CN104774244A - 一种抗菌水凝胶因子及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物凝胶材料领域,公开了一种抗菌水凝胶因子及其制备方法、用途,所述的抗菌水凝胶因子化学结构式如下:,其中:。所述的抗菌水凝胶因子通过化学固相合成得到。制备得到的抗菌水凝胶因子具有非常良好的抗降解性能、生物相容性和抗菌性能。在医用材料、日化用品、农业材料及用品中具有非常广阔的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物凝胶材料领域,涉及一种抗菌水凝胶因子及其制备方法、用途,特别是涉
及一种具有良好生物相容性、抗菌性能的抗菌水凝胶因子及其制备方法、用途。
背景技术
糖基化在自然界中是普遍存在的,它是生物体内细胞蛋白翻译后修饰的过程。细胞中糖基通过N-连接或O-连接的方法与细胞蛋白中的天冬氨酸,丝氨酸,苏氨酸的侧链相连接,从而形成糖蛋白。系统的研究表明,这个过程不仅为编码在基因组的蛋白质引进多种多样的结构,通过糖基和相邻氨基酸侧链的氢键作用和疏水作用使原蛋白的稳定性增加,而且产生了功能性更丰富的糖蛋白,糖蛋白通过受体配位基调节细胞内和细胞外交换,细胞的黏着,细胞的分化和细胞生长。
由于合成化学的显著前进和糖肽分子的生物作用的进一步了解,在过去的数十年间越来越多的糖肽分子被合成,这些由定点糖基化合成已经知道分子结构的糖肽分子被作为一种新型的治疗癌症的抗原疫苗,和抑制微生物的引诱受体,或者研究糖肽分子的生物作用。
此外,最近的研究显示,某些糖肽分子扩展分子间相互作用(氢键、范德华相互作用和π-π叠加)通过超分子形成新的生物材料也表现出了很好的前景。例如, 由氨基糖苷类和肽结合的超分子水凝胶因子与细胞溶解物的浓缩物和孤立产物中的16 s rRNA表现出特异相互作用。
在受到肽糖基化可以扩大超出其编码顺序决定肽结构的多样性,并生成具有丰富的超分子相互作用的糖肽的鼓舞下,我们推测,多肽糖基化在增加现存多肽水凝胶因子的结构多样性,调整其自组装行为,并生成具有先进性能的超分子自组装体方面具有很大的现实意义。
发明内容
要解决的技术问题:本发明的目的在于公开一种具有强抗水解能力、良好生物相容性、较强抗菌性的水凝胶因子及其制备方法、用途。
技术方案:一种抗菌水凝胶因子,所述的抗菌水凝胶因子化学结构式如下:
,其中:
。
一种抗菌水凝胶因子的制备方法,所述的制备方法包括以下步骤:
a) 1g氯三苯甲基氯树脂(100~200目和0.3~0.8 mmol/g)放在固相反应器中,加入40 mL无水二氯甲烷,用高纯氮鼓气震荡30分钟后,除去二氯甲烷,用无水DMF洗三次树脂;b) Fmoc-Asp(R1)-OH和DIEA溶解在30 mL无水DMF中,并将溶液加入到已经溶胀好的树脂中;用高纯氮鼓气震荡一个小时后,除去反应液,用无水DMF洗三次树脂;c) 加入20 mL猝灭溶剂(二氯甲烷:甲醇:DIEA=80:15:5),在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟,除去反应液,再次加入20 mL猝灭溶剂,在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟后,除去反应液,树脂用无水DMF洗三次;d) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;e) Fmoc-Asp(R2)-OH、DIEA和HBTU溶解在无水DMF中配成溶液,加入到树脂中,反应30分钟后,用无水DMF洗涤树脂三次,除去反应液;f) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;g) Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;h) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;i) Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;j) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;k) 把2-萘乙酸,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;l) 用DMF,DCM,甲醇,正己烷分别洗涤树脂5次,然后用高纯氮气将树脂吹干;m) 加入30 mL 95%三氟乙酸(水)溶液于反应器中,用高纯氮气鼓气三个小时,收集反应液,树脂用20 mL95%三氟乙酸(水)溶液洗涤树脂,收集反应液并与开始的反应液集中在一起;n) 用空气泵将溶剂吹干,加适量的去离子水,将所得黏性物质超声分散在水中,冷冻干燥;干燥好的粗产品经高效液相纯化,色谱柱为C18柱,梯度为水:乙腈=70:30~0:100;制备得到凝胶因子1、2、3或5;
凝胶因子4再用未纯化过的凝胶因子3用液相法合成的;将未纯化的凝胶因子3与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A;D-氨基葡萄糖溶解在10 mL水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加20 mL的DMF,得溶液B;将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,粗产品冷冻干燥,经高效液相纯化(色谱柱为C18柱,梯度为水:乙腈=70:30~0:100)后制备得到凝胶因子4;
合成凝胶因子1时,R1和R3是羟基,R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子2时,R2和R3是羟基,R1是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子3时,R3是羟基,R1和R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子4时,R3,R1和R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子5时,R1,R2和R3是羟基;
所述的水凝胶因子的制备方法的化学反应式如下:
,其中:
。
进一步的,所述的一种抗菌水凝胶因子的制备方法,其中所述的Fmoc-Asp(R1)-OH或Fmoc-Asp(R2)-OH,当R1或R2为glu时,其制备方法为:以Fmoc-Asp(OtBu)-OH为原料,经液相法合成,具体合成步骤如下:Fmoc-Asp(OtBu)-OH与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A;D-氨基葡萄糖溶解在10 mL水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加入20 mLDMF,得溶液B;将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,加适量的水,用浓盐酸调节pH=1,抽滤得粗产品,冷冻干燥后经柱色谱纯化分离(梯度为二氯甲烷:甲醇=50:1~5:1);分离后的纯品溶解在50%三氟乙酸(二氯甲烷)中,在室温下搅拌3小时,脱去天冬氨酸主链上羧基的保护基团;用空气泵将溶剂吹干,加入50 mL乙醚,在-20℃的冰箱中过夜;次日,将混合物抽滤,得到原料Fmoc-Asp(glu)-OH。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备细胞培养基中的用途。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备医用材料中的用途,所述的医用材料包括组织再生材料、组织修复材料、医用水凝胶材料或医用抗菌材料。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备药品中的用途,所述的药品包括膏剂、片剂、口服剂、注射剂或酊剂。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备日化用品中的用途,所述的日化用品包括护肤品、面膜、眼膜或护手霜。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备农业材料中的用途,所述的农业材料包括农业固体培养基材料或大棚薄膜材料。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备农业用品中的用途,所述的农业用品包括动植物用药膏或水土保湿剂。
所述的一种抗菌水凝胶因子在制备工业隔热涂层材料中的用途。
本发明与现有技术相比,其有益效果为: 本发明针对以上技术分析和存在问题,提供了一种合成抗酶水解的多肽类水凝胶的方法。我们受在自然界普遍存在的糖基化过程的启发,合成了一种具有强抗水解能力的多肽类水凝胶因子,这些水凝胶因子在抗水解的同时,对革兰氏阴性菌和阳性菌都有很强的抗菌性。本发明的凝胶因子第一次表明肽的糖基化可以生成一系列在水中自组装成比较有序的纳米结构和超分子水凝胶的凝胶因子,这种水凝胶的热稳定性和生物稳定性比他们的肽类似物有显著的提高。此外,糖苷基的掺入也使这些分子的水凝胶通过形成的纳米结构影响细菌细胞质交换和细胞迁移,从而对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抗菌活性。因此,本发明不仅通过肽的糖基化构建可调节分子结构的方法来合成超分子水凝胶,但也显示了这种水凝胶具有改进的生物物理性质(例如,热稳定性和生物稳定性),抗菌活性和与哺乳动物细胞生物相容性的新型生物材料,并且可以在抗微生物涂层,伤口敷料、局部用药、农业材料用品、工业用品、日化用品方面产生较广的应用。
附图说明
图1为抗菌凝胶因子的成胶照片,从A到B依次为凝胶因子1、凝胶因子2、凝胶因子3、凝胶因子4、凝胶因子5;
图2为抗菌凝胶因子的细胞相容性实验结果;
图3为抗菌凝胶因子的抗生物酶降解能力测定结果;
图4为抗菌凝胶因子的大肠杆菌涂板结果,从A到F依次为对照,凝胶因子1、凝胶因子2、凝胶因子3、凝胶因子4、凝胶因子5;
图5为抗菌凝胶因子的金黄色葡萄球菌涂板结果,从A到F依次为对照,凝胶因子1、凝胶因子2、凝胶因子3、凝胶因子4、凝胶因子5;
图6为抗菌凝胶因子的抗菌情况:A)大肠杆菌涂板计数统计;B)金黄色葡萄球菌涂板计数情况;未经水凝胶处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌C)和D);经水凝胶处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌E)和F)。
具体实施方式
氯三苯甲基氯树脂(100~200 目和0.3~0.8 mmol/g),Fmoc-Asp-OH,Fmoc-Phe-OH,2-萘基乙酸,DIEA(N,N-二异丙基乙胺),HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐),NHS(N-羟基丁二酰亚胺),DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)都是从Sigma购买的,其他溶剂是从国药订购的。
a) 1g氯三苯甲基氯树脂(100~200 目和 0.3~0.8 mmol/g)放在固相反应器中,加入40 mL无水二氯甲烷,用高纯氮鼓气震荡30分钟后,除去二氯甲烷,用无水DMF洗三次树脂; b) Fmoc-Asp(R1)-OH和DIEA溶解在30 mL无水DMF中,并将溶液加入到已经溶胀好的树脂中。用高纯氮鼓气震荡一个小时后,除去反应液,用无水DMF洗三次树脂;c) 加入 20 mL猝灭溶剂(二氯甲烷:甲醇:DIEA=80:15:5),在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟,除去反应液,再次加入20 mL猝灭溶剂,在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟后,除去反应液,树脂用无水DMF洗三次; d) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;e) Fmoc-Asp(R2)-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中配成溶液,加入到树脂中,反应30分钟后,用无水DMF洗涤树脂三次,除去反应液; f) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;g) Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;h) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;i) Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;j) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;k) 2-萘乙酸,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;l) 用DMF,DCM,甲醇,正己烷分别洗涤树脂5次,然后用高纯氮气将树脂吹干;m) 加入30 mL 95%三氟乙酸(水)溶液于反应器中,用高纯氮气鼓气三个小时,收集反应液,树脂用20 mL95%三氟乙酸(水)溶液洗涤树脂,收集反应液并与开始的反应液集中在一起;n) 用空气泵将溶剂吹干,加适量的去离子水,将所得黏性物质超声分散在水中,冷冻干燥;干燥好的粗产品经高效液相纯化(色谱柱为C18柱、梯度为水:乙腈=70:30~0:100)。制备得到凝胶因子1、2、3、5。
凝胶因子4在用未纯化过的凝胶因子3用液相法合成的;凝胶因子3与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A;D-氨基葡萄糖溶解在10 mL水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加20 mL的DMF,得溶液B;将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,粗产品冷冻干燥,经高效液相纯化(色谱柱为C18柱子,梯度为水:乙腈=70:30~0:100)。
合成凝胶因子1时,R1和R3是羟基,R2是氨基葡萄糖;产率为68%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ12.60 (s, 2H), 8.41-8.33 (d, 1H), 8.26-8.16 (m, 2H), 8.08-7.99 (d, 1H), 7.88-7.83 (d, 1H), 7.81-7.71 (m, 2H), 7.60-7.54 (s, 1H), 7.52-7.42 (m, 2H), 7.28-7.08 (m, 12H), 6.45-6.41 (s, 1H), 5.01-4.88 (m, 2H), 4.71-4.38 (m, 7H), 3.77-3.43 (m, 7H),3.18-2.96 (m, 3H), 2.85-2.61 (m, 5H). MS: calcd M+=871.88, obsd (M-H)-=870.3.
合成凝胶因子2时,R2和R3是羟基,R1是氨基葡萄糖;产率为68%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ12.62 (s, 2H), 8.41-8.35 (d, 1H), 8.23-8.15 (m, 2H), 8.02-7.98 (d, 1H), 7.88-7.83 (d, 1H), 7.82-7.72 (m, 2H), 7.58-7.56 (s, 1H), 7.52-7.42 (m, 2H), 7.29-7.10 (m, 12H), 6.51-6.36 (s, 1H), 4.97-4.88 (m, 2H), 4.68-4.37 (m, 7H), 3.66-3.44 (m, 7H), 3.18-2.93 (m, 3H), 2.71-2.51 (m, 5H). MS: calcd M+=871.88, obsd (M-H)-=870.3.
合成凝胶因子3时, R3是羟基,R1和R2是氨基葡萄糖;产率为64%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ12.57 (s, 2H), 8.34-8.28 (d, 1H), 8.23-8.15 (m, 2H), 8.03-7.99 (d, 1H), 7.85-7.81 (d, 1H), 7.80-7.69 (m, 3H), 7.57-7.53 (s, 1H), 7.49-7.41 (m, 2H), 7.27-6.98 (m, 12H), 6.44-6.35 (s, 2H), 4.99-4.86 (m, 4H), 4.69-4.33 (m,10), 3.70-3.39 (m, 10H), 3.16-2.95 (m, 4H), 2.83-2.52 (m, 6H). MS: calcd M+=1033.04, obsd (M+H)+=1033.40.
合成凝胶因子4时, R3,R1和R2是氨基葡萄糖;(产率71%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ8.37-8.33 (d, 1H), 8.27-8.19 (m, 2H), 8.04-7.99 (d, 1H), 7.88-7.83 (d, 1H), 7.80-7.71 (m, 4H), 7.60-7.55 (s, 1H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.29-6.98 (m, 12H), 6.49-6.38 (s, 3H), 4.99-4.91(s, 4H), 4.75-4.33 (m, 15H), 3.68-3.52 (m, 14H), 3.16-2.96 (m, 4H), 2.83-2.54(m, 7H). MS: calcd M+=1194.20, obsd (M+H)+= 1195.31.
合成凝胶因子5时,R1,R2和R3是羟基。产率为73%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ12.43 (s, 3H), 8.40 (d, 1H), 8.21 (d, 1H), 8.17 (d, 1H), 8.05 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.50-7.44 (m, 3H), 7.24-7.16 (m, 10H), 4.66-4.50 (m, 4H), 3.59-3.46 (m, 2H), 3.08-2.95 (m, 2H), 2.83-2.55 (m, 6H). MS: calcd M+=710.73, obsd (M+H)+=711.3.
Fmoc-Asp(glu)-OH是以Fmoc-Asp(OtBu)-OH为原料,经液相法合成,具体合成步骤如下:Fmoc-Asp(OtBu)-OH与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A。D-氨基葡萄糖溶解在10 ml水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加入20 mLDMF,得溶液B。将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,加适量的水,用浓盐酸调节pH=1,抽滤得粗产品,冷冻干燥后经柱色谱纯化分离(梯度为二氯甲烷:甲醇=50:1~5:1);分离后的纯品溶解在50%三氟乙酸(二氯甲烷)中,在室温下搅拌3小时,脱去天冬氨酸主链上羧基的保护基团;用空气泵将溶剂吹干,加入50 mL乙醚,在-20℃的冰箱中过夜;次日,将混合物抽滤,得到原料Fmoc-Asp(glu)-OH;(产率78%)1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ12.64 (s, 2H), 7.95-7.87 (d, 2H), 7.77-7.66 (m, 3H), 7.52-7.46 (d, 1H), 7.46-7.38 (t, 2H), 7.38-7.30 (t, 2H), 6.48-6.40 (d, 1H), 5.00-4.87 (m, 2H), 4.67-4.17 (m, 6H), 3.83-3.41 (m, 5H), 3.20-3.01 (m, 1H), 2.77-2.58 (m, 2H). MS: calcd M+=516.50, obsd (M-H)-=515.1。
所述的制备方法的化学反应式如下:
,其中:
。
为了研究这些在肽链上具有不同程度和不同位置糖基化分子的凝胶化性能,我们首先将所有的类似物分子溶解在水中,随后改变pH的来触发超分子水凝胶过程,并观察到所有的分子通过超分子相互作用形成在不同pH值和不同的最低凝胶浓度(MGC)的水凝胶。图1展示了凝胶因子1、2、3、4、5自组装成水凝胶的光学图像。凝胶因子1和2在糖肽链中在不同位置有一个糖基。他们在pH=7.4的水中形成透明的溶液,改变溶液pH为5.5形成最低成胶浓度分别为0.2和0.3 wt%的透明水凝胶。而没有经过糖基化的凝胶因子5在pH=4.5的水中形成浓度为1.2 wt%的半透明水凝胶。凝胶因子3和4与凝胶因子1,2和5相比在分子的不同位置修饰2或3个糖苷基团,这使得3和4的在pH=7.4的水中的溶解度下降,这可能是分子中可离子化的集团(例如,羧基)减少引起的。可以通过稍微提高pH值到碱性条件(即,pH值9.0)以及与温和加热的方法来提高它们在水中的溶解度。接着分别改变pH值到7.0和7.4,他们可以再最低成胶浓度为0.3和1.0wt%的情况下形成稳定的胶体。这一结果表明,肽的糖基化提供了一个有效的,简单的方法来构造由糖肽组建新型超分子水凝胶,其中糖苷基团可以改变水凝胶因子的溶解度(由于超分子水凝胶因子的pKa值的移位),并调整它们的凝胶化能力,这些都高度依赖于分子的含量和糖苷基团的位置。
生物相容性实验:
我们用CCK-8实验来测试细胞的活性。小鼠成纤维细胞被分散成浓度为2*104后,在96孔板中37℃培养。24小时后,原来的培养基被加了不同浓度的样品(20.0 μm, 50.0 μm, 100.0 μm, 200.0 μm, 500.0 μm)的细胞培养基取代。24小时后,用CCK-8溶液替代原来的培养基。最后,用光谱扫描多功能读数仪测试溶液在450 nm的光密度值(OD值)。细胞生存力表示为对照(未处理的)细胞数的百分比。在对照组的细胞生存能力被指定为100%。所有实验一式五份进行的。
由图2可以得出结论,我们合成的凝胶因子1, 2, 3, 4, 5的生物相容性很好,对细胞完全友好。
抗水解能力实验:
试验方法:将1.0 mg的样品溶解在pH=7.5的HEPES缓冲溶液中。然后加入蛋白酶K,使蛋白酶K的浓度为3.2 units/mL。所有的溶液在37℃的水浴中恒温培养24小时。在此期间,每到特定的时间取出100 μL进行高效液相分析。
糖基化也是生物系统中采用的以防止蛋白水解降解的有效策略,由于糖残基的存在可为蛋白酶接触多肽骨架周围提供的立体屏蔽。因此,我们通过将所有水凝胶因子与蛋白酶K在溶液中孵育,蛋白酶K是在检验分子生物稳定性方面被广泛接受的酶。如图3所示,水凝胶因子1、2、3和4表现出良好的抗蛋白酶消化的性质。凝胶因子1、2、3和4在和蛋白酶培养了24小时之后分别剩余48%,29%,52%和53%。由此可以看出他们的生物稳定性跟多肽糖基化的位置和程度有很大的关联,多肽上的糖苷在蛋白酶水解蛋白质的时候起到了保护多肽骨架的作用。相反的,没有经过糖基化凝胶因子5在4小时内就被蛋白酶完全水解,这表明凝胶因子5对蛋白酶K的水解毫无抵抗能力。这些结果表明,在多肽上面修饰糖苷基的方法在设计和合成用于生物组织工程的具有长效生物稳定性的超分子水凝胶因子的方法中提出新的策略。
抗菌实验:
平板计数法:水凝胶的抗菌性能是用平板计数法得到的。大肠杆菌(ATCC8739)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)用作抗菌试验的参考菌株。在接种前,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养在培养液中37℃培养24小时,以达到106 CFU/ mL的浓度,然后用LB溶液稀释,制备细菌悬浮液浓度为104 CFU/ mL。将50微升细菌悬浮液等分加入到每个凝胶的表面上,没有水凝胶存在下的细菌溶液用作对照。将所有的样品放在摇床上37℃培养4小时,稀释100倍后,取50μL涂板。涂好的固体培养基在37℃恒温箱中倒置培养16小时后取出,拍照,计数。每个菌落的实验一式三份。我们对不同样品之间控制细菌生长的差异性的显著性进行了统计。使用学生纽曼柯二氏测试进行多重比较。P<0.05的值被认为是显著的。(图6中图A和图B)。
实验中所用固体培养基成分为:胰蛋白胨4g,酵母提取物2g,NaCl 4g,琼脂粉6g,加超纯水至400 mL;124℃灭菌处理40min;每个一次性培养皿中20 ml固体培养基。
菌的SEM图像:我们用扫描电镜来观察细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)在水凝胶处理前后形态的差别。水凝胶处理前后的细菌溶液被滴在硅片上,用浓度为1%的四氧化锇在室温下固定一个小时。样品干燥后,表面经过喷涂铂,然后进行扫描电镜观察。
多价碳水化合物 - 蛋白质在宿主细胞和感染病原微生物之间的粘附和特异性识别的过程中起到了至关重要的作用。因此,多价糖类化合物被合成并用做细菌检测,抗菌和抑菌。这些化合物包括一些糖簇聚合物,糖簇树枝状分子,糖簇球状分子。由于凝胶因子1,2,3,4的自组装纳米纤维的潜在的多价效应,我们试图,用细菌检查它们细胞相互作用的潜力,并通过纳米纤维和细菌剂的细胞之间的多价碳水化合物受体的相互作用调节其增殖。在这项研究中,我们选择了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性和阳性菌的代表,以评估它们的抗菌功效,这两种细菌是人类感染中最常见的病原体。从图6中图A和图B中所示的数据,我们通过细菌平板计数的方法观察到我们的分子在抗菌性能上的差别。例如,在Asp(2)的侧链上修饰糖苷基团的凝胶因子2 具有最高的抗菌性,并且诱导的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在与对照实验(无水凝胶)比较,其死亡率分别48%和57%。然而,在天冬氨酸(1)的侧链上修饰糖苷基团的水凝胶因子1中,显示相对低的毒性(33%和39%)。由于水凝胶因子3和4在其分子结构中糖苷的密度增加,使他们与水凝胶5相比显示出可比的抗菌活性,导致在大肠杆菌中死亡率分别为40%,35%,和31%,金黄色葡萄球菌中的死亡率分别为22%,15%,和46%。我们统计由水凝胶因子1、2、3、4和5得到的细胞死亡情况彼此不同,这表明我们的凝胶因子对大肠杆菌抗增殖作用是有差别的。
深入了解我们的合成糖肽水凝胶因子的抗菌机制,我们使用了水凝胶因子2作为代表来检查与水凝胶因子2孵育后细菌的形态学变化。如图6 中分图C和D所示,而未经处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显示出清晰的边缘和平滑的表面,在水凝胶因子2处理后的细胞呈现完全不同的形态,附着并覆盖所述的细胞,其表面纤维状结构的存在影响细胞的质量交换和细胞迁移,导致增殖抑制。这些结果表明,肽的糖基化在用于产生具有抗菌活性超分子水凝胶上具有很大的潜力,并且这种抗菌作用高度依赖于糖苷在肽链的密度和位置,这是与以前的研究结果是一致的,自组装的结构的表面上的基团的空间位阻或糖苷的拥挤可以降低其细菌抑制的功效。
Claims (10)
1.一种抗菌水凝胶因子,其特征在于:所述的抗菌水凝胶因子化学结构式如下:
,其中:
。
2.一种抗菌水凝胶因子的制备方法,其特征在于:所述的制备方法包括以下步骤:
a) 1g氯三苯甲基氯树脂(100~200目和0.3~0.8 mmol/g)放在固相反应器中,加入40 mL无水二氯甲烷,用高纯氮鼓气震荡30分钟后,除去二氯甲烷,用无水DMF洗三次树脂;b) Fmoc-Asp(R1)-OH和DIEA溶解在30 mL无水DMF中,并将溶液加入到已经溶胀好的树脂中;用高纯氮鼓气震荡一个小时后,除去反应液,用无水DMF洗三次树脂;c) 加入20 mL猝灭溶剂(二氯甲烷:甲醇:DIEA=80:15:5),在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟,除去反应液,再次加入20 mL猝灭溶剂,在高纯氮气鼓气震荡下反应十分钟后,除去反应液,树脂用无水DMF洗三次;d) 加入40 mL 20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;e) Fmoc-Asp(R2)-OH、DIEA和HBTU溶解在无水DMF中配成溶液,加入到树脂中,反应30分钟后,用无水DMF洗涤树脂三次,除去反应液;f) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;g) Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;h) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;i)Fmoc-Phe-OH,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;j) 加入40 mL20%哌啶(无水DMF)溶液并与树脂反应30分钟后,分别用20%哌啶(无水DMF)溶液和无水DMF洗涤三次树脂,除去反应液;k) 把2-萘乙酸,DIEA和HBTU溶解在无水DMF中,与树脂反应30分钟后,用无水DMF洗涤三次,除去反应液;l) 用DMF,DCM,甲醇,正己烷分别洗涤树脂5次,然后用高纯氮气将树脂吹干;m) 加入30 mL 95%三氟乙酸(水)溶液于反应器中,用高纯氮气鼓气三个小时,收集反应液,树脂用20 mL95%三氟乙酸(水)溶液洗涤树脂,收集反应液并与开始的反应液集中在一起;n) 用空气泵将溶剂吹干,加去离子水,将所得黏性物质超声分散在水中,冷冻干燥;干燥好的粗产品经高效液相纯化,色谱柱为C 18柱,梯度为水:乙腈=70:30~0:100;制备得到凝胶因子1、2、3或5;
凝胶因子4再用未纯化过的凝胶因子3用液相法合成的;将未纯化的凝胶因子3与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A;D-氨基葡萄糖溶解在10 mL水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加20 mL的DMF,得溶液B;将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,粗产品冷冻干燥,经高效液相纯化(色谱柱为C18柱,梯度为水:乙腈=70:30~0:100)后制备得到凝胶因子4;
合成凝胶因子1时,R1和R3是羟基,R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子2时,R2和R3是羟基,R1是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子3时,R3是羟基,R1和R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子4时,R3,R1和R2是氨基葡萄糖;
合成凝胶因子5时,R1,R2和R3是羟基;
所述的水凝胶因子的制备方法的化学反应式如下:
,其中:
。
3.根据权利要求2所述的一种抗菌水凝胶因子的制备方法,其特征在于:所述的Fmoc-Asp(R1)-OH或Fmoc-Asp(R2)-OH,当R1或R2为Glu时,其制备方法为:以Fmoc-Asp(OtBu)-OH为原料,经液相法合成,具体合成步骤如下:Fmoc-Asp(OtBu)-OH与NHS和DIC在DMF中,在室温下搅拌8小时,得溶液A;D-氨基葡萄糖溶解在10 mL水中,用Na2CO3调节pH=8~9,加入20 mLDMF,得溶液B;将溶液A逐滴加入到溶液B中;期间,若有浑浊出现,再补加DMF;室温下搅拌12小时后,用空气泵将溶剂吹干,加水,用浓盐酸调节pH=1,抽滤得粗产品,冷冻干燥后经柱色谱纯化分离(梯度为二氯甲烷:甲醇=50:1~5:1);分离后的纯品溶解在50%三氟乙酸(二氯甲烷)中,在室温下搅拌3小时,脱去天冬氨酸主链上羧基的保护基团;用空气泵将溶剂吹干,加入50 mL乙醚,在-20℃的冰箱中过夜;次日,将混合物抽滤,得到原料Fmoc-Asp(glu)-OH。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备细胞培养基中的用途。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备医用材料中的用途,其特征在于,所述的医用材料包括组织再生材料、组织修复材料、医用水凝胶材料或医用抗菌材料。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备药品中的用途,其特征在于,所述的药品包括膏剂、片剂、口服剂、注射剂或酊剂。
7.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备日化用品中的用途,其特征在于,所述的日化用品包括护肤品、面膜、眼膜或护手霜。
8.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备农业材料中的用途,其特征在于,所述的农业材料包括农业固体培养基材料或大棚薄膜材料。
9.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备农业用品中的用途,其特征在于,所述的农业用品包括动植物用药膏或水土保湿剂。
10.根据权利要求1所述的一种抗菌水凝胶因子在制备工业隔热涂层材料中的用途。
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