血管直径，管腔面积、血管总面积，然后计算管壁厚度与血管半径百分比(WT％)、管壁面积与血管总面积百分比(WA％)，管腔面积与血管总面积百分比(LA％)；免疫组化切片测量肺小动脉管壁内VEGF平均吸光度值作为其相对含量；定量分析每张切片均选取3-5个小动脉进行测量，并算取其平均值进行统计学分析。

二、结果：

1.血清中VEGF结果：

模型组大鼠血清VEGF含量较正常对照组明显升高，各治疗组VEGF水平比模型组均有不同程度的降低，但各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表19)。

表19 各组大鼠血清VEGF OD值比较

注：与正常对照组比较*P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

2.肺组织VEGFmRNA基因表达：

模型组肺组织VEGFmRNA表达较正常对照组明显升高，运用药物干预治疗后各治疗组VEGFmRNA表达明显降低，但保肺定喘汤低剂量组较正常对照组仍明显增高，各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表20)。

表20 各组大鼠肺组织VEGF mRNA含量比较

注：与正常对照组比较*P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

3.肺血管形态学的变化：

光镜下见正常对照组大鼠肺小动脉管壁菲薄，内皮细胞扁平连续，厚薄基本一致；模型组肺小动脉血管壁明显增厚，平滑肌细胞增生肥厚，管腔变小且不规则，部分呈裂隙状；各治疗组大鼠肺小动脉管壁增厚及管腔狭窄程度较模型组均有不同程度减轻。模型组与正常对照组比较肺小动脉管壁增厚，管腔狭窄，WT％、WA％均明显增大，LA％则明显减小；各治疗组均能在一定程度上减轻肺血管重构，其中硝苯地平组和保肺定喘汤高剂量组尤为明显，与正常对照组比较无差异，但各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表21)。

表21 组大鼠肺小动脉WTWA LA结果比较

注：与正常对照组比较^△P<0.05，^△△P<0.01。与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

4.免疫组化肺小动脉VEGF表达：

光镜下正常对照组肺小动脉的内皮细胞可见少量VEGF阳性表达，而模型组除了肺小动脉的内皮细胞阳性表达外，在部分的动脉壁的平滑肌细胞、毛细血管内皮细胞、肺泡内渗出的巨噬细胞和支气管的上皮细胞也可见阳性的表达，各治疗组VEGF阳性表达与模型组比较都有不同程度的抑制，各组之间VEGF平均吸光度比较：模型组大鼠肺小动脉VEGF平均吸光度比正常对照组显著增加；各治疗组VEGF平均吸光度均有不同程度的降低，且保肺定喘汤各剂量组VEGF表达与正常对照组无明显差异，但各治疗组之间比较其差异无统计学意义(见表22)。

表22 组大鼠肺小动脉VEGF平均吸光度比较

注：与正常对照组比较^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

三、讨论：

1.保肺定喘汤，既有益气活血、行滞通络的作用，又能兼顾脾肾、清肺化痰止咳，这正好针对肺血管重构从气虚到血瘀、痰阻再致局部肺络痹阻的发生发展过程，起到了扶正固本、祛邪通络的作用。

2.保肺定喘汤可以明显抑制VEGF表达，减轻野百合碱诱发肺动脉高压大鼠之肺血管管壁增厚、管腔狭窄等形态改变程度，减轻肺血管重构，且功效与剂量成正相关。

Claims (5)

1.一种中药组合物，其特征在于所述中药组合物由如下质量配比的原料组成：仙灵脾1份、党参1～5份、黄芪1～5份、丹参1～5份、当归1～5份、熟地1～5份、麦冬1～5份、广地龙1～5份、桔梗1～5份和甘草1～5份。

2.如权利要求1所述中药组合物，其特征在于所述中药组合物由如下质量配比的原料组成：仙灵脾1份、党参3份、黄芪3份、丹参1.5份、当归1.2份、熟地1.5份、麦冬1.2份、广地龙1.5份、桔梗1份和甘草0.6份。

3.一种权利要求1所述中药组合物在制备治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为下列之一：⑴颗粒剂、⑵片剂、⑶口服液或⑷胶囊剂。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用是将中药组合物制备成颗粒剂，具体制备方法为：将配方量的原料加水浸没，在室温浸渍0.5～1小时，煎煮2次，每次1～2小时，合并两次煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.12，冷却后加乙醇至乙醇体积含量为60％，充分搅拌，冷藏静置至析出沉淀，取醇沉上清液，过滤，滤液减压回收乙醇，继续浓缩至相对密度为1.34～1.40，获得浸膏，取浸膏加入质量为浸膏质量1.5～2.0倍的淀粉，搅匀、制粒、干燥、整粒，混匀，即得所述颗粒剂。