CN104768549A - 未分化细胞的选择性抑制剂 - Google Patents

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尼辛·班冯尼斯提
派尔·阿罗拉
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F Hoffman-Laluoai Ltd
Prebiotic Research And Development Co Ltd Of Hebrew University Of Jerusalem
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Abstract

本文揭露一种以式I-VI的任一化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途，和多种包括式I-VI的任一化合物的药物组合物，以及多种鉴定用于抑制未分化细胞的主要候选物的方法。进一步公开一种以SCD-1抑制剂作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途。

Description

未分化细胞的选择性抑制剂
技术领域
本发明，在其一些实施例中，涉及治疗领域，更具体地而言(但不是唯一)，涉及未分化细胞的治疗，例如多能细胞和未分化癌细胞，涉及适用于其的新化合物，以及涉及鉴定适用于其的化合物的方法。
背景技术
由于人类多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)的自我更新和分化成人体所有细胞类型的独特能力，其于再生医学具有良好前景。然而，相同的特性也使这些细胞具有潜在的致瘤性(tumorigenic)。
报告指出肿瘤形成与未分化的多能干细胞的残留存在正相关[Miura等人，自然生物科技Nature Biotechnology 27：743-745(2009)]。畸胎瘤的形成仅需要非常稀少的hPSC[Lee等人，细胞周期Cell Cycle 8：2608-2612(2009)；Hentze等人，干细胞研究Stem Cell Research 2：198-210(2009)]，而且即使在长时间分化于培养基后，一些致瘤性多能干细胞仍然存在[Narsinh等人，临床研究杂志Journal of ClinicalInvestigation 121：1217-1221(2011)；Ghosh等人，癌症研究CancerResearch 71：5030-5039(2011)；Fu等人，干细胞与发育Stem Cells andDevelopment 21：521-529(2012)]。
因此建议在临床施用其衍生物之前，消除多能细胞的残留。[Ben-David&Benvenisty，自然癌症回顾Nature Reviews Cancer 11：268-277(2011)]。
重要的是，诱导的多能干细胞(iPS)的产生可能已经解决免疫性排斥的问题，畸胎瘤形成的风险对于胚胎干细胞(embryonic stem cell，FS)和iPS细胞仍然均是主要障碍[Miura等人，自然生物技术NatureBiotechnology 27：743-745(2009)；Fu等人，干细胞与发育Stem Cells andDevelopment 21：521-529(2012)：521-529(2012)；Ben-David&Benvenisty，自然癌症回顾Nature Reviews Cancer 11：268-277(2011)；Puri&Nagy，干细胞Stem Cells 30：10-14(2012)。
为了促进从分化培养物中去除残留的多能细胞，建议几种策略，根据遗传操作(genetic manipulations)或细胞分选(cell sorting)，包括：引入自杀基因(suicide gene)[Schuldiner等人，干细胞Stem cell 21：257-265(2003)；Hara等人，干细胞和细胞发展Stem Cells andDevelopment 17：619-627(2008)]；干扰肿瘤发展基因(tumor progressiongenes)[Blum等人，自然生物科技Nature Biotechnology 27：281-287(2009)]或肿瘤抑制剂[Menendez等人，衰老细胞Aging Cell 11：41-50(2012)]；根据PSC特异性表面抗原的抗体，萤光活化或磁性活化的细胞分选(FACS或MACS)，[Fong等人，干细胞回顾Stem Cell Reviews 5：72-80(2009)；Tang等人，自然生物科技Nature Biotechnology 29：829-834(2011)；Wang等人，细胞研究Cell Research 21：1551-1563(2011)]；以及使用针对多能干细胞的细胞毒性抗体[Choo等人，干细胞Stem Cells26：1454-1463年(2008)；Schriebl等人，组织工程A部分TissueEngineering Part A(2012年1月4日，电子刊物)。
先前的研究已经表明，hPSC可能对一些细胞扰动特别敏感，因此在某些情况下比其他类型的细胞更倾向进行细胞凋亡[Qin等人，生物化学期刊Journal of Biological Chemistry 282：5842-5852(2007)；Momcilovic等人，PloS One 5：e13410(2010)]。
癌症干细胞假说认为癌的生长是由一部份的癌细胞所驱动，在本领域中称为癌干细胞(cancer stem cells)或癌干样细胞(caner stem-likecells，CSCs)，其特征为具有引起肿瘤的潜力，自我更新能力，对治疗的抗性和具有分化成异质的(heterogeneous)和可能的非致瘤性癌细胞(non-tumorigenic cancer cells)的能力[Scaffidi&Misteli，自然细胞生物学Nature Cell Biology 13：1051-1061(2011)；Campos等人，临床癌症研究Clinical Cancer Research 16：2715-2728(2010)；Medema所著，自然细胞生物学Nature Cell Biology 15：338-344(2013)；Visvader和Lindeman，自然癌症回顾Nature Reviews Cancer 8：755-768(2008)。报导指出CSCs包括表达CD34但不表达CD38的白血病细胞的子群集〔Bonnet&Dick，自然医学Nature Medicine 3：730-737(1997)]，以及脑癌[Singh等人，癌症研究Cancer Research 63：5821-5828(2003)]，乳腺癌[Al-Hajj等人，PNAS100：3983-3988(2003)]，结肠癌[O’Brien等人，Nature445：106-110]，卵巢癌症[Zhang等人，癌症研究Cancer Research 68：4311-4320(2008)]，胰腺癌[Li等人，癌症研究Cancer Research67：1030-1037(2007)]，前列腺癌[Maitland&Collins，临床肿瘤学杂志Journal ofClinical Oncology 26：2862-2870年(2008)；Lang等，病理学杂志Journalof Pathology 217：299-306(2009)]，黑色素瘤[Schatton等人，Nature451：345-349(2008)；Boikoet等人，自然Nature 466：133-137(2010)；Schmidt等人，PNAS108：2474-2479(2011)；Civenni等人，癌症研究Cancer Research71：3098-3109(2011)]和多发性骨髓瘤[Matsui等人，Blood 103：2332-2336(2004)；Matsui等人，Cancer Research 68：190-197(2008)]的癌细胞子群集。
硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase-1，SCD)是通过催化硬脂酸的去饱和(desaturation of stearic acid)以产生油酸(oleicacid)的酶。报导指出有两种异构体，SCD1和SCD5，存在于人体中。
报导指出抑制SCD1在某些人类癌细胞系(cancer cell line)中会引起内质网(endoplasmic reticulum，ER)压力及未折叠蛋白反应(unfoldedprotein response，UPR)，从而导致这些细胞的细胞凋亡(apoptosis)，并且其被建议作为癌症治疗的有潜力的标靶[Roongta等人，分子癌症研究Molecular Cancer Research 9：1551-1561(2011)；Minville-Walz等人，PloS One 5：e14363(2010)；Scaglia等人，PloS One 4：e6812(2009)；Hess等人，PloS One 5：e11394(2010)；Morgan-Lappe等人，癌症研究Cancer Research 67：4390-4398(2007)；Mason等人，PloS One7：e33823(2012)]。报导指出SCD1在hPSCs中表达[Assou等人，干细胞Stem Cells 25：961-973(2007)]，但其在这些细胞中的作用在前面还没有被描述。
报导指出饱和脂肪酸(SCD1基质)的累积通过几种机制会诱导内质网压力(ER stress)和未折迭蛋白反应(UPR)：产生活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，从而导致内质网钙的耗竭[Borradaile等人，细胞分子生物学Molecular Biology of the Cell 17：770-778(2006)]；改变内质网膜组成物，导致在其结构和完整性的剧烈地损伤[Borradaile等人，脂质研究期刊Journal of Lipid Research 47：2726-2737(2006)]；内质网到高基氏体的交流损伤，导致在内质网中积聚的蛋白质[Preston等人，糖尿病学52：2369-2373(2009)]。报导指出油酸(SCD1活性的产物)与饱和脂肪酸竞争，阻断异常脂质分布，并降低内质网压力[Peng等人，内分泌学152：2206-2218(2011)；Hapala等人，细胞生物学/在欧洲细胞生物学会主持之下Biology of the Cell/under the auspices of the EuropeanCell Biology Organization 103：271-285(2011)]。
报导指出高SCD活性与增加的心血管风险相关联，包括升高的血浆三酸甘油酯(triglycerides)，高体质量指数(body mass index，BMI)和降低的血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)[Attie等人，脂质研究期刊J Lipid Res 43：1899-1907(2002)]。
国际专利申请PCT/CA2006/000949(公开为WO 2006/130986)，国际专利申请PCT/CA2007/001026(公开为WO 2007/143823)，国际专利申请PCT/CA2007/001027(公开为WO 2007/143824)，国际专利申请PCT/CA2007/001396(公开为WO 2008/017161)，国际专利申请PCT/CA2007/001858(公开为WO 2008/046226)，国际专利申请PCT/CA2007/002139(公开为WO 2008/064474)与美国专利申请2008/0182838描述SCD1抑制剂及其在心血管疾病，肥胖症，糖尿病，神经系统疾病，代谢综合征，胰岛素抵抗，癌症，肝脂肪变性(liver steatosis)的治疗用途。
额外的背景技术包括Behrouzian and Buist[前列腺素，白三烯和必需脂肪酸Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids68：107-112(2003)]；Raju and Reiser[生物化学期刊J Biol Chem242：379-384(1967)]；Park等人[生物化学生物生理学报BiochimBiophys Acta 1486：285-292(2000)]；Liu等人[药物化学期刊J Med Chem50：3086-3100(2007)]；Zhao等人[生物组织医学快报Bioorg Med ChemLett 17：3388-3391(2007)]；Xin等人[生物组织医学快报Bioorg MedChem Lett 18：4298-4302(2008)]；及国际专利申请具有公开号WO2005/011653，WO 2005/011654，WO 2005/011655，WO 2005/011656，WO2005/011657，WO 2006/014168，WO 2006/034279，WO 2006/034312，WO2006/034315，WO 2006/034338，WO 2006/034341，WO 2006/034440，WO2006/034441，WO 2006/034446，WO 2006/086445，WO 2006/086447，WO2006/101521，WO 2006/125178，WO 2006/125179，WO 2006/125180，WO2006/125181，WO 2006/125194，WO 2007/044085，WO 2007/046867，WO2007/046868，WO 2007/050124，WO 2007/130075，WO 2007/136746，WO2008/074835，WO 2008/074835，WO 2008/074824，WO 2008/036715，WO2008/044767，WO 2008/029266，WO 2008/062276，WO 2008/127349，WO2008/003753，WO 2007/143697，WO 2008/024390，WO 2008/096746andWO 2008/056687；及Liu[治疗专利的专家意见Expert Opinion onTherapeutic Patents 19：1169-1191(2009)]。
发明内容
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式I化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
其中：
R1是氢；及
R2是选自于以下组成的群组：
氢，
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基(2，4-dioxo-5-fluoropyrimidin-1-ylcarbonyl)，
2-甲基苯并呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)，及
-NH-R5；其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基(pyridinyl carbonyl)
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基(2-hydroxyl-2-phenyl-2-thiophen-2-yl-acetyl)，
(C1-6)烷基-羰基((C1-6)alky1-carbonyl)
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基(N-(ethoxycarbonylmethyl)-2，4-dioxo-pyrrolidine-3-ylidene-methyl，
萘基磺酰基(naphthyl sulfonyl)，及
N-羟基-乙酰亚胺酰基(N-hydroxy-acetimidoyl)；
或者，其中：
R1是苯甲酰基(benzoyl)及R2是4-氯代苯甲酰胺(4-chlorobenzamido)；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基(biphenyloxymethyl)甲基，([1，1’-biphenyl]-4-yloxy)methyl)及(C1-4)烷基(alkyl)所组成的群组；
其条件是R1，R2，R3及R4中的至少一个不是氢，卤素，NH2或(C1-4)烷基。
根据本发明一些实施例，R1是氢；及R2是选自于以下组成的群组：
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基(2，4-dioxo-5-fluoropyrimidin-1-ylcarbonyl)，
2-甲基苯并呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)，及
-NH-R5，其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基(pyridinyl carbonyl)，
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基(2-hydroxyl-2-phenyl-2-thiophen-2-yl-acetyl)，
(C1-6)烷基-羰基((C1-6)alky1-carbonyl)，
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基(N-(ethoxycarbonylmethyl)-2，4-dioxo-pyrrolidine-3-ylidene-methyl)，
萘基磺酰基(naphthylsulfonyl)及
N-羟基-乙酰亚胺酰基(N-hydroxy-acetimidoyl)；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基及(C1-4)烷基所组成的群组。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式II化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式III化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式IV化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式V化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以式VI化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
根据本发明一些实施例的一方面，提供所述药物组合物包括一化合物的一治疗有效量及一药学上可接受的载体。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的方法，所述方法包括对所述对象施用本文所述的化合物的一治疗有效量。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种将本文所述的化合物用于制备一用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的用途。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种本文所述的化合物，用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症。
根据本发明一些实施例，所述组合物被鉴定为用于抑制未分化的细胞。
根据本发明一些实施例，所述未分化的细胞包括多能干细胞。
根据本发明一些实施例，所述未分化的细胞包括未分化的癌细胞。
根据本发明一些实施例，所述组合物被鉴定用于治疗与未分化细胞增殖相关的一增殖性疾病或病症。
根据本发明一些实施例，所述增殖性疾病或病症选自于畸胎瘤，未分化癌症，白血病，脑癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，黑色素瘤，肝癌，肺癌，头颈部癌，间叶癌(mesenchymal cancer)及多发性骨髓瘤所组成的群组。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种鉴定用于抑制多能干细胞的主要候选物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供多个多能干细胞的样品，各个所述样品包括一不同类型的多能干细胞；
将所述样品与一候选化合物接触；及
监测在所述样品中所述干细胞的存活力，由此如果在至少两个所述样品中的存活力降低，则所述候选化合物被鉴定为能够抑制多能干细胞，从而鉴定为一主要候选物。
根据本发明一些实施例，所述的方法，用于鉴定选择性抑制多能干细胞的一主要候选物，所述方法还包括以下步骤：
(d)提供至少一已分化的细胞的样品；
(e)将所述至少一样品与所述化合物接触，所述化合物被鉴定为能够降低多能干细胞的群体总数；
(f)监测在至少一所述样品中所述已分化的细胞的一存活力，由此如果在至少一所述样品中的存活力被维持，则所述化合物被鉴定为能够选择性抑制多能干细胞。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以SCD1(硬脂酰辅酶A去饱和酶-1)抑制剂作为多能干细胞的细胞毒性抑制剂的用途。
根据本发明一些实施例，所述SCD1抑制剂选自于A939572，CAY-10566，MF-438，CVT-11127，GSK-993，5-(十四烷氧基)-2-糠酸及SCD1的核酸沉默序列所组成的群组。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明有关领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的方法和材料可以在实践或测试本发明的实施例中使用，示范性的方法和/或材料在以下进行说明。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为主。此外，材料，方法和实施例仅仅是说明性的而不是意图进行必要的限制。
附图说明
在本文中本发明的一些实施例仅以示例的方式描述，请参考附图。现在详细具体参考附图，需要强调的是所示的细节是以举例的方式，用于说明性地讨论本发明的实施例。在这点上，描述结合附图可使得本领域的技术人员更明了本发明的实施例如何被实施。
图1A和图1B显示被遗传标记的CSES2-SO2/32人类胚胎干细胞的显微镜影像，其是通过光学显微镜而得到(图1A)，及通过显示被萤光(fluorescenee)标记的Oct-4的萤光显微镜所得到(图1B)；
图2A和图2B显示H9人类胚胎干细胞的影像，以碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase)，具有(图2A)和不具有(图2B)放大倍率；
图3显示Mel-1人胚胎干细胞的萤光显微镜图像，对Oct-4染色24，72和120小时，之后接种在384孔板(384-well plate)；
图4显示被遗传标记CSES2-SO2/32的人类胚胎干细胞的萤光显微镜影像显示出萤光标记Oct-4 48和96小时，之后接种在384孔板；
图5为显示在活的H9人类胚胎干细胞中根据三磷酸腺苷(ATP-based)的冷光测定分析(luminescence assay)量测相对光单位(RLU)的图表，作为在样品中所接种的H9干细胞数目的函数(k＝1000；在24接种后小时进行分析)；
图6显示H9细胞接种在384孔板3，24，48和72小时后，在多个孔洞中以亚甲蓝(methylene blue)染色的H9细胞的图像；
图7为显示筛检噻吗洛尔马来酸(timolol maleate，48)，放线菌酮(actidione，6)，安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride，10)，阿莫地喹(amodiaquine，9)，卡铂(carboplatin，13)，环丙沙星(ciprofloxacin，16)，响尾蛇素(crotaline，19)，多西环素(doxycycline，22)，雌二醇(estradiol，24)，法莫替丁(famotidine，25)，非诺贝特(fenofibrate，26)，氟氢可的松醋酸酯(fludrocortisoneacetate，27)，丙咪嗪(imipramine，29)，异丙肾上腺素(isoproterenol，31)，酮康唑(ketoconazole，33)，和四环素(tetracycline，46)的细胞毒性的示例性结果的长条图，其在暴露于化合物6，24，48或72小时之后；各曝光时间的5条状物代表剂量为30微摩尔(μM)，10微摩尔(μM)，3微摩尔(μM)，1微摩尔(μM)和300纳摩尔(nM)(从左到右)；
图8为一示意图，显示用于对多能干细胞筛选细胞毒性的示例性建议；
图9为显示Z’因子的图表，其被用于计算149个384孔板中的各孔版，对多能干细胞细胞毒性的示例性筛选(各种颜色表示多个孔版中一同进行筛选的批次)；
图10为一直方图，显示受试化合物的数目以作为所述化合物所表现的多能细胞抑制功能(箭头指示60％抑制的截止值)；
图11为一散布图，显示以20微摩尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2和H9人类胚胎干细胞(ESCs)(r2＝0.87，数据仅显示用于抑制这两种细胞型60％以上的化合物)；
图12A-图12C是二维(图12A和图12B)及三维(图12C)的散布图，显示示例性化合物的pEC50值(pEC50＝-logEC50，EC50值是以摩尔(M)为单位，图12A和图12B)或由20微摩尔(μM)示例性化合物的抑制百分比(图12C)，其针对于CSES2(图12A-图12C)，CSES2-SO2/3(图12A和图12C)及H9(图12C)人类胚胎干细胞(ESCs)和BJ-iPS28诱导的多能干细胞(图12B)；
图13为一散布图，显示示例性化合物的pEC50值，由处理CSES2细胞24小时(x轴)和48小时(y轴)所护得(pEC50＝-logEC50，EC50值是以摩尔为单位)；
图14为一示意图，显示示例性多能干细胞(pluripotent cells，iPS)(胚胎干(embryonic stem cells，ES)和诱导的多能干细胞)与示例性的复能干细胞(multipotent stem cells)及祖细胞(progenitor cells)，已分化细胞和癌细胞之间的关系；
图15为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞(y-轴)与心肌细胞(cardiomyocytes，x-轴)(r2＝0.03，数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制心肌细胞小于20％))；
图16为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与成纤维细胞(fibroblasts)(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制纤维母细胞小于20％))；
图17为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与肝细胞(hepatocytes)(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制肝细胞小于20％))；
图18为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与神经母细胞瘤细胞(Kelly)(neuroblastoma cells)(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制神经母细胞瘤细胞小于20％))；
图19为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与HeLa细胞(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制HeLa细胞小于20％))；
图20为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与Huh7细胞(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制Huh7细胞小于20％))；
图21为一散布图，显示以20微莫尔(μM)的示例性化合物抑制CSES2细胞与内胚层祖细胞(endodermal progenitor cells)(数据仅显示抑制CSES2细胞60％以上的化合物，CSES2细胞的选择性抑制剂由方框指示(抑制内胚层祖细胞小于20％))；
图22表示萤光显微镜影像，显示在分化之前(day 0)或之后(day 8)，被遗传标记的CSE2-SO2/3细胞中，Oct-4的红色萤光标记(左)与SOX17的绿色萤光标记(右)(比例尺＝200微米(μm))；
图23表示一直方图，显示在分化后，98％的CSES2-SO2/3细胞表现出CXCR4的萤光染色，然而在分化前，3％的细胞表现出CXCR4的萤光染色；
图24表示萤光显微镜影像，显示在设置于384孔板而分化之后，在分化后的CSE2-SO2/3细胞中，Oct-4的红色萤光标记(左，没有萤光是可见的，表示缺乏Oct-4)与SOX17的绿色萤光标记(右)(比例尺＝200微米(μm))；
图25A和图25B显示示例性化合物的pEC50值，由处理BJ-成纤维细胞(图25A，y轴)和BJ-成纤维细胞衍生的诱导多能干细胞(图25B，x轴)，以及CSES2-SO2/3胚胎干细胞(图25B，x轴)和CSES2-SO2/3衍生的已分化细胞(图25B，y轴)所护得(pEC50＝-logEC50，EC50值是以摩尔为单位)；
图26A和图26B表示曲线图，显示抑制CSES2胚胎干细胞(图26A，左)和已分化的CSES2衍生的内胚层祖细胞(EPCs)(图26A，右)，以及抑制BJ-成纤维细胞(图26B，左)和BJ-成纤维细胞衍生诱导的多能干细胞(BJ-iPS28)(图26B，右)，以示例性化合物PluriSIn#1浓度的函数表示(浓度单位以对数(log)刻度表示)；
图27为多个曲线图，显示CSES2-SO2/3胚胎干细胞(SO2/3 ESCs)，CSES2-SO2/3衍生的已分化细胞(SO2/3 diff)，BJ-成纤维细胞和BJ成纤维细胞衍生诱导的多能干细胞(BJ-iPS28)的抑制率(％)，以15个示例性化合物PluriSIn#1到15浓度的函数表示(PluriSIn#显示在各方块的左上角，浓度单位以对数(log)刻度表示)；
图28为一图表，显示根据化合物的抑制(各化合物由直行表示)的细胞型层次聚类(hierarchical clustering of cell types)，进一步显示15个只抑制多能干细胞(上方四排)的化合物(由黄色方框标记)(H＝高抑制，L＝低抑制)；
图29为一长条图，显示在以20微摩尔(μM)的各PluriSIns#1～#11处理72小时之后，以亚甲蓝(methylene blue)分析测定存活的H9胚胎干细胞的数目(相对于未处理的控制组细胞)；
图30表示多个显微影像，显示以20微摩尔(μM)的各PluriSIns#1～#11处理72小时之后H9胚胎干细胞以及未经处理的控制组细胞；
图31表示多个萤光显微影像，显示在以示例性化合物PluriSIn#6处理之后，在CSES2-SO 2/3的胚胎干细胞中的Oct-4的红色萤光标记(图31A-图31C)，与在CSES2-SO 2/3衍生的已分化细胞中SOX17的绿色萤光标记，以0.5％DMSO作为阴性控制组(NC)，或是以5微摩尔(μM)的安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride)为细胞毒性阳性控制组(PC)(比例尺＝100微米(μm))；
图32A-图32C表示多个萤光显微影像，显示在以示例性化合物PluriSIn#1处理之后(右侧方块)，以0.5％DMSO作为阴性控制组(左侧方块)，在CSES2-SO 2/3的胚胎干细胞中的Oct-4的红色萤光标记(图32A)，在CSES2-SO 2/3衍生的已分化细胞中SOX17的绿色萤光标记(图32B)，以及在CSES2-SO 2/3的胚胎干细胞与CSES2-SO 2/3衍生的已分化细胞的混合体中，胚胎干细胞的红色萤光标记和细胞核的蓝色萤光标记(比例尺＝100微米(μm))；
图33为一长条图，显示以20微摩尔(μM)的各PluriSIns#1处理72小时之后，以亚甲蓝(methylene blue)分析测定存活的BJ-成纤维细胞，HeLa细胞，HepG2细胞和Kelly细胞的数目(相对于未处理的控制组细胞)；
图34表示显微影像，显示以20微摩尔(μM)PluriSIns#1处理72小时之后的BJ-成纤维细胞，HeLa细胞，HepG2细胞和Kelly细胞以及未经处理的控制组细胞；
图35表示一图表，显示根据基因表达的未分化胚胎干细胞(ESCs)与胚胎干细胞衍伸的未分化内胚层祖细胞的层次聚类(hierarchicalclustering of cell types)，其中以PluriSIn#1，PluriSIn#6处理或未经处理(控制组)，所述图谱表示在控制及处理情况之间，所有差异表达的基因(＞2倍)(以2个实验结果来呈现各ESC控制组和以PluriSIn#1处理ESC的处理组，红色表示高度表达(H)，蓝色表示低度表达(L))；
图36为一长条图，显示在以PluriSIn#1(ES PluriSIn#1)，PluriSIn#6(ES PluriSIn#6)处理胚胎干细胞之后，或以PluriSIn#1(DIFFPluriSIn#1)处理ES衍生的已分化细胞之后，与与细胞凋亡相关的基因表达的改变；
图37A和图37B表示多个图表，显示膜联蛋白-V-萤光素异硫氰酸(Annexin-V-fluorescein isothiocyanate，FITC)的萤光和碘化丙啶(propidium ioidde，PI)的萤光的代表性的FACS分析(图37A)，以及一柱状图(图37B)，显示以20微摩尔(μM)的示例性PluriSIn#1化合物处理，或以控制组处理16小时之后(图37A下方，和图37B)(0.2％DMSO；图37A上方和图37B)胚胎干细胞的细胞凋亡(*p＜0.05)；
图38表示免疫印迹(immunoblot)的影响，在以20微摩尔(μM)示例性化合物PluriSIn#1处理的胚胎干细胞中或以1毫摩尔(mM)的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT，阳性控制组)的胚胎干细胞中，幷在未处理的控制组细胞中(以β-连环蛋白(β-catenin)水平作为装载(loading)控制组)，显示胱冬酶原-3(procaspase-3)与被切割的胱冬酶-3(cleavedcaspase-3)的水平；
图39是一长条图，显示当存在0，25，100的Z-VAD-FMK，以20微摩尔(μM)的示例性化合物PluriSIn#1处理24小时后的人胚胎干细胞的存活力，以及未处理的控制组细胞中的存活力(*p＜0.05；**p＜0.01)；
图40是一长条图，显示与内质网压力(ER stress)和未折迭蛋白反映(UPR)相关的基因表达的改变，在以二硫苏糖醇(DTT，一普遍的内质网压力诱导剂)，PluriSIn#1(ES PluriSIn#1)或PluriSIn#6(ES PluriSIn#6)处理胚胎干细胞，或以PluriSIn#1(Diff PluriSIn#1)处理ES衍生的已分化细胞。
图41为一长条图，显示在以20微摩尔(μM)的示例性PluriSIn#1化合物处理，或以1毫摩尔(mM)二硫苏糖醇(DTT)处理，或以控制组处理(*p＝0.007)12小时之后，在胚胎干细胞(ESCs)以及在8天分化的胚胎干细胞衍生的细胞(ESCs 8d diff)中，sXBP1的拼接异构体(splicing isoforms)的表达(相对于控制组)(对sRP2水平标准化)；
图42为免疫印迹(immunoblot)的影像，显示在以20微摩尔(μM)的示例性PluriSIn#1化合物处理，或以1毫摩尔(mM)二硫苏糖醇(DTT)处理，或以控制组处理的胚胎干细胞及以分化细胞中，磷酸化eIF2α的水平(p-eIF2α)(以α微管蛋白(α-tubulin)作为装载(loading)对照组)；
图43为一长条图，显示在以20微摩尔(μM)的示例性PluriSIn#1化合物处理，或以1微摩尔(μM)的环己酰亚胺(cycloheximide)处理，或以控制组处理(*P＝0.005)12小时之后，以35S甲硫胺酸(35S-Met)的合幷来测定(对总蛋白标准化)胚胎干细胞(ES)和成纤维细胞中蛋白质的合成；
图44为一长条图，显示以示例性化合物PluriSIn#1和PluriSIn#6处理胚胎干细胞(ESC)和ES衍生的已分化细胞(Diff.)之后，或在以SCD抑制剂A939572处理H19299癌细胞之后，示例性基因的表达变化；
图45为一长条图，以20微摩尔(μM)的示例性PluriSIn#1化合物处理，或以控制组处理12小时之后，显示SCD1活性(对控制组水平标准化)(*p＝2.1·10-6)；
图46为一长条图，在存在或不存在100微摩尔(μM)油酸(oleic acid，OA)的情形下，以75纳摩尔(nM)的SCD1抑制剂A939572及CAY-10566处理，或以控制组48处理小时之后，显示胚胎干细胞存活力(对控制组水平标准化)(*p≤0.0003)；
图47为一曲线图，显示以20微摩尔(μM)PluriSIn#1或2微摩尔(μM)的安吖啶(amsacrine，Ams)处理的或未经处理的(控制组)多能干细胞的存活力(相对于控制组平均值)，以油酸(oleic acid，OA)浓度或偶联(conjugated)至牛血清白蛋白(BSA)的油酸浓度的函数来表示；
图48表示多个影像，显示未经处理的(控制组)多能干细胞，或在以20毫摩尔(μM)PluriSIn#1以及0，6.25，25及100毫摩尔(μM)偶联至牛血清白蛋白的油酸处理(右三图)之后的多能干细胞(3右列)；
图49为一长条图，显示在有和没有100毫摩尔(μM)的偶联至牛血清白蛋白的油酸(OA)的情形下，以20毫摩尔(μM)PluriSIn#1，#2，#3，#5或#6的示例性化合物处理的胚胎干细胞的存活力(*p≤0.006)；
图50表示在以20微摩尔(μM)的示例性化合物PluriSIn#1，A939572100纳摩尔(nM)，或DMSO(控制组)处理18小时之后，膜联蛋白-V-萤光素异硫氰酸(Annexin-V-fluorescein isothiocyanate，FITC)萤光和碘化丙啶(propidium iodide，PI)萤光的代表性FACS分析；
图51为一长条图，显示在以100纳摩尔(nm)的A939572或1毫摩尔mM的二硫苏糖醇(dithiothritol，DTT)处理之后，胚胎干细胞(ESCs)和已分化的ESC衍生的细胞中的sXBP1的拼接异构物的表达(相对于控制组)，(*p＜0.05)；
图52表示免疫印迹的影像，显示以20微摩尔(μM)PluriSIn#1处理，以100纳摩尔(μM)A939572处理，以1毫摩尔(mM)二硫苏糖醇(dithiothritol，DTT)处理或以控制组处理后的胚胎干细胞(左)以及ESC衍生的已分化细胞(右)中，磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)的水平(以α微管蛋白(α-tubulin)作为装载控制组)；
图53为一长条图，显示在以100纳摩尔(nM)的A939572处理，以10微摩尔(μM)的环己酰亚胺(cycloheximide)处理，或以控制组处理12小时之后，以35S甲硫胺酸(35S-Met)的合幷来测定(对总蛋白标准化)胚胎干细胞(ES)中蛋白质的合成(*p＜0.05)；
图54为一长条图，显示在以1毫摩尔(mM)的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)处理，或以10微摩尔(μM)的环己酰亚胺(cycloheximide，Compound)与或不与100微摩尔(μM)油酸(oleic acid，OA)处理，或以控制组处理12小时之后，以35S甲硫胺酸(35S-Met)的合幷来测定(对总蛋白标准化)H9胚胎干细胞(ESCs)或BJ-成纤维细胞(Differntiated)中蛋白质的合成(*p＜0.05)；
图55为一示意图，显示示例性化合物(例如PluriSIn#1)，棕榈酸(palmitic acid)和油酸(oleic acid)对于细胞功能和存活力影响的一潜在机制；
图56表示一长条图，显示在以20微摩尔(μM)示例性化合物PluriSIn#1，#2，#4或#6处理后，小鼠多能干细胞的存活力，相对于未处理的(控制组)的细胞；
图57表示在以示例性化合物PluriSIn#6处理之后，或以0.5％的DMSO处理之后(以作为阴性控制组(NC))，或以5微摩尔(5μM)安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride)处理之后(为细胞毒性阳性控制组(PC))，R1Oct4-GFP的小鼠胚胎干细胞的本显微影像，由光学显微镜(下方块)，或由显示Oct-4萤光标记的萤光显微镜(上方块)所获得(比例尺＝100微米)；
图58表示在交配后4和4.5天的代表性小鼠胚胎的本显微影像，在以对照组(0.2％DMSO或无DMSO)处理后显示出良好质量(A/B级)的囊胚(blastocytes)，在以20微摩尔(μM)PluriSIn#1处理后，17个样品中有7个的囊胚显示良好质量，以及在以20微摩尔(μM)PluriSIn#1处理后，17个样品中有6个的囊胚显示不良质量(C级，没有内细胞团块(innercell mass，ICM))，17个样品中有6个显示受阻的囊胚(或桑葚胚)(PluriSIn#1与0.2％的DMSO一起施用，比例尺＝100微米)；
图59为一长条图，显示在以控制组处理之后，或是在存在或不存在100微摩尔(μM)油酸酸(OA)的情况下，以20微摩尔(μM)PluriSIn#1处理之后的良好质量(A/B级)囊胚，不良质量(C级)囊胚及受阻碍囊胚的比例(*p＝0.0001)；
图60表示在交配后4.5天的代表性小鼠胚胎的显微影像，在不存在或存在100微摩尔(μM)油酸(OA)的情形下，在以控制组处理24小时后，显示良好质量(A/B级)的囊胚；在以20微摩尔(μM)PluriSIn#1与100微摩尔(μM)油酸(OA)处理24小时后，7个样品中有5个显示良好质量(A/B级)的囊胚；在以100纳摩尔(nM)A939572单独处理24小时后，9个样品中有5个显示良好质量(A/B级)的囊胚；以及在有100微摩尔(μM)油酸(OA)的情形下，以20微摩尔(μM)PluriSIn#1或100纳摩尔(nM)A939572处理之后，或是以100纳摩尔(nM)A939572单独处理之后，显示不良质量(C级)囊胚及受阻碍囊胚(比例尺＝100微米(μm))。
图61为一长条图，显示在以控制组处理之后，或是在存在或不存在100微摩尔(μM)油酸酸(OA)的情况下，以100纳摩尔(nM)A939572处理24小时之后的良好质量(A/B级)囊胚，不良质量(C级)囊胚及受阻碍囊胚的比例(*p＝0.007)；
图62表示在暴露于20微摩尔(μM)PluriSIn#1，24或48小时之后，在6-孔板中的H9干细胞的显微影像；或是未暴露于PluriSIn#1(控制组)，在6-孔板中的H9干细胞的显微影像(比例尺＝200微米(μm))；
图63A和图63B表示在小鼠胚胎成纤维细胞之上的H9干细胞的显微影像，其在在10厘米-孔板中，暴露于20微摩尔(μM)PluriSIn#1(图63B)24或48小时之后，或是未暴露于PluriSIn#1(图63B样品，显示于图63A)；
图64为一长条图，显示以PluriSIn#1(Tra-1-60PluriSIn#1)处理混合细胞群体(分化和未分化的CSES2-SO2/细胞)，或以DMSO处理(Tra-1-60DMSO控制组)(″只有细胞″的结果也显示为控制组，其未染色)48小时之后的细胞的数量，其以TRA-1-60萤光染色的函数表示；
图65表示萤光显微镜影像，显示以PluriSIn#1处理混合细胞群体(分化和未分化的CSES2-SO2/细胞)48小时之后的OCT-4萤光标记，或以控制组处理48小时之后的OCT-4萤光标记；
图66A和图66B表示被注射CSES2-SO 2/3的胚胎干细胞(图66A)或BJ-iPS28诱导的多能干细胞(图66B)于两侧的小鼠的影像，其中注射于一侧(注射位置以箭头标示)的细胞以PluriSIn#1预先处理且无可见的畸胎瘤，而注射于另一侧的细胞没有被预先处理，产生一畸胎瘤(以椭圆标示，幷显示于右侧方块)；
图67A和图67B表示被注射已分化或未分化的H9胚胎干细胞的混合物(图67A)或已分化或未分化的BJ-iPS28诱导的多能干细胞的混合物(图67B)于两侧的小鼠的影像，其中注射于一侧(注射位置以箭头标示)的细胞以PluriSIn#1预先处理且无可见的畸胎瘤，而注射于另一侧的细胞没有被预先处理，产生一畸胎瘤(以椭圆标示，幷显示于右侧方块)；
图68表示显示以苏木精/伊红染色(hematoxylin/eosin-stained)的ES衍生及iPS衍生的畸胎瘤的组织学影像；
图69表示被注射人类胚胎干细胞(左侧方块)于两侧的小鼠的影像，其中注射于一侧(注射位置以箭头标示)的细胞以PluriSIn#1预先处理且无可见的畸胎瘤，而注射于另一侧的细胞没有被预先处理，产生一畸胎瘤(以椭圆标示，幷显示于右侧方块)；
图70表示在转染(transfection)SCD1的siRNA或模拟的(mock)siRNA(绿色萤光蛋白的siRNA)72小时之后的人类胚胎干细胞的代表性样品的显微图像；
图71为一长条图，显示未处理的人胚胎干细胞和被转染72小时后的人类胚胎干细胞的相对存活力，所述人类胚胎干细胞被转染40纳摩尔(nM)或80纳摩尔(nM)的SCD1的siRNA，80纳摩尔(nM)的SCD1的siRNA伴随100微摩尔(μM)的油酸(OA)，或控制组siRNA(绿色萤光蛋白的siRNA)(*p＜0.05)；
图72为一曲线图，显示在暴露于PluriSIn#172小时之后，通过人类端粒酶反转录酶的表达(human telomerase reversetranscriptase)(BJ+hTERT)而被永生化(immortalized)的正常BJ成纤维细胞的相对存活力，以及通过hTERT和H-RasV12的表达与p53和视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein)的抑制而被转化(transformed)的BJ成纤维细胞(BJ+hTERT-RB-P53)的相对存活力，以示例性化合物PluriSIn#1浓度的函数表示，(未处理PluriSIn#1的相对存活力被定义为1)；以及
图73为一曲线图，显示在暴露于PluriSIn#172小时之后，已分化和未分化的似干细胞的神经胶质瘤细胞(SLGCs)的相对细胞存活力，以示例性化合物PluriSIn#1浓度的函数表示，(未处理PluriSIn#1的相对存活力被定义为1)。
具体实施方式
本发明，在其一些实施例中，涉及治疗领域，更具体地而言(但不是唯一)，涉及未分化细胞的治疗，例如多能细胞和未分化癌细胞，涉及适用于其的新化合物，以及涉及鉴定适用于其的化合物的方方法。
如上文所讨论的，以前用于从已分化培养物去除潜在的致瘤性的多能干细胞(PSCs)残留所建议的方法，不是根据遗传操作(geneticmanipulations)就是根据细胞分选(cell sorting)。而这样的方法通常不适于细胞治疗目的。此外，到目前为止，还未知任何单一抗体和任何单一周期的细胞分选能从培养混合物完全去除所有未分化细胞。因此，有需要一种更可靠的方法，用于从培养物中消除未分化多能干细胞，特别是一种适用于细胞治疗目的的方法。
还有需要一种能够消除未分化细胞的化合物(例如，未分化癌细胞)，特别是在治疗增殖性疾病或病症中使用。
本发明人已预见可以通过鉴定小分子而达成改良去除多能干细胞(PSCs)，所述小分子选择性地扰乱PSCs中的关键路径，从而只有在这些细胞中诱发细胞凋亡。当实践本发明时，本发明人设计了一小分子的无偏(unbiased)高通量筛选。选用选择性地以人类PSCs为标靶的小分子，有效和有力消除培养物中所有的未分化细胞，而不影响其已分化的衍生物。因此根据本发明的一些实施方案，在移植至病人之前，这些小分子于已分化细胞培养物中的应用将大幅降低，甚至消除，由残留未分化细胞造成肿瘤形成的风险。
本发明的一些实施例的基本策略具有几个优于现有策略的优点，例如，比任何其他先前建议的方法更加快速，高效，确实和可扩展的。此外，本文所描述的策略不需要细胞遗传操作或分离(dissociation)成单一细胞。因此，本发明的实施例允许基因正常的PSCs被诱导而分化成复杂结构，不需要在被移植之前被分离(disassembled)。
当实践本发明时，本发明人进一步发现那些选择性地以未分化细胞为标靶而不影响其已分化的衍生物的化合物，能够有效地和有力消除未分化的癌细胞。
在详细说明本发明至少一实施方案之前，但是应当理解的是本发明不必限制应用于在以下描述所阐述的或通过实施例所举例说明的细节。本发明能够以其它实施例被实践或以各种方式进行。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供以任何如本文所述的化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途(例如，多能干细胞，未分化癌细胞)。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供任何如本文所述的化合物在制备抑制未分化细胞的药物的用途(例如，多能干细胞，未分化癌细胞)。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供抑制多能干细胞的方法，其通过以任何如本文所述的化合物接触未分化细胞(例如，多能干细胞，未分化癌细胞)而实现。
在一些实施方案中，以如本文所述的化合物接触未分化细胞(例如，多能干细胞)是在体外(in vitro)实现。
在一些实施方案中，接触是离体(ex vivo)实现。例如，在一些实施方案中，为了抑制一样品中的多能干细胞而施用至一对像，接触是离体(exvivo)实现的(例如非多能干细胞的细胞)。
在一些实施方案中，接触是在体内(in vivo)实现，通过将所述化合物施用于在有需要治疗的对象。
以抑制剂接触细胞可以通过任何在体外条件下执行，例如包括进行，将抑制剂添加于源自于一对象的细胞(例如，一初代细胞培养物，一细胞系)，或一生物样品，其包括相同的细胞(例如，一包含细胞的流体(fluid)，液体(liquid))，使得所述抑制剂与细胞直接接触。根据本发明的一些实施方案中，所述对象的细胞与抑制剂培养。就一段时间/细胞的浓度/抑制剂的浓度/细胞和药物之间的比率等等而选择用于培养细胞的条件，其使得所述抑制剂诱导未分化细胞(例如多能干细胞)的细胞变化，例如改变特定基因的转录和/或转译速率，细胞增殖率，分化，细胞死亡，坏死，细胞凋亡(apoptosis)等。
以抑制剂诱导的细胞变化的监测方法是本领域已知的，例如包括MTT试验，其是根据活细胞将黄盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基溴化四氮唑，[3-(4，5-dimethylthiazolyl-2)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)](Sigma，Aldrich St Louis，MO，美国)还原成一蓝紫色不溶性甲(formazan)沉淀物的选择性能力；在BrdU分析[细胞增殖ELISA BrdU的比色试剂套件(Roche，曼海姆，德国)]；TUNEL分析[Roche，曼海姆，德国]；膜联蛋白V分析(Annexin V assay)[膜联蛋白V凋亡试剂套件(Clontech公司实验室公司，加州，美国)，Annexin V Apoptosis Kit(Clontech Laboratories公司，加州，美国)]；衰老相关联-β半乳糖苷酶分析(the Senescenceassociated-β-galactosidase assay)[Dimri等人，美国国家科学院院刊Proc Natl Acad Sci USA 92：9363-9367(1995)]；以及各种RNA和蛋白质检测方法(其检测表达水平和/或活性)，其进一步描述于上述内容。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供如本文所述的一化合物做为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途(例如多能干细胞，未分化癌细胞)或用于抑制未分化细胞的方法(例如，多能干细胞，未分化癌细胞)。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供一种用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的方法，所述方法包括对所述对象施用本文所述的化合物的一治疗有效量。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种将本文所述的化合物用于制备一用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的用途。
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种本文所述的化合物，用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症。
本文所使用的词汇“未分化细胞(undifferentiated cells)”是描述以缺乏特定形态及功能特性为特征的细胞，所述特定形态及功能特性是在正常细胞在发展过程中所获得(在本领域中称为“分化(differentiation)”的过程)。细胞发展过程中的分化导致在不同的组织和细胞类型(其特征在于不同的大小，形状，膜电位，代谢活性和/或对信号的反应性)，其源自于一简单未分化的受精卵。一未分化细胞可以是一部分细胞系(lineage)，其从未进行过分化，或是源自于一已分化细胞，通过一消除所述已分化细胞的特定形态及功能特性的步骤。
在任何方面的一些实施例，所述未分化的细胞包括多能干细胞。
在任何方面的一些实施例，所述未分化的细胞包括未分化的癌细胞。
在一些实施例中，未分化癌细胞包括癌干细胞和/或癌干样细胞(cancer stem-like cells)。
如本文所使用的词汇“多能干细胞(pluripotent stem cells)”描述的是(即能分裂(devide)和分化(differentiate)成各种细胞类型的细胞)有潜力以分化成三个胚层的任一者：内胚层，中胚层或外胚层的干细胞。本领域中已知的实例包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。
如本文和本领域中使用的词汇“未分化癌细胞(undifferentiatedcancer cells)”描述的是表征为非常不成熟且与周围组织的细胞有区别的癌细胞，例如，逆行性生长的细胞(anaplastic cells)。未分化癌细胞的特性是现有技术中所习知的，例如，使用美国联合委员会于癌症的准则(the guidelines of the American Joint Committee on Cancer)未分化细胞可以被归类为第四级[AJCC癌症分期手册AJCC Cancer Staging Manual.7th ed.New York，NY：Springer；2010]。
在未分化癌细胞在一对象中可形成大部份的癌细胞(例如，在一肿瘤中)。这样的癌症(例如，根据美国联合委员会于癌症的准则，为第四级肿瘤[AJCC癌症分期手册AJCC Cancer Staging Manual.7th ed.New York，NY：Springer；2010])在本文和本领域中被称为“未分化癌症(undifferentiated cancer)”。
在未分化癌细胞在一对象中可形成大部份的癌细胞(例如，在一肿瘤中)。然而，即使是少量的，未分化癌细胞可以具有非常高的临床重要性，例如作为癌症干细胞。
如本文所使用和本领域中，词汇“癌干细胞(cancer stem cell)”和“癌干样细胞(cancer stem-like cell)”是可互换的，幷且指一癌细胞子集(例如，肿瘤或血液癌症中发现的细胞)，其具有可引起一特定的癌症样品中发现各种细胞类型的能力。这种引起不同癌症细胞类型的能力(其导致相当大的肿瘤形成能力)类似于正常干细胞引起不同的正常细胞类型的特性。
癌干细胞的多种例子以及其特征标记物(marker)是本领域习知的。举例而言，用于鉴定癌干细胞的合适标记物被Medema描述，[自然细胞生物学Nature Cell Biology 15：338-344(2013)〕和Visvader&Lindeman[自然评论杂志Nature Reviews Cancer 8：755-768(2008)]。实例包括(但不限于此)白血病细胞表达CD34标记物，但不表达CD38标记物，如Bonnet&Dick所述[自然医学Nature Medicine 3：730-737(1997]；脑癌(例如神经胶质瘤)细胞表达CD133标记物，如Singh等人所描述[癌症研究CancerResearch 63：5821-5828(2003)]，和/或CD15，CD90，α6-整合素(α6-integrin)和/或巢蛋白(nestin)标记；乳癌细胞表达CD44，但不表达CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD31，CD64和CD140b(细胞系标记物)，以及少量或是没有CD24(CD44+CD24-/低细胞系-细胞)，如Al-Hajj等人所述[美国国家科学院院刊PNAS 100：3983-3988(2003)]，和/或ALDH1，CD24，CD90，CD133，Hedgehog-Gli活性和/或α6-整合素(α6-integrin)；结肠癌细胞表达CD133，如O’Brien等人所述[自然期刊Nature 445：106-110]，CD44(例如EpCAMhi/CD44+细胞，如Dalerba等人所述[美国国家科学院院刊PNAS 104：10158-10163(2007)]，ABCB5，ALDH1，β连环蛋白(β-catenin)活性，CD24，CD26，CD29，CD166和/或LGR5；卵巢癌细胞表达CD44和CD117，如Zhang等人所述[癌症研究Cancer Research 68：4311-4320(2008)]，CD24和/或CD133；胰腺癌细胞表达CD44，CD24和上皮特异性抗原(epithelial-specific antigen，ESA)，如Li等人所述。[癌症研究[CancerResearch 67：1030-1037(2007)]，ABCG2，ALDH1，CD133，c-Met，CXCR4，巢蛋白(nestin)和/或节点蛋白激活素(nodal activin)；前列腺癌细胞表达CD133，α2β1整合素和CD144(α2β1 hi/CD133+/CD144+)，如Maitland&Collins所描述[临床肿瘤学杂志Journal of Clinical Oncology26：2862-2870(2008)]，以及Lang等人所描述[病理学杂志Journal ofPathology 217：299-306(2009)]ALDH1，CD44，CD166，α6整合素(α6-integrin)和/或Trop2；黑色素瘤细胞(melanoma cells)表达ABCB5，如Schatton等人所述[自然Nature 451：345-349(2008)]，和/或CD271，如由Boiko等人[自然Nature 466：133-137(2010)]和/或Civenni等人所述[癌症研究Cancer Research 71：3098-3109(2011)]，和/或高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)和CD20，如Schmidt等人所述[美国国家科学院院刊PNAS 108：2474-2479(2011)]和/或ALDH1和/或CD133；肝癌细胞表达CD13，CD24，CD44，CD90和/或CD133；肺癌细胞表达ABCG2，ALDH1，CD90，CD117和/或CD133；头颈癌细胞表达CD44；间叶癌细胞(mesenchymalcancer cells)以Hoechst 33342染剂的外排(efflux)为特征；和多发性骨髓瘤细胞(multiple myeloma cells)不表达CD138(CD138-)，如Matsui等人所述[血液期刊Blood 103：2332-2336(2004)]，例如CD138-/CD20+/CD27+细胞，例如通过Matsui等人所述[癌症研究Cancer Research68：190-197(2008)]。
可以预期的，一专利从申请案成熟的期间，将鉴定出许多相关的癌干细胞和癌干样细胞并发现其特征，术语“癌症干细胞(cancer stem cell)”和“癌干细胞样细胞(cancer stem-like cell)”的范围旨在事先包括所有这样的细胞先验。
本文所使用的“未分化细胞的细胞毒性抑制剂(cytotoxic inhibitor)”是描述一种化合物，当其接触未分化细胞时(例如，多能干细胞，未分化癌细胞)，通过抑制这些细胞的生长和/或增殖和/或通过杀死至少一部分这些细胞，减少了这些细胞的群体数量，。
因此词汇“抑制(inhibiting)未分化细胞”是描述通过抑制这些细胞的生长和/或增殖/或杀死至少一部分这些细胞，减少未分化细胞的群体数量(例如多能干细胞，未分化癌细胞)。
本文所用词汇“治疗有效量(therapeutically effective amount)”是描述施用化合物的一定量将减轻一或多个所治疗病症的症状至某种程度。
如本文所用词汇“对象(subject)”包括患有本文所述的病症(例如，增殖性疾病或病症)于任何年龄的哺乳动物，优选为人类，包括有风险发展成一病症的个体。
在一些实施方案中，所述对像是被诊断为具有未分化癌细胞的个体，其于某一程度上存在，使得所述对象被诊断为患有与未分化细胞相关的病症(例如增殖性疾病或病症)，如本文所述，或者所述对象具有风险发展成一病症。
在一些实施方案中，对像是被诊断为具有未分化癌细胞的个体，其可存在于一个程度，使得所述对象被诊断为患有与未分化细胞相关的病症(例如，增殖性疾病或病症)，如本文所述，或者对像是在开发这样的病症的风险。
如本文中所讨论的，抑制多能干细胞(的PSCs)可以阻止这些细胞从成熟的成癌细胞，因此当对象接受干细胞疗法(或其它细胞疗法)以减少此对象的癌症风险时，是有利的。
因此在一些实施方案中，本文所描述的任何的方法和用途被用于减少接受干细胞疗法的对象的癌症风险。
例如，接受干细胞疗法的对象可以是，在接受干细胞疗法之前，患有可以干细胞疗法而被治疗的疾病或病症的对象。这样的疾病和病症包括(但不限于)癌症，I型糖尿病，帕金森氏症(Parkinson’s disease)，亨廷顿氏症(Huntington’s disease)，阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease)，脑损伤，脊髓损伤，腹腔疾病，心脏衰竭，心脏损害，贫血，脱发，耳聋，失明，视力障碍，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)，宿主排斥移植物症(graft vs.host disease)，克罗恩病(Crohn’sdisease)，不育症，伤口，骨科疾病或障碍，肌肉损伤和神经障碍。
当由于PSCs增殖，对象具有发展(或已开发)与干细胞增殖相关的增殖性疾病或病症的风险，抑制PSCs也是有利的。
本文所使用的“增殖性疾病或病症(proliferative disease ordisorder)”描述的是与未分化细胞(例如，干细胞，未分化癌细胞)异常增殖相关的任何医学病症。此病症包括(但不限于)良性和恶性瘤形成(benignand malignant neoplasia)(例如癌症)，原位癌(carcinoma in situ)和增生(hyperplasia)。
与未分化细胞增殖相关联的增殖性疾病或病症的实例，包括(但不限于)畸胎瘤，未分化的癌症，白血病，脑癌(例如神经胶质瘤)，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，黑色素瘤(melanomas)，肝癌，肺癌，头颈癌，间叶癌(mesenchymal cancer)和多发性骨髓瘤(multiple myelomas)。
在一些实施方案中，所述增殖性疾病或病症是一畸胎瘤和/或一未分化癌。
在一些实施方案中，所述增殖性疾病或病症为癌症，如白血病，脑癌(例如神经胶质瘤)，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，黑色素瘤，肝癌，肺癌，头和颈癌，间叶癌和/或多发性骨髓瘤，癌症正在与癌症干细胞的增殖相关。
例如，具有发展增殖性疾病或病症风险的对像是被施用(例如作为细胞疗法的一部分)干细胞或干细胞衍生的细胞(例如通过分化)的对象，其中，此细胞为多能干细胞，已知包括多能干细胞，或具有包括一或多个多能干细胞的风险。
例如，患有与干细胞增殖相关的疾病或病症的对象为具有良性或恶性生殖细胞肿瘤(germ cell tumor)的对象(例如非精原细胞生殖细胞肿瘤(nonseminatous germ cell tumor))，例如畸胎瘤。
根据本发明的一些实施方案中，可用于本文所述的任何方法和用途中的化合物由式I所表示：
其中：
R1是氢；及R2是选自于以下组成的群组：
氢，
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基(2，4-dioxo-5-fluoropyrimidin-1-ylcarbonyl)，
2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)，及
-NH-R5；其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基(pyridinylcarbonyl)(例如：吡啶-4-基羰基，pyridin-4-ylcaronyl)，
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基(2-hydroxyl-2-phenyl-2-thiophen-2-yl-acetyl)，
(C1-6)烷基-羰基((C1-6)alkyl-carbonyl)(例如：一线性烷基-羰基，一非取代的烷基羰基)，
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基(N-(ethoxycarbonylmethyl)-2，4-dioxo-pyrrolidine-3-ylidene-methyl，
萘基磺酰基(naphthylsulfonyl)(例如：2-萘基磺酰基)，及
N-羟基-乙酰亚胺酰基
(N-hydroxy-acetimidoyl)(-C(＝NOH)CH3)；
或者，其中：
R1是苯甲酰基(benzoyl)
及R2是4-氯代苯甲酰胺(4-chlorobenzamido)；
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基(biphenyloxymethyl)(例如([1，1’-双苯基]-4-基氧)甲基，([1，1’-biphenyl]-4-yloxy)methyl)及(C1-4)烷基(alkyl)(例如：一线性烷基-羰基，一非取代的烷基羰基)所组成的群组。在一些实施例中，所述烷基为甲基。
在一些实施例中，R1，R2，R3及R4中的至少一个不是氢，卤素，NH2或(C1-4)烷基(alkyl)。
在一些实施例中，R1是氢，R2如上文所定义。
在一些实施例中，R1是氢；及R2是选自于以下组成的群组：
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基(2，4-dioxo-5-fluoropyrimidin-1-ylcarbonyl)，
2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)，及
-NH-R5，其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基(pyridinylcarbonyl)，
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基(2-hydroxyl-2-phenyl-2-thiophen-2-yl-acetyl)，
(C1-6)烷基-羰基((C1-6)alkyl-carbonyl)，
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基(N-(ethoxycarbonylmethyl)-2，4-dioxo-pyrrolidine-3-ylidene-methyl)，
萘基磺酰基(naphthylsulfonyl)及
N-羟基-乙酰亚胺酰基(N-hydroxy-acetimidoyl)；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基及(C1-4)烷基所组成的群组。
在一些实施例中，R1是苯甲酰基及R2是4-氯代苯甲酰胺；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基及(C1-4)烷基所组成的群组。
在一些实施例中，R2选自于2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)，-NH-R5(如本文定义)，和4-氯代苯甲酰胺(4-chlorobenzamido)所组成的群组。在一些实施例中，R2选自于-NH-R5(如本文定义)和4-氯代苯甲酰胺(4-chlorobenzamido)所组成群组。在一些实施例中，R2选自于2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺(2-methylbenzofuran-3-ylmethyleneamino)和-NH-R5(如本文定义)。在一些实施例中，R2是-NH-R5。
一可使用于本文所述的任何方法及用途的示例性化合物为式II的化合物：
一可使用于本文所述的任何方法及用途的示例性化合物为式III的化合物：
一可使用于本文所述的任何方法及用途的示例性化合物为式IV的化合物：
一可使用于本文所述的任何方法及用途的示例性化合物为式V的化合物：
一可使用于本文所述的任何方法及用途的示例性化合物为式VI的化合物：
词汇“烷基(alkyl)”描述的是一脂肪族(aliphatic)的碳氢物，包含直链及支链基团。因此指示“烷基”团中碳原子的数目。“烷基”团可以被取代也可以不被取代。在一些实施例中，所述“烷基”是不被取代的，除非在其他地方有特别描述。被取代的“烷基”可具有一或多个取代物(substituent)，其中取代基团可以分别为，例如：胺(amine)，卤素(halo)，磺酸酯(sulfonate)，亚砜(sulfoxide)，膦酸酯(phosphonate)，羟基(hydroxy)，烷氧基(alkoxy)，硫代羟基(thio)，硫代烷氧基(thioalkoxy)，氰基(cyano)，异氰酸酯(isocyanate)，硝基(azo)，偶氮(nitro)，磺酰胺(sulfonamide)，氧代(oxo)，羰基(carbonyl)，羧基(carboxy)，硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)，尿素(urea)，硫脲(thiourea)，氨基甲酸酯(carbamate)，环氧化物(epoxide)，硫杂丙环(thiirane)，氮丙啶(aziridine)，酰胺(amide)和肼(hydrazine)。
如本文所用的术语“胺(amine)”描述的是-NRxRy基团及-NRx-基团，其中Rx和Ry各分别为氢，甲基(CH3)或乙基(CH2CH3)。
因此胺基(amine group)可以是伯胺(primary amine)：其中Rx和Ry皆是氢，仲胺(secondary amine)：其中Rx是氢和Ry是烷基(alkyl)，或叔胺(tertiary amine)，其中Rx和Ry皆是烷基。
术语“卤化物(halide)”和“卤素(halo)”描述了氟，氯，溴或碘(fluorine，chlorine，bromine or iodine)。
术语“亚砜(sulfoxide)”是描述-S(＝O)Rx基团，其中Rx如本文所定义。
术语“磺酸酯(sulfonate)”是描述-S(＝O)2Rx基团，其中Rx如本文所定义。
如本文所使用的术语“磺酰胺(sulfonamide)”包括S-磺胺(sulfonamides)和N-磺胺(sulfonamides)。
术语“S-磺酰胺(S-sulfonamide)”是描述-S(＝O)2-NRxRy基团，Rx和Ry如本文所定义。
术语“N-磺酰胺(N-sulfonamide)”是描述RxS(＝O)2-NRy-基团，其中Rx和Ry如本文所定义。
在＝这里使用的术语“羰基(carbonyl)”或“碳酸酯(carbonate)”，是描述-C(＝O)-Rx团基，如本文所定义。
本文所使用的术语“氧代(oxo)”是描述＝O基团。
术语“羟基(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”是描述-OH基团。
术语“烷氧基(alkoxy)”是描述-O-(C1-2)烷基团
术语“硫代羟基(thiohydroxy)”是描述-SH基团。
术语“硫代烷氧基(thioalkoxy)”是描述-S-(C1-2)烷基组。
术语“氰基(cyano)”和“腈(nitrile)”是描述-C≡N基团。
术语“异氰酸酯(isocyanate)”是描述-N＝C＝O基团。
术语“硝基(nitro)”是描述-NO2基团。
术语“偶氮(azo)”是描述-N＝NRx基团，如Rx上文所定义。
本文所使用的术语“羧基(carboxy)”，包括C-羧基(carboxy)和O-羧基(carboxy)。
术语“C羧基(carboxy)”是描述-C(＝O)-ORx基团，其中Rx如本文所定义。
术语“O-羧基(carboxy)”是描述-OC(＝O)-Rx基团，其中Rx如本文所定义。
术语“尿素(urea)”是描述-NRxC(＝O)-NRyRw基团，其中Rx和Ry如上定义，Rw如本文Rx和Ry所定义的。
术语“硫脲(thiourea)”描述本文所定义的一个-NRx-C(＝S)-NRyRw基，Rx，Ry及Rw如本文所定义。
本文所使用的术语“酰胺(amide)”包括C-酰胺(amide)和N-酰胺(amide)。
术语“C-酰胺(amide)”是描述-C(＝O)-NRxRy基团，其中Rx和Ry如本文所定义。
术语“N-酰胺(amide)”是描述RxC(＝O)-NRy-基团，其中Rx和Ry如本文所定义。
本文所使用的术语“氨基甲酸酯(carbamate)”包括N-氨基甲酸酯(carbamate)和O-氨基甲酸酯(carbamate)。
术语“N-氨基甲酸酯(carbamate)”是描述RyOC(＝O)-NRx-基团，Rx和Ry如上定义。
术语“O-氨基甲酸酯(carbamate)”是描述-OC(＝O)-NRxRy基团，Rx和Ry如上定义。
本文所使用的术语“硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)”包括O-硫代氨基甲酸盐(thiocarbamate)和N-硫代氨基甲酸盐(thiocarbamate)。
术语“O-硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)”是描述-OC(＝S)-NRxRy基团，Rx和Ry如上定义。
术语“N-二硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)”是描述RyOC(＝S)-NRx-基团，Rx和Ry如上定义。
本文所用术语“环氧化物(epoxide)”是描述其中Rx，Ry和Rw如本文所定义。
本文所使用的术语“硫杂丙环(thiifane)”是描述一机团，同等于环氧化物(epoxide)”，其中所环氧化物中的氧原子(O)被置换为硫原子(S)。
本文所使用的术语“氮丙啶(aziridine)”是描述一机团，同等于环氧化物(epoxide)”，其中所环氧化物中的氧原子(O)被置换为氮原子(N)，且所述氮原子除了结合两个相邻碳原子，还结合Rq，其中Rq是根据Rx的相同定义。
本文所使用的术语“肼(hydrazine)”是描述-NRx-NRyRw基，Rx，Ry和Rw如本文所定义。
本文所述的任何一方法和用途中，本文描述的化合物本身可利用作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂(例如，PSCs，未分化癌细胞)，优选地是在具有药学上可接受的载体的药物组合物中。
因此根据本发明的另外的方面，提供一种药物组合物，包括本文所述的一或多种化合物(例如，多个细胞毒性抑制剂)和一药学上可接受的载体。
如本文所使用的“药物组合物”是指本文所述化合物的制备物，与其它化学组分例如药学上可接受的及适合的载体和赋形剂(carriers andexcipients)。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。
下文中，术语“药学上可接受的载体”是指一载体或稀释剂对生物体不会引起显着刺激，且不会消除所施用化合物的生物学活性和特性。载体的非限制性实施例是：丙二醇(propylene glycol)，盐水，乳化剂和水与有机溶剂的混合物，以及固态(例如粉末)和气态载体。
此处的“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进施用一化合物的惰性物质。赋形剂的非限制性实施例包括碳酸钙(calciumcarbonate)，磷酸钙(calcium phosphate)，各种糖和各种类型的淀粉(starch)，纤维素衍生物(cellulose derivatives)，明胶(gelatin)，植物油和聚乙二醇(poly-ethylene glycols)。
可以在“雷明顿的制药科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)”Mack出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，latest edition)发现用于配制和施用药物的技术，在此引入作为参考。
因此据本发明多个实施例中，所用的药物组合物可以使用一或多个药学上可接受的载体，以常规方式配制，其包含赋形剂和辅剂(auxiliaries)，以便将化合物加工成药学上可使用的制备物。适当的制剂取决于所选择的给药途径。所述剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而有变化。各医师可以根据考虑患者病情选择确切的制剂，给药途径和剂量(例如参见Fingl等人，1975，在“治疗学的药理基础”The Pharmacological Basisof Therapeutics，第1章第1页)。
根据所选择的是局部性或是全身性治疗或施用，以及治疗的区域，药物组合物可以以一或多种路径而配制施用。可经口服，吸入，或非肠胃的方式施用，例如通过静脉滴注(intravenous drip)或腹膜内(intraperitoneal)，皮下(subcutaneous)，肌肉(intramuscular)或静脉注射(intravenous injection)，或局部方式(topically)(包括眼，阴道，直肠，鼻内)(ophthalmically，vaginally，rectally，intranasally)。
局部给药制剂可包括但不限于：洗剂(lotions)，软膏(ointments)，凝胶(gels)，霜剂(creams)，栓剂(suppositories)，滴剂(drops)，液体(liquids)，喷雾剂(sprays)和粉剂(powders)。常规药物载体(carrier)，水性溶液(aqueous)，粉末(powder)或油性基质(oily bases)，增稠剂(thickeners)等可能是必要的或需要的。
用于口服给药的组合物包括粉末(powders)或颗粒剂(granules)，水或非水介质中的悬浮液或溶液(suspensions or solutions in water ornon-aqueous media)，小药囊(sachets)，丸剂(pills)，胶囊形片剂(caplets)，胶囊剂(capsules)或片剂(tablets)，增稠剂(thickeners)，稀释剂(diluents)，矫味剂(flavorings)，分散助剂(dispersing aids)，乳化剂(emulsifiers)或粘着剂(binders)可能是需要的。
用于非肠胃的施用制剂可以包括，但不限于无菌溶液，其还可以含有缓冲剂(buffers)，稀释剂(diluents)和其它适合的添加剂(additives)。可设想缓慢释放的组合物已进行治疗。
当然，所施用的组合物的量将根据于接受治疗的对象，痛苦的严重程度，给药方式，处方医师的判断等。
如果需要，本发明的实施方案的组合物可以存在于一包装(pack)或分配器(dispenser)装置，例如美国FDA(美国食品和药物管理局)批准的试剂盒，其可以包含含有活性成分的一或多个单位剂型。举例而言，所述包装可以包括金属或塑料箔，诸如，但不限于泡罩包装(blister pack)或加压容器(pressurized container)(用于吸入)。所述包装或分配装置可附有施用说明书。所述包装或分配器也可以伴随着与容器相关的通知，所述容器的形式是依照监管药品生产，使用或销售的政府机构所规定，所述通知反映所述组成物的用于人体或兽医的形式授所述机构批准。举例而言，这样的通知，可能是经过美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插入物。组成物包括配制在药学相容的载体中的本发明的化合物，所述组合物可以被制备，置于合适的容器中，并标记，以用于治疗本文中所述的病症(例如，与未分化细胞增殖相关的增殖性疾病或病症)如本文中详细说明。
因此，根据本发明的实施方案中，本发明的药物组合物被包装在一包装材料中，并以包装材料之上或之中的印刷辨识，以用于治疗本文中所描述的病症(例如，与未分化细胞增殖相关的增殖性疾病或病症)。
根据的任何方法本文中，所呈现的用途和组合物的进一步的实施例中，本发明的化合物通常可以与其它通常用于治疗本文所述病症的活性成份结合(例如，与未分化细胞增殖相关的增殖性疾病或病症)。
根据本发明的实施方案的另一个方面，提供一本文描述的化合物，被鉴定以用于抑制未分化细胞(例如，本文所述多能干细胞和/或未分化癌细胞)。
如本文实施例所示，本发明人已证实，抑制SCD(stearoyl-CoAdesaturase，硬脂酰辅酶A去饱和酶)导致多能干细胞的选择性细胞毒性抑制。
因此，根据本发明一些实施例的一方面，提供一种以SCD抑制剂作为多能干细胞的细胞毒性抑制剂的用途。在示范性实施例中，未分化细胞是多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种以SCD抑制剂制造用于抑制未分化细胞的药物的用途。在示例性实施例中，未分化细胞是多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供抑制未分化细胞的方法，其通过将未分化细胞与SCD抑制剂接触而实施。在示例性实施例中，未分化细胞是多能干细胞。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供药物组合物，包括一治疗有效量的SCD抑制剂和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，这样的组合物被配制，鉴定，如本文所述地使用和/或包装(例如，如本文中所描述，相对于如本文中所描述的化合物)。
在一些实施方案中，SCD抑制剂(如本发明的任何方面所描述)是一个SCD1抑制剂。
示例性SCD1抑制剂包括A939572(4-(2-氯苯氧基)-N-(3-(甲基氨基甲酰基)-苯基)呱啶-1-甲酰胺，4-(2-chlorophenoxy)-N-(3-(methylcarbamoyl)-phenyl)piperidine-1-carboxamide)，CAY-10566(3-[4-(2-氯-5-氟苯氧基)-1-呱啶基]-6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-哒嗪，3-[4-(2-chloro-5-fluorophenoxy)-1-piperidinyl]-6-(5-methyl-1，3，4-oxadiazol-2-yl)-pyri daz ine)，MF-438(2-甲基-5-[6-[4-[2-(三氟甲基)苯氧基]呱啶-1-基]哒嗪-3-基]-1，3，4-噻二唑，2-methyl-5-[6-[4-[2-(trifluoromethyl)phenoxy]piperidin-1-yl]pyridazin-3-yl]-1，3，4-thiadiazole)，CVT-11127(N-(2-(6-(3，4-双氯苄胺)-2-(4-甲氧苯基)-3-氧吡啶[2，3-b]吡嗪-4(3H)-基)乙基)乙酰胺，N-(2-(6-(3，4-dichlorobenzylamino)-2-(4-methoxyphenyl)-3-oxopyrido[2，3-b]pyrazin-4(3H)-yl)ethyl)acetamide)，TOFA(5-(十四烷氧基)-2-糠酸，5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid)和GSK-993(N-(1-(5-氯-2-异丁氧基)-5-甲基-1H-吡唑-3-基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-6-甲酰胺，N-(1-(5-chloro-2-isobutoxybenZyl)-5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline-6-carboxamide，例如Issandou等人所著[欧洲药理学期刊Eur J Pharmacol 618：28-36(2009)]和梅森等人所著[PloS One 7：e33823(2012)])。
在一些实施方例中，所述SCD1抑制剂是MF-438，CAY-10566，A939572，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，CAY-10566，A939572，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，MF-438，A939572，CVT-11127和/或6SK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，MF-438，CAY-10566，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，MF-438，CAY-10566，A939572，和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，A939572，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，A939572，MF-438和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，A939572，MF-438和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，MF-438，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，MF-438，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，CVT-11127和/或6SK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，MF-438和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，MF-438和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，MF-438和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566，MF-438和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，CAY-10566和/或6SK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，MF-438和/或CAY-10566。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572，CAY-10566和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，A939572和/或CAY-10566。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，A939572和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，A939572和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，A939572和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，CAY-10566和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，CAY-10566和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，CAY-10566和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，MF-438和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，MF-438和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA，CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572和/或CAY-10566。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是A939572和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CAY-10566和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是MF-438和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是MF-438和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是CVT-11127和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或CAY-10566。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或CVT-11127。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或GSK-993。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或MF-438。
在一些实施方案中，所述SCD1抑制剂是TOFA和/或A939572。
在一些实施方案中，在SCD抑制剂是核酸沉默序列为SCD1(例如SCD1)。的siRNA对于SCD1是示例性核酸沉默序列。
本文所用术语“核酸沉默序列(nucleic acid silencing sequence)”是指一核酸(例如，RNA)，包含一能够特异地抑制或使目标基因的表达被“沉默”的序列(例如，SCD1)。在某些实施方案中，所述核酸沉默序列是能够通过后转录沉默机制(post-transcriptional silencing mechanism)防止mRNA分子的呈序完整(例如，完整转译和/或表达)。核酸沉默序列包括非编码RNA分子，例如双链RNA(RNA duplexes)，其包括配对的两股(strand)，以及RNA前驱物(precursor)，从中可以产生小的非编码RNA。示例性RNA沉默序列包括双股RNA(dsRNA)，如siRNA，mircoRNA和shRNA的。在一实施例中，核酸沉默序列能够诱导RNA干扰(RNA interference)。在另一个实施例中，所述核酸沉默序列能够调节转译抑制。
根据本发明的一实施例中，核酸沉默序列对目标RNA有特异性(例如，SCD1)，不交叉(cross)抑制或使基因或剪接变体沉默，所述基因或剪接变体表现出99％或更低的目标基因的总体同源性，例如小于98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％的目标基因的总体同源性。
RNA干扰指的是在动物中短干扰RNAs(short interfering RNAs，siRNAs)所调节的序列特异性后转录基因沉默的的过程(sequence-specific post-transcriptional gene silencing)。
在细胞中长dsRNA的存在刺激核糖核酸酶III酶(ribonuclease III)的活性，其称为切丁酶(dicer)。切丁酶(dicer)涉及将dsRNA加工成短片段的dsRNA，称为短干扰RNAs(short interfering RNAs，siRNAs)。切丁酶活性衍生的短干扰RNAs一般约为21至约23个核苷酸长度，幷包含约19个碱基对的双链体(pair duplexes)。所述RNAi反应还以内切核酸酶复合物(endonuclease complex)为特色，通常称为RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，其调节单股RNA的裂解，所述单股RNA具有siRNA双链体的反义股(antisense strand)的互补序列。目标RNA的裂解发生互补于siRNA双链体的反义股的中间区域。
因此，本发明的一些实施例考虑使用dsRNA负向调节来自于mRNA的表达。
根据一实施例，所述dsRNA大于30对碱基。长dsRNA(即dsRNA的大于30碱基对)的使用是非常有限制的，这是由于相认为双股RNA的这些较长区域将导致干扰素和PKR反应的诱导。然而，使用长dsRNA可以提供许多优点，其中细胞可以选择最佳的沉默序列减轻测试大量siRNA的需求；长dsRNA将允许沉默资料库(silencing libraries)具有比较小的复杂性，相较于siRNA所必需的复杂性；也许最重要的是，当作为疗法使用时，长双链RNA可以避免病毒逃逸突变(viral escape mutations)。
各种研究表明，使用长dsRNA可以沉默基因表达而不诱导的压力反应或不引起显着的非目标效应(off-target effects)[Strat等人，核酸研究Nucleic Acids Research，34：3803-3810(2006)；Bhargava等人，脑研究建议Brain Res.Protoc.13：115-125(2004)；Diallo等人，寡核苷酸Oligonucleotides 13：381-392(2003)；Paddison等人，美国国家科学院院刊PNAS 99：1443-1448(2002)；Tran et al.，FEBS Lett.573：127-134(2004)]。
具体而言，根据一些实施例，本发明设想将长dsRNA(超过30个碱基的转录片段(transcripts))引入于细胞中以用于将基因沉默，所述细胞中干扰素途径未被激活(例如在胚胎细胞和卵母细胞)-例如参见Billy等人。[美国国家科学院院刊PNAS 98：14428-14433(2001)]和Diallo等人[寡核苷酸Oligonucleotides 13：381-392(2003)]。
根据一些实施例，根据一些实施例，本发明设想引入长dsRNA，其设计为不会引起干扰素和PKR路径，以负向调控基因表达。例如，Shinagwa andIshii[基因与开发Genes&Dev.17：1340-1345(2003)]已经开发出一种载体(vector，命名为pDECAP)以RNA聚合酶II(RNA polymerase II，PolII)启动子表达长的双股RNA。因为源自于pDECAP的转录片段(transcripts)缺少5’-帽(5’-cap)结构及3’多聚(A)尾部(3’-poly(A)tail)，以便dsRNA输出到细胞质中，而源自于pDECAP的长双链RNA并会不诱导干扰素反应。
在哺乳动物系统中回避干扰素和PKR通路的另一种方法是通过引入小抑制RNA的(small inhibitory RNAs，siRNA)或者通过转染(transfection)或内源表达(endogenous expression)。
术语“siRNA”是指小抑制性RNA双链体(small inhibitory RNAduplexes，通常为18-30个碱基对)，诱导RNA干扰(RNAi)途径。通常情况下，siRNA是化学合成为21聚体(21mers)以及中央19碱基对的双链区域和在末端(termini)对称的2碱基的3’突出端(overhang)，然而最近已描述25-30碱基长度的化学合成RNA双链体可具有高达增加100倍的效力，当与21单位(21mers)在相同位置相比。使用更长的RNA触发RNAi，以获得观察到的增加效力，理论上是因为提供切丁酶(dicer)基质(substrate)(27聚体)而非产物(21聚体)，这样提高siRNA双链进入RISC的速度或效率。
已经发现3’突出端(overhang)的位置影响siRNA的效力，幷且具有3’突出端(overhang)于反义股的不对称的双链通常比突出端(overhang)于有义股的更有效力(Rose等人，2005年)。这可以归因于装载到RISC的不对称股，当以反义转录片段(transcript)作为目标时，观察到相反的效力形式。
双股干扰RNA(例如，siRNA)的双股可以被连接以形成发夹(hairpin)或茎环结构(stem-loep structure)(例如shRNA)。因此，如所述的，本发明的一些实施例中，核酸沉默序列也可以是一短发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA)。
本文所用的术语“shRNA的”，是指一RNA具有茎-环结构(stem-loopstructure)，包括互补序列的第一和第二区域，这些区域的互补性(complementarity)和取向(orientation)的程度的足以使得在发生区域之间产生碱基配对，第一和第二区域通过环状区域连接，所述环体(loop)是由于所述环状区域中核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对所导致。在环体的核苷酸数目是包括3到23，或5至15或7至13，或4至9，或9至11之间的一数字。在环体中一些核苷酸可与环体中的其他核苷酸的碱基对相互作用有关。可用于形成环体的寡核苷酸序列的实例包括5’-UUCAAGAGA-3’[Brummelkamp等人，Science 296：550(2002)]和5’-UUUGUGUAG-3’[Castanotto等人，RNA 8：1454(2002)]。所得到的单链寡核苷酸形成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机制相互作用的双链区域，这可被本领域中的专业技术人员识别。
适用于本发明的一些实施例的核酸沉默序列的合成可如以下实施。首先，扫描目标mRNA序列中AUG起始密码子下游的AA二核苷酸序列。每个AA的发生点以及与3’相邻的19个核苷酸被记录为潜在的siRNA目标位点。优选地，siRNA目标位点选自于开放阅读框(open reading frame)，因为非转译区(untranslated regions，UTR)具有较多的调控蛋白结合位点(regulatory protein binding sites)。UTR结合蛋白和/或转译起始复合物可能干扰siRNA内切酶复合物(siRNA endonuclease complex)的结合[Tuschl所著，化学生物化学ChemBiochem.2：239-245(2001)]。但可以理解的是，引导至非翻译区的siRNA也可能是有效的，这已由GAPDH所显示，其中引导至5’端非编码区的siRNA调节降低约90％的细胞GAPDH mRNA并完全消除蛋白水平。
第二，将有潜力的目标位点与适当的基因组资料库(例如，人，小鼠，大鼠等)比较，使用任何序列比对软件，例如可用从NCBI服务器的BLAST软件。过滤掉与其他编码序列表现出显着同源性的假定目标位点。
合格的目标序列被选择作为siRNA合成模板。优选的是那些包括低G/C含量的序列，因为相对于G/C含量高于55％的序列，这些序列已经被证明更有效地调节基因沉默。优选地沿着目标基因的长度选择几个目标位点进行评估。为了达到所选择的siRNA的更佳评估，优选地一起使用阴性控制组。阴性控制组siRNA优选地包括与所述siRNA相同的核苷酸组成，但在基因组中缺乏显着同源性。因此，优选使用一打散的(scrambled)siRNA核苷酸序列，其对其他任何基因不显示任何显着同源性。
应该理解的是，本发明的一些实施方案中，核酸沉默序列不必限于那些只包含RNA的分子，但还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在一些实施例中，本文提供的核酸沉默序列功能上与细胞穿透肽(cell-penetrating peptide)相关联。本文所使用的“细胞穿透肽”是一种肽，其包括一短(约12-30个残基(residue))氨基酸序列或功能性基序(functional motif)，其赋予与能量无关的转运(transloation)特性(即非胞吞(non-endocytotic))，此特性与穿过细胞膜和/或核膜的膜可透复合物(membrane-permeable complex)的转输(tranport)相关联。使用于本发明的一些实施方例的膜可透复合物(membrane-permeable complex)的细胞穿透肽(cell-penetrating peptide)优选地包含至少一非功能性的半胱氨酸残基(cysteine residue)，其可以是游离的或衍生化的(derivatized)，与双股核糖核酸形成双硫链接(disulfide link)，所述双股核糖核酸被修改以用于这种联接。赋予这类特性的代表性氨基酸基序都列在美国专利6348185号，其内容明确地通过引用并入本文。本发明一些实施方案中的细胞穿透肽优选包括(但不限于)，穿膜蛋白(penetratin)，运输蛋白(transportan)，pIsl，TAT(48-60)，pVEC，MTS和MAP。
根据一些实施方式中，核酸沉默序列是微小RNA(miRNA)。
术语“微RNA(microRNA，miRNA，miRNA为同意辞)”是指大约19-28个核苷酸长度的非编码单链RNA分子，其调控基因表达。miRNA被发现在广泛的生物体中，幷已证明在发育，稳态和疾病病因中扮演角色。
根据一些实施例中，核酸沉默序列是微RNA模拟物(microRNA mimic)。
术语微RNA模拟物(microRNA mimic)是指合成非编码RNA分子，能够进入RNAi途径和调控基因表达。miRNA模拟物模仿内源性微RNA(miRNA)的功能，幷且可以被设计为成熟的双股分子或模拟的前驱物(precursor)(例如，或pre-miRNA)。miRNA模拟物可以包括被修改的或未被修改的RNA，DNA，RNA-DNA杂合体，或替代性核酸化合物(alternativenucleic acid chemistries)(例如LNAs或2’-O，4’-C-乙烯桥联核酸(2’-O，4’-C-ethylene-bridged nucleic acids，ENA))。成熟的双股miRNA模拟物的双链区长度可以在13-33，18-24或21-23个核苷酸之间变化。所述miRNA还可包括至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39或40个核苷酸的总数。miRNA序列可以是pre-miRNA的最前面的13-33个核苷酸的的。miRNA的序列也可以是pre-miRNA的最后面的13-33个核苷酸。miRNA模拟物的制备可以通过化学合成方法或通过重组方法进行。
在一些实施方案中，所述SCDl抑制剂是如本文所述(例如本文所述的PluriSIn化合物)的化合物。PluriSIns#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)和#6(2-羟基-2-(噻吩-2-基)-2-苯乙酸4-甲基-N’-苯基酰肼，2-hydroxy-2-(thiophen-2-yl)-2-phenylacetic acid4-methyl-N’-phenylhydrazide)是示例性SCD抑制剂。
在一些实施方案中，SCD抑制剂是式II的化合物(如本文所述)和/或式I的化合物(如本文所述)，其中式II的R2选自于2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺，-NH-R5(如本文定义)，和4-氯代苯甲酰胺所组成的群组。这样的化合物包括苯基酰肼基团(phenylhydrazide moiety)，一种与SCD抑制相关的结构，如本文中示例部分所举例说明。
在一些实施方案中，R2选自于-NH-R5(如本文定义)，和4-氯代苯甲酰胺所组成的群组。在一些实施方案中，R2选自于2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺，和-NH-R5(如本文定义)所组成的群组。在一些这样的实施方案中，R2是-NH-R5。
举例而言，根据本发明的实施例，适用的额外的SCD抑制剂包括硫杂脂肪酸基质类似物(thia-fatty acid substrate analogs)(例如9-硫杂硬脂酸，9-thiastearic acid)，如Behrouzian和Buist所述[前列腺素，白三烯和必需脂肪酸Prostaglandins，Leukotrienes and EssentialFatty Acids 68：107-112(2003)]；环丙烯脂肪酸(cyclopropenoid fattyacids)(例如，苹婆酸(8-(2-辛基环丙烯基)辛酸，sterculic acid(8-(2-octylcyclopropenyl)octanoic acid))和锦葵酸(malvalic acid)(7-(2-辛基环丙烯基)庚酸)，7-(2-octylcyclopropenyl)heptanoic acid))，如Raju和Reiser所述[生物化学杂志J Biol Chem 242：379-384(1967)]；共轭长链脂肪酸的异构体(conjugated long-chain fatty acid isomers)，如Park等人所述[生物化学生物生理学报Biochim Biophys Acta1486：285-292(2000)]；小分子SCD1抑制剂，如Liu等人所述[药物化学期刊J Med Chem 50：3086-3100(2007)]，由Zhao等人所述[Bioorg医学化学快报Bioorg Med Chem Lett 17：3388-3391(2007)〕，Xin等人所述。[Bioorg药物化学快报Bioorg Med Chem Lett 18：4298-4302(2008)]；和SCD抑制剂在具有公开号的国际专利申请中描述：WO 2005/011653，WO2005/011654，WO 2005/011655，WO 2005/011656，WO 2005/011657，WO2006/014168，WO 2006/034279，WO 2006/034312，WO 2006/034315，WO2006/034338，WO 2006/034341，WO 2006/034440，WO 2006/034441，WO2006/034446，WO 2006/086445，WO 2006/086447，WO 2006/101521，WO2006/125178，WO 2006/125179，WO 2006/125180，WO 2006/125181，WO2006/125194，WO 2007/044085，WO 2007/046867，WO 2007/046868，WO2007/050124，WO 2007/130075，WO 2007/136746，WO 2008/074835，WO2008/074835，WO 2008/074824，WO 2008/036715，WO 2008/044767，WO2008/029266，WO 2008/062276，WO 2008/127349，WO 2006/130986，WO2007/009236，WO 2007/056846，WO 2007/071023，WO 2007/134457，WO2007/143823，WO 2007/143824，WO 2008/017161，WO 2008/046226，WO2008/064474，WO 2008/003753，WO 2007/143697，WO 2008/024390，WO2008/096746and WO 2008/056687，以及美国专利申请号2008/0182838，以及Liu[关于治疗专利的专家意见Expert Opinion on TherapeuticPatents 19：1169-1191(2009)]。在一些实施方案中，SCD抑制剂是反义寡核苷酸，例如适合实现SCD-1的RNA干扰的寡核苷酸，如Morgan-Lappe等人所描述[癌症研究Cancer Research 67：4390-4398(2007)]。
所有上述引用文献的教示以引用方式并入，如同在本文中完全阐述。
可以预期的，一专利从申请案成熟的期间，将发展出许多相关的SCD抑制剂(例如SCD1抑制剂)，术语“SCD抑制剂”的范围旨在事先包括所有这样的新技术的先验。
在一些实施方案中，将未分化细胞(例如，多能干细胞)与SC抑制剂接触是在体外(in vitro)实现(例如如本文中描述与本文中描述的化合物)。
在一些实施方案中，接触是以离体(ex vivo)实现(例如如本文中描述与本文中描述的化合物)。
在一些实施方案中，SCD抑制剂(如在本发明的任一方面描述)是本文中所描述的化合物。在一些实施方案中，该化合物含有一种取代或未取代的苯基酰肼基团(phenylhydrazide moiety)和/或一种取代或未取代的苯基酰肼衍生物。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供本文所述化合物(例如本文中所述的SCD抑制剂)于治疗与增殖细胞相关的增殖性疾病或病症的用途，所述增殖细胞的特征为对SCD抑制敏感。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供本文所述化合物(例如本文中所述的SCD抑制剂)于制备用于治疗与增殖细胞相关的增殖性疾病或病症的药物的用途，所述增殖细胞的特征为对SCD抑制敏感。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗与增殖细胞相关的增殖性疾病或病症的方法，所述增殖细胞的特征为对SCD抑制敏感，所述SCD抑制是通过以如本文所述的化合物(例如本文中所述的SCD抑制剂)接触未分化细胞而实现。在一些实施例中，所述未分化细胞为多能干细胞。
根据本发明的一些实施例的方面，提供一种药物组合物，包括本文所述的化合物(例如本文中所述的SCD抑制剂)的一治疗有效量，及一药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物被配制，鉴定和/或包装，如本文所述。
在一些实施方案中，与增殖细胞相关的增殖性疾病或病症，所述增殖细胞的特征为对SCD抑制敏感，所述增殖性疾病或病症为癌症。
所述增殖性疾病或病症与增殖细胞特征对SCD抑制的敏感性是一种癌症相关联。
本文进一步所例示，本发明人已发现了一种新且有效的技术，来鉴用于抑制未分化细胞的化合物，举例而言在寻找有用的未分化细胞抑制剂，其可以用于作为主要候选物。
因此，根据本发明的实施例的另一方面，提供一种中鉴定用于抑制未分化细胞的主要候选物的方法，所述方法包括：
(a)提供多个多能干细胞的样品，各个所述样品包括一不同类型的多能干细胞；
(b)将所述样品与一候选化合物接触；及
(c)监测在所述样品中所述干细胞的存活力，由此如果在至少两个所述样品中的存活力降低，则所述候选化合物被鉴定为能够抑制多能干细胞，从而鉴定为一主要候选物。
在示范性实施例中，未分化细胞是多能干细胞，所述方法是为了鉴定用于抑制多能干细胞主要候选物。
在一些实施方案中，多个未分化细胞(例如多能干细胞)的样品包括至少三个样品。在一些实施方案中，多个未分化细胞(例如多能干细胞)的样品包括至少四个样品。在一些实施方案中，多个未分化细胞(例如多能干细胞)的样品包括至少五个样品。
在一些实施方案中，在至少三个未分化细胞的样品中(例如多能干细胞)，存活力降低。在一些实施方案中，在至少四个未分化细胞的样品中，存活力降低。在一些实施方案中，在至少五个未分化细胞的样品中，存活力降低。
在一些实施方案中，在所有未分化细胞(例如多能干细胞)的样品中，或是在所有样品但除了一样品中，存活力降低。在一些实施方案中，在所有样品中，存活力降低。
在一些实施方案中，所述方法是鉴定用于选择性地抑制未分化细胞(例如多能干细胞)的主要候选物，所述方法还包括：
(d)提供至少一已分化细胞的样品；
(e)将所述至少一样品与所述化合物接触，所述化合物被鉴定为能够降低未分化细胞的群体总数(例如多能干细胞的群体总数)；
(f)监测在至少一所述样品中所述已分化的细胞的一存活力，由此如果在至少一所述样品中的存活力被维持，则所述化合物被鉴定为能够选择性抑制未分化细胞(例如多能干细胞)。
在一些实施例中，所述化合物与已分化细胞的多个样品接触。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个个样品包括至少三个样品。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个个样品包括至少四个样品。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个个样品包括至少五个样品。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个个样品包括至少六个样品。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个个样品包括至少七个样品。在一些实施例中，所述已分化细胞的多个样品包括至少八个样品。
在一些实施例中，存活力并未在已分化细胞的样品中降低，除了一个样品。在一些实施例中，存活力并未在已分化细胞的样品中降低。
合适的未分化细胞(例如多能干细胞，未分化癌细胞)和已分化细胞在以下的实施例中进行描述。
在一些实施例中，所述已分化细胞衍生于所述未分化细胞(例如通过多能干细胞和/或未分化癌细胞的分化)，或反之亦然(例如，通过多能性(pluripotency)和/或恶性(malignancy)的已分化细胞的诱导)。
在一些实施例中，如本文所述测试多个候选化合物。在一些实施例中，测试至少5个候选化合物。在一些实施例中，测试至少10个候选化合物。在一些实施例中，测试至少20个候选化合物。在一些实施例中，测试至少50个候选化合物。在一些实施例中，测试至少100个候选化合物。在一些实施例中，测试至少有200个候选化合物。在一些实施例中，测试至少有500个候选化合物。在一些实施例中，测试至少1000个候选化合物。在一些实施例中，测试至少2000个候选化合物。在一些实施方案中，测试至少5000个候选化合物。在一些实施例中，测试至少10000个候选化合物。在一些实施例中，测试至少20000个候选化合物。在一些实施例中，测试至少50000个候选化合物。
存活力的监测可以根据本领域已知的技术来进行，例如，本文所述的分析。
在一些实施方案中，存活力是使用细胞存活力光谱分析(aspectroscopic assay of cell viability)监测。光谱分析可提供以一种有效的和非昂贵的方式，分析许多样品的能力(例如，不同的细胞类型和/或不同的候选化合物)。
术语“包括”(comprises)，“包括”(comprising)，“包括”(includes)，“包含”(including)，“具有”(having)和其词形变化是指“包括但不限于”。
术语“由...组成”(consisting of)意指“包括幷且限于”。
本文中所用的词汇“示例性(exemplary)”表示“用作为一示例(exemple)，实例(instance)或例证(illustration)”。任何被描述为“示例性”实施例未必被解释为优选或优于其它实施例和/或排除与来自其它实施例的特征结合。
本文中所用的词汇“可选择地(optionally)”表示“在一些实施例中提供，而在其它实施例中不提供”。任何本发明的特定实施例可以包括多个“可选择的”特征，除非此类特征相冲突。
术语“基本上由......组成”(essentially consisting of)是指组合物，方法或结构可包括额外的成分，步骤和/或部件，但只有当额外的成分，步骤和/或部件实质上不改变所要求保护的组合物，方法或结构的基本特征和新特征。
本文所使用的单数形式“一”，“一个”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在。应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便和简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1，2，3，4，5和6，此不管范围宽度皆适用。
每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。术语，第一指示数字和第二指示数字″之间的范围”及第一指示数字″到”第二指示数字″的范围″在本文中可互换，幷指包括第一和第二指示数字，和其间的所有分数和整数。
如本文所用的术语“方法(method)”指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
如本文所使用的，术语“治疗”包括消除(abrogate)，本质上地抑制(substantially inhibiting)，减慢或逆转(reversing)一状态的进展，本质上改善(ameliorating)一状态的临床或美学的症状，或本质上预防一状态的临床表现或美学症状。
可以理解，本发明中的特定特征，为清楚起见，在分开的实施例的内文中描述，也可以在单一实施例的组合中提供。相反地，本发明中，为简洁起见，在单一实施例的内文中所描述的各种特征，也可以分开地，或者以任何合适的子组合，或者在适用于本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的内文中所描述的特定特征，幷不被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施例没有那些元素就不起作用。
上文所述的及以上权利要求项部分所请求的本发明各种实施例和方面，可在以下的实施例中找到实验支持。
示例：
现在参考以下实施例，连同上面的描述以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。
材料和方法：
材料：
A939572从BioFine International公司(温哥华，加拿大)获得；
激活素A(activin A)从R&D Systems公司获得；
安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride)从Sigma-Aldrich公司获得；
牛血清白蛋白(bovine serum albumin)从Sigma-Aldrich公司获得；
CAY10566从Cayman Chemical公司获得；
2’，7’-二氯萤光素(2’，7’-dichlorofluorescein)从Sigma-Aldrich公司获得；
氯仿从Sigma-Aldrich公司获得；
二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)从Bio-Lab公司(以色列)获得；
DMEM(Dulbecco的改良Eagle培养基)从Sigma-Aldrich公司获得；
DMEM/F12(1∶1)培养基从Sigma-Aldrich公司获得；
DMSO(二甲基亚砜，dimethylsulfoxide)从Sigma-Aldrich公司获得；
胎牛血清从Biological Industries公司(Beit Haemek，以色列)获得；
FGF-2(成纤维细胞生长因子2，fibroblast growth factor 2)得自PeproTech公司获得；
Folch溶液从Sigma-Aldrich公司获得；
G418遗传霉素硫酸盐(G418 geneticin sulfate)从GIBCO获得；
谷氨酰胺(glutamine)从BiologicalIndustries公司(Beit Haemek，以色列)获得；
戊二醛(glutardialdehyde)从Sigma-Aldrich公司获得；
hCG(人绒毛膜促性腺激素，human chorionic gonadotropin)从Sigma-Aldrich公司获得；
异丙醇(isopropanol)从Sigma-Aldrich公司获得；
剔除DMEM培养基(knockout DMEM medium)从Invitrogen公司获得；
剔除血清替代品(knockout serum replacement)从Invitrogen公司获得；
白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)从Invitrogen获得；
β巯基乙醇(β-mercaptoethanol)从Sigma-Aldrich公司获得；
M2培养基从Sigma-Aldrich公司获得；
M16培养基从Sigma-Aldrich公司获得；
MatrigelTM基质是从BD Biosciences公司获得；
甲醇从Sigma-Aldrich公司获得；
蛋氨酸(methionine)是从Biological Industries公司(Beit Haemek，以色列)获得；
亚甲蓝(methyalene blue)从Sigma-Aldrich公司获得；
矿物油是从Sigma-Aldrich公司获得；
mTeSR1定义培养基(mTeSR1 defined medium)从STEMCELLTechnologies公司(温哥华，加拿大)获得；
正己烷(n-hexane)从Sigma-Aldrich公司获得；
非必需氨基酸(nonessential amino acids)从Sigma-Aldrich公司获得；
油酸(oleic acid)([1-14C]标记和未标记的，及油酸-白蛋白(albumin))从Sigma-Aldrich公司获得；
青霉素(penicillin)是从Biological Industries公司(Beit Haemek，以色列)获得；
PMSG(pregnant mare’s serum gonadotropin，孕马血清促性腺激素)从Sigma-Aldrich公司获得；
嘌呤霉素(puromycin)从Sigma-Aldrich公司获得；
视黄酸(retinoic acid)从Sigma-Aldrich公司获得；
RPMI-1640培养基从Invitrogen公司获得；
S35标记的蛋氨酸从Izotop公司(匈牙利)获得；
脱脂乳(粉末)从Difco公司获得；
丁酸钠(sodium butyrate)从Sigma-Aldrich公司获得；
丙酮酸钠(sodium pyruvate)从Sigma-Aldrich公司获得；
硬脂酸(stearic acid)([1-14C]标记和非标记的)从Sigma-Aldrich公司获得；
链霉素(streptomycin)从Biological Industries公司(Beit Haemek，以色列)获得；
三氯乙酸(trichloroacetic acid)从Merck Millipore公司获得；
Triton X-100从Sigma-Aldrich公司获得；
胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)从Biological Industries公司(BeitHaemek，以色列)获得；
Z-VAD-FMK从Santz Cruz Biotechnology公司获得。
细胞系：
BJ成纤维细胞(永生的)从Clontech Laboratories公司获得；
BJ-iPS28诱导多能干细胞是衍生的，如Pick等人所述[干细胞StemCells 27：2686-2690(2009)]；
CSES2人胚胎干细胞是衍生的，如Lavon等人所述[干细胞Stem Cells26：1874-1882(2008)]；
CSES2-S02/3胚胎干细胞是衍生的，如Kopper&Benvenisty等人所述[干细胞研究Stem Cell Research 8：335-345(2011)]；
人类胚胎干细胞衍生的肝细胞从Cellartis公司(瑞典，哥德堡)获得，根据制造商的说明书而操作；
诱导的人类多能干细胞衍生的心肌细胞从Cellular DynamicsInternational公司(麦迪逊，威斯康辛)，根据制造商的说明书而操作；
Mel-1人胚胎干细胞从Millipore公司获得。
细胞培养：
人类胚胎干细胞(ES)细胞系H9[Thomson等人，科学期刊Science282：1145-1147(1998)]，CSES2，CSES2-S02/3和Mel-1，且诱导的多能干细胞(iPS)细胞系BJ-iPS28，不用饲养细胞(feeder cell)而培养在预涂覆有MatrigelTM的10厘米组织培养皿中(Greiner Bio-One)，使用补充有青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)的mTeSR1定义培养基。细胞使用AccutaseTM(Millipore)传代培养(passage)。
神经母细胞瘤细胞系Kelly培养在RPMI-1640培养基，补充有15％胎牛血清(FBS)，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)。
肝癌细胞系Huh-7培养在一DMEM/F12(1∶1)培养基，补充有10％FBS，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)。
宫颈癌细胞系HeLa，畸胎瘤细胞系NTERA-2和永生BJ成纤维细胞的细胞系，分别在补充有10％FBS，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)的DMEM中培养。
使用已建立的方案(protocol)，CSES2-SO2/胚胎干细胞分化为内胚层祖细胞[Duan等人，干细胞Stem Cells 28：674-686(2010)]。使用mTeSR1培养基将未分化细胞以10,000细胞/平方厘米密度被接种在MatrigelTM涂覆的培养皿。次日(第1天)，培养基换成无血清的RPMI-1640培养基，其补充有2毫摩尔(mM)的谷氨酰胺(glutamine)，100纳克/毫升的激活素A(Activin A)，60微克/毫升的G418遗传霉素硫酸盐(geneticinsulfate)，及0.3微克/毫升嘌呤霉素。从第3天至第8天，在相同的培养基再补充1xB27补充剂(Invitrogen)和0.5毫摩尔(mM)的丁酸钠(sodiumbutyrate)。所述细胞的细胞鉴定为内胚层祖细胞，其通过定量绿色SOX17+细胞的百分比和CXCR4+细胞的百分比而被确定，使用EasyCyteTMPlus流式细胞仪系统(Millipore)。通过使用对抗早期内胚层表面标记物CXCR4的抗体，对细胞萤光染色(CXCR4-PE抗体，1∶25；BD Biosciences)而获得进一步验证。使用EasyCyteTM Plus流式细胞仪系统，量化CXCR4+细胞的百分比。
人类胚胎干细胞(SA001)分化为神经干细胞(NSCs)，使用双SMAD抑制方案(protocol)如Chambers等人所述[自然生物技术NatureBiotechnology 27：275-280(2009)]。调整从hPSCs产生的神经祖细胞的方案(STEMCELL Technologies公司)，使得神经聚集物(neural aggregates)含有高达5000的细胞；神经上皮细胞诱导培养基是N2B27(Invitrogen公司)，补充有0.2％ SB431542 10毫摩尔(mM)(Tocris公司)，0.2％人类Noggin蛋白133微克/毫升(PeproTech公司)，和0.05％人类FGF-2 10微克/毫升。
人类胚胎干细胞(SA001)分化为神经干细胞(NSCs)，使用双SMAD抑制方案(protocol)如Lai等人所述[方法分子生物学Methods Mol Biol698：141-150(2011)]。调整方案，使得细胞在剔除DMEM培养基中生长10-15天，其含有20％FBS，1％非必需氨基酸，1％Glutamax(Invitrogen公司)，0.1％青霉素和链霉素，0.1％β巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.1％FGF-2 10微克/毫升，和1％抗坏血酸-2-磷酸(ascorbic acid2-phosphate，100毫摩尔(mM))。细胞传代培养(passage)3-6次，以获得一稳定表型。
R1 Oct4-GFP小鼠胚胎干细胞[Yeom等人，发育Development122：881-894(1996)]生长在明胶(gelatin)包被的培养皿，使用DMEM培养基，15％FBS，1毫摩尔(mM)丙酮酸钠，0.1毫摩尔(mM)非必需氨基酸，0.1毫摩尔(mM)β巯基乙醇和1000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)。
化学资料库筛选(Chemical Library Screening)：
所述的发光细胞存活例分析(Promega公司，麦迪逊，威斯康辛)被实现为高通量筛选分析(high-throughput screening assay，HTS)，用于384孔洞型式的化学资料库筛选。在DMSO耐受度分析被评价，并且各种细胞类型的最佳细胞数被测定之后，以下列50种市售化合物进行试点筛选(pilot screen)：
3-乙酰氨基苯酚(3-acetamidophenol)，4-乙酰氨基苯酚(4-acetamidophenol)，6-甲基香豆素(6-methyalcoumarin)，对乙酰氨基酚(acetaminophen)，乙酰唑胺(acetazolamide)，放线菌酮(actidione)，盐酸金刚烷胺(amantadine hydrochloride)，氨基水杨酸(aminosalicylicacid)，阿莫地喹(amodiaquine)，安吖啶盐酸盐(amsacrinehydrochloride)，氨曲南(aztreonam)，咖啡因(caffeine)，卡铂(carboplatin)，头孢孟多钠(cefamandole sodium)，胆酸(cholic acid)，环丙沙星(ciprofloxacin)，氯氮平(clozapine)，香豆素(coumarin)，响尾蛇素(crotaline)，二氟尼柳(diflunisal)，多巴胺(dopamine)，多西环素(doxycycline)，红霉素(erythromycin)，雌二醇(estradiol)，法莫替丁(famotidine)，非诺贝特(fenofibrate)，氟氢可的松醋酸酯(fludrocortisone acetate)，庆大霉素(gentamicin)，丙咪嗪(imipramine)，异烟肼(isoniazid)，异丙肾上腺素(isoproterenol)，卡那霉素(ketoconazole)，酮康唑(kanamycin)，L-甲状腺素(L-thyroxine)，甲灭酸(mefenamic acid)，纳多洛尔(nadolol)，盐酸纳布啡水合物(nalbuphine hydrochloride hydrate)，尼扎替丁(nizatidine)，去甲肾上腺素(norepinephrine)，苯巴比妥(phenobarbital)，奎宁盐酸盐(quinine hydrochloride)，水杨酸钠(salicylate sodium)，2-巯基-乙磺酸盐(2-mercapto-ethanesulfonate)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，舒林酸(sulindac)，四环素(tetracycline)，二硫化四乙基秋兰姆(tetraethylthiarum disulfide)，噻吗洛尔马来酸盐(timolol maleate)，丙戊酸钠(valproic acid sodium)，WY-14643。
关于初级筛选，与Roche内部化合物结合的52448化合物筛选资料库(称为“金”库)在384孔形式进行了测试。化合物以0.5微升(μl)的4毫摩尔(mM)DMSO溶液分布于384孔板中(每个板352个化合物)。关于确认筛选，反筛选和化合物数据表筛选(counter-screens and compoundprofiling screens)，从Roche专有化合物清单(Roche proprietarycompound inventory)得到被定义为命中(hits)的化合物，幷以8微升(μl)的5毫摩尔(mM)DMSO溶液分布于384孔洞形式。
使用WellMate细胞分配器(dispensor)(Matrix，Hudson，NH)，将5000个CSES2细胞被接种于预覆有MatrigelTM的黑色384孔洞透明底部孔板(Falcon，BD)，其每孔洞有50微升(μl)的mTeSR1培养基。接种24小时后，将培养基更换为25微升(μl)新鲜培养基与25微升(μl)40毫摩尔(mM)的化合物培养基溶液，在来自于中间化合物稀释板(intermediatecompound dilution plates)的1％DMSO中。将孔板孵育于37℃，5％CO2大气压之下，持续整个筛选期间，当需要操控液体时，不列入计时。在以化合物处理24小时之后，使用冷光细胞存活力分析试剂套件(luminescent cell viablity assay kits)测定细胞存活力。50微升(μl)的CellTiter-GloTM试剂加入到孔板的的各孔洞中幷充分混合。在室温下孵育15分钟后，将25微升(μl)液体从各孔洞中传送到白色不透明底384孔板中(PerkinElmer)，并使用孔板读取器(PerkinElmer)测量冷光。使用16个中性控制组孔洞(0.5％DMSO)和8个阳性控制组孔洞(5毫摩尔(mM)安吖啶盐酸盐)以标准化化合物的效果。所有液体转移步骤均使用FXP实验室自动化工作站(Beckman Coulter公司，富勒顿，加州)以及Multidrop Combi液体分配器(dispensor)(Thermo Fisher，沃尔瑟姆，麻州)。使用Assay Analyzer分析仪(Genedata，巴塞尔，瑞士)进行数据模式的校正和计算。使用Spotfire软件(Spotfire，萨默维尔，麻州)进行数据表示。
对于3种多能干细胞系(CSES2，H9和CSES2-SO 2/3)，重新测试在初级筛选中被鉴定为命中的化合物(以20微摩尔(μM)的浓度)，以作为确认筛选。测试在确认筛选中696个确认的命中，以13种不同细胞类型的图表表示，使用上述的相同的筛选方案(除了在胚胎干细胞来源的神经干细胞(NSCs)和间叶干细胞(MSCS)的情况下)，其方案如下所述。如下面所讨论的，根据剂量的多浓度方式或以单一浓度方式测试化合物。筛选CSES2和CSES2-SO2/3细胞系，以及衍生于此细胞系(CSES2-SO2/3-分化)的早期内胚层祖细胞，以范围从50微摩尔(μM)至23纳摩尔(nM)的8个浓度，使用1∶3的续列稀释步骤。筛选BJ-iPS28细胞系和从其衍生的BJ成纤维细胞，以范围从50微摩尔(μM)至200纳摩尔(mM)的6个浓度，使用1∶3的续列稀释步骤。以20微摩尔(μM)的浓度筛选心肌细胞。以20微摩尔(μM)的二重复筛选HeLa和NTERA-2细胞系。以20微摩尔(μM)的三重复筛选Kelly和的Huh-7。以20微摩尔(μM)的二重复于原来细胞到达的96孔板筛选肝细胞(40,000个细胞各孔洞，在160微升(μl)培养基，对所涉及的所有试剂的体积做相应调整)。以12.5微摩尔(μM)的二重复筛选间叶干细胞(MSC)和神经干细胞(NSC)。
间叶干细胞和神经干细胞接种在白色384孔透明底部孔板(Corning公司)预先涂覆有聚鸟氨酸/层粘连蛋白(poly-ornithin/laminin)。以各孔洞4,000个细胞的密度于38微升(μl)培养基中接种细胞。孵育4小时后，将2微升(μl)预稀释的化合物加入至细胞中，以到达12.5微摩尔(μM)的终浓度，且具有0.25％的DMSO。细胞与化合物孵育24小时，然后去除25微升(μl)的培养基，将15微升(μl)的CellTiter-GloTM试剂加入所述孔板。在一小时内读出发光信号(luminescence signal)。
各孔洞的原始强度数据都经过背景校正，通过减去在同一平板上所有阳性控制组孔洞的中间质强度(median intensity)，幷用于计算各细胞系的各化合物的抑制效果。Genedata分析仪和Condoseo(Genedata AssayAnalyzer and Condoseo)用于数据型式校正，运算和IC50曲线拟合。为各个孔版决定一个Z’因子。
碱性磷酸酶染色，免疫化学法和免疫印迹：
碱性磷酸酶染色依照白血球碱性磷酸酶试剂盒(Leukocyte AlkalinePhosphatase Kit，Sigma-Aldrich公司)的指示进行。
关于免疫细胞化学染色，以PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞两次，以含有4％(重量/体积)多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS在室温下固定30分钟，以0.2％的Triton X-100透化(permeablize)，并以含有3％(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻隔(block)2小时。用下列抗体进行(依照指示稀释在阻隔缓冲液中)初级抗体(primary antibody)染色：小鼠抗人类Oct3/4(IgG，1∶200，SantaCruz Biotechnology公司)，山羊抗人NANOG(IgG，1∶100，R&D Systems公司)。细胞在4℃下用初级抗体孵育过夜，洗涤并以Alexa Fluor二级抗体(Invitrogen)孵育进行2小时。
关于免疫印迹，10％聚丙烯酰胺胶体(polyacrylamide gel)用于蛋白质分离和检测。将胶体转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)并且抗体杂和反应(hybrydization)和化学发光(chemiluminescence)分别根据标准程序进行的。在本分析中的一级抗体是兔抗磷酸化eIF2α的抗体(1∶250，Cell Signaling Technology公司)，兔抗胱天蛋白酶-3(caspase-3，1∶1000，Cell Signaling Technology公司)，小鼠抗β连环蛋白(β-catenin，1∶10,000，BD Biosciences公司)和小鼠抗α微管蛋白(β-catenin，1∶50000，Sigma-Aldrich公司)。辣根过氧化物酶缀合的抗兔和抗小鼠次级抗体自Jackson ImmunoresearchLaboratories公司获得。
RNA分离，反转录和定量PCR：
使用PerfectPureTM RNA培养细胞试剂套件(5 Prime公司)萃取总RNA。使用1微克的总RNA于反转录反应，使用ImProm-IITM的逆转录酶(Promega)。定量即时PCR(Quantitative real-time PCR)的执行是以1微克(μg)的RNA反转录为cDNA，再使用PowerGreen PCR MasterMix(Applied Biosystems公司)以及7300及时PCR系统(7300 real-timePCR System，Applied Biosystem公司)进行分析。拼接过的XBP1(sXBP1)的引子序列(Primer sequence)为ctgctgagtccgcagcaggtgca(前)和ggtccaagttgtccagaa tgc(后)；对于RPB1引子序列为tgcgcaccatcaagagagtc(前)和ctccgtca cagacattcgctt(后)；OCT4，NANOG和GAPDH的TaqMan探针的分别为：HS00005111_g1，HS02387400_g1和HS99999905_m1。
细胞存活力测定：
对于高通量筛选，如上所述使用冷光细胞存活力分析测定相对细胞数。或者，通过0.5％戊二醛(glutardialdehyde)固定并以亚甲烯蓝溶于0.1M硼酸(pH值8.5)染色，以测定相对的细胞数。
使用0.1M盐酸中进行颜色提取，通过在650nm的波长的吸光度定量所述染色(其正比于细胞数)。
FACS分析：
关于人类胚胎干定量细胞衍生的内胚层祖细胞，以AccutaseTM(Millipore公司)将细胞分离，以40微摩尔(μM)尼龙(nylon)细胞过滤器(Falcon BD公司)过滤，并用PBS洗涤两次。分离的细胞以105个细胞/毫升的最终浓度悬浮。将细胞与CXCR4-PE抗体在冰上孵育(1∶25稀释，BDBiosciences公司)1小时，用PBS洗涤两次，悬浮于具有2％FBS的PBS，并使用EasyCyteTM Plus流式细胞仪系统(Millipore)以及Express软件(Millipore公司)分析。
关于处理后其余未分化细胞的量化，将细胞以20微摩尔(μM)的PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)持续处理48小时或72小时，使用TrypLETM Select(Invitrogen)分离，并用补充有10％FBS和0.05％迭氮化钠(sodium azide)的PBS洗涤。解离的细胞悬浮到106个细胞/毫升的最终浓度。将细胞与TRA1-60-PE抗体(1∶40，BD Biosciences公司)在冰上孵育，洗涤，以LSR II FACS流式细胞仪(BDBiosciences公司)及FCS Express软件(De Novo Software，洛杉矶，CA)进行分析。
关于凋亡的定量，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂套件(Annexin V-FITCApoptosis Detection Kit，eBioscience公司)。将细胞用20微摩尔(μM)的PluriSIn#11处理6小时，使用TrypLETM Select进行离解，并用补充有10％FBS和0.05％迭氮化钠(sodium azide)的PBS洗涤。解离的细胞以2-5×105个细胞/毫升的终浓度悬浮，并根据制造商的说明书进行处理。以LSR II FACS流式细胞仪及FCS Express软件进行分析。
显微成像：
在黑色透明底384孔板(Falcon BD)中进行CSES2-SO2/3萤光细胞(mCherry+或EGFP+)高含量成像(high content imaging)，使用Opera高含量筛选成像平台(Opera high-content screen imaging platform，PerkinElmer公司)。或是，在24孔洞，6孔洞或10厘米孔板(Greiner Bio-One)执行所有细胞的光和萤光成像，使用Olympus CellR成像站(Olympus CellR imaging station)。在35毫米培养皿中(Falcon，BD)进行发育中小鼠胚胎的光成像，使用Olympus IX70显微镜。
整体基因表达分析：
人类胚胎干细胞，及衍生于人胚胎干细胞的早期内胚层祖细胞，分别用化合物PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acidN’-phenylhydrazide)，PluriSIn#6(2-羟基-2-(噻吩-2-基)-2-苯乙酸4-甲基-N’-苯基酰肼，2-hydroxy-2-(thiophen-2-yl)-2-phenylaceticacid4-methyl-N’-phenylhydrazide)，或用0.2％DMSO控制组处理12小时。根据制造商的方案，使用PerfectPureTM核糖核酸培养细胞试剂套件(PerfectPureTM RNA Cul tured Cell Kit，5Prime公司)萃取总RNA，并使用人类基因组U133A 2.0微阵列平台(Human Genome U133A 2.0microarray platform，Affymetrix公司)进行分析；根据制造商方案进行洗涤及筛选。原始微阵列数据可以在NCBI基因表达总括(NCBI GeneExpression Omnibus，GEO)的数据库以登录号GSE37040取得。
使用Affymetrix公司的表达控制平台的MAS5演算法将阵列标准化。在探针组不存在于控制组和处理组的条件下，通过MAS5不存在/存在而滤出。表达值低于50的探针组被提高到此水平。使用2倍的阈值，构成差异表达的基因的列表，以用于各对条件：以PluriSIn#1与控制组处理胚胎干细胞，以PluriSIn#6与控制组处理胚胎干细胞，以及以PluriSIn#1与控制组处理内胚层祖细胞。
为了检测显着占绝大多数的(over represented)基因本体(geneontolody，GO)的生物过程(biological process)，差异表达基因的列表是以DAVID功能注释集群工具处理(DAVID functional annotationclustering tool，www.david.abcc.ncifcrf.gov)。高
为了发现PluriSIns所诱导的基因表达改变与以及已知药物所诱导的基因表达改变之间的相似性，根据开发人员的指示，差异表达的基因的列表是以一关联性图谱分析(Connectivity Map，cmap)处理，(www.broadinstitute.org/CMAP)。
使用差异表达的基因的列表做为输入资料，以用于无监督的层次聚类(unsupervised hierarchical clustering)，以Partek基因组套件版本6.3执行(Partek Genomics Suite version 6.3，Partek，圣路易斯，密苏里州)进行。
蛋白质合成的代谢标记：
H9胚胎干细胞以2×105个细胞/孔洞的密度，接种在MatrigelTM预涂的6孔洞组织培养孔板中，幷使用mTeSR1定义的培养基培养。BJ成纤维细胞以相同的密度接种在6孔洞组织培养孔板，幷用补充有10％FBS，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)的DMEM培养。以20微摩尔(μM)的PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)或用0.2％DMSO处理细胞12小时。然后将细胞用PBS洗涤，并补充甲硫氨酸不足型介质(methionine-deficient medium)1小时。然后使用10μCi的S35-标记的甲硫氨酸(methionine)于1毫升/孔洞，在20微摩尔(μM)PluriSIn#1或0.2％DMSO的存在下，进行细胞代谢标记1小时。细胞以含有10微摩尔(mM)甲硫氨酸的PBS洗涤，然后在含有10微摩尔(mM)甲硫氨酸，0.4毫升，30％，冰冷的三氯乙酸(trichloroaceticacid，TCA)中裂解(lysed)15分钟。一3MM预过滤器以及在其之上的一GF/C过滤去分别设置在一过滤装置中，并装设一不锈钢稳定柱筒(stillcylinder)。所述过滤器在真空条件下以10％TCA预先湿润。以各孔洞的内容物通过过滤器而收集TCA沉淀物，并用5％TCA洗涤三次，用乙醇洗涤一次。滤膜被风干，然后使用2900T液体闪烁分析仪(2900TR Liquid Scintillation Ahalyzer(PerkinElmer))以液体闪烁光谱(liquid scintillation spectrometry)处理。总蛋白质浓度是使用Bradford蛋白测定法(Bradford Protein Assay，Sigma-Aldrich公司)确定，并且所述放射性测量相应地标准化。实验以三重复执行。
SCD1活性的测定：
细胞以50,000至100,000个细胞每孔洞的密度接种于6孔洞的孔板中。24小时后，将20微摩尔(μM)的PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)或0.2％DMSO(控制组)加入至细胞中。在37℃下，5％CO2孵育12小时后，除去旧培养基，用PBS洗涤细胞，并添加新培养基含有2.3微摩尔(μM)，0.75UCi[1-14C]硬脂酸。然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育达4小时。
孵育期间结束后，舍弃培养基，并用2毫升的PBS将细胞洗涤3次。添加2毫升的正己烷∶异丙醇混合物(n-hexane∶isopropanolmixture)(3∶2体积∶体积)，然后将细胞在37℃温度，5％CO2下孵育30分钟。随后加入2毫升Folch溶液(体积∶体积为2∶1的氯仿∶甲醇混合物)中。将所述液体转移至多个管体内，加入1毫升的水，以用于相分离(phase partition)。将下方的有机相(organic phase)蒸发，并用于脂质皂化(lipid saponification)及游离的[1-14C]硬脂酸(stearic acid，基质)和[1-14C]油酸(oleic acid，成形产物)的TLC(薄层色谱法)分离。从细胞中提取的脂质被涂抹至先前被浸渍于10％AgNO3的TLC平板并在120℃的温度下进行60分钟的活化。未标记的硬脂酸和油酸加入到各个涂抹点，作为载体和作为标准，以进行鉴定。然后将平板用氯仿∶甲醇∶乙酸∶二次蒸馏水(DDW)(90∶8∶1∶0.8)的混合溶剂流过。在以2’，7’-二氯萤光素(2’，7’-dichlorofluorescein)溶液喷洒TLC后，通过紫外线照射进行游离脂肪酸的检测。刮下对应于硬脂酸和油酸的点，在Packard1600TR闪烁计数器(scintillating counter)下计量放射性。从基质转产物的百分比转化率以及每106个细胞每分钟转化为皮摩尔(picomole)来计算SCD1去饱和酶(SCD1 desaturase)活性。实验以三重复执行。
油酸补救分析(Oleic acid rescue assay)：
在预涂覆有MatrigelTM的24孔组织培养板(GreinerBio-One公司)上，使用mTeSR1定义培养基，不使用饲养细胞，培养人类胚胎干细胞。用20微摩尔(μM)受测PluriSIn化合物，5微摩尔(μM)安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride)，或0.02％DMSO，在油酸-白蛋白(oleic acid-albumin)或只有白蛋白(albumin)存在或不存在的情况下。24小时后，对细胞显微成像和测量细胞存活力。
体外(In-vitro)胚胎发育实验：
通过注射促性腺激素诱导雌性小鼠(CB6F1/OLAHSD和ICR：HSD(CD-1))超数排卵(Superovulation)：在下午1：00腹腔注射5IU PMSG(孕马血清促性腺激素)，47小时后，随后腹膜内注射5IU的hCG(人绒毛膜促性腺激素)，根据Najy等人所述的方法。[操纵小鼠胚胎：实验室手册，Manipulating the mouse embryo：a laboratory manual，3rd Edn.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(2003)]。
雌性在第二次注射后，立即与雄性交配，在第二天早晨明显地观察到栓子。牺牲怀孕雌鼠(交配后约36小时)，收集双细胞的胚胎根据Najy等人所述的方法。[操纵小鼠胚胎：实验室手册，Manipulating the mouseembryo：a laboratory manual，3rd Edn.，Cold Spring HarborLaboratory Press(2003)]。打开腹腔，切下输卵管并转移至含有室温的M2培养基的培养皿。以M2培养基冲洗输卵管，使用移液器(pipette)收集胚胎，用M2培养基冲洗碎片。将胚胎转移至M16培养基的微滴。
在前一天准备35毫米的培养皿(Falcon BD)，其含40微升(μl)M16培养基的微滴，以矿物油覆盖，并且在37℃温度，5％CO2下孵育过夜。在收集之后，随后胚胎被转移到这些微滴下，并以37℃温度5％CO2下孵育。使用光学显微镜成像，一天检视两次胚胎的发育。在桑椹期(约3.5天)，将胚胎转移到40微升(μl)M16培养基的微滴，20微摩尔(μM)的PluriSIns#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)及0.2％DMSO中，或是含有0.2％DMSO的控制组微滴。其它控制组胚胎被留在原来的微滴，以用于控制传移本身可能的影响。大约在交配后第4天和4.5天时，用光学显微镜成像检视胚胎，以Cortes等人所述的方式进行囊胚分级[干细胞与发育Stem Cells and Development 17：255-267(2008)]。
畸胎瘤的形成：
在预涂覆有MatrigelTM的6孔组织培养板(Greiner Bio-One公司)上，使用mTeSR1定义培养基，不使用饲养细胞，培养人类胚胎干细胞和诱导的多能干细胞系培。以20微摩尔(μM)的PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼，isonicotinic acid N’-phenylhydrazide)于0.2％DMSO中，或以0.2％DMSO处理细胞24小时，随后更换培养基与进行第二处理持续另外24小时。在开始暴露于测试的化合物48小时后，以胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)收集细胞，再次悬浮于mTeSR1：MatrigelTM为1∶1的混合物，而致总体积为200微升(μl)。然后将细胞皮下注射到NOD-SCIDIL2Rγ-/-小鼠背面(Jackson Lab)。注射后六周牺牲小鼠，检视肿瘤的形成，幷对得到的畸胎瘤进行拍照，解剖和冷冻保存于O.C.T.化合物(Sakura Finetek，托兰斯，加州)。
可替代地，人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞于培养基上自动进行分化10天的期间，通过将它们生长于明胶(gelatin)包覆的培养板上，使用85％剔除DMEM培养基，其补充有15％剔除血清替代品，1毫摩尔(mM)谷氨酰胺(glutamine)，0.1毫摩尔(mM)β巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，1％非必需氨基酸，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升)，而不使用基本成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)。将视黄酸(Retinoic acid)加入到培养基中成为1微摩尔(μM)的最终浓度。10天后，将已分化细胞s收获并与未分化的亲代细胞以1∶1的比例接种于预涂覆有MatrigelTM的6孔组织培养板(Greiner Bio-One公司)，其具有mTeSR1定义的培养基。以20微摩尔(μM)的PluriSIn#1或0.2％的DMSO处理细胞24小时，随后更换培养基和进行第二处理持续另外24小时。在开始暴露于测试的化合物48小时后，以胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)收集细胞并使用Countess自动细胞计数器(Countessautomated cell counter，Invitrogen)进行计数。来自于各条件的一百万个可见细胞被再次悬浮于mTeSR1∶MatrigelTM为1∶1的混合物，而致总体积为200微升(μl)。然后将细胞皮下注射到NOD-SCIDIL2Rγ-/-小鼠背面。每只小鼠以PluriSIn#1处理过的细胞注射到其躯体一侧，并以控制组处理过的细胞注射到另一侧。注射六周后牺牲小鼠，检视肿瘤的形成，幷将得到的畸胎瘤进行拍照，解剖和冷冻保存于O.C.T.化合物。
SCD1削减(knockdown)：
对于SCD1遗传消除(ablation)，使用针对人类SCD1的ON-TARGET plusSMART pool siRNA(ON-TARGET plus SMART pool siRNA against human SCD1，Dharmacon RNAi Technologies，拉法叶，科罗拉多州)，进行SCD1削减。如先前所述将siRNA转染进入人胚胎干细胞[Ma等人，RNA 16：2564-2569(2010)]使用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)。以40纳摩尔(nM)或80纳微摩尔(nM)的最终浓度使用siRNA寡核苷酸。针对绿色萤光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的siRNA被用作为模拟的(mock)siRNA(Integrated DNA Technologies，Coralville，爱荷华州)。转染后72小时，测定细胞存活力。
统计：
基因表达水平资料(profiles of gene expression levels)以及与化合物反应资料(profiles of reaction to compounds)的分级聚类(Hierarchical clustering)通过Partek基因组学套件版本6.3执行(Partek，圣路易斯，密苏里州)进行。
使用单尾学生t测验，比较控制组和处理组细胞之间的选择的基因的基因表达水平以及SCD和蛋白质合成活动。
关于DAVID功能注释分析(DAVID functional annotation analysis)在使用Benjamini修正之后，显着性阈值决定为p＝0.05，。
在PluriSIn化合物列表中具有苯基肼(phenylhydrazine)化合物的丰富显着性(enrichment significance)，以及在关联性图谱(cmap)中蛋白质合成抑制剂的丰富显着性，是使用Pearson’s chi-squaregoodness-of-fit测试所确定。体外胚胎发育的实验的显着性是采用Fisher精确试验所确定。
Z’因子根据下式进行计算：
1-[3(pos.con.的s.d.-neg.con.的s.d.)/|pos.con.的平均值-neg.con.的平均值|]
其中s.d.＝标准差(standard deviation)；pos.＝正；neg.＝负；con.＝控制组。
示例1
筛选干细胞的细胞毒性：
为了鉴定人类多能干细胞(hPSC)，设计和使用小分子的高通量筛选(high-throughput screen，HTS)，如上所述。为了便于筛选，开发幷使方案最佳化，可用于在384孔洞型式中培养未分化的hPSC，自动涂抹小分子于细胞孔盘，以及在细胞暴露于测试物质之后准确地评估细胞存活力。
首先，人类胚胎干细胞(ES)和诱导的多能性干细胞(iPS)生长在MatrigelTM涂覆的孔板，不使用饲养细胞(feeder cells)，使用无血清的定义培养基(mTeSR1)。
在这些条件下的细胞多能性是通过检视其形态，通过碱性磷酸酶染色(staining for alkaline phosphatase，AP)，并且通过对Oct-4免疫化学染色来评价，如上所述。
如图1A和1B所示，所述细胞表现出正常形态(图1A)和表达Oct-4(图1B)。
如图2A和2B所示，所述细胞对碱性磷酸酶表现阳性染色。
这些结果证实干细胞的多能性。
然后收集细胞并以每孔洞5000个细胞的密度接种于384孔板中。执行针对Oct-4和NANOG的定量PCR和免疫萤光染色，为了验证这些细胞在这些条件下保持未分化持续至少5天。
如图3和图4所示，当在孔板上生长，将细胞维持其正常形态，形成的群落(colonies)，并且增殖，保持未分化，至少5天。
根据三磷酸腺苷的冷光细胞存活力分析(ATP-based luminescent cellviability assay，)被用来精确地测量未分化细胞的培养基中的活细胞的量，如上所述。
如图5所示，在未分化细胞中所观察到的根据三磷酸腺苷的冷光是紧密与在量测24小时之前接种于一样品中的细胞数量相关联。
如图6所示，通过亚甲蓝染色分析未分化细胞存活力提供了与通过根据三磷酸腺苷的冷光细胞存活力分析所获得的结果相类似
这些结果证实根据三磷酸腺苷的冷光细胞存活力分析精确地测量培养中的未分化细胞的存活力。
然后用50种市售化合物进行一试点筛选(pilot screen，如本文上方的材料和方法部分所述)，其随机从已知的细胞毒性化合物行库中选择。细胞以范围为30微摩尔(μM)至300纳摩尔(nM)中5个不同浓度暴露于所述化合物中，持续4段曝光时间(6，24，48或72小时)，然后进行存活力分析。
如图7所示，所有表现出可观察到的细胞毒性的受测化合物在24小时时表现出其活性。因此24小时的测试期间被选择为接下来的初级筛选。
此外，如图7所示，安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride，一种DNA拓扑异构酶(topoisomerase)抑制剂)，在24小时内几乎杀死所有细胞，以及放线菌酮(cycloheximide，一转译抑制剂，在本领域中也称为actidione)，在24小时后，于1-3微摩尔(μM)浓度，导致大约50％的细胞存活力降低。
基于这些结果，安吖啶盐酸盐被选定用于初级筛选而作为阳性控制组，而放线菌酮(cycloheximide or actidione)作为其EC50控制(即一控制组化合物对细胞导致50％毒性)。
在hPSC细胞毒性抑制剂的初级筛选中，针对未分化的人胚胎干细胞筛选52448个小分子，如在材料和方法部分所述。这些分子属于Hoffman-LaRoche“黄金”化合物资料库(“golden”compound library of Hoffman-LaRoche)，其包含各种不同的化学实体。这个资料库的目的是代表所述制药公司的整个化合物资料库，其中包括超过一百万个不同分子。
在图8中示例性地描述初级筛选的方案。将人类胚胎干细胞(CSES2)生长在MatrigelTM涂覆在培养板，幷使用mTeSR1定义培养基。在接种在384孔板之前，所述细胞的多能性以其形态及碱性磷酸酶染色确认其多能性。之后细胞被收集，计数并以5000个细胞的密度自动分配于各孔洞。将孔板孵育过夜，使细胞适当地沉淀下来。准备149个这样的孔板，以配合“黄金”资料库的149个化合物板。接种细胞24小时后，所述化合物稀释幷转移到分析板，使得各52448的化合物以20微摩尔(μM)(含0.5％的DMSO)的终浓度加入到一孔洞。除了来自于资料库的352个化合物，各分析板还包括自己的控制组：只具有0.5％DMSO(阴性控制组)的16个孔洞，具有5微摩尔(μM)的安吖啶盐酸盐(amsacrine hydrochloride，阳性对照)的8个孔洞，以及具有2微摩尔(μM)放线菌酮(cycloheximide，EC50控制组)的8个孔洞。化合物加入后24小时，使用CellTiter-存活力分析定量在个孔洞中活细胞的数量。使用冷光板读数器，测定各孔洞中冷光强度(liminescence intensity)，并且标准化及分析数据，如在材料和方法部分所述。
如图9所示，所述分析显示稳定高的Z’因子(0.078+/-0.06各个384孔分析板)，指示初级筛选是非常稳健。
当化合物诱导60％以上的抑制作用则被确定为命中。使用所述阈值，2031个化合物(小于受试化合物4％)被鉴定为命中。受试化合物所显示的抑制的分布在图10中呈现。
接着选择2031个命中以在确认和验证分析中针对四个人类ES和iPS细胞系进行重新测试。使用两个人类ES细胞系(CSES2和H9)以单一浓度(20微摩尔(μM))执行第一确认筛选。确认筛选从初级筛选除去假阳性命中，以及为细胞系特异性作用的化合物。
如图11所示，确认筛选产生了696个命中，其对CSES2和H9细胞皆有细胞毒性。
然后696个这样确认过的命中针对人胚胎干细胞系CSES2和其克隆CSES2-SO 2/3以8个浓度(范围从50微摩尔(μM)至23纳摩尔(nM)，进行1∶3序列稀释步骤)进行测试。
如图12A和图12C所示，在各种受试的人类ES细胞系中，化合物效力是非常高度相关的。此外，在98％以上的情况下，所述多种化合物的细胞毒性作用具有剂量依赖性。
如在图12B进一步显示，iPS细胞中化合物效力与ES细胞获得的化合物效力是高度相关的。没有发现任何化合物是对一种细胞型具有细胞毒性，而对其他没有不利影响。
为了验证所述化合物的抑制效果持续一段时间，CSES2细胞以6种浓度暴露于所述化合物中持续48小时的期间。
如图13所示，每个受试化合物的细胞毒性保持48小时。在暴露于任何化合物之后没有观察到任何细胞恢复。
然后测定所选择化合物对人iPS细胞的效果。BJ-iPS28细胞生长在与ES细胞完全相同的条件下，并以6种浓度进行了测试(范围从50微摩尔(μM)至200纳摩尔(nM)，进行1∶3序列稀释步骤)。
这些结果表明，如上所述确定的696个化合物是人类PSC的有效细胞毒性抑制剂。
示例2
筛选对干细胞呈现选择性细胞毒作用的化合物(PluriSIns)：
为了鉴定hPSC高度选择性细胞毒性抑制剂，依示例1描述所鉴定的696个hPSC细胞毒性抑制剂，依照材料和方法部分所述，针对其他细胞型做反向筛选(counter-screen)，所述细胞类型代表所有胚层与发育阶段。重要的是，许多这些细胞类型是由ES或iPS细胞分化而来。所筛选的细胞类型包括ES衍生的神经干细胞(NSCs)，ES衍生的间叶干细胞(MSC)，ES衍生的内胚层祖细胞，ES衍生的肝细胞，iPS衍伸的心肌细胞，iPS衍生的成纤维细胞(BJ成纤维细胞)，和三个癌细胞系：神经母细胞瘤(kelly)，子宫颈癌(HeLa细胞)和肝癌(Huh7)。所述细胞类型和它们与干细胞之间的关系在图14中示意性地描绘。
针对大多数或所有上述696种化合物，以二重复或三重复方式，20微摩尔(μM)浓度，筛选各种细胞类型。
如图15-21所示，受试化合物对hPSC的细胞毒性与对心肌细胞(图15)，成纤维细胞(图16)，肝脏细胞(图17)，神经母细胞瘤细胞(Kelly)(图18)，Hela细胞(图19)，或Huh7细胞(图20)的细胞毒性之间几乎没有关联性，但是与内胚层祖细胞的细胞毒性较为相关(图21)。
这些结果对于之前所述的结果形成鲜明对比，之前所述的结果显示在不同类型的hPSCs中的化合物效力是高度相关(比较图15与图11和12A-12C)。
为了进一步验证所鉴定的化合物的选择性细胞毒性，以多个浓度，针对已分化细胞以及遗传上相匹配的未分化细胞筛选化合物。
CSES2-SO2/3是一种遗传上被标记的细胞系，其在多能性标记基因(thepluripotency hallmark gene)OCT-4的促进子(promoter)之下表现mCherry，以及在早期内胚层标记(the early endodermal marker)SOX17的促进子(promoter)之下表现GFP。因此在未分化时这些细胞是红色的，而在它们分化成为内胚层细胞系时变为绿色[Kopper&Benvenisty，干细胞研究，Stem Cell Research 8：335-345(2011)]。使用8天分化方案，绿色早期内胚层祖细胞从红色未分化细胞产生，如Duan所描述。[干细胞Stem Cells 28：674-686(2010)]。
如图22所示，细胞分化之前为红色，但在8天之后，大部分的细胞是绿色的，而红色未分化细胞可能几乎检测不到。这些结果表明，该分化方案是高度有效的。
分化方案的效率通过内胚层标记物CXCR4的FACS分析而证实。
如图23所示，98％的细胞表达早期内胚层标记物CXCR4，从而确认所述分化方案的效率。
如图24所示，在接种在384孔板之后，已分化细胞维持存活和绿色。这个结果表明，可针对小分子筛选已分化细胞的。
使用未分化的红色细胞和已分化绿色细胞以8种浓度筛选被鉴定的化合物，并由此对于基因完全相同的已分化和未分化细胞计算出可靠的EC50值。
此外，使用衍生于iPS细胞系(BJ-iPS28)的BJ-成纤维细胞以6种浓度筛选被鉴定的化合物，并由此对于iPS细胞和其来源的体细胞计算出可靠的EC50值。
如图25A和25B所示，许多受试化合物显示出对BJ-iPS28(图25A)和CSES2-SO2/3(图25B)多能干细胞的细胞毒性的效力，但对基因完全相同已分化细胞显示相当少的细胞毒性(分别为BJ-成纤维细胞(图25A)和已分化的CSES2-SO2/3细胞(图25B))。
为了鉴定对hPSCs呈现高度选择性的细胞毒性化合物，设置一阈值，其特征在于在各受试的hPSC类型中，具有约80％或以上的抑制(在20微摩尔(μM))，在受试的非hPSC细胞类型中，具有小于20％的抑制(在20微摩尔(μM))，(ES衍生的神经干细胞例外，其相对类似于ES细胞)。此外，对于CSES2，CSES2-SO2/3和BJ-iPS28细胞，所述标准需要EC50值为5微摩尔(μM)或更低，但对于分化后8日的CSES2-SO2/3和BJ-成纤维细胞，则高于50微摩尔(μM)。
如表1，2和3所示，15个化合物满足上述条件或接近满足上述标准(例如，在hPSCs和已分化细胞之间EC50表现出超过10倍的差异)，并且因此称为多能特异性抑制剂(Pluripotent-Specific Inhibitors，PluriSIns)。在15个被鉴定的PluriSIns显示于表1。如表1所示，许多(15个中有9个)PluriSIns包括苯基肼基团(hydrazine moiety)。所述PluriSIns的抑制作用显示于表2和表3。
表1：PluriSIn化合物结构和化学名称(强调出共有基团)
表3：PluriSIn化合物抑制各种细胞类型的EC50值(微摩尔(μM))
如图26A和表3所示，人类胚胎干细胞(CSES2细胞)在其分化为CSES2衍生的内胚层祖细胞(EPCs)后丧失了对PluriSIn#1的敏感性。
同样地，如图26B和表3所示，人类体细胞(human somatic cells)(BJ-成纤维细胞)在它们重编程(reprogramming)为iPS细胞(BJ-iPS28细胞)时，获得对PluriSIn#1的敏感性。
同样地，如图27和表3所示，人类胚胎干细胞(CSES2-SO 2/3细胞)在其分化为内胚层祖细胞(EPCs)后丧失了对15个PluriSIn化合物的敏感性，BJ-成纤维细胞在它们重编程为iPS细胞(BJ-iPS28细胞)时，获得对BJ-成纤维细胞的敏感性。
使用受试细胞类型的化合物抑制资料(the compound inhibitionprofiles of tested cell types)进行无监控的细胞型层次聚类(Unsupervised hierarchical clustering of cell types)。
如图28所示，通过对小分子反应，hPSC丛聚在一起，15个化合物的子集对hPSC显示出高度的选择性细胞毒性。这些结果表明，当与其他类型细胞相比(例如已分化的细胞)，hPSCs普遍而言对不同的化合物敏感。
为了确认在额外的分析中，各种PluriSIns的细胞毒性作用，以PluriSIns处理细胞，并进行三磷酸线苷独立的(ATP-independent)亚甲蓝存活力测定，再以高含量显微成像(high-content microscopic imaging)检视。
如图29所示，通过亚甲基蓝分析的测定，从PluriSIns#1到#11的各者大幅降低H9胚胎干细胞的存活力。
如图30所示，通过显微镜观察，PluriSIns#1到#11的各者大幅减少H9胚胎干细胞的数量。
显着地，在先前的以HepG2细胞进行的高分辨率细胞毒性筛选中(数据未示出)，没有PluriSIns被鉴定为具有细胞毒性，进一步表明其细胞毒性对PSC是有选择性的。
为了进一步验证PluriSIns的选择性，并排除任何与分析相关的潜在干扰，在暴露于PluriSIns 24小时后，对未分化和已分化CSES2-SO 2/3的细胞进行显微成像，。
如图31所示，PluriSIn#6消除了红色未分化细胞，且无对绿色已分化的细胞表现出任何可检测的影响。如其中进一步所示，PluriSIn对未分化细胞的效果可与5微摩尔(μM)的安吖啶盐酸盐(amsacrinehydrochloride)相比拟，其被用作为细胞毒性控制组化合物，而PluriSIn处理过的已分化细胞可与未经处理的已分化细胞相比拟。同样地，如图32A-图32C所示，PluriSIn#1消除了未分化细胞(图32A)，且没有对已分化细胞(图32B)表现出任何可检测的效果，并且在已分化和未分化细胞的混合物中还消除了未分化细胞(图32C)。
为了确定所述PluriSIn细胞毒性的选择性是细胞类型依赖性的(celltype-dependent)，而非细胞培养基依赖性的(cell medium-dependent)，四个非多能细胞类型(BJ-成纤维细胞，HeLa细胞，HepG2和Kelly细胞)在人类胚胎干细胞的培养基中培养并暴露于PluriSIn#1，72小时。然后通过亚甲蓝分析测定细胞存活力，如上所述。
如图33和图34所述，PluriSIn#1对胚胎干细胞培养基中的非多能细胞的存活力没有影响，从而证实PluriSIn#1的细胞毒性是细胞类型依赖性的，而不是细胞培养基依赖性。
上述结果表明，PluriSIn对hPSCs显示显着，稳健，迅速和选择性的细胞毒性作用。
示例3
PluriSIns的作用机制：
如上所述，15个中有9个PluriSIns包括一苯基肼基团(phenylhydrazine moiety)(见表1)。具体而言，PluriSIns#1，#5，#6，#9，#10和#14包含N’-苯基酰肼基团(N’-phenylhydrazide，一种苯基肼的酸衍生物)，PluriSIns#8和#13包含N’-苯基腙基团(N’-phenylhydrazone苯基肼的酮或醛衍生物)，和PluriSIn#11包括一个N’-苯基肼基团，其可以互变成为N’-苯基腙基团。
15个中有9个PluriSIns存在有共同的苯基肼基团，当与整个的“黄金”资料库(p＜10-16)比较，此基团约为60倍的过度代表(over-representation)，这表明此基团可能与PluriSIns的作用机制或特异性相关联。
为了试图进一步厘清PluriSIns的作用机制，对最有效的和最具选择性的化合物PluriSIn#1(异烟酸N’-苯基酰肼)以及PluriSIn#6(2-羟基-2-(噻吩-2-基)-2-苯基乙酸4-甲基-N’-苯基酰肼)的活性进行进一步研究。
在一毒性基因体学(toxicogenomic)研究中，不同类型的人类胚胎干细胞暴露于PluriSIns#1或#6中，或暴露于控制组的DMSO，12小时，在一时间点上尚未观察到细胞死亡。为了比较，相似地处理从人类胚胎干细胞衍生的(如上述)的早期内胚层祖细胞。从细胞取得RNA和使用基因表达微阵列(Affymetrix U133A)以分析基因表达，如在材料和方法部分所述。之后应用几个生物信息学工具分析基因表达的变化，以鉴定受干扰的路径，如在材料和方法部分所述。
如图35所示，与未处理的控制组相比较，无监控的细胞型层次聚类(Unsupervised hierarchical clustering of cell types)显示在PluriSIn处理过的未分化细胞中标记基因表达的改变，然而没有在处理过的已分化细胞发生这样基因表达的改变。
如图36所示，PluriSIn处理导致与细胞凋亡相关的多个基因表达的改变(大于2倍的变化)。
使用DAVID功能注释工具(DAVID functional annotation clusteringtool)进行负向调控的基因(＞2倍变化)的功能分析，如Huang等人所描述。[自然方案Nature Protocols 4：44-57(2009)]，并揭示显着增加的细胞凋亡(Benjamini校正后2.7倍增加，p＝0.007)。
发现基因表达与细胞凋亡相关联和先前报告的多能细胞倾向于细胞凋亡，两者相一致[Qin等人，生物化学期刊Journal of Biological Chemistry282：5842-5852(2007)；Momcilovic et al.，PloS One 5：e13410(2010)]。然而，还有报导指出多能细胞易感受于其它类型的细胞死亡，例如胀亡(oncosis)[Tan等，干细胞Stem Cells 27：1792-1801(2009)]及自噬(autophagy)[Alexander等人.，PNAS 108：15828-15833(2011)]。因此针对胱天蛋白酶-3(caspase-3，细胞凋亡的主要执行者)的Annexin V-FITC针测分析(Annexin V-FITC detection assay)与免疫印迹(immunoblot)被用来确认PluriSIn#1诱导的大量hPSC死亡确实是细胞凋亡。
如图37A和图37B所示，在PluriSIn#1处理后16小时，增加细胞凋亡的细胞数约7倍。
如图38所示，PluriSIn#1处理增强caspase-3活化。
并且检视所述胰抑制剂(pancaspase inhibitor)Z-VAD-FMK对PluriSIn#1诱导细胞死亡的作用。以25微摩尔(μM)或100微摩尔(μM)的Z-VAD-FMK处理细胞，1小时后将PluriSIn#1(20微摩尔(μM))加入到培养基中。24小时后，对培养物进行细胞存活力测量，如上所述。
如图39所示，Z-VAD-FMK以剂量依赖性的(dose-dependen)方式显着抑制PluriSIn#1诱导的细胞死亡。
这些结果证实，细胞凋亡是PluriSIn#1所诱导的细胞死亡的主要机制。
此外，如图40所示，PluriSIn#1和#6处理导致与内质网压力(ERstress)和未折叠蛋白反应(UPR)的相关基因表达的大量变化。二硫苏糖醇(dithiothreitol，普遍的内质网压力诱导剂，1微摩尔(μM))所赋予的基因表达变化被用作为阳性控制组。
DAVID功能分析显示增加内质网压力反应(12倍增加)。
PluriSIn处理后正向调控最甚的基因是CHOP(也称为DDIT3)，其为未折叠蛋白反应(UPR)的标记(9倍正向调控，p＝0.01)。
为了进一步研究未折叠蛋白反应(UPR)的重要性，进一步检视XBP1mRNA拼接(mRNA splicing)和eIF2α的磷酸化(皆为UPR的标记)。人类胚胎干细胞和ES衍生的已分化细胞分别与PluriSIn#1处理12小时，并通过定量PCR和免疫印迹(immnuoblotting)测定sXBP1拼接异构体(spliced isoform)的表达，如在材料和方法部分所述。二硫苏糖醇(dithiothretiol，1微摩尔(μM))所导致的基因表达变化被使用为阳性控制组。
如图41所示，通过定量PCR测定，PluriSIn#1增加sXBP1拼接异构体的表达大约3.5倍。
如图42所示，通过免疫印迹测定，在hPSC中PluriSIn#1增加磷酸化eIF2α的水平。
这些结果证实PluriSIn#1诱导hPSC的UPR。
在图41和图42分别进一步显示，PluriSIn#1并未增加已分化8日的细胞中sXBP拼接异构体的表达或eIF2α的磷酸化。
然后使用关联性图谱(Connectivity Map，cmap)(一种全基因组的转录表达数据的数据库，源自于以生物活性小分子处理培养的人类细胞)分析基因表达数据。关联性图谱(cmap)的开发方便了发现未知活性小分子所扰动的途径，根据类似小分子赋予的共同基因表达变化[Lamb等人，科学期刊Science 313：1929-1935(2006)]。关联性图谱(cmap)包括代表1309个独特分子的超过7000个表达资料(expression profile)，包括通过各种机制运作的细胞毒性化合物(如细胞周期阻断剂(cell cycle blockers)，CDK抑制剂(CDK inhibitors)，拓扑异构酶抑制剂(topoisomeraseinhibitors)，生物碱(alkaloids)等)。所述分析通过测试化合物的相似性列出所有化合物，并提供代表相似度的“关联性价值”，其介于-1至1之间。
在以PluriSIn#1处理12小时之后，以在hPSC中至少2倍的正向调控或负向调控的基因列表，查询关联性图谱(cmap)数据库。
一列表呈现在表4中，其描述10个化合物表现出与PluriSIn#1最相似的活性。针对PluriSIn#6，执行一相似的查询。一列表呈现在表5中，其描述10个化合物表现出与PluriSIn#6最相似的活性。
表4：相对于PluriSIn#1，具有高cmap关联性分数的十大化合物(各化合物p＝0.00000)
排名 Cmap名称 Cmap分数
1 吐根酚碱(Cephaeline)料 0.897
2 放线菌酮(Cycloheximide)料 0.881
3 吐根碱(Emetine)** 0.876
4 茴香霉素(Anisomycin)料 0.849
5 七里香甙甲(Helveticoside) 0.766
6 棉酚(Gossypol) 0.735
7 毛花甙丙(Lanatoside C) 0.733
8 洋地黄毒苷配基(Digitoxigenin) 0.687
9 缬氨霉素(Valinomycin)* 0.680
10 8-氮鸟嘌呤(8-Azaguanine)* 0.671
料蛋白质合成抑制剂(如cmap定义)
*化合物在cmap中不定义为蛋白质合成抑制剂，但已知的降低蛋白质转译。
表5：相对于PluriSIn#6，具有高cmap关联性分数的十大化合物(各化合物p＝0.00000)
排名 Cmap名称 Cmap分数
1 毒胡萝卜素(Thapsigargin) 0.887
2 嘌呤霉素(Puromycin)* 0.772
3 氯硝柳胺(Niclosamide) 0.770
4 缬氨霉素(Valinomycin)* 0.723
5 棉酚(Gossypol) 0.702
6 吐根碱(Emetine)** 0.681
7 阿来西定(Alexidine) 0.673
8 吐根酚碱(Cephaeline)料 0.667
9 酚苄明(Phenoxybenzamine) 0.648
10 5707885* 0.627
料蛋白质合成抑制剂(如cmap定义)
*化合物在cmap中不定义为蛋白质合成抑制剂，但已知的降低蛋白质转译。
如表4所示，PluriSIn#1活性与蛋白质合成抑制剂(PSI)非常相似，蛋白质合成抑制剂(PSI)在列表中排名最高，具有非常高的关联性分数。
实际上，只有4种化合物(吐根酚碱，吐根碱，茴香霉素，放线菌酮)在cmap数据库中被归类为真正的PSI[Iorio等人，PNAS 107：14621-14626(2010)]，而它们都出现在10个与PluriSIn#1最类似的化合物之中(65倍增加，P＜0.0001)。
为了比较，在以PluriSIn#1处理12小时之后，以在8天的已分化细胞中至少2倍的正向调控或负向调控的基因列表，查询关联性图谱(cmap)数据库。所述分析没有检测到对任何小分子的相似性，进一步证实PluriSIn#1不在这些细胞中改变总基因表达。
类似地，如表5所示，PluriSIn#6活性相当类似于蛋白质合成抑制剂(PSI)。
PSI和PluriSIn#1和#6之间的相似性与未折迭蛋白反应(UPR)可导致转译降低的事实相符。为了确认此关联性，测定PluriSIn#1处理对蛋白质合成的影响。在PluriSIn#1存在或不存在的情况下，使用脉冲示踪(pulse-chase)的放射性标记分析测量35S-Met合并进入ES细胞和已分化细胞(成纤维细胞)。以放线菌酮(Cycloheximide，普遍的蛋白质合成抑制剂，10微摩尔(μM)))，作为阳性控制组。
如图43所示，在hPSC中PluriSIn#1降低蛋白质合成约30％(p＝0.005)，但显示不影响已分化细胞(成纤维细胞)。
上述结果表明PluriSIn#1通过在未分化细胞中导致未折叠蛋白反应(UPR)和蛋白质合成抑制(PSI)，从而导致其细胞凋亡，以发挥其细胞毒性的效果。此外，在已分化细胞中没有鉴定到总基因表达变化，也没有细胞凋亡/未折迭蛋白反应(UPR)的基因被解除调控(deregulated)。由于在已分化细胞中PluriSIn#1不会诱发UPR和PSI，PluriSIn#1选择性地针对未分化细胞，而已分化细胞保持不变。
示例4
PluriSIns抑制SCD1：
之前研究已经表明，没有PluriSIns表现出细胞毒性作用(数据未示出)。但是在体外(in vitro)生化筛选已经鉴定这三种化合物，包括PluriSIn#1和PluriSIn#6，可能为SCD1的直接抑制剂，SCD1为在单元不饱和脂肪酸(mono-unsaturated fatty acids，MUFA)的生物合成中为关键酵素。报导已经指出SCD1的抑制在一些人癌细胞系中诱导内质网压力(ER stress)和未折迭蛋白反应(UPR)，从而导致这些细胞的细胞凋亡[Roongta等人，分子癌症研究Molecular Cancer Research 9：1551-1561(2011)；Minville-Walz等人，PloS One 5：e14363(2010)；Scaglia等人，PloS One 4：e6812(2009)；Hess et等人，PloS One 5：e11394(2010)；Morgan-Lappe等人，癌症研究Caneer Research 67：4390-4398(2007)；Mason等人，PloS One 7：e33823(2012)]。
为了确定PluriSIns是否经由SCD抑制以发挥显着效果，将我们在hPSCs观察到的基因表达改变(在处理PluriSIn#1之后)，与之前报导所指出的人类癌细胞系(H19299)的基因表达改变(在特异性抑制剂A939572导致的SCD1药理抑制之后)相比较。[Roongta等人，分子癌症研究Molecular Caneer Researeh 9：1551-1561(2011)]。
如图44中所示，在SCD1抑制之后，18个中有12个基因表现出最显着表达变化(p＜0.05，大于2倍变化)(如Roongta等人所报导[分子癌症研究Molecular Cancer Research 9：1551-1561(2011)])，其在处理PluriSIns#1或#6之后也显着地被负向调控。此外，许多上述基因与内质网压力(ERstress)途径相关。
这些结果表明，PluriSIns所诱导的选择性细胞毒性(和内质网压力)是经由SCD抑制实现。
本文中所呈现的结果与在人类癌症细胞系中SCD1的抑制会诱导特有的UPR激活的报告相符合，其特征在于CHOP表达急剧增加，而不会影响内质网分子伴侣(ER chaperone)GRP78的表达[Minville-Walz等人，PloS One5：e14363(2010)]。如实施例3中所述，PluriSIn处理诱导未折叠蛋白反应(UPR)，CHOP是正向调节最甚的基因。与此相反，GRP78表达没有显着地因PluriSIn处理(1.2倍，p＝0.13)而改变。
为了直接检视是否PluriSIn#1抑制SCD活性，以及这种抑制作用是否仅限于多能细胞，SCD1活性通过脉冲示踪标记分析(pulse-chaselabeling assay)而测量，如在材料和方法部分所述。以PluriSIn#1处理人类胚干细胞和已分化细胞(分别为H9和BJ-成纤维细胞)12小时，然后以[1-14C]硬脂酸(stearic acid)标记，硬脂酸为SCD1的基质。在长达4小时孵育之后，纯化脂质，然后通过直接测量SCD1的基质和产物([1-14C]油酸(oleic acid))的放射性强度，评估酵素活性。
如图45所示，在胚胎干细胞中，PluriSIn#1降低约65％的SCD1活性，(p＝2.1x10-6)。
为了确定hPSC存活力是否确实取决于功能性SCD1的活性，hPSCs暴露在75纳摩尔(nM)的SCD1特异性抑制剂A939572和CAY-10566，48小时。一些样品补充有100微摩尔(μM)的油酸(OA)，以评估外源补充油酸(SCD1活性的产物)对细胞死亡的效果。
如图46所示，SCD1抑制剂A939572和CAY-10566皆引起hPSC存活力的大幅减少(大于80％的下降，p＝6.4x10-6为A939572，p＝2×10-5为CAY-10566)。如其中进一步所示，油酸完全将细胞从SCD-1抑制剂诱导的细胞死亡中援救出(对于A939572和油酸为p＝10，对于CAY-10566和油酸为p＝10-4)。
这些结果证实，hPSC需要SCD活性而生存。
为了进一步研究SCD活性对hPSC存活力的影响，进一步研究外源的补充油酸(SCD1的直接产物)将细胞从PluriSIn诱导的细胞凋亡援救出的能力，使用在材料和方法部分中描述的程序。在存在持续增加的BSA共轭油酸(BSA-OA)浓度下，将细胞暴露于PluriSIn#1。
如图47和48所示，BSA-OA保护细胞免于PluriSIn#1诱导的细胞凋亡，其以一种剂量依赖性的(dose-dependent)方式，在高浓度的存在下完全援救，而单独只有牛血清白蛋白并没有得到任何对抗细胞凋亡的保护。如其中进一步所示，所述保护是特异性的，BSA-OA没有影响控制组细胞的增殖，没有保护细胞免于DNA拓扑异构酶抑制剂(DNA-topoisomeraseinhibitor)(安吖啶(amsacrine)，图47)的细胞毒性。
为了进行比较，将细胞暴露于20微摩尔(μM)的PluriSIn#1，#2，#3和#6中，并存在100μM的BSA-OA。
如图49所示，BSA-OA保护细胞免受PluriSIn#1(p＝0.0004)，PluriSIn#5(p＝0.0006)，或PluriSIn#6(p＝0.006)所诱导的细胞死亡，但不免于PluriSIn#2或PluriSIn#3所诱导的细胞死亡。
由于PluriSIn#1，PluriSIn#5和PluriSIn#6各者皆包括一苯基肼基团，而PluriSIn#2或PluriSIn#3不包括这样的基团时，上述的结果表明，包括有苯基肼基团的PluriSIns具有相同的细胞毒性机制。
为了证实SCD1的抑制是hPSCs暴露于PluriSIn#1之后所观察到的细胞扰动的基础，则确定所述SCD1抑制剂A939572可重现PluriSIn#1所诱导的细胞反应。如上所述，以PluriSIn#1和与A939572，评估内质网压力，蛋白质合成抑制和细胞凋亡。
如图50所示，PluriSIn#1和A939572都以类似的方式增加未分化细胞的细胞凋亡。
如图51所示，通过定量PCR测定，A939572在未分化的胚胎干细胞中增加剪拼接异构体sXBP1的表达大约2倍，而在已分化细胞中没有增加表达。
如图52所示，通过免疫印迹测定，在胚胎干细胞中，PluriSIn#1和A939572以类似方式增加磷酸化eIF2α的水平，而在已分化细胞中没有增加水平。
如图53所示，在胚胎干细胞中，A939572降低约50％的蛋白质合成。
如图54所示，内质网压力诱导剂二硫苏糖(dithiothreitol)和蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide)的细胞毒性是针对胚胎干细胞和已分化细胞(人类成纤维细胞)，而油酸不保护细胞免受其细胞毒性。
上述结果表明，hPSCs的生存取决于SCD1的正常活动，hPSCs对于单元不饱和脂肪酸(MUFA)生物合成途径的扰动高度敏感，而且至少一些PluriSIn的针对hPSC的选择性细胞毒性(例如，包括一苯基肼基团(phenylhydrazine)的PluriSIn)与SCD1活性的干扰有关以及这些细胞对于SCD1活性的干扰的敏感性有关。与一些癌细胞系相似，抑制在hPSC中SCD1活性会诱导内质网压力和未折叠蛋白质反应，接着降低转译作用，最终可能会导致细胞凋亡。图55示意性地描述了这样的机制。
示例5
PluriSIn细胞毒性对小鼠多能干细胞和囊胚的影响：
小鼠多能干细胞(mPSCs)被广泛用于多能性相关研究，因此产生mPSC-已分化细胞的纯培养物具有重要意义。因此确定了mPSCs是否也对PluriSIn敏感。R1的Oct4-GFP小鼠胚胎干细胞接种在96孔板中幷暴露于20微摩尔(μM)浓度的PluriSIns#1，#2，#4或#6，使用一冷光存活力分析以及萤光显微镜成像，评估24，48和72小时后的细胞存活力，如在材料和方法部分所述。
如图56所示，四个受试PluriSIn的各者诱导mPSC中相当程度的细胞死亡。一代表性样本显示PluriSIn#6所诱导的细胞死亡，如图57所示。这些结果表明小鼠(mPSC)和人类(hPSC)的多能干细胞皆有PluriSIn敏感性。由PluriSIn抑制mPSCs与抑制hPSC的效率不同，其需要暴露于化合物较长时间。这可能是小鼠和人类PSC之间的遗传差异的结果，但也可归因于培养这些细胞型时所用的不同培养基和因素。
然后使用小鼠系统以确定PluriSIn#1是否对内细胞团(inner cellmass，ICM)具有细胞毒性，胚胎干细胞是衍生于所述内细胞团。据推测，如果SCD1活性在体内(in vivo)的多能干细胞非常重要，PluriSIn#1将对内细胞团(inner cell mass，ICM)具有细胞毒性，因此对正常胚胎发育有损害。
如在材料和方法部分中所述，以两品系的小鼠进行一系列的独立实验，其中双细胞的胚胎从交配后大约1.5天的怀孕小鼠的输卵管采集，然后这些胚胎在体外(in vitro)培养。胚胎在交配后大约3.5天达到桑椹期，然后转移至20微摩尔(μM)PluriSIn#1的液滴(胚胎总数为17)，20微摩尔(μM)PluriSIn#1伴随100微摩尔(μM)的油酸液滴(胚胎总数为7)，或者具有0.2％DMSO的控制组液滴(胚胎总数为8)，而其他控制组胚胎无转移，被留下任其发育(胚胎总数为10)。使用光学显微镜成像，追踪胚胎发育直到其成为成熟囊胚(在交配后约4.5天，之后在培养物中崩解所有胚胎)。囊胚然后分为三种显着类别：(A)质量好的小鼠囊胚具有大和明显ICM；(B)小鼠囊胚具有显着的，但较小的ICM；和(C)质量差的小鼠囊胚没有显着的ICM，如Cortes等人所描述[干细胞与发育Stem Cells and Development17：255-267(2008)]。
被转移到具有0.2％DMSO液滴的所有8个控制组囊胚，以及没有被转移到新液滴的所有10个控组制囊胚，发展成具有明显ICM的囊胚(类别A/B)。
相反地，暴露于PluriSIn#1的囊胚，只有少于一半(7/17)的囊胚发展成质量好囊胚(类别A/B)，而其它胚胎(6/17)发展成没有可分辨ICM的囊胚(C类)，或者滞留在桑椹期(4/17)。暴露于PluriSIn#1的胚胎命运的显着差异是高度明显的(p＝0.0001)。
囊胚的代表性实例显示在图58中，显示出良好质量的控制囊胚和PluriSIn处理过的囊胚，不良质量的PluriSIn处理过的囊胚和PluriSIn处理过的囊胚停留在桑椹期。
如图59和60中，补充油酸从PluriSIn#1的效果援救大多数胚胎，7个中有5个油酸补充的胚胎(71％)发育成高质量的囊胚，相对于在没有油酸下，17个中有7个(41％)发育成高质量的囊胚。
然后使用SCD1抑制剂A939572代替PluriSIn#1，以小鼠胚胎重复上述实验，并与PluriSIn#1所获得的结果相比较，以确定PluriSIn#1的效果与抑制SCD1活性相关联。
如图60和图61进一步所示，A939572显着抑制囊胚发展，9个暴露于A939572的胚胎中只有5个(56％)发展成高质量的囊胚，相对于18个中有18个控制组胚胎(p＝0.007)。如其中进一步所示，油酸补充增加高质量的囊胚比例至7分之5(71％)。
这些结果表明，PluriSIn#1对ICM细胞具有细胞毒性，从而阻止囊胚的正常发展。这些结果进一步表明，PSC对于SCD1的依赖性(例如实施例4中所述)于多能状态是被遗传的，无论是在体外(in vitro)和体内(invivo)，而PluriSIn#1对于ICM细胞的细胞毒性与抑制SCD1活性相关联。
示例6
PluriSIn对畸胎瘤的细胞毒性：
选择性HPSC抑制的特别理想的目标是通过有效去除残留的未分化细胞来预防畸胎瘤形成。因此使用体外和体内分析测试PluriSIn于此应用的实用性，如在材料和方法部分所述。
所述PluriSIns首先在不同的培养条件和接触时间下进行测试。有趣的是，PluriSIn在较小(384或96孔)培养板比在较大的(6孔或10厘米)培养板更有效力，以及在低细胞密度比在高细胞密度更有效力，这表示大群落(colony)可能赋予保护作用。
因此，例如图62所示，完全消除培养在6孔板中的未分化细胞需要细胞暴露20微摩尔(μM)的PluriSIn#1持续48小时。
此外，如图63A和图63B所示，培养在MEF(mouse embryonicfibroblasts，小鼠胚胎成纤维细胞)的hPSC，在普通的胚胎细胞培养基中，对于PluriSIn较不敏感。这个结果可能是因为不同的培养基的组合物，或者由于所述MEF的保护作用所造成。
在所测试的条件下，当培养于MatrigelTM所涂覆的培养板，无使用饲养细胞，而使用mTeSR1定义培养基，发现PluriSIns消除hPSCs是最有效地。
然后在体外(in vitro)施用PluriSIn#1之后，评估留在培养物中残余未分化细胞的数量，并测定此类细胞的体内(in vivo)致瘤性。
在6孔洞孔板中培养混合的细胞群体，并暴露于PluriSIn#1持续48小时。然后通过FACS分析，利用多能性标记物TRA-1-60的染色，并由OCT4的光学显微镜成像来分析细胞，如在材料和方法部分所述。
如图64所示，暴露于PluriSIn#1持续48小时可从培养物中除去99％以上的多能细胞，通过FACS分析确定。
如图65所示，暴露于PluriSIn#1持续48小时几乎消除所有的OCT4表达细胞，通过CSES2-SO/3细胞的萤光显微成像测定。
这些结果表明，PluriSIn#1在混合细胞族群中消除多能干细胞是高度有效的。
为了评估在体内致瘤性，hPSC分别在PluriSIn#1存在或不存的在上述条件下培养，然后将培养物皮下注射到免疫受损的NOD-SCID IL2Rγ-/-小鼠，先前报导已经指出，其为特别容易受到来自人类的肿瘤影响[Quintana等人，自然期刊Nature456：593-598(2008)]。4-6周后牺牲小鼠，评估畸胎瘤的形成。
被注射控制组H9胚胎干细胞的所有小鼠(3/3)都发展出畸胎瘤，而注射以PluriSIn#1处理过的H9胚胎干细胞的小鼠(0/3)，没有任何小鼠发展出畸胎瘤。
同样，CSES2-SO2和BJ-iPS28细胞系注射到免疫受损的小鼠(各细胞系，2只小鼠)，控制组细胞和处理过的细胞被注入同一动物躯体的两侧。
所有被注射的小鼠(4/4)仅在被注射控制组hPSCs的一侧发展出畸胎瘤。图66A和图66B显示代表性例子，其显示畸胎瘤只有发展在注射有未经处理的细胞的一侧。
然后以设计为模拟临床环境模型评估PluriSIns对畸胎瘤形成的作用。人类ES和iPS细胞自发性的分化于培养物中，持续10天的期间，而后收集已分化细胞并与未分化细胞一起接种，以未分化细胞和已分化细胞的1∶1混合物，如所述在材料和方法部分。在暴露于PluriSIn#148小时之后，收获细胞并皮下注射入NOD-SCID IL2Rγ-/-小鼠，各鼠被注射PluriSIn#1处理过的细胞进入其躯体的一侧，并注射控制组细胞进入另一侧。注入到两侧的细胞总数量相同。
所有注射的小鼠的(4/4)仅在注射有控制组hPSC的一侧发展出畸胎瘤。图67A和图67B显示代表性例子，其显示畸胎瘤只有发展在注射有未经处理的细胞的一侧。如图68所示，畸胎瘤发展通过组织学检查而证实。
如下表6所示，一起比较，当以PluriSIn#1处理过的hPSC移植，没有在小鼠中产生畸胎瘤(0/11)，而当以未经处理的细胞移植则一定在小鼠中产生畸胎瘤(10/10)。同样的，当以PluriSIn#1处理过的已分化和未分化hPSC的1∶1混合物移植，没有在小鼠中产生畸胎瘤，而当以未经处理的混合物移植则一定在小鼠中产生畸胎瘤(4/4)。
表6：在注射PluriSIn#1处理过或未经处理的hPSC之后，畸胎瘤形成的发生：
上述结果表明，PluriSIn可以有效地用于从hPSC衍伸细胞的培养物除去致瘤性未分化细胞。
示例7
SCD1抑制剂对多能干细胞抑制的作用：
如上所述，所述SCD1抑制剂A939572和CAY-10566引起多能干细胞存活力相当大的减少，及PluriSIn，其表现出SCD抑制作用，有效地从混合细胞族群中消除多能干细胞，并从hPSC衍生细胞的培养物中除去致瘤性未分化细胞。
为了确定SCD1抑制剂对致瘤性未分化细胞的功效，胚胎干细胞移植之后，测试特异性的SCD抑制剂A939572以防止畸胎瘤形成，使用如示例6中所描述的步骤。
如图69，在移植胚胎干细胞于小鼠之后，以A939572处理显示出对畸胎瘤形成具有保护作用。
上述结果表明，抑制SCD1活性可以有效地用于从hPSC衍生细胞的培养物中除去致瘤性未分化细胞。
为了进一步厘清SCD1抑制剂对针对致瘤性未分化细胞的功效，胚胎干细胞移植的之后，测试额外的特异性SCD抑制剂(例如CAY-10566)以防止畸胎瘤形成，如文中所描述。
示例8
SCD1表达的siRNA削减(knockdown)对多能干细胞抑制的作用：
如上所述，所述SCD1抑制剂A939572和CAY-10566引起多能干细胞的存活力显着下降，这与PluriSIn的SCD抑制效果是一致的。
为了进一步证明，一般而言SCD1的抑制能抑制多能干细胞，使用SCD1基因的iRNA削减(knockdown)，及在材料和方法部分中描述的方法，抑制SCD1表达。用未处理的细胞和用模拟(mock)siRNA处理的细胞作为控制组。测定多能干细胞的存活力。
如图70和71中所示，SCD1基因的siRNA削减(knockdown)导致干细胞存活力大幅下降(p＝0.002)。
如图71中进一步所示，存活力的减少是依赖siRNA的剂量。
如图71中进一步所示，外源补充油酸能援救SCD1基因被siRNA削减的细胞(p＝0.006)
这些结果进一步证实，一般而言，SCD1的抑制能抑制多能干细胞，并且该SCD1的抑制可以通过核酸沉默序列来实现。
示例9
PluriSIn细胞毒性对未分化癌细胞的作用：
选择性抑制的未分化细胞使得选择性抑制癌细胞成为可能，例如，癌症治疗。因此测试PluriSIn#1对未分化癌细胞的效果，并比较相关的已分化细胞的效果。
在一实验中，永生BJ成纤维细胞作为已分化细胞和与被引导进行细胞转化的BJ成纤维细胞做比较，其作为未分化癌的对应(counterpart)。成纤维细胞通过表达人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)而永生化，通过结合hTERT以及致癌基因的突变体H-RasV12的表达，伴随通过猿病毒(simian virus 40，SV40)Large-T(LT)及Small-T(ST)抗原以抑制p53和成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastomaprotein，RB)大T(LT)和小-T(ST)的抗原，而进行转化，根据Scaffidi&Misteli描述的方法[自然细胞生物学Nature Cell Biology 13：1051-1061(2011)]。在第二个实验中，未分化的干细胞样神经胶质瘤细胞(stem-likeglioma cells，SLGC)与已分化的SLGC相比较，SLGC是通过单层粘附(monlayer adhesion)和暴露于1微摩尔(μM)的视黄酸(retinoic acid)一周而分化，根据Campos等人描述的方法[临床癌症研究Clinical CancerResearch 16：2715-2728(2010)]。SLGC的分化与致肿瘤性的降低有关[Campos等人，临床癌症研究Clinical Cancer Research 16：2715-2728(2010)]。
已分化和未分化细胞暴露于高达100微摩尔(μM)的PluriSIn#1持续72小时，在低浓度(2％)的胎牛血清条件下。然后使用亚甲蓝存活力分析测量其存活力，如上所述。
如图72所示，PluriSIn#1对已转化的BJ成纤维细胞具有高度细胞毒性，而对正常(永生)BJ成纤维细胞几乎不具效果。
这一结果表明，细胞转化(导致癌细胞)显着增加PluriSIn#1的细胞敏感性。
如图73所示，PluriSIn#1对未分化SLGC具有高度细胞毒性，但对以分化的SLGC没有明显的影响。
这一结果表明，当分化为非致瘤性细胞，肿瘤细胞失去其对PluriSIn#1的敏感性，即使在分化只有一星期后。
上述结果表明，PluriSIn对未分化癌细胞的选择性细胞毒性(例如癌症干细胞样细胞)的方式与PluriSIn对多能干细胞的选择性细胞毒性相同。
尽管本发明已经结合具体实施方案进行了描述，但显然的，许多替换，修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见。因此，其意在涵盖落入所附权利要求的精神和范围内的所有替换，修改和变型。
在本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请以其整体在此引入本说明书中作为参考，其以相同的程度，如同各独立的出版物，专利或专利申请被具体和独立地指明，以引入本文作为参考。此外，本申请中任何引用或标识的参考文献不应被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在某程度上，段落标题中使用的范围，不应该被解释为必要的限制。

Claims (22)

1.一种以式I化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
其中：
R1是氢；及
R2是选自于以下组成的群组：
氢，
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基，
2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺，
及
-NH-R5；其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基，
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基，
(C1-6)烷基-羰基，
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基，
萘基磺酰基，及
N-羟基-乙酰亚胺酰基；
或者，其中：
R1是苯甲酰基及R2是4-氯代苯甲酰胺；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基及(C1-4)烷基所组成的群组；
其条件是R1，R2，R3及R4中的至少一个不是氢，卤素，NH2或(C1-4)烷基。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：
R1是氢；及
R2是选自于以下组成的群组：
2，4-二氧代-5-氟嘧啶-1-基羰基，
2-甲基苯幷呋喃-3-基亚甲基胺，及
-NH-R5，其中R5选自于以下组成的群组：
吡啶基羰基，
2-羟基-2-苯基-2-噻吩-2-基-乙酰基，
(C1-6)烷基-羰基，
N-(乙氧基羰基甲基)-2，4-二氧代-吡咯啶-3-亚基甲基，
萘基磺酰基及
N-羟基-乙酰亚胺酰基；
或者，其中：
R1是苯甲酰基及R2是4-氯代苯甲酰胺；及
R3及R4独自地选自于由氢，卤素，NH2，双苯氧甲基及(C1-4)烷基所组成的群组。
3.一种以式II化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
4.一种以式III化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
5.一种以式IV化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
6.一种以式V化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
7.一种以式VI化合物作为未分化细胞的细胞毒性抑制剂的用途：
8.如权利要求1至7任一项所述的用途，其特征在于：所述未分化的细胞包括多能干细胞。
9.如权利要求1至7任一项所述的用途，其特征在于：所述未分化的细胞包括未分化的癌细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括：如权利要求1至7任一项所述的化合物的一治疗有效量；及一药学上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于：所述组合物被鉴定为用于抑制未分化的细胞。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于：所述未分化的细胞包括多能干细胞。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于：所述未分化的细胞包括未分化的癌细胞。
14.如权利要求10所述的组合物，其特征在于：所述组合物被鉴定用于治疗与未分化的细胞的增殖相关的一增殖性疾病或病症。
15.一种用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的方法，其特征在于：所述方法包括：对所述对象施用如权利要求1至7任一项所述的化合物的一治疗有效量。
16.一种将如权利要求1至7任一项所述的化合物用于制备一用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症的用途。
17.一种如权利要求1至7任一项所述的化合物，用于在有需要治疗的对象体内治疗与未分化的细胞的增殖相关的增殖性疾病或病症。
18.如权利要求14所述的组合物，如权利要求15所述的方法，如权利要求16所述的用途或如权利要求17所述的化合物，其特征在于：所述增殖性疾病或病症选自于畸胎瘤，未分化癌症，白血病，脑癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，黑色素瘤，肝癌，肺癌，头颈部癌，间叶癌(mesenchymal cancer)及多发性骨髓瘤所组成的群组。
19.一种鉴定用于抑制多能干细胞的主要候选物的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(a)提供多个多能干细胞的样品，各个所述样品包括一不同类型的多能干细胞；
(b)将所述样品与一候选化合物接触；及
(c)监测在所述样品中所述干细胞的存活力，由此如果在至少两个所述样品中的存活力降低，则所述候选化合物被鉴定为能够抑制多能干细胞，从而鉴定为一主要候选物。
20.如权利要求19所述的方法，用于鉴定选择性抑制多能干细胞的一主要候选物，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
(d)提供至少一已分化的细胞的样品；
(e)将所述至少一样品与所述化合物接触，所述化合物被鉴定为能够降低多能干细胞的群体总数；
(f)监测在至少一所述样品中所述已分化的细胞的一存活力，由此如果在至少一所述样品中的存活力被维持，则所述化合物被鉴定为能够选择性抑制多能干细胞。
21.一种以SCD1(硬脂酰辅酶A去饱和酶-1)抑制剂作为多能干细胞的细胞毒性抑制剂的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于：所述SCD1抑制剂选自于A939572，CAY-10566，MF-438，CVT-11127，GSK-993，5-(十四烷氧基)-2-糠酸及SCD1的核酸沉默序列所组成的群组。
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