CN104770230A - 一种生产沉香的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种生产沉香的方法。所述方法在沉香树或白木香树的树干或枝条上钻孔，将包裹有丝核菌属、尖镰孢霉、枝顶孢霉、紧密枝顶孢霉、内生枝顶孢霉和青霉属菌的混合菌种的微胶囊塞入孔中，然后封住孔洞，间隔1-2个月加入一次，处理3-24个月后，然后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香。本发明将现有刺激结香的混合菌种通过海藻酸钠-氯化钙体系包裹并放置于沉香树或白木香树中，菌种释放并在树体中生长繁殖，共同刺激树干或枝条产生沉香，所得沉香的醇溶性浸出物、沉香油含量以及沉香油中倍半萜含量均高于现有方法。

Description

一种生产沉香的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种生产沉香的方法。
背景技术
沉香(agarwood)是为瑞香科(Thymelaeaceae)植物沉香(Aquilaria agallochaRoxb.)或白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.]含有黑色树脂的木质部。前者主产印度和马来西亚等地，我国称其为进口沉香，后者主产我国海南、广东和广西等省区，称为国产沉香或土沉香。沉香不仅是我国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材，更是一种名贵的天然香料。沉香在中东、中国和日本至少有3000年的历史，在印度和法国，甚至在圣经的旧约全书中也有沉香的记载。目前沉香仍然是世界上最昂贵的香料之一，仅新加坡每年出口沉香的价值就超过12亿美元。
健康的沉香或白木香在正常生长情况下无法生成沉香，只有在受到外界伤害之后，其伤口附近会逐步产生含有树脂的木块，通常要积累数年才能形成，所以自然条件下沉香的产出率非常低。为此，人们经通过科学研究和实践经验，总结出“砍伤法”、“半断枝法”、“凿洞法”、“人工接菌法”和“化学法”等人工结香的方法。
砍伤法、半断枝法和凿洞法虽然结香效果好，但操作麻烦，效率低下。化学法因其采用化学试剂刺激，要求树龄在5年以上，且收获沉香时整棵树被砍倒，不能可持续利用。人工接菌法因其接近天然产香条件，且可以在树木的任何部位实施结香操作，对树木损坏小，采香后树木还可以再进行结香操作，因此在实践中被广泛应用。目前人工接菌法是把单株菌或多种菌株的混合液利用不同方法接种至白木香或沉香树干中，如申请号201210197582.8的专利公布的将多种菌株利用瓶插法接种至白木香中制备沉香的技术方案。虽然该人工接菌方法取得了一定的效果，且操作简单，但其所选择的多种菌并非最佳组合，接入树干中时会产生生存竞争，可能使部分种类的菌株死亡，影响菌株之间的协同作用，使得沉香得率不够高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产沉香的方法，使得该方法生产的沉香能够提升沉香油以及沉香油中倍半萜含量，提升沉香品质。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生产沉香的方法，在沉香树或白木香树的树干或枝条上钻孔，将包裹有混合菌种的微胶囊塞入孔中，然后封住孔洞，间隔1-2个月加入一次，处理3-24个月后，然后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香；
其中，所述混合菌种为丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、尖镰孢霉(Fusariumoxysporum)、枝顶孢霉(Acremonium furcatum)、紧密枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)和青霉属菌(Penicilliumsp.)。
针对现有人工接菌法中菌种搭配不合理的缺陷，本发明调整混合菌种的组成，以较优的丝核菌属(Rhizoctonia sp.，菌种编号为CPCC480164)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum，菌种编号为CPCC810100或CPCC810101)、枝顶孢霉(Acremonium furcatum，菌种编号为CGMCC3.5370)、紧密枝顶孢霉(Acremonium strictum，菌种编号为ACCC30554)、内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium，菌种编号为CCTCCM206118)和青霉属菌(Penicillium sp.，菌种编号为CPCC441453)刺激白木香树或沉香树，依靠各菌种的协同作用，提高沉香油以及沉香油中倍半萜含量，提升沉香品质。上述微生物菌种均可以通过市售方式获得，如可购自于中国科学院微生物研究所。
作为优选，所述微胶囊还包括海藻酸钠和氯化钙。
更优先地，所述微胶囊由混合菌种、海藻酸钠和氯化钙制得。
进一步优选地，所述微胶囊由以下方法制得：
将所述混合菌种培养后分别与海藻酸钠溶液混合，然后缓慢滴入氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将所述各个菌株的微胶囊混合，获得所述包裹有混合菌种的微胶囊。
最优选地，所述微胶囊由以下方法制得：
将所述混合菌种经马铃薯液体培养基培养后分别与质量百分比为3％的海藻酸钠溶液混合，然后缓慢滴入等体积的4.5％氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将所述各个菌株的微胶囊混合，获得所述包裹有混合菌种的微胶囊。
微胶囊制备方法中作为优选，所述混合菌种经培养后的培养液与海藻酸钠溶液的体积比为1:30；作为优选，所述培养的温度为25-27℃、时间为2-3天。
作为优选，本发明所述包裹有混合菌种的微胶囊中各个菌种的微胶囊体积相同。
作为优选，所述处理时间为6-12个月。
作为优选，所述微胶囊的用量为每孔5-10g。
此外，本发明对钻孔数量不加限制，可以为一个，也可以为多个。
本发明将现有刺激结香的混合菌种通过海藻酸钠-氯化钙体系包裹，然后放入沉香或白木香树干内部，菌种释放并在树体中生长繁殖，共同刺激树干或枝条产生沉香。经过和以往的瓶插法(申请号201210197582.8)对比，结果显示，本发明所得的沉香中醇溶性浸出物、沉香油含量以及沉香油中倍半萜含量和上述方法所得沉香均高于瓶插法所得沉香。
同时，本发明所生产的沉香和野生沉香经GC-MS分析，在挥发油成分上两者基本一致，含有野生沉香特征成分白木香醛、马兜铃烯、α-绿叶烯等倍半萜类化合物，完全满足市场需求和要求，且菌种微胶囊可用于大规模、标准化、商品化的生产，推广方便。
具体实施方式
本发明公开了一种生产沉香的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在具体实施方式中，本发明对生产的沉香随机挑选三份样品的醇浸出物进行了含量测定，同一批样品平行试验5次，得实验产出的沉香样品浸出物含量均高于10％，达到药典要求水平。沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测结果显示得到提高。检测方法如下：
醇溶性浸出物含量检测：
割取的沉香参照2010年《中华人民共和国药典》所载醇溶性浸出物测定法项下的热浸法制取沉香油，并对所得沉香样品的醇溶性浸出物含量进行了测定。精密称取沉香药材粉末2.0g，置250ml的锥形瓶中，精密加入无水乙醇50ml，塞紧，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷，取下圆底烧瓶，塞紧，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，即得沉香油。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算药材中醇溶性浸出物的含量(％)。
沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测：
精确称取样品10.0g，粉碎后分别加入100ml乙醚于室温下浸提三次，回收乙醚后即得挥发油。
将样品的挥发油进行GC-MS分析。仪器为美国惠普公司的HP6890/5973GC/MS联用仪。色谱柱为HP-INno-wax Polyethylene Glycol(30.0m×320m×0.25m)弹性石英毛细管柱。程序升温：柱温60℃，保留2min，以4℃/min升温至230℃，保持20min，气化室温度250℃。载气为高纯He(99.999％)；柱前压5.08psi，载气流量2.0ml/min；进样量1μl(丙酮溶液)；分流比10：1。
离子源为EI源；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6A；倍增器电压1412V；接口温度280℃；质量扫描范围为10-550amu。分析结果通过HPMSD化学工作，结合Nist2005标准质谱图库和WILE275质谱图库进行鉴定，采用峰面积归一化法计算相对含量。
以下就本发明所提供的一种生产沉香的方法做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述包裹混合菌种的微胶囊
将丝核菌Rhizoctonia sp.(CPCC480164)、尖镰孢霉Fusarium oxysporum(CPCC810100)、紧密枝顶孢霉Acremonium strictum(ACCC30554)、内生枝顶孢霉Acremonium endophytium(CCTCCM206118)、青霉属菌Penicillium sp.(CPCC441453)各菌种分别接种于马铃薯液体培养基中，25℃摇瓶培养至菌体生长旺盛，获得培养液。将枝顶孢霉Acremonium furcatum(CGMCC3.5370)接种于马铃薯液体培养基中，27℃摇瓶培养至菌体生长旺盛，获得培养液。
将上述菌株的培养液分别与3％的海藻酸钠(质量分数)溶液按照体积比为1:30混合，然后缓慢滴入等体积的4.5％的氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将各个菌种的微胶囊等体积混合，装入胶囊，获得包裹混合菌种的微胶囊。
实施例2：制备本发明所述包裹混合菌种的微胶囊
将丝核菌Rhizoctonia sp.(CPCC480164)、尖镰孢霉Fusarium oxysporum(CPCC810101)、紧密枝顶孢霉Acremonium strictum(ACCC30554)、内生枝顶孢霉Acremonium endophytium(CCTCCM206118)、青霉属菌Penicillium sp.(CPCC441453)各菌种分别接种于马铃薯液体培养基中，25℃摇瓶培养至菌体生长旺盛，获得培养液。将枝顶孢霉Acremonium furcatum(CGMCC3.5370)接种于马铃薯液体培养基中，27℃摇瓶培养至菌体生长旺盛，获得培养液。
将上述菌株的培养液分别与3％的海藻酸钠(质量百分数)溶液按照体积比为1:30混合，然后缓慢滴入等体积的4.5％的氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将各个菌种的微胶囊等体积混合，装入胶囊，获得包裹混合菌种的微胶囊。
实施例3：人工接菌法生产沉香以及试验对比
1、本发明方法
选取3年树龄的白木香树，在距离树木顶端5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻5个深4cm的孔，每个孔中塞入5g实施例1制备的微胶囊，然用橡胶塞封住孔洞。6个月后割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
2、对比方法
选取3年树龄的白木香树，在距离树木顶端5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻5个深4cm的孔，按照专利201210197582.8具体实施方式记载的方法，将混合菌种通过瓶插法注入孔中，然用橡胶塞封住孔洞。6个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
3、试验检测
对上述两种方法制备的沉香以及野生沉香进行醇溶性浸出物含量、沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测，见表1。野生沉香采自海南屯昌县。
表1沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 沉香油含量％ 沉香油中倍半萜含量％
本发明方法 11.7 2.0 17.0
对比方法 10.8 1.5 15.4
野生沉香 20.2 5.6 35.7
上表数据显示，本发明不止提高了沉香油和沉香油中倍半萜含量，在醇溶性浸出物方面的含量也得到提高。
实施例4：人工接菌法生产沉香以及试验对比
1、本发明方法
选取5年树龄白木香树，在距离顶端5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深4cm的孔。每个孔中塞入7g实施例2制备的微胶囊，然用橡胶塞封住孔洞。12个月后割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
2、对比方法
选取5年树龄白木香树，在距离顶端5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深4cm的孔。按照专利201210197582.8具体实施方式记载的方法，将混合菌种通过瓶插法注入孔中，然用橡胶塞封住孔洞。12个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
3、试验检测
对上述两种方法制备的沉香以及野生沉香进行醇溶性浸出物含量、沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测，见表2。野生沉香采自海南屯昌县。
表2沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 沉香油含量％ 沉香油中倍半萜含量％
本发明方法 15.8 3.7 29.4
对比方法 14.6 3.3 25.5
野生沉香 20.2 5.6 35.7
上表数据显示，本发明不止提高了沉香油和沉香油中倍半萜含量，在醇溶性浸出物方面的含量也得到提高。
实施例5：微生物微胶囊刺激生产沉香以及试验对比
1、本发明方法
选取7年树龄的沉香树，在距离顶端10cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻6个深5cm的孔。每个孔中塞入7g实施例1制备的微胶囊，然用橡胶塞封住孔洞。24个月后割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
2、对比方法
选取7年树龄的沉香树，在距离顶端10cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻6个深5cm的孔。按照专利201210197582.8具体实施方式记载的方法，将混合菌种通过瓶插法注入孔中，然用橡胶塞封住孔洞。24个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
3、试验检测
对上述两种方法制备的沉香以及野生沉香进行醇溶性浸出物含量、沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测，见表3。野生沉香采自海南屯昌县。
表3沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 沉香油含量％ 沉香油中倍半萜含量％
本发明方法 16.7 5.1 31.1
对比方法 15.3 4.0 25.8
野生沉香 20.2 5.6 35.7
上表数据显示，本发明不止提高了沉香油和沉香油中倍半萜含量，在醇溶性浸出物方面的含量也得到提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生产沉香的方法，其特征在于，在沉香树或白木香树的树干或枝条上钻孔，将包裹有混合菌种的微胶囊塞入孔中，然后封住孔洞，间隔1-2个月加入一次，处理3-24个月后，然后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香；
其中，所述混合菌种为丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、尖镰孢霉(Fusariumoxysporum)、枝顶孢霉(Acremonium furcatum)、紧密枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)和青霉属菌(Penicilliumsp.)。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述微胶囊还包括海藻酸钠和氯化钙。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述微胶囊由混合菌种、海藻酸钠和氯化钙制得。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述微胶囊由以下方法制得：
将所述混合菌种培养后分别与海藻酸钠溶液混合，然后缓慢滴入氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将所述各个菌株的微胶囊混合，获得所述包裹有混合菌种的微胶囊。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述微胶囊由以下方法制得：
将所述混合菌种经马铃薯液体培养基培养后分别与质量百分比为3％的海藻酸钠溶液混合，然后缓慢滴入等体积的4.5％氯化钙溶液，缓慢搅拌，真空干燥得各个菌种的微胶囊，将所述各个菌株的微胶囊混合，获得所述包裹有混合菌种的微胶囊。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述混合菌种经培养后的培养液与海藻酸钠溶液的体积比为1:30。
7.根据权利要求1、4或5所述方法，其特征在于，所述包裹有混合菌种的微胶囊中各个菌种的微胶囊体积相同。
8.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述培养的温度为25-27℃、时间为2-3天。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述处理时间为6-12个月。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述微胶囊的用量为每孔5-10g。
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