KR20170016718A - 모나콜린 k 함량과 항산화활성이 증가된 홍국발아현미의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍국발아현미의 제조방법으로서, 더욱 자세하게는 발아현미를 기질로 하여 홍국균 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)을 접종하여 발효시키는 홍국발아현미 제조방법 및 이를 통해 제조된 모나콜린 K 함량과 항산화활성이 증가된 기능성 홍국발아현미에 관한 것이다. 본 발명에 따른 홍국발아현미 제조방법은 특정 온도 및 기간 동안 발아가 이루어진 발아현미를 기질로 하여 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus 305-9: KFCC11410P)를 접종하여 발효시킴으로써 총 모나콜리 K의 생성량을 두드러지게 증대시킬 수 있으며, 독소성분인 시트리닌(citrinin)을 생성하지 않을 뿐만 아니라, 항산화 활성도 향상시킬 수 있는바, 이러한 제조방법을 통해 기능성 물질을 다양 함유하는 특수·기능성 고품질 홍국쌀 생산에 기여할 수 있다. 특히, 본 발명의 제조방법으로 생산된 홍국발아현미는 항산화 활성과 더불어 다량의 모나콜린 K를 함유하고 있는바, 인체 내의 콜레스테롤 수치를 완화하여 고지혈증의 예방 또는 개선에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 홍국발아현미의 제조방법으로서, 더욱 자세하게는 발아현미를 기질로 하여 홍국균 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)을 접종하여 발효시키는 홍국발아현미 제조방법 및 이를 통해 제조된 모나콜린 K 함량과 항산화활성이 증가된 기능성 홍국발아현미에 관한 것이다.
모나스커스(Monascus)속 곰팡이인 홍국균은 특유의 적색으로 인하여 중국과 대만을 중심으로 600여년 이상 전부터 발효식품의 제조뿐 아니라 천연색소나 보존제로 사용되어 왔으며, 백미에 배양한 홍국쌀은 항균활성과 함께 콜레스테롤 생합성 억제, 혈압강하 및 혈관이완 효과 등 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히 모나콜린 K(monacolin K)는 콜레스테롤 생합성 경로에서 콜레스테롤 합성효소(HMG-CoA reductase)의 저해제로서 작용하여 콜레스테롤의 생합성을 억제하는 것으로 보고되었으며, 우수한 생리활성으로 건강기능식품 소재로 활용도가 높아지고 있다. 식품의약품안전처에서는 기능성원료로서 홍국을 활성형 모나콜린 K가 포함된 총 모나콜린 K를 500 mg/kg 이상 함유하고 시트리닌(citrinin)은 0.05 mg/kg 이하여야 하며, 일일섭취량을 총 모나콜린 K로서 4～8 mg으로 규정하고 있다.
홍국과 관련된 연구는 발효과정 중 시트리닌(citrinin) 생성량을 감소시킬 수 있는 균주와 배양방법을 개발하는 연구, 모나콜린 K 생성량을 증가시키기 위한 균주탐색, 기질의 종류 및 배양방법 최적화에 관한 연구들이 주를 이루고 있다. 또한 홍국균에 의한 모나콜린 K 생성량은 기질의 탄소원으로서 글루코스 함량, 배양 시 홍국균과 기질이 접촉하는 비표면적과 산소의 이동성에 큰 영향을 받는 것으로 보고되었다.
한편, 벼의 종자는 씨눈과 배젖에 있는 비활성 상태의 DNA 유전정보와 각종 효소, 영양소 등이 외적 환경 여건이 좋아지면 활성화되어 발아되는데, 일반적으로 발아가 진행됨에 따라 다양한 성분들이 증가되거나 생성되고 그에 따라 다양한 생리활성이 증가되는 경향이 있다고 보고되고 있다. 특히 발아된 현미는 감마-오리자놀(γ-oryzanol)이나 아라비녹실란(arabinoxylane), 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid), 비타민 E 등의 생리활성 성분들이 증가하고 발아 중에 효소가 활성화되어 영양성분들의 체내 흡수가 용이하게 되는 것으로 보고되었다.
종래기술에서는 홍국균을 배양하여 모나콜린 K를 생성시 기질로서 곡류 주로 백미를 사용하고 있으며 일부 현미를 이용한 연구가 보고된 바 있으나, 현미의 발아조건을 달리하여 제조한 발아현미를 기질로 사용한 발명은 시도된 바가 없다.
이에 본 발명자는 다양한 발아 조건에서의 현미발아를 기질로 하여 홍국균 발효 시 기능성분인 모나콜린 K 함량과 항산화활성을 증진시킬 수 있는 홍국발아현미 제조공정을 연구하던 중, 특정 온도 및 기간 동안 발아가 이루어진 발아현미를 기질로 하여 홍국균 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus 305-9: KFCC11410P)를 접종하여 발효시킨 홍국발아현미의 경우 총 모나콜린 K의 생성량이 두드러지게 증대되며, 독소성분인 시트리닌(citrinin)을 생성하지 않을 뿐만 아니라, 항산화활성도 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 총 모나콜린 K의 생성량의 증진과 더불어 우수한 항산화활성을 이끌어낼 수 있는 홍국발아현미의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 기능성 물질인 모나콜린 K를 다량으로 포함하며 항산화활성이 우수한 홍국발아현미를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 a) 현미를 발아시키는 단계; b) 발아현미에 홍국균을 접종하여 발효시키는 단계; 및 c) 홍국으로 발효시킨 발아현미를 살균한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 홍국발아현미의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 현미를 30~40℃의 온도조건에서 1~7일 동안 발아시키는 단계일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 홍국균은 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 발아현미에 홍국균을 접종한 후 온도 25~45℃, 습도 70-95%에서 20~30일 동안 발효시키는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 홍국발아현미를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍국발아현미는 총 모나콜린 K 함량이 500-2,000 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍국발아현미는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 각각 1.0~20.0 mg/g과 0.5~3.0 mg/g일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍국발아현미는 DPPH 라디칼 소거활성이 10 내지 25 mg TE/g일 수 있다.
본 발명에 따른 홍국발아현미 제조방법은 특정 온도 및 기간 동안 발아가 이루어진 발아현미를 기질로 하여 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus 305-9: KFCC11410P)를 접종하여 발효시킴으로써 총 모나콜리 K의 생성량을 두드러지게 증대시킬 수 있으며, 독소성분인 시트리닌(citrinin)을 생성하지 않을 뿐만 아니라, 항산화 활성도 향상시킬 수 있는바, 이러한 제조방법을 통해 기능성 물질을 다양 함유하는 특수·기능성 고품질 홍국쌀 생산에 기여할 수 있다. 특히, 본 발명의 제조방법으로 생산된 홍국발아현미는 항산화 활성과 더불어 다량의 모나콜린 K를 함유하고 있는바, 인체 내의 콜레스테롤 수치를 완화하여 고지혈증의 예방 또는 개선에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 모나콜린 K 표준품의 고성능액체크로마토그라피 크로마토그램을 나타낸 것이며, 도 1b는 본 발명에 따라 제조된 홍국발아현미의 고성능액체크로마토그라피 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 홍국발아현미의 제조과정을 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 홍국발아현미의 제조과정을 나타낸 공정도이다.
본 발명은 모나콜린 K 함량과 항산화활성을 증가시킬 수 있는 홍국발아현미의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 모나콜린 K 함량과 항산화활성을 증가시키기 위하여 현미를 발아시키는 최적의 발아조건 확립과 더불어, 특정 홍국균 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus 305-9: KFCC11410P)을 통해 발효시키는 것을 가장 큰 특징으로 한다.
본 발명의 홍국발아현미는 발아현미에 홍국을 접종하여 발효시킨 것을 의미한다.
본 발명의 홍국발아현미의 제조방법은 a) 현미를 발아시키는 단계; b) 발아현미에 홍국균을 접종하여 발효시키는 단계; 및 c) 홍국으로 발효시킨 발아현미를 살균한 후 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 a) 단계는 현미를 발아시키는 단계로서, 자세하게는 현미를 30~40℃의 온도 조건에서 1~7일 동안 발아시키는 과정을 통해 현미를 발아시키는 발아공정이다.
본 발명의 상기 b) 단계는 발아현미에 홍국균을 접종하여 발효시키는 단계로서, 자세하게는 상기 a)단계를 통해 제조된 발아현미에 홍국균으로 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)를 접종하여 온도 25~45℃, 습도 70-95%에서 20~30일 동안 발효시키는 발효공정이다.
본 발명의 상기 c) 단계는 홍국으로 발효시킨 발아현미를 살균한 후 건조시키는 단계로서, 자세하게는 상기 b) 단계를 통해 제조되는 홍국으로 발효시킨 발아현미를 100℃에서 25~35분간 살균한 다음, 50~60℃의 열풍건조기에서 수분함량이 10% 이하가 되도록 건조하는 살균건조공정이다.
한편, 본 발명의 홍국발아현미의 제조방법은 상기 a) 단계 이전에 현미를 도정하지 않은 벼를 현미기를 사용하여 현미를 분리하는 현미제조공정 및 현미를 세척한 후 암소에서 침지하는 침지공정을 더 포함할 수 있으며, 상기 a) 단계 이후 및 b) 단계 이전에 발아현미를 세척한 후 멸균기를 이용하여 멸균하는 멸균공정을 더 포함할 수 있다.
본 발명자는 다양한 온도(32℃, 35℃, 37℃) 및 기간(1, 2, 3, 4일) 조건에서 발아시킨 발아현미에 홍국균인 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus 305-9: KFCC11410P)를 접종하여 발효시킴으로써 총 모나콜리 K의 생성량을 두드러지게 증대시킬 수 있으며, 독소성분인 시트리닌(citrinin)을 생성하지 않을 뿐만 아니라, 항산화 활성도 향상시킬 수 있음을 실험을 통해 객관적으로 확인하였다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 방법으로 제조된 홍국발아현미를 제공한다.
본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 홍국발아현미는 총 모나콜린 K 함량이 500-2,000 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 홍국발아현미는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 각각 1.0~20.0 mg/g과 0.5~3.0 mg/g일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 상기 홍국발아현미는 DPPH 라디칼 소거활성이 10 내지 25 mg TE/g일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
본 발명의
홍국발효
발아현미 제조
<1-1> 발아현미 제조
본 발명에서는 일반 벼 품종인 일품 벼(Oryza sativa L.)를 농가로부터 구매하여 현미기(FC2K, Kett Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 현미를 제조하였다. 현미를 20℃의 물로 수세하여 이물질을 제거하고 1일 2회 물갈이를 실시하며 3일간 암소에서 침지시켰다. 침지된 벼는 습도 85%로 조정된 발아기(WGC 450, Daihan Scientific Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 발아 온도 32, 35 및 37℃, 발아 기간 1, 2, 3 및 4일의 조건으로 발아시켰다.
<1-2>
모나스커스
필로서스
305-9(
KFCC
11410P) 배양액 제조
본 발명에서 사용한 홍국균 모나스커스 필로서스 305-9(KFCC 11410P)는 (주)에프앤피로부터 제공받았으며, 접종액은 PDA(potato dextrose agar) 배지에 홍국균을 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 콜로니를 seeding 배지에 접종한 후 shaking incubator(VS-1400LH, Vision Sci. Co., Ltd, Korea)에서 130 rpm, 30℃에서 5일간 배양하였다. 배양액 0.5 L를 발효배지 100 L에 접종한 후 30℃, 0.5기압의 조건에서 산소를 공급하며 3일간 후배양하여 제조하였다.
<1-2> 발아현미의
홍국
발효
상기 실시예<1-1>을 통해 준비된 발아온도(32℃, 35℃, 37℃)와 기간(1, 2, 3, 4일)을 달리하여 제조한 총 12종류의 발아현미는 각각 세척한 후 물기를 제거하고 에어 필터(air filter)가 부착된 멸균 폴리에틸렌 백(polyethylene bag)에 1 kg씩 입봉하고 121℃에서 120분간 멸균하였다. 이후, 미리 준비해둔 모나스커스 필로서스 305-9(Monascus pilosus 305-9: KFCC 11410P) 배양액 100 mL을 접종한 후 온도 29±1℃, 습도 75±5%의 배양기에서 20일간 배양하였다. 발효물을 100℃에서 30분간 2차 살균한 후 55℃에서 수분함량이 10% 이하가 되도록 건조하고 60mesh 이하로 분쇄하여 본 발명의 홍국발효 발아현미를 제조하였다.
| 발아 온도 | 발아 기간 | 실험군 |
| 32℃ | 1일 | 실험군 1 |
| 2일 | 실험군 2 | |
| 3일 | 실험군 3 | |
| 4일 | 실험군 4 | |
| 35℃ | 1일 | 실험군 5 |
| 2일 | 실험군 6 | |
| 3일 | 실험군 7 | |
| 4일 | 실험군 8 | |
| 37℃ | 1일 | 실험군 9 |
| 2일 | 실험군 10 | |
| 3일 | 실험군 11 | |
| 4일 | 실험군 12 |
<
실시예
2>
홍국발효
발아현미 에탄올 추출물 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미의 홍국색소 및 항산화 활성 측정을 위하여 에탄올 추출물을 제조하였다.
자세하게는 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미 분말 5g에 75% 에탄올(v/v) 50 mL을 가하여 1시간씩 3회 초음파 추출한 후 여과(Whatman No. 42, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)하였다. 여과액을 회전식 진공농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)로 40℃에서 용매를 완전히 제거한 후 동결건조(Freeze dryer, FD5508, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)하고 -18 냉동고에 보관하면서 하기 실험의 분석용 시료로 사용하였다.
<
실험예
1>
색도 및
홍국색소
측정
에탄올 추출물의 색변화는 색차계(CR-200, Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 명암도를 나타내는 L값(lightness), 적색도를 나타내는 a값(redness), 황색도를 나타내는 b값(yellowness)을 측정하였다. 홍국색소(Monascus pigment)는 에탄올 추출물 중 일부를 취하여 여과(Whatman No. 42)한 후 spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 각각 500nm(red color group), 470nm(orange color group) 및 400nm(yellow color group)에서 흡광도를 측정하여 그 값으로 나타내었다.
그 결과는 하기 표 2 및 3에서 자세히 나타내었다.
| 발아 온도 (℃) |
발아 기간 (day) | 명도 (L-value) |
적색도 (a-value) |
황색도 (b-value) |
| 백미 | 45.11±0.03b | 1.68±0.04m | 0.15±0.01n | |
| 현미 | 44.26±0.03c | 2.88±0.03l | 0.91±0.01m | |
| 32 | 1 | 37.67±0.03n | 9.25±0.12a | 5.99±0.02g |
| 2 | 38.88±0.04m | 8.33±0.04b | 7.25±0.02c | |
| 3 | 42.88±0.03e | 4.17±0.01j | 4.30±0.03k | |
| 4 | 43.54±0.01d | 3.47±0.02k | 4.44±0.01j | |
| 35 | 1 | 41.05±0.02h | 5.61±0.04g | 7.07±0.02d |
| 2 | 39.73±0.02j | 7.06±0.06e | 7.35±0.03b | |
| 3 | 41.71±0.02g | 5.11±0.03h | 5.57±0.01h | |
| 4 | 45.27±0.01a | 1.16±0.01n | 1.03±0.02l | |
| 37 | 1 | 39.27±0.01l | 7.43±0.03d | 7.43±0.01a |
| 2 | 39.83±0.01i | 6.87±0.01f | 6.76±0.02f | |
| 3 | 39.39±0.04k | 7.59±0.05c | 6.94±0.03e | |
| 4 | 42.04±0.01f | 4.82±0.04i | 5.43±0.03i | |
| 백미와 현미는 발아시키지 않은 무발아 백미 및 현미이다. a~n은 95% 유의수준에서 일원배치분산분석을 실시하고, 사후분석으로 Duncan의 다중분석을 실시한 결과이다. | ||||
| 발아 온도 (℃) |
발아 기간 (day) |
적색계(500 nm) | 오렌지색계(470 nm) | 황색계(400 nm) |
| 백미 | 0.122±0.001l | 0.099±0.001l | 0.181±0.001j | |
| 현미 | 0.235±0.007k | 0.178±0.004j | 0.353±0.010i | |
| 32 | 1 | 2.320±0.024a | 1.909±0.017a | 4.663±0.026a |
| 2 | 1.669±0.038b | 1.398±0.033b | 3.760±0.075b | |
| 3 | 0.494±0.017i | 0.420±0.014h | 1.169±0.041h | |
| 4 | 0.432±0.003j | 0.383±0.002i | 1.225±0.010h | |
| 35 | 1 | 0.936±0.004f | 0.815±0.004f | 2.178±0.010f |
| 2 | 1.289±0.017d | 1.113±0.014d | 3.074±0.048d | |
| 3 | 0.701±0.007g | 0.597±0.005g | 1.738±0.016g | |
| 4 | 0.129±0.002l | 0.131±0.001k | 0.415±0.004i | |
| 37 | 1 | 1.425±0.008c | 1.230±0.007c | 3.580±0.017c |
| 2 | 1.189±0.014e | 1.015±0.013e | 2.705±0.034e | |
| 3 | 1.323±0.061d | 1.111±0.051d | 3.117±0.140d | |
| 4 | 0.664±0.009h | 0.577±0.007g | 1.744±0.022g | |
| 백미와 현미는 발아시키지 않은 무발아 백미 및 현미이다. a~n은 95% 유의수준에서 일원배치분산분석을 실시하고, 사후분석으로 Duncan의 다중분석을 실시한 결과이다. | ||||
상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 홍국발효 발아현미는 발아기간이 길어짐에 따라 명도를 나타내는 L값은 증가하였으나 적색도와 황색도를 나타내는 a값과 b값은 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 적색도와 황색도는 백미보다 현미가 높았으며, 발아 현미를 기질로 이용할 경우 이러한 색소 생성량을 크게 증가시켰다. 모나스커스(Monascus)속 균주들은 자색에서 적색의 색을 띄며, 홍국 색소는 황색의 모나신(monascin)과 안카플라빈(ankaflavin), 오렌지색의 루브로펑크타틴(rubropunctatin)과 모나스코루브린(monascorubrin), 적색의 루브로펑크타민(rubropunctamine)과 모나스코루브라민(monascorubramine) 등 10여 종 이상의 색소가 복합적으로 구성되어 있다.
색소성분들은 특이적인 UV-absorbance를 가져 집단화할 수 있으며 그 결과는 상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 적색계(A500), 오렌지계(A470) 및 황색계(A400) 모두 백미보다는 현미에서 높았으며, 발아현미에서 그 생성량이 크게 증가하였으나 발아기간이 길어짐에 따라 감소하는 경향을 보였다. 이는 색차계를 이용하여 측정한 적색도와 황색도 결과와 일치하는 결과이다. 홍국색소의 색상, 색의 강도 및 생성량은 균의 종류는 물론 생육조건에 따라 상당한 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 발아기간에 따라 색소생성량이 감소하는 것은 미생물의 생육이 저하되고 있음을 의미한다. 또한 발아에 따라 활성화된 알파-아밀라아제(-amylase)와 글루코아밀라아제(glucoamylase)로 인하여 글루코스(glucose) 함량이 증가되고 홍국균의 생육이 증가되어 발아초기에 홍국색소 생성량이 높았으나, 발아가 진행되는 과정에서 연화된 전분립이 살균과정에서 응집하여 홍국균이 생육할 수 있는 비표면적이 작아지고 통기성이 저하되어 색소생성량이 감소하는 것으로 판단된다.
<
실험예
2>
모나콜린
K(
Monacolin
K) 및
시트리닌
(
citrinin
) 함량 측정
본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미(표 1 참조: 실험군 1 내지 12)의 모나콜린 K 및 시트리닌의 함량을 측정하였다.
모나콜린 K 함량 측정을 위한 추출물 제조는 건강기능식품 시험법의 총 모나콜린 K 시험법(Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린 K)에 따라 준비하였다. 자세하게는, 상기 실시예 1을 통해 제조된 발아온도(32℃, 35℃, 37℃) 및 발아기간(1, 2, 3, 4일)별 본 발명의 홍국발효 발아현미 분말 4 g을 50 mL 원심분리관에 넣고 75% 에탄올 40 mL을 넣은 후 1시간 초음파 추출하였다. 추출물을 3,500 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 50 mL로 정용하고 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하였으며, 적정농도로 희석하여 분석에 사용하였다. 표준용액으로 비활성형 모나콜린 K (Mevinolin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)는 10 mg을 정확히 칭량하여 75% 에탄올 50 mL에 녹여 제조하였으며, 활성형 모나콜린 K는 이 중 2 mL을 취하여 0.05 N 에탄올성 수산화나트륨용액 0.5 mL을 넣고 실온에서 30분 방치하여 제조하였다. Monacolin K의 분석은 HPLC(Acme 9000 system, Younglin Inst., Anyang, Korea)를 사용하였으며, 분석에는 Mightysil RP-18 GP column(2504.6 mm, 5 m pore size, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하였으며 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile)을 A로 0.2% 인산을 B로 하여 기울기용리로 하였으며 시료 20 μL를 주입하여 1 mL/min의 유속으로 용출시키며 237 nm에서 측정하였다.
한편, 시트리닌 함량 측정을 위한 추출물 제조는 건강기능식품 시험법의 시트리닌 제1시험법(Ⅲ.2.5.4.1 시트리닌(제1법))에 따라 준비하였다. 자세하게는, 상기 실시예 1을 통해 제조된 발아온도(32℃, 35℃, 37℃) 및 발아기간(1, 2, 3, 4일)별 본 발명의 홍국발효 발아현미 분말 2.5 g을 50 mL 원심분리관에 넣고 에탄올 20 mL을 넣은 후 30분간 초음파 추출하였다. 추출물을 3,500 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 농축한 후 메탄올 1 mL에 재용해시키고 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 분석에 사용하였다. 표준용액은 시트리닌 (Sigma-Aldrich) 10 mg을 정확히 칭량하여 100% 메탄올 100 mL에 녹여 제조한 후 희석하여 사용하였다. 시트리닌의 분석은 HPLC(Agilent 1200 Series, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였으며, 분석에는 Mightysil RP-18 GP column을 사용하였으며 이동상은 아세토니크릴 : 0.1% 트리플루오로아세트산 = 40 : 60로 1 mL/min의 유속으로 용출시키며 여기파장 335 nm, 측정파장 502 nm에서 측정하였다.
그 결과는 하기 표 4에서 자세히 나타내었다.
| 발아 온도 (℃) | 발아 기간 (day) | Monacolin K 함량 (mg/kg) | 시트리닌 함량 (mg/kg) |
||
| 활성형 (Acid form) |
비활성형 (Lactone form) |
총 모나콜린 K | |||
| 백미 | 30.22±1.24j | 10.19±0.12j | 40.41±1.19k | ND | |
| 현미 | 113.82±2.13h | 102.03±1.38h | 215.85±2.91h | ND | |
| 32 | 1 | 573.53±10.46a | 689.51±5.28a | 1263.04±15.75a | ND |
| 2 | 424.89±8.81b | 331.55±5.27c | 756.44±14.07b | ND | |
| 3 | 72.95±1.14i | 62.35±1.21i | 135.30±2.35j | ND | |
| 4 | 73.56±1.21i | 108.79±5.82h | 182.35±7.03i | ND | |
| 35 | 1 | 137.14±1.43g | 204.51±2.19f | 341.66±3.62f | ND |
| 2 | 266.07±0.07e | 269.45±0.52d | 535.52±0.59d | ND | |
| 3 | 135.18±0.26g | 123.21±1.57g | 258.38±1.83g | ND | |
| 4 | 9.96±0.13k | 14.60±0.26j | 24.57±0.39l | ND | |
| 37 | 1 | 309.32±8.29d | 447.02±12.25b | 756.33±20.54b | ND |
| 2 | 204.63±2.48f | 198.67±2.28f | 403.30±4.76e | ND | |
| 3 | 333.67±3.10c | 248.84±3.13e | 582.51±6.23c | ND | |
| 4 | 116.95±0.87h | 128.04±0.51g | 244.99±1.37g | ND | |
| 백미와 현미는 발아시키지 않은 무발아 백미 및 현미이다. ND : 불검출 a~n은 95% 유의수준에서 일원배치분산분석을 실시하고, 사후분석으로 Duncan의 다중분석을 실시한 결과이다. |
|||||
발아 온도와 기간에 따른 본 발명의 홍국발효 발아현미의 모나콜린 K 함량 변화는 상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 발아조건으로 32℃에서 1일간 발아시킨 발아 현미의 경우 1263.04 mg/kg으로 나타나 무발아 현미에 비해 5.9배 높은 함량 증가를 보였다. 그러나 발아 기간이 길어질수록 총 모나콜린 K 함량은 감소하는 경향을 보였으며, 35℃에서 4일간 발아시킨 발아 현미는 165 mg/kg으로 가장 낮은 함량을 보였다. 한편, 한편 무발아 현미의 총 모나콜린 K 함량은 215.85 mg/kg로 나타나, 백미의 40.41 mg/kg 보다 5.3배 높은 함량을 보여주었다.
또한 활성형 모나콜린 K의 비율은 무발아 백미와 현미가 각각 75%와 53%이었으며, 발아조건에 따라서는 일정한 경향을 보이지 않았지만 평균 50%로 나타났다. 홍국균 배양 시 모나콜린 K는 활성형인 acid form과 비활성형인 lactone form으로 공존하며 이들은 일반적으로 6:5의 함량비율을 가져 모나콜린 K의 인위적인 첨가 여부를 판단하는 지표가 된다. 참고로, 식품의약품안전처(KFDA)에서 홍국미 제조에 사용할 수 있도록 허용하고 있는 홍국균은 Monascus anka, M. purpureus, M. pilosus 및 M. ruber의 총 35종이며, 이들 균주는 기질의 종류와 양, 배양방법, 배양온도 및 배양시간에 따라 모나콜린 K 생성량과 활성형/비활성형 모나콜린 K 비율이 다양하다. 모나콜린 K 생성량은 홍국균의 생장과 관련이 높으며, 기질의 탄소원으로 글루코스의 이용도가 높지만 수크로오스와 락토오스는 전혀 이용할 수 없으며, 배양 중 공기가 통할 수 있는 호기조건에서 생육이 원활하다. 본 발명에서 무발아 백미/ 또는 무발아 현미보다 발아현미를 기질로 이용할 때 모나콜린 K 생성량이 증가한 이유는 발아에 의해 활성화된 효소들이 홍국균이 탄소원으로 이용할 수 있는 글루코스의 생성량이 증가했기 때문이며, 발아가 진행됨에 따라 탄소원뿐 아니라 질소원 및 무기성분의 소비에 의해 모나콜린 K 생성량이 감소한 것으로 판단된다.
한편, 시트리닌은 홍국배양 시 색소와 함께 생성되는 마이코톡신(mycotoxin)의 일종으로 항균효과가 있으나 여러 동물에서 신장독성을 유발한다고 알려져 있어 식약처에서는 홍국제품의 시트리닌 함량을 0.05 mg/kg 이하로 제한하고 있다. 본 발명의 모든 처리구에서 시트리닌이 검출되지 않아(표 4 참조) 변이주인 M. pilosus 305-9 (KFCC 11410P)는 시트리닌을 생성하지 않고, 고농도의 모나콜린 K를 생성하는 유용한 균주로서 건강기능식품 개발에 보다 적극적으로 활용이 가능할 것으로 판단된다.
<
실험예
3>
총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정
본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미(표 1 참조: 실험군 1 내지 12)의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu phenol reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 자세하게는, 상기 실시예 2를 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미 에탄올 추출물 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분 동안 방치하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL 를 가하고 30분 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 표준물질인 갈산(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 검량선을 작성하였으며, 총 폴리페놀 함량은 시료 g 중의 mg 갈산(gallic acid)으로 나타내었다.
총 플라보노이드 함량 분석은 상기 실시예 2를 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미 에탄올 추출물 250 μL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 75 μL를 가한 다음, 5분 후 10% AlCl36H2O 150 μL를 가하여 6분 방치하고 1 N NaOH 500 μL를 가하였다. 반응 11분 후 반응액의 흡광도 값을 510 nm에서 측정하였다. 표준물질인 카테킨(Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량은 시료 g 중의 mg 카테킨(catechin)으로 나타내었다.
그 결과는 하기 표 5에서 자세히 나타내었다.
| 발아 온도 (℃) | 발아 기간 (day) |
총 폴리페놀 함량 (mg/g) | 총 플라보노이드 함량 (mg/g) |
| 백미 | 0.31±0.01m | 0.08±0.00m | |
| 현미 | 3.71±0.14l | 0.35±0.00l | |
| 32 | 1 | 4.62±0.08k | 0.43±0.01k |
| 2 | 5.21±0.11j | 0.49±0.01j | |
| 3 | 7.32±0.09h | 0.69±0.01h | |
| 4 | 8.84±1.24f | 0.83±0.02f | |
| 35 | 1 | 5.86±0.08i | 0.55±0.01i |
| 2 | 7.33±0.11h | 0.69±0.00h | |
| 3 | 9.14±0.12e | 0.86±0.01e | |
| 4 | 11.53±0.08b | 1.08±0.01b | |
| 37 | 1 | 8.26±0.14g | 0.78±0.00g |
| 2 | 10.30±0.09d | 0.97±0.01d | |
| 3 | 10.84±0.08c | 1.02±0.02c | |
| 4 | 13.80±0.09a | 1.30±0.02a | |
| 백미와 현미는 발아시키지 않은 무발아 백미 및 현미이다. a~n은 95% 유의수준에서 일원배치분산분석을 실시하고, 사후분석으로 Duncan의 다중분석을 실시한 결과이다. | |||
발아 온도와 기간에 따른 본 발명의 홍국발효 발아현미의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은, 발아온도와 기간이 증가함에 따라 각각 4.62~13.80 및 0.43~1.30 mg/g 범위로 유의적인 증가를 보였다. 이는 발아에 따라 활성화된 다양한 효소들에 의하여 결합형 페놀 화합물이 유리형으로 전환되고, 세포벽의 완화로 인하여 페놀 화합물의 추출수율이 증가된 것으로 판단된다. 한편, 무발아 현미의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 3.71 및 0.35 mg/g으로 백미의 0.31 및 0.08 mg/g보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 참고로, 상기 표에서는 개시되어 있지 않지만, 홍국을 배양하지 않은 현미의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 각각 1.40 및 0.19 mg/g로 나타나, 홍국배양에 따라 페놀 화합물의 함량이 증가되는 것도 실험을 통해 확인하였다(결과 미도시).
<
실험예
4>
전자공여능과
총
항산화력
측정
본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 홍국발효 발아현미(표 1 참조: 실험군 1 내지 12)의 전자공여능과 총 항산화력을 측정하였다.
전자공여능은 DPPH 라디칼 소거활성으로 측정하였다. 즉 에탄올 추출물 0.2 mL에 0.2 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich) 용액 0.8 mL를 가하여 실온에서 60분 동안 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity, mg trolox eq/g)로 표현하였다.
총 항산화력은 ABTS cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다. ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시킨 후 이용액을 735 nm에서 흡광도 값이 1.4~1.5가 되도록 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 1 mL에 에탄올 추출물 50 μL를 가하여 흡광도의 변화를 60분 후에 측정하였으며, 표준물질로서 L-ascorbic acid를 동량 첨가하였고 AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)로 표현하였다.
| 발아 온도 (℃) |
발아 기간 (day) |
DPPH 라디칼 소거활성 (mg TE/g) |
ABTS 라디칼 소거활성 (mg AAE/g) |
| 백미 | 0.56±0.01m | 1.56±0.03m | |
| 현미 | 3.73±0.09i | 10.47±0.13i | |
| 32 | 1 | 22.16±0.12a | 62.27±0.21a |
| 2 | 13.23±0.08b | 37.16±0.14b | |
| 3 | 2.31±0.08k | 6.49±0.11k | |
| 4 | 3.14±0.11j | 8.83±0.10j | |
| 35 | 1 | 5.94±0.09f | 16.69±0.15f |
| 2 | 9.35±0.07d | 26.27±0.21d | |
| 3 | 4.48±0.12g | 12.58±0.14g | |
| 4 | 1.37±0.14l | 3.03±0.09l | |
| 37 | 1 | 13.24±0.17b | 37.21±0.12b |
| 2 | 7.03±0.08e | 19.75±0.08e | |
| 3 | 10.18±0.15c | 28.59±0.11c | |
| 4 | 4.25±0.09h | 11.94±0.10h | |
| 백미와 현미는 발아시키지 않은 무발아 백미 및 현미이다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 각각 홍국배양 발아현미 1 g에 해당하는 trolox와 비타민 C의 당량으로 표현하였다. a~n은 95% 유의수준에서 일원배치분산분석을 실시하고, 사후분석으로 Duncan의 다중분석을 실시한 결과이다. |
|||
그 결과 상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 발아 온도와 기간에 따른 본 발명의 홍국발효 발아현미의 자유라디칼 소거활성은 32℃에서 1일간 발아시킨 현미의 경우 전자공여능과 총 항산화력이 각각 22.16 mg TE/g과 62.27 mg AAE/g으로 가장 높은 항산화활성을 보였으나, 발아기간이 증가함에 따라 항산화활성은 감소하는 경향을 보였다. 한편, 홍국을 배양하지 않은 현미의 전자공여능과 총 항산화력은 각각 1.14 mg TE/g과 2.85 mg AAE/g이었으나(결과 미도시), 홍국배양 현미는 각각 3.73 mg TE/g과 10.47 mg AAE/g으로 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 발아 온도와 기간에 따른 본 발명의 홍국발효 발아현미의 홍국색소생성, 색도, 모나콜린 K 생성과 항산화 활성간의 상관관계를 분석한 결과는 하기 표 7에서 나타내었다. 기질로 사용된 발아 현미의 발아온도와 홍국색소생성량, 적색도 및 황색도는 양의 상관관계를 보였으나 발아기관과는 음의 상관관계를 보여 발아기간이 길어짐에 따라 홍국균의 생육을 저해하는 것으로 나타났으며, 이는 탄소원의 감소 및 통기성 불량 등이 원인인 것으로 판단되었다. 홍국색소와 적색도, 황색도는 0.769~0.968의 높은 양의 상관관계를 보였으나(P<0.001), 명도와는 -0.967~-0.983의 높은 음의 상관관계(P<0.001)를 보였다. Monacolin K 생성량은 발아기간과 음의 관계였으며, 홍국색소, 적색도 및 황색도와 높은 상관관계(0.633~0.969, P<0.001)를 보였으며, 이는 곰팡이에서 생성되는 색소를 포함한 많은 2차 대사산물들이 공통적인 polyketide pathway를 경유해 합성되기 때문은 것으로 판단된다. 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 발아가 진행됨에 따라 효소의 활성화로 추출수율 및 유리형의 전환율이 높아져 발아온도 및 기간과 높은 양의 상관관계를 보였으나(0.742~0.830, P<0.001), 홍국색소, 적색도, 황색도, 모나콜린 K 생성과는 상관성을 보이지 않아 발아기간에 따른 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 증가는 발아에 의한 영향이 큰 것으로 판단된다. 항산화 활성은 홍국색소, 색도 및 모나콜린 K 생성량과 높은 상관관계를 보였으나 발아기간, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과는 음의 상관관계를 보였다. 일반적으로 페놀 화합물과 자유라디칼 소거활성은 높은 양의 상관관계가 있는 것으로 알려져 있으나, 본 연구결과에서 음의 상관관계를 보인 것은 발아에 의해 생성된 페놀 화합물보다 홍국균 발효에 의해 생성된 홍국색소의 항산화 활성이 더 높기 때문으로 판단된다.
| A500 | A470 | A400 | L | a | b | MK | TPC | TFC | DPPH | ABTS | |
| Temp | 0.470** | 0.493** | 0.559*** | -0.558*** | 0.525*** | 0.759*** | 0.325* | 0.742*** | 0.747*** | 0.336* | 0.333* |
| Period | -0.193 | -0.180 | -0.116 | 0.134 | -0.140 | 0.126 | -0.289 | 0.830*** | 0.827*** | -0.275 | -0.279 |
| A500 | 1.000 | 0.999*** | 0.988*** | -0.967*** | 0.965*** | 0.769*** | 0.969*** | -0.026 | -0.017 | 0.966*** | 0.967*** |
| A470 | 1.000 | 0.992*** | -0.972*** | 0.968*** | 0.788*** | 0.963*** | -0.007 | 0.002 | 0.960*** | 0.961*** | |
| A400 | 1.000 | -0.983*** | 0.978*** | 0.841*** | 0.940*** | 0.070 | 0.078 | 0.937*** | 0.938*** | ||
| L | 1.000 | -0.996*** | -0.887*** | -0.897*** | -0.092 | -0.101 | -0.889*** | -0.892*** | |||
| a | 1.000 | 0.877*** | 0.899*** | 0.064 | 0.074 | 0.890*** | 0.893*** | ||||
| b | 1.000 | 0.633*** | 0.329* | 0.337* | 0.622*** | 0.625*** | |||||
| MK | 1.000 | -0.128 | -0.119 | 0.997*** | 0.998*** | ||||||
| TPC | 1.000 | 0.979*** | -0.115 | -0.119 | |||||||
| TFC | 1.000 | -0.106 | -0.109 | ||||||||
| DPPH | 1.000 | 0.991*** | |||||||||
| * : P<0.05, ** : P<0.01, *** : P<0.001, A500 : 적색계, A470 : 오렌지색계, A400 : 황색계, L : 명도, a : 적색도, b : 황색도, MK : 총 모나콜린 K 함량 (mg/kg), TPC: 총 폴리페놀 함량 (mg/g), TFC : 총 플라보노이드 함량 (mg/g), DPPH : DPPH 자유라디칼 소거활성 (mg TE/g), ABTS : ABTS 자유라디칼 소거 활성 (mg AAE/g). | |||||||||||
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- a) 현미를 발아시키는 단계;
b) 발아현미에 홍국균을 접종하여 발효시키는 단계; 및
c) 홍국으로 발효시킨 발아현미를 살균한 후 건조시키는 단계를 포함하는 홍국발아현미의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 a) 단계는 현미를 30~40℃의 온도조건에서 1~7일 동안 발아시키는 것을 특징으로 하는 홍국발아현미의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계에서 홍국균은 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)인 것을 특징으로 하는 홍국발아현미의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계는 발아현미에 홍국균을 접종한 후 온도 25~45℃, 습도 70-95%에서 20~30일 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 홍국발아현미의 제조방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 홍국발아현미.
- 제5항에 있어서,
상기 홍국발아현미는 총 모나콜린 K 함량이 500-2,000 mg/kg인 것을 특징으로 하는 홍국발아현미. - 제5항에 있어서,
상기 홍국발아현미는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 각각 1.0~20.0 mg/g과 0.5~3.0 mg/g인 것을 특징으로 하는 홍국발아현미. - 제5항에 있어서,
상기 홍국발아현미는 DPPH 라디칼 소거활성이 10 내지 25 mg TE/g인 것을 특징으로 하는 홍국발아현미.
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| KR20130077431A (ko) | 2011-12-29 | 2013-07-09 | 대상 주식회사 | 곡자의 ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ의 함량을 증진시키는 방법 |
-
2015
- 2015-08-04 KR KR1020150110171A patent/KR101771795B1/ko active IP Right Grant
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