CN104774839A - 棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp-1及其应用 - Google Patents
棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp-1及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774839A CN104774839A CN201510215161.7A CN201510215161A CN104774839A CN 104774839 A CN104774839 A CN 104774839A CN 201510215161 A CN201510215161 A CN 201510215161A CN 104774839 A CN104774839 A CN 104774839A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cotton
- fpsp
- pollen
- fiber
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 title claims abstract description 120
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 42
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 76
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 19
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 15
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 14
- 238000011161 development Methods 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 5
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 4
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 4
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012877 elongation medium Substances 0.000 description 2
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical class CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000008122 ovule development Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 239000012804 pollen sample Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M sodium acetate trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].CC([O-])=O AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1及其应用；所述启动子具如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述启动子可在制备转基因棉花中应用，用于控制目标基因在转基因棉花纤维和花粉中特异表达；本发明利用基因工程技术成功分离棉花纤维和花粉特异表达的基因的启动子FPSP-1，验证FPSP-1序列在棉花中具纤维和花粉表达特异性，能指导报告基因在棉花纤维和花粉中特异性表达，为基因工程改良棉花的产量和品质提供可能性和有效的途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1及其应用。
背景技术
我国是棉花生产和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了较大的成功，但近20 年来，世界棉花品种的产量已经达到平台期。因此，利用现有的遗传资源和传统育种手段难以再大幅度提高棉花产量。基因工程方法具有后代易于稳定，育种周期短等优点，可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移。利用基因工程改良棉花产量和纤维品质是解决这一难题的有效途径。
但基因工程在作物改良中的作用发挥取决于三个方面的进展程度：目标基因的功能、调控目标性状的分子机理和控制目标基因在特定部位表达的特异启动子。在棉花纤维品质和产量的基因工程改良中，常常需要在纤维细胞中超量或抑制一些基因的表达，来达到提高产量或改良品质的目的。同时棉花纤维产量的重要指标是棉花育性，而花粉育性是棉花育性的重要指标，直接关系到棉花成铃率、座果率和产量，因此需要有纤维花粉特异的启动子来控制目标基因的表达。在棉花纤维发育的分子机理研究中，也需要纤维细胞特异表达启动子来上调或下调目标基因的表达，进而分析其在纤维细胞中的功能，最大限度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。但是，目前已报道的具有棉花纤维特异性的启动子非常有限；如在利用基因工程改良棉花纤维产量和品质过程使用组成型启动子（如CaMV35S）常常引起副作用的问题，即在不需要表达目的基因的部位而发生了目标基因的表达，常常引起植株生长的异常变化，达不到改良纤维产量和品质的效果。因此，棉花纤维特异启动子的克隆，在转基因棉花中限制目标基因在棉花花粉和纤维中特异性表达，对棉花纤维发育相关基因功能研究和棉花纤维的基因工程改良，具有十分重要的意义。
近年来，植物组织器官和发育特异性表达基因的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花种子和纤维是棉花的经济器官，花粉育性是棉花产量的一个重要因子，纤维的发育直接影响纤维的品质和产量。因此，研究和筛选纤维和花粉特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是解决现有组成型启动子（如CaMV35S）常常引起副作用，即在不需要表达目的基因的部位而发生了目标基因的表达，常常引起植株生长的异常变化，达不到改良纤维产量和品质的效果的技术问题，而提供一种棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1。
本发明还提供棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
上述棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1的应用，在制备转基因棉花中的应用，用于控制目标基因在转基因棉花纤维和花粉中特异表达。
一种棉花纤维和花粉特异型表达的启动子制备转基因植物的方法，包括以下步骤：
（1）构建具有上述SEQ ID NO.1所示序列的启动子FPSP-1；
（2）将所述启动子可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；
（3）将步骤（2）获得植物表达载体转化宿主，获得转化体；
（4）将所述转化体转化植物，经培养获得转基因植物。
一种棉花纤维和花粉特异型表达的启动子制备转基因棉花的方法，包括以下步骤：
（1）构建具有上述SEQ ID NO.1所示序列的启动子FPSP-1；
（2）将所述启动子可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；
（3）将步骤（2）获得植物表达载体转化到棉花的愈伤再生组织中；
（4）培养所述棉花愈伤再生组织，经筛选和诱导获得含棉花纤维和花粉特异性的启动子的棉花植株。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、由于棉花纤维是胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长而成，因此纤维细胞是胚珠表皮细胞的一部分；为了筛选棉花纤维特异或优势表达的启动子，本发明通过筛选纤维细胞伸长期cDNA文库，获得一个在纤维细胞伸长期优势表达的基因，该基因与其它物种的花粉特异性蛋白基因SF3同源，命名为GhSF3L-1（SF3
Like-1）基因；通过检测该基因在棉花不同组织器官和细胞的表达特性，表明该基因在纤维细胞和花粉中特异表达；同时在纤维细胞中的表达主要集中在纤维快速伸长期。
2、本发明通过染色体步行，获得了GhSF3L-1基因5'-上游调控序列；通过克隆、序列分析、构建启动子分析植物表达载体和棉花遗传转化，并通过分子鉴定为转基因棉花后，对转基因棉花不同组织器官和细胞以及不同发育时期的纤维细胞进行GUS染色分析；明确了这段克隆的启动子序列在棉花中的表达特性，即在纤维细胞和花粉中特异表达，是一个纤维和花粉特异表达启动子；将这段启动子序列命名为FPSP-1（Fiber-Pollen Specific Promoter-1）。
3、本发明利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维花粉特异表达的GhSF3L-1基因的启动子，所述FPSP-1启动子含1486 bp片段；由于花粉发育（花粉育性）是棉花产量的一个重要指标，纤维细胞发育直接与纤维的产量和品质相关；本发明通过验证得出所述FPSP-1启动子序列在棉花中具有纤维花粉表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维和花粉中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维和花粉特异性表达的启动子序列，为基因工程改良棉花的产量和品质提供了可能性和有效途径。
4、长期的棉花栽培过程（不断地选择和培育高产优质品种），使得较多基因（如GhSF3L-1基因）在纤维和花粉中发挥作用；如果在棉花基因工程中使用本发明的棉花花粉和纤维特异性表达启动子指导目标基因只在纤维和花粉中表达，将有利于更好改良棉花纤维产量和品质，具有巨大的发展前景和意义。
附图说明
图1显示GhSF3L-1基因在棉花不同组织器官和不同发育时期纤维胚珠中的表达特性；
图2显示GhSF3L-1基因在棉花纤维不同发育时期的表达特性；
图3是FPSP-1启动子扩增产物电泳；
图4显示了FPSP-1启动子序列上具有的顺式调控元件；
图5是FPSP-1启动子分析的植物表达载体pBI121-FPSP-1::GUS酶切验证；
图6是pBI121-FPSP-1::GUS植物表达载体图谱；
图7是扩增验证转基因棉花中的FPSP-1::GUS基因；
图8显示FPSP-1启动子控制GUS基因在花粉中表达----野生型棉花；
图9显示FPSP-1启动子控制GUS基因在花粉中表达----转基因棉花；
图10显示FPSP-1在转基因棉花纤维中表达-----野生型纤维和胚珠；
图11显示FPSP-1在转基因棉花纤维中表达-----转基因纤维和胚珠；
图12是FPSP-1启动子控制GUS基因在转基因棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的表达情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的详细说明。以下的描述并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神, 均应属于本发明所附权利要求的范围。
除非另有说明，本发明实例中的试剂、药品、材料均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为徐州142（Gossypium hirsutum
L. cv 徐州142），来源于中国农业科学院棉花研究所。转基因受体为冀棉14，来源于河北农业大学。
实施例 1 ：棉花RNA的提取；
选取约3 g新鲜棉花材料（分别取根、茎、叶、花、开花后0天的胚珠和纤维、开花后6天的胚珠和纤维、开花后6天的纤维、开花后20天的纤维、开花后6天的胚珠和花后20天的胚珠各3 g）；在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 毫升离心管，加入15 毫升 65℃预热的RNA提取液（2%（W/V）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），2%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP），100 毫摩/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl，pH 8.0），0.5克/升亚精胺（Spermidine），2.0 摩/升的氯化钠（NaCl），2%巯基乙醇（V/V，使用前加入），上述浓度均为所述物质在RNA提取液中的终浓度），颠倒混匀；于65℃水浴3分钟，期间混匀2~3次；随后用等体积氯仿:异戊醇（体积比24:1）抽提2次（在室温下，于10,000 转/分钟离心5分钟）；取上清，加入上清液1/4体积的10 摩/升的氯化锂（LiCl）溶液，于4℃放置6小时，以等体积酚(pH4.5) :氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）和等体积氯仿:异戊醇（体积比24:1）各抽提1次（在室温下，于10,000 转/分钟离心5分钟）；继而加入上清液2倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30 分钟以上后，于4℃，以12,000转/分钟的转速离心20 分钟，弃上清；取沉淀用500微升经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水溶解；并以等体积酚(pH4.5) :氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）和等体积氯仿:异戊醇（体积比24:1）各抽提1次（在室温下，于10,000 转/分钟离心5分钟）；加上清液2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30 分钟以上；于4℃，以12,000转/分钟的转速离心20 分钟，弃上清；沉淀用70%（体积浓度）的酒精漂洗一次，风干；再加200微升的经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水溶解后；用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。
实施例 2 ： cDNA第一链的合成；
取约10微克总RNA加入到焦碳酸二乙酯处理的扩增管中，65℃水浴10分钟使RNA变性后，立即冰浴3 分钟；然后向扩增管中依次加入2 微升10´RNA 反应缓冲液（宝生物工程有限公司，中国大连），4 微升 25 毫摩/升的氯化镁（MgCl2），2微升10毫摩/升脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），5单位逆转录酶，0.5 微升RNA酶抑制剂(20单位)和1 微升2.5微摩/升T重复寡核苷酸（Oligo-dT）3'接头，加入经焦碳酸二乙酯处理的水至终体积20微升。反转录反应程序为：30℃，10分钟；50℃，45分钟；95℃，5分钟；5℃，5分钟。程序结束后，于-20℃冻存产物。
实施例 3：
GhSF3L-1基因在棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期中的表达特性；
由于棉花纤维是胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长而成，因此纤维细胞是胚珠表皮细胞的一部分。为了筛选棉花纤维特异或优势表达的启动子，发明人通过筛选纤维细胞伸长期cDNA文库，获得一个在纤维细胞伸长期优势表达的基因，该基因与其它物种的花粉特异性蛋白基因SF3同源，命名为GhSF3L-1（SF3 Like-1）基因， cDNA序列为SEQ
ID NO.2；
运用实时定量PCR扩增分析GhSF3L-1的表达水平，用cDNA第一链合成试剂盒（MBI）合成棉花不同器官和组织总RNA的第一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。采用实时定量PCR试剂盒（Bio-Rad）进行扩增，在20微升的反应体系中包括10微升的混合缓冲液（Bio-Rad），5'-端和3'-端引物各1 微升 （5微摩/升）。循环参数为94℃预变性3分钟；94℃，30 秒，55℃，30 秒，72℃，30秒，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内标，Histone3的5'-引物是GhHIS1（5'-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3'）(SEQ ID NO.3)，3'-引物为GhHIS2（5'’-CTACCACTACCATCATGGC-3'）(SEQ ID NO.4)；扩增GhSF3L-1基因的5'-引物序列为GhSF3L-1-1（5'-GCATCATCTTCCGATTCGACT-3'）(SEQ
ID NO.5)，3'-引物序列为GhSF3L-1-2（5'-GACTTGCAGCCTTCTTCTCAG-3'）(SEQ
ID NO.6)。
按上述实施例1和2的方法获得棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的总RNA进行实时定量RT-PCR分析；在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带，每个样品重复3次。
图1显示GhSF3L-1基因在棉花不同器官和组织中以及纤维和胚珠不同发育时期的表达；
OF-0DPA~OF-4DPA:
开花当天的棉花胚珠（含纤维细胞）至开花后4天的棉花胚珠（含纤维细胞）；F-6DPA~F-18DPA: 开花后6天的纤维细胞至开花后18天的纤维细胞；O-6DPA~O-18DPA: 开花后6天的棉花胚珠至开花后18天的棉花胚珠。其中，误差棒表示3次生物学重复的标准差。
此图说明GhSF3L-1基因在棉花花药和纤维细胞的发育早期表达；在纤维中的表达高峰出现在纤维细胞快速伸长期（F-10DPA左右）。
结果如图1所示，GhSF3L-1基因在棉花根、下胚轴、叶和茎中无表达、在花药中表达量最高，在开花当天的胚珠（含纤维）中无表达，在开花后4天的胚珠（含纤维）中有少量表达，在开花后6天的纤维中表达量较高，表达峰值出现在开花后10天的纤维细胞中，在开花后14天的纤维中表达水平迅速下降（图1），在胚珠中几乎无表达。说明GhSF3L-1基因具有明显的花粉和纤维细胞表达优势。而且在纤维发育过程中，随着纤维的伸长生长，该基因的表达水平快速增加，在开花后6天和12天的纤维细胞中的表达量较高；随后逐渐降低，在开花18天后的纤维细胞中几乎检测不到该基因的表达（图2）。在整个胚珠发育过程中，该基因的表达水平极低。由此说明GhSF3L-1基因在花粉和纤维中特异表达，而且在纤维细胞快速伸长期表达水平较高, 在胚珠中基本不表达。
实施例 4 ：棉花基因组DNA的提取；
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取棉花基因组DNA。取0.5 克棉花幼叶，在液氮中迅速研磨成粉，加入3毫升65℃预热的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液，快速振荡混匀。65℃水浴30分钟，然后加入1毫升5 摩/升醋酸钾（KAc），冰浴20 分钟后，用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（12,000 转/分钟，4℃离心5 分钟），取上清，加入上清液2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30 分钟，挑出絮状沉淀，用75%（体积浓度）的乙醇反复漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重溶于500 微升TE缓冲液（10 毫摩的Tris-cl (PH值8.0）和1毫摩的EDTA(PH值8.0）（EDTA：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠）中；再加入1微升RNA酶A（10 毫克/毫升），37℃处理1小时；再用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和等体积氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（12,000 转/分钟，4℃离心5 分钟），取上清，加入上清液2倍体积的无水乙醇沉淀DNA；于-20 ℃放置约30 分钟，离心（12,000转/分钟，4℃离心5 分钟），弃上清，沉淀用75%的乙醇（体积浓度）漂洗，风干，溶于200 微升TE缓冲液（同前）中，-20 ℃保存备用。
实施例 5：
GhSF3L-1基因5'-上游调控序列的获得；
采用YADE（Y-shaped Adaptor
Dependant Extension）（肖月华, 罗明, 方卫国, 罗克明, 侯磊, 罗小英, 裴炎。利用YADE 法进行棉花基因组PCR步行.遗传学报，2002,29（1），62-66）法进行GhSF3L-1基因的步行。
酶切目标基因组DNA：将2 微克基因组DNA用10U的内切酶按说明书的条件在20 微升体系中酶切过夜，70℃灭活10分钟。
准备接头：向扩增管中加入2 微升接头短链（100 微摩/升）（接头序列与使用的内切酶酶切位点相匹配），5U T4多聚核苷酸激酶，1 微升10毫摩/升腺苷三磷酸（ATP），10微升体系，37℃保温30分钟，70℃灭活10分钟；加入2 微升10×退火缓冲液，2微升接头长链（100微摩/升）（5'-CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGGCCAG-3'）和6微升水，65℃保温10 分钟，缓慢冷却到室温，使长短链退火形成接头。
连接接头：取2微升以上方法准备好的接头（10微摩/升）和5纳克酶切产物，加5U T4连接酶，16℃连接16小时。
线性扩增：第一步为线性扩增，25 微升体系中含1 微升连接产物，1×Ex Taq Buffer（无Mg2+），200微摩/升 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），2微摩/升氯化镁（MgCl2），200微摩/升特异引物GhSF3L-1-SP1（上述各种浓度为各种物质在反应液的终浓度）
(5′-CAGTCTTATCACAAATCGTGC-3′)，1U Ex Taq DNA聚合酶（在94℃预变性时加入）。循环参数为：94℃预变性5分钟；94℃，30秒，56℃，30秒，72℃，2分30秒，40个循环。
指数扩增：取1微升线性扩增产物进行第二步指数扩增，除引物为接头引物（5'-CGGTAGGATCCCGCAGAAC-3'）和特异引物GhSF3L-1-SP2 (5′-GAGAAGATTCAAGGGAAGAC-3′)外（5 微摩/升引物各1微升），反应体系中其他成分同线性扩增。反应扩增35个循环后，72℃延伸10分钟。
经过一次YADE延伸，获得5'-上游调控序列。
实施例 6：克隆GhSF3L-1基因的启动子FPSP-1序列；
根据已经获得的GhSF3L-1基因的5'-上游调控序列，设计特异引物FPSP-1-up（5'-CCCACGTTGTTAACCCCAATG-3'）(SEQ ID NO.7)和在近ATG位点处设计特异引物FPSP-1-down（5
'-GACAAACACCGAGTTCCAGTC-3'）(SEQ ID NO.8)，以徐州142基因组DNA为模板进行扩增，25微升的反应体系包含约50纳克棉花DNA，2.5微升10倍扩增缓冲液（宝生物工程有限公司，中国大连），2微升2.5毫摩/升脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），1.5 微升25 毫摩/升氯化镁（MgCl2），5 微摩/升的上下游引物各1微升，1单位DNA聚合酶（Progema）。扩增程序为：94℃， 5 分钟；94℃，30秒，56℃，30秒，72℃，1.5分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
扩增产物经过电泳（图3）回收、将其连接在克隆载体pMD19 (TaKaRa，中国大连)上，形成pMD19-FPSP-1载体，该载体经过转化大肠杆菌、验证和测序，结果表明扩增片段长度为1486bp，命名为FPSP-1，如SEQ ID NO.1所示。序列分析在PlantCare数据库进行（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），分析结果见图3，序列中除具有一般启动子所具有的大量TATA框和CAAT框外，还具有许多特异性响应元件，如厌氧反应元件、光反应元件、乙烯反应元件、胚乳表达元件、防御与胁迫反应元件、脱落酸反应元件、生长素响应元件、赤霉素响应元件、分生组织表达元件、干旱诱导反应元件、昼夜节律调控元件等。
图3是FPSP-1启动子扩增产物电泳；其中，M2000：DNA
marker M2000；1：FPSP-1启动子扩增产物；此图说明扩增的FPSP-1启动子片段大约1500bp。
图4显示了FPSP-1启动子序列上具有的顺式调控元件；
其中，序列分析在PlantCare数据库进行（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。
此图说明FPSP-1序列中具有植物激素应答、生物和非生物胁迫反应和组织特异性表达元件。
实施例 7 ：FPSP-1启动子分析植物表达载体pBI121-FPSP-1::GUS的构建；
用HindⅢ和XbaⅠ内切酶从pMD19-FPSP-1载体上切下FPSP-1片段，连接到用HindⅢ和XbaⅠ双酶切的pBI121载体片段上，从而使FPSP-1片段置换了pBI121载体中的CaMV35S启动子。通过酶切验证（见图5），构建成植物表达载体pBI121-FPSP-1::GUS（图6）。
图5是FPSP-1启动子分析的植物表达载体pBI121-FPSP-1::GUS酶切验证；
M15：DNA marker 15（MBI）；1：pBI121-FPSP-1::GUS质粒酶切图。
此图说明目标启动子序列（FPSP-1）已经替换pBI121上控制GUS基因表达的CaMV35S启动子，成功构建了pBI121-FPSP-1::GUS植物表达载体。
图6是pBI121-FPSP-1::GUS植物表达载体图谱；
其中，LB: T-DNA区段左边界； RB：T-DNA区段右边界； Kanr，卡拉霉素抗性基因； GUS：b-葡萄糖酸苷酶基因； Nos-T:冠瘿碱合成酶基因终止子。
此图显示FPSP-1启动子与下游GUS基因的融合关系。
实施例 8 ：棉花的遗传转化；
用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。
参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。
上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：
冀棉14（河北农业大学提供）种子剥去外壳，用质量浓度0.1%的升汞（HgCl2）灭菌10分钟，用大量无菌水冲洗8次；将冲洗后的种子放入125毫升三角瓶中，并加入约35毫升无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水；当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2~3天，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。
转化用的含pBI121-FPSP-1::GUS植物表达载体的农杆菌菌株在含50毫克/升 卡拉霉素（Km）和125 毫克/升链霉素（Sm）的YEB固体培养基上活化；挑取其单菌落，接种于5毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200转/分钟震荡培养过夜；培养后的农杆菌菌液按1：20的比例转接到25毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6~0.8，于10,000转/分钟离心1分钟收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。
转化时，将棉花下胚轴切成1.5~2.0厘米的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃、摇床120转/分钟、侵染30分钟。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。
共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织；愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120转/分钟摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0毫升枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2厘米时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5厘米高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。
表1 根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基
| 培养基名称 | 成 分（表中所述浓度为各种成分在相应培养基中的终浓度） |
| 种子萌发培养基 | 1×MSB（1×MS无机+1×B5有机+7 g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8）+20 g/L蔗糖+2.4 g/L Gelrite, pH6.5 |
| 共培养培养基 | 1×MSB+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT+100 mg/L AS+30 g/L葡萄糖+2.4 g/L Gelrite, pH5.4 |
| 下胚段筛选培养基 | 1×MSB+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT+30 g/L葡萄糖+50 mg/L Km+200 mg/L cef +2.4 g/L Gelrite，pH5.8 |
| 胚性愈伤诱导培养基 | 1/2MSB（1/2×MS无机+1×B5有机+7 g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8）+1.9 g/L KNO3+0.1 mg/L KT+15 g/L葡萄糖+15 g/L蔗糖+50 mg/L Km+200 mg/L cef +2.4 g/L Gelrite，pH5.8 |
| 胚性愈伤悬浮培养基 | 1/2MSB（1/2×MS无机+1×B5有机+7 g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8）+1.9 g/L KNO3+0.1 mg/L KT+15 g/L葡萄糖+15 g/L蔗糖+50 mg/L Km，pH5.8 |
| 体胚伸长培养基 | 1/2MSB（1/2×MS无机+1×B5有机+7 g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8）+1.9 g/L KNO3+0.1 mg/L KT+15 g/L葡萄糖+15 g/L蔗糖+50 mg/L Km +2.4 g/L Gelrite，pH5.8 |
| 成苗培养基 | 1×SH培养基+0.8 g/L 活性碳+2.4 g/L Gelrite, pH6.5 |
注:MS: Murashige & Skoog, 1962; B5: Gamborg, 1986；SH培养基：phytoTechnology
laboratories® 产品号：S816，lot：11L081602613。
实施例 9 ：转基因棉花的分子验证；
用简易的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法或任何本领域已知的方法提取实施例8获得的棉花抗性幼苗的DNA。以特异结合FPSP-1序列5'端的引物FPSP-1-up (SEQ
ID NO.7)和特异结合GUS基因序列5'端的引物GUS-1（5'-GTTGGGGTTTCTACAGGACGT-3'）(SEQ ID NO.9)扩增抗性棉花基因组DNA，预计扩增片段大约1500 bp。25微升的反应体系包含约50 纳克基因组DNA，2.5微升10倍扩增缓冲液，2微升2.5毫摩/升脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），1.5 微升25毫摩/升氯化镁（MgCl2），5微摩/升的上下游引物各1微升，1单位DNA聚合酶。扩增程序为：94°C，5分钟；94°C，30秒，56°C，30秒，72°C，2分钟，35个循环；72°C延伸10分钟。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（图7）。
图7是扩增验证转基因棉花中的FPSP-1::GUS基因；如图7可见，从5株抗性棉花植株中扩增出了约1.5kb的特异带，说明载体片段已经整合到转基因棉花植株的基因组中。
图7中，M15：DNA Marker15（MBI）；+：阳性对照（煮沸过的pBI121-FPSP-1::GUS农杆菌液）；-: 阴性对照（未转基因棉花）；H2O：以水为扩增模板；1-5：转基因后再生的Kan抗性苗；此图说明FPSP-1::GUS::Nos表达单元已经整合到转基因棉花基因组中。
实施例 10 ：转基因棉花中GUS活性的检测；
随机选取5株PCR阳性的转基因棉花植株进行全面的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性检测, GUS的表达特性基本一致。结果显示只在转基因棉花的花粉和纤维细胞中检测到较强的GUS信号，在其它组织器官样品中均没有检测到GUS信号（图8~图11）。这些检测结果说明FPSP-1启动子是一个纤维花粉特异表达启动子。
图8显示FPSP-1启动子在转基因棉花花粉中的表达情况----野生型棉花；
图9显示FPSP-1启动子在转基因棉花花粉中的表达情况----转基因棉花
图10显示FPSP-1启动子在转基因棉花纤维细胞中的表达情况----野生型棉花；
图11显示FPSP-1启动子在转基因棉花纤维细胞中的表达情况----转基因棉花。
实施例 11 ：转基因棉花中GUS基因的表达检测；
为了进一步检测FPSP-1启动子的表达特性，利用实时定量PCR检测了转基因棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的GUS基因的表达水平。结果显示GUS基因的表达主要出现在纤维和花粉样品中，在其它样品中几乎检测不到GUS的表达（图12）。这结果进一步说明FPSP-1启动子是一个纤维花粉特异表达启动子。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 西南大学；
<120> 棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1及其应用；
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.1的核苷酸序列
<400> 1
cccacgttgt
taaccccaat gcacaaacaa gcttggatta caagttctat agattgttgg 60
tacttttatt
taaccaaagg gctttgttat ttgataggaa aaactggaaa agaagaagga 120
agaatatgca
gagaaaatga aaaacaaagt ggctcaactc cataaacaag ctgaagaaag 180
aagagcgatg
atcgaagcca agaaaggtga agattttctt aagatagagg aaacagcagc 240
caagtttcgt
tcaactggat atacaccaaa gaaatttctt ggctgtttcg gtagttaaca 300
tcctcaacaa
atgtttcata tataggacac atttttcttc ctcgaattta gtttgattct 360
ttgcctatgt
tttcttatta cttttcctct tgttggtttg taattgtcaa agacattcta 420
atattggttt
ttaatcatta tctatgtgtg tatatataca aatatatatt gtgaaataca 480
ttaattccta
tttgaatatc acatcgccat acacttcagt gttagagtta tgatcctgtt 540
ataaaggcag
ttccaacttg agctatagct ctagtttgat aaccataaca tgcttgattt 600
cgtgttggca
atctttgatg ttgatctatt gaaaaaaaat aaaagactca aaaatccgtg 660
ggaaaactct
tagatatgac aggcttgact tatgtagttc atgcaagggt gagctctcat 720
atttttgttt
agtaagaaac tatttgagag cacatttttt ttaaatgagt cacctgattt 780
tatagttaag
ggtataactt agtagagagt gatgtagatt ttagtatgaa tatgaagttg 840
ctacatgagg
agttgtacga cttaaatttt ctcttgtatg agtttataag atagtgaatt 900
agctcaaggt
tggattgaga actaactggt acattagtct tggagtaagg aaaaaattga 960
tggacccacg
aaacattatg aattggacta acgttctaaa taaactcaca aatataaata 1020
aaaactgaat
tgtctaacca atttatttat attagttctg tttgatgttc ctcaccaatt 1080
acttgtcaca
attgcaactg aatcaatatc agcaaacgtg acaagccatg tatacatata 1140
catatattat
atcatgctgg cacgtacaaa ggagtggatt atgttagata acgttgtgaa 1200
cttaaaatta
atatctggat ccatcaatga aaaacttggt caggaaatgg ttgcatctct 1260
gtcactcaac
atgaaacgtg ggcctattct tagagcaata gaagtctata tattgccaaa 1320
ggagttaggg
aaggaccatt gattgcgtat ccttaataag cgttgggtca tgtatattat 1380
tatatcctcc
accattttta aggaggaaaa cagtagacaa ttctttctga gttccttccc 1440
tatctcacct
ttcttctgag atagcgactg gaactcggtg tttgtc 1486
<210> 2
<211> 856
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.2的核苷酸序列
<400> 2
gactggaact
cggtgtttgt cttcccttga atcttctcat cctttctttt ctaaaaggaa 60
gatggcattt
agtgggacga cagataaatg cacgatttgt gataagactg ttcatttcat 120
tgatttatta
actgctgatg ggattcctta tcataagacc tgcttcaaat gcacccattg 180
caatggctta
ctcgtgatga gcaactattg ttcaatggaa ggagtgctct attgcaagcc 240
tcactttgaa
cagctcttca aagaaactgg cacttatacc aagaatttcc aatccaaaaa 300
atccgacagg
ccaaatgggc agacaaagac tccgaacaga cttgcagcct tcttctcagg 360
cacacaagat
aaatgcggag tctgtaacaa aaccgcgtac cccttagaga aggtgacagt 420
ggagggagaa
aactaccaca aatcctgctt caggtgttca ccagggggtt gcttgcttac 480
accatcaaca
tatgctgcaa tggatggtat cctttactgc aaacatcact ttgctcagct 540
gttcatggag
aagggatgct acagtcacct tgccaagcaa gcctgcatga agaaaaactt 600
ggcaggatct
tcaccggagc aaaagcccga agatgcagtc gaatcggaag atgatgcgaa 660
accagaagca
gaagcaggaa cagaagcaga agcagaagaa acagaagaaa aatctgaaga 720
agctggtgca
gaaacctaat agtggaatgc tcactgaacg ttgaggggat ttatccgaat 780
tgcggtgctt
gaccttgttc tattgaagtt cttcctatgg ctccaagggt ctccccagtt 840
ctccaccttg
caagca
856
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.3的核苷酸序列
<400> 3
gaagcctcat
cgataccgtc
20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.4的核苷酸序列
<400> 4
ctaccactac
catcatggc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.5的核苷酸序列
<400> 5
gcatcatctt
ccgattcgac t
21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.6的核苷酸序列
<400> 6
gacttgcagc
cttcttctca g
21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.7的核苷酸序列
<400> 7
cccacgttgt
taaccccaat g
21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.8的核苷酸序列
<400> 8
gacaaacacc
gagttccagt c
21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.9的核苷酸序列
<400> 9
gttggggttt
ctacaggacg t
21
Claims (2)
1.棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1，其特征在于，所述启动子FPSP-1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.棉花纤维和花粉特异表达启动子FPSP-1的应用，其特征在于，将权利要求1所述启动子FPSP-1在制备转基因棉花中的应用，用于控制目标基因在转基因棉花纤维和花粉中特异表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510215161.7A CN104774839B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp‑1及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510215161.7A CN104774839B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp‑1及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104774839A true CN104774839A (zh) | 2015-07-15 |
| CN104774839B CN104774839B (zh) | 2017-04-12 |
Family
ID=53616610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510215161.7A Expired - Fee Related CN104774839B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp‑1及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104774839B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103382474A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-11-06 | 西南大学 | 一种棉花纤维和花粉特异表达启动子和应用 |
| WO2014184196A1 (en) * | 2013-05-14 | 2014-11-20 | Bayer Cropscience Nv | Enhanced selective expression of transgenes in fiber producing plants |
-
2015
- 2015-04-30 CN CN201510215161.7A patent/CN104774839B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103382474A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-11-06 | 西南大学 | 一种棉花纤维和花粉特异表达启动子和应用 |
| WO2014184196A1 (en) * | 2013-05-14 | 2014-11-20 | Bayer Cropscience Nv | Enhanced selective expression of transgenes in fiber producing plants |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JESSICA PAPUGA等: "Arabidopsis LIM Proteins: A Family of Actin Bundlers with Distinct Expression Patterns and Modes of Regulation", 《THE PLANT CELL》 * |
| YUANDA LV等: "Characterization of expressed sequence tags from developing fibers of Gossypium barbadense and evaluation of insertion-deletion variation in tetraploid cultivated cotton species", 《BMC GENOMICS》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104774839B (zh) | 2017-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020221029A1 (zh) | 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用 | |
| CN105087640B (zh) | 调节植物种子发育的基因及其应用 | |
| CN113462689B (zh) | 大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用 | |
| CN102296085B (zh) | 一种植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用 | |
| CN104531708B (zh) | 棉花纤维特异表达启动子tb17p1及其应用 | |
| CN103772495B (zh) | 一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用 | |
| CN106967720B (zh) | 一个逆境诱导启动子SlWRKY31P的克隆及应用 | |
| CN101875932B (zh) | 一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用 | |
| CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN110106269A (zh) | Bna-miR156d在控制甘蓝型油菜分枝发育中的应用 | |
| CN103382474A (zh) | 一种棉花纤维和花粉特异表达启动子和应用 | |
| CN109852634A (zh) | 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法 | |
| CN104651367B (zh) | 一种种皮与纤维组织特异性表达启动子sfs及其应用 | |
| CN109536501B (zh) | 甘蓝型油菜组成型启动子pBnaC05g31880D及其应用 | |
| CN108753777B (zh) | 一种具有花药组织特异性的启动子及其应用 | |
| CN109694874B (zh) | 小麦基因TaCPSF30编码序列的克隆及应用 | |
| CN104774839A (zh) | 棉花纤维和花粉特异表达启动子fpsp-1及其应用 | |
| Zhang et al. | An efficient regeneration protocol for Agrobacterium-mediated transformation of melon (Cucumis melo L.) | |
| CN105602957B (zh) | 棉花纤维特异表达启动子tb7p1及其应用 | |
| CN106399312B (zh) | 一种诱导启动子NtPCS1P及其应用 | |
| CN105624161B (zh) | 一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d及其应用 | |
| CN105018493B (zh) | 水稻OsAHL1基因的启动子及包含其的重组载体、转化体以及其应用 | |
| CN114540354B (zh) | 含有榨菜ifl1启动子融合gus基因的表达载体及其应用 | |
| CN103387984A (zh) | microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用 | |
| CN110423753B (zh) | 一种由根结线虫诱导的根结特异性启动子t106-p及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170412 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |