KR20150013777A - 미분화세포의 선택적 억제제 - Google Patents

미분화세포의 선택적 억제제 Download PDF

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우리 벤-데이비드
니심 벤베니스티
파얄 아로라
청-펜 간
랄프 제이. 가리파
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이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘, 엘티디.
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 미분화세포의 세포독성 억제제로서 화학식 I 내지 VI 중 어느 하나의 화합물의 용도뿐만 아니라, 화학식 I 내지 VI 중 어느 하나의 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 미분화세포의 억제를 위한 선두 후보의 식별 방법을 기술된다. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 SCD-1 억제제의 용도를 추가로 기술된다.

Description

미분화세포의 선택적 억제제{SELECTIVE INHIBITORS OF UNDIFFERENTIATED CELLS}
본 발명은 그의 일부 실시태양에서 치료법 및 보다 특히, 비제한적으로, 만능세포 및 미분화 암세포와 같은 미분화세포의 치료, 이에 적합한 신규의 화합물 및 이에 적합한 화합물의 식별 방법에 관한 것이다.
인간 만능줄기세포(hPSC)는 인체의 모든 세포 유형들로 자기-증식되고 분화되는 독특한 능력으로 인해 재생 의학에 대단히 유망하다. 그러나, 동일한 성질이 또한 상기 세포를 잠재적으로 종양형성성으로 만든다.
종양 형성은 미분화된 만능세포의 잔류 존재와 양의 상관성을 갖는 것으로 보고되었다(Miura et al., Nature Biotechnology 27:743-745 (2009)). 기형종 형성에 매우 적은 hPSC가 필요하며(Lee et al., Cell Cycle 8:2608-2612 (2009); Hentze et al., Stem Cell Research 2:198-210 (2009)), 배양 중 연장된 분화후에조차 종양형성성 만능세포는 여전히 남아있다(Narsinh et al., Journal of Clinical Investigation 121:1217-1221 (2011); Ghosh et al., Cancer Research 71:5030-5039 (2011); Fu et al., Stem Cells and Development 21:521-529 (2012)).
따라서 상기 만능세포 유도체의 임상 적용 전에 잔류 만능세포를 제거할 것이 권장되었다(Ben-David & Benvenisty, Nature Reviews Cancer 11:268-277 (2011)).
중요하게는, 유도만능줄기(iPS) 세포의 생성이 면역원성 거부 문제를 해결했을 수도 있지만, 기형종 형성의 위험성은 배아줄기(ES) 세포 및 iPS 세포에 똑같이 관련된 큰 장애로 남아있다(Miura et al., Nature Biotechnology 27:743-745 (2009); Fu et al., Stem Cells and Development 21:521-529 (2012); Ben-David & Benvenisty, Nature Reviews Cancer 11:268-277 (2011); Puri & Nagy, Stem Cells 30:10-14 (2012)).
분화 배양물로부터 잔류 만능세포의 제거를 촉진하기 위해서, 유전자 조작 또는 세포 분류에 근거한 다수의 전략들, 예를 들어 자살 유전자의 도입(Schuldiner et al., Stem Cells 21:257-265 (2003); Hara. et al., Stem Cells and Development 17:619-627 (2008)); 종양 진행 유전자의 방해(Blum et al., Nature Biotechnology 27:281-287 (2009)) 또는 종양 억제제의 방해(Menendez et al., Aging Cell 11:41-50 (2012)); PSC-특이성 표면 항원에 대한 항체를 기본으로 하는 형광-활성화된 또는 자기-활성화된 세포 분류(FACS 또는 MACS)(Fong et al., Stem Cell Reviews 5:72-80 (2009); Tang et al., Nature Biotechnology 29:829-834 (2011); Wang et al., Cell Research 21:1551-1563 (2011)); 및 만능세포에 대한 세포독성 항체의 사용(Choo et al., Stem Cells 26:1454-1463 (2008); Schriebl et al., Tissue Engineering Part A (2012 Jan. 4, electronically published))이 제안되었다.
선행의 연구들은 hPSC가 일부 세포 섭동(perturbation)에 특히 민감할 수 있으며, 따라서 다른 세포 유형들보다 일부 환경 하에서 세포사멸을 겪기가 더 쉬운 경향이 있음을 시사하였다(Qin et al., Journal of Biological Chemistry 282:5842-5852 (2007); Momcilovic et al., PloS One 5:e13410 (2010)).
암 줄기세포 가설은 암 성장이 암세포의 부분집합(당해 분야에서는 암 줄기세포 또는 암 줄기-유사 세포(CSC)라 칭한음)(종양-기술 가능성, 자기-증식 능력, 치료에 대한 내성 및 이종 및 가능하게는 비-종양형성성 암세포로의 분화 능력을 특징으로 한음)에 의해 구동됨을 전제로 한다(Scaffidi & Misteli, Nature Cell Biology 13:1051-1061 (2011); Campos et al., Clinical Cancer Research 16:2715-2728 (2010); Medema, Nature Cell Biology 15:338-344 (2013); Visvader & Lindeman, Nature Reviews Cancer 8:755-768 (2008)). 보고된 CSC는 CD34(CD38은 아닌)를 발현하는 백혈병 세포의 아집단(Bonnet & Dick, Nature Medicine 3: 730-737 (1997))뿐만 아니라 뇌암(Singh et al., Cancer Research 63:5821-5828 (2003)), 유방암(Al-Hajj et al., PNAS 100:3983-3988 (2003)), 결장암(O’Brien et al., Nature 445:106-110), 난소암(Zhang et al., Cancer Research 68:4311-4320 (2008)), 췌장암(Li et al., Cancer Research 67:1030-1037 (2007)), 전립선암(Maitland & Collins, Journal of Clinical Oncology 26:2862-2870 (2008); Lang et al., Journal of Pathology 217:299-306 (2009)), 흑색종(Schatton et al., Nature 451:345-349 (2008); Boiko et al., Nature 466:133-137 (2010); Schmidt et al., PNAS 108:2474-2479 (2011); Civenni et al., Cancer Research 71:3098-3109 (2011)) 및 다발성 골수종(Matsui et al., Blood 103:2332-2336 (2004); Matsui et al., Cancer Research 68:190-197 (2008))에서의 암세포 아집단을 포함한다.
스테아로일-CoA 불포화효소(SCD)는 스테아르산의 불포화에 의해 올레산의 생산을 촉매화하는 효소이다. 2 개의 아이소폼, SCD1 및 SCD5가 인간에서 보고되었다.
SCD1의 억제는 일부 인간 암 세포주에서 소포체(ER) 스트레스 및 접히지 않은 단백질 반응(UPR)을 유도하여, 상기 세포의 세포사멸을 도출하는 것으로 보고되었으며, 암요법에 대한 잠재적인 표적으로서 제시되었다(Roongta et al., Molecular Cancer Research 9:1551-1561 (2011); Minville-Walz et al., PloS One 5:e14363 (2010); Scaglia et al., PloS One 4:e6812 (2009); Hess et al., PloS One 5:e11394 (2010); Morgan-Lappe et al., Cancer Research 67:4390-4398 (2007); Mason et al., PloS One 7:e33823 (2012)). SCD1은 hPSC에서 발현되는 것으로 보고되었지만(Assou et al., Stem Cells 25:961-973 (2007)), 이들 세포에서 그의 역할은 이전에 기술되지 않았다.
포화 지방산 SCD1 기질의 축적은 다수의 기전들, 즉 반응성 산소종(ROS)의 발생(ER 칼슘 고갈에 이르게 된음)(Borradaile et al., Molecular Biology of the Cell 17:770-778 (2006)); 구조 및 완전성을 대단히 손상시키는 ER 막 조성의 변경(Borradaile et al., Journal of Lipid Research 47:2726-2737 (2006)); 및 ER 중 단백질의 증대를 생성시키는 ER에서 골지체로의 수송의 장애(Preston et al., Diabetologia 52:2369-2373 (2009))에 의해 ER 스트레스 및 UPR을 유도하는 것으로 보고되었다. SCD1 활성의 산물인 올레산은 상기 포화 지방산과 경쟁하고, 비정상적인 지질 분배를 차단하며, ER 스트레스를 약화시키는 것으로 보고되었다(Peng et al., Endocrinology 152:2206-2218 (2011); Hapala et al., Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization 103:271-285 (2011)).
고 SCD 활성은 상승된 혈장 트라이글리세라이드, 높은 체질량 지수 및 감소된 혈장 HDL을 포함하여, 증가된 심혈관 위험성 프로파일과 관련되는 것으로 보고되었다(Attie et al., J Lipid Res 43:1899-1907 (2002)).
국제 특허 출원 PCT/CA2006/000949(WO 2006/130986로서 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/CA2007/001026(WO 2007/143823로서 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/CA2007/001027(WO 2007/143824로서 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/CA2007/001396(WO 2008/017161로서 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/CA2007/001858(WO 2008/046226로서 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/CA2007/002139(WO 2008/064474로서 공개됨) 및 미국특허 출원 제2008/0182838 호는 SCD1 억제제들 및 심혈관 질환, 비만증, 당뇨병, 신경학적 질환, 대사 증후군, 인슐린 내성, 암 및 간 지방증의 치료에서의 그들의 용도를 기술된다.
추가적인 배경 기술은 하기의 문헌들 및 하기의 공개 번호들을 갖는 국제 특허 출원들을 포함한다: Behrouzian and Buist [Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 68:107-112 (2003)]; Raju and Reiser [J Biol Chem 242:379-384 (1967)]; Park et al. [Biochim Biophys Acta 1486:285-292 (2000)]; Liu et al. [J Med Chem 50:3086-3100 (2007)]; Zhao et al. [Bioorg Med Chem Lett 17:3388-3391 (2007)]; Xin et al. [Bioorg Med Chem Lett 18:4298-4302 (2008)]; 및 WO 2005/011653, WO 2005/011654, WO 2005/011655, WO 2005/011656, WO 2005/011657, WO 2006/014168, WO 2006/034279, WO 2006/034312, WO 2006/034315, WO 2006/034338, WO 2006/034341, WO 2006/034440, WO 2006/034441, WO 2006/034446, WO 2006/086445, WO 2006/086447, WO 2006/101521, WO 2006/125178, WO 2006/125179, WO 2006/125180, WO 2006/125181, WO 2006/125194, WO 2007/044085, WO 2007/046867, WO 2007/046868, WO 2007/050124, WO 2007/130075, WO 2007/136746, WO 2008/074835, WO 2008/074835, WO 2008/074824, WO 2008/036715, WO 2008/044767, WO 2008/029266, WO 2008/062276, WO 2008/127349, WO 2008/003753, WO 2007/143697, WO 2008/024390, WO 2008/096746 및 WO 2008/056687; 및 Liu [Expert Opinion on Therapeutic Patents 19:1169-1191 (2009)].
본 발명은 그의 일부 실시태양에서 치료법 및 보다 특히, 비제한적으로, 만능세포 및 미분화 암세포와 같은 미분화세포의 치료, 이에 적합한 신규의 화합물 및 이에 적합한 화합물의 식별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 I 화합물의 용도를 제공한다:
Figure pct00001
화학식 I
상기 식에서,
R1은 수소이고,
R2는 수소,
2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
-NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
피리디닐카보닐,
2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
(C1-6)알킬-카보닐,
N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
나프틸설포닐 및
N-하이드록시-아세트이미도일로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는
R1은 벤조일이고 R2는 4-클로로벤즈아미도이며;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 할로, NH2, 바이페닐옥시메틸 및 (C1-4)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되나, 단
R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소, 할로, NH2 또는 (C1-4)알킬이 아니다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라서,
R1은 수소이고,
R2는 2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
-NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
피리디닐카보닐,
2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
(C1-6)알킬-카보닐,
N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
나프틸설포닐 및
N-하이드록시-아세트이미도일로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는
R1은 벤조일이고 R2는 4-클로로벤즈아미도이며;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 클로로, NH2 및 메틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 II 화합물의 용도를 제공한다:
[화학식 II]
Figure pct00002
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 III 화합물의 용도를 제공한다:
[화학식 III]
Figure pct00003
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 IV 화합물의 용도를 제공한다:
[화학식 IV]
Figure pct00004
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 V 화합물의 용도를 제공한다:
[화학식 V]
Figure pct00005
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 VI 화합물의 용도를 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00006
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 치료학적 유효량의 본 발명에 기술된 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명에 기술된 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 기술된 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 기술된 화합물을 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 조성물은 미분화세포의 억제에 사용하기 위해 식별된다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 미분화세포는 만능줄기세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 미분화세포는 미분화 암세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 조성물은 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위해 식별된다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 증식성 질환 또는 장애은 기형종, 미분화암, 백혈병, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 폐암, 두경부암, 중간엽암 및 다발성 골수종으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 만능줄기세포의 억제를 위한 선두 후보의 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 다수의 만능줄기세포 샘플을 제공하고, 이때 상기 샘플들은 각각 상이한 유형의 만능줄기세포를 포함하고;
(b) 상기 샘플을 후보 화합물과 접촉시키고;
(c) 상기 샘플에서 상기 줄기 세포의 생육력 (viability)을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 샘플 중 적어도 2 개에서 감소하는 경우, 상기 후보 화합물을 만능줄기세포를 억제할 수 있는 것으로서 식별하고, 이에 의해 선두 후보를 식별함을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 방법은 만능줄기세포를 선택적으로 억제하는 선두 후보를 식별하기 위한 것이며, 상기 방법은
(d) 적어도 하나의 분화세포 샘플을 제공하고;
(e) 상기 적어도 하나의 샘플을, 만능줄기세포 집단을 감소시킬 수 있는 것으로서 식별된 화합물과 접촉시키고;
(f) 상기 적어도 하나의 샘플에서 상기 분화세포의 생육력을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 적어도 하나의 샘플에서 유지되는 경우, 상기 화합물을 만능줄기세포를 선택적으로 억제할 수 있는 것으로서 식별함을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 만능줄기세포의 세포독성 억제제로서 SCD1(스테아로일-CoA 불포화효소-1) 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 상기 SCD1 억제제는 A939572, CAY-10566, MF-438, CVT-11127, GSK-993, 5-(테트라데실옥시)-2-퓨로산 및 SCD1에 대한 핵산 침묵화 서열 (scilencing sequence)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및/또는 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기술된 바와 유사하거나 동일한 방법 및 물질들을 본 발명의 실시태양들을 실시 또는 시험하는데 사용할 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질들이 하기에 기술된다. 충돌하는 경우에는, 정의를 포함하여, 본 특허 명세서가 지배할 것이다. 또한, 상기 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것이며 반드시 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 일부 실시태양들을 단지 예로서, 첨부되는 도면을 참조하여 본 발명에 기술하였다. 이제 상기 도면들을 상세히 구체적으로 참조하여, 도시된 항목들이 예시를 목적으로 하며 본 발명의 실시태양들의 예시적인 논의를 목적으로 함을 강조한다. 이에 관하여, 상기 도면들과 관련된 설명은 당해 분야의 숙련가들에게 본 발명의 실시태양들을 어떻게 실행할 수 있는지를 자명하게 한다.
도면에서:
도 1a 및 1b는 광학 현미경검사(도 1a)에 의해서 및 형광-표지된 Oct-4를 나타내는 형광 현미경검사(도 1b)에 의해서 획득된, 유전학적으로 표지된 CSES2-SO2/3 인간 배아줄기세포의 현미경 상을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 확대된(도 2a) 및 확대되지 않은(도 2b), 알칼리성 포스파타제에 대해 염색된 H9 인간 배아줄기세포의 상을 나타낸다.
도 3은 384-웰 플레이트에서 시딩 후 24, 72 및 120 시간째에, Oct-4에 대해 염색된 Mel-1 인간 배아줄기세포의 형광 현미경검사 상을 나타낸다.
도 4는 384-웰 플레이트에서 시딩 후 48 및 96 시간째에, 형광-표지된 Oct-4를 나타내는 유전학적으로 표지된 CSES2-SO2/인간 배아줄기세포의 형광 현미경검사 상을 나타낸다.
도 5는 샘플 중에 시딩된 H9 줄기세포의 수의 함수로서, 살아있는 H9 인간 배아줄기세포의 ATP-기재 발광분석에서 측정된 상대 밝기 단위(RLU)를 나타내는 그래프이다(k = 1,000; 분석은 시딩 후 24 시간째에 수행되었음).
도 6은 시딩 후 3, 24, 48 및 72 시간째에, 384-웰 플레이트의 웰에서 메틸렌 블루로 염색된 H9 세포의 상을 나타낸다.
도 7은 6, 24, 48 또는 72 시간 동안 화합물들에 대한 노출에 따른, 티몰올 말리에이트(48), 악티디온(6), 암사크린 하이드로클로라이드(10), 아모다이아퀸(9), 카보플라틴(13), 시프로플록사신(16), 크로탈린(19), 독시사이클린(22), 에스트라디올(24), 파모티딘(25), 페노피브레이트(26), 플루드로코르티손 아세테이트(27), 이미프라민(29), 아이소프로테레놀(31), 케토코나졸(33) 및 테트라사이클린(46)에 대한 세포독성에 대한 선별의 예시적인 결과들을 나타내는 막대 그래프를 나타낸다; 각각의 노출 시간에 대한 5 개의 막대는, 좌측에서 우측으로, 30 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM 및 300 nm의 용량을 나타낸다.
도 8은 만능세포에 대한 세포독성을 선별하기 위한 예시적인 프로토콜을 나타내는 도해이다.
도 9는 만능세포에 대한 세포독성의 예시적인 선별의 384-웰 플레이트 중 각각 149 개에 대해 계산된 Z' 인자를 나타내는 그래프이다(각각의 색상은 함께 선별된 플레이트들의 배치를 가리킨음).
도 10은 시험 화합물들에 의해 나타난 만능세포 억제의 함수로서 상기 화합물들의 수를 나타내는 히스토그램이다(60% 억제의 컷오프 값을 화살표로 나타내었음).
도 11은 20 μM의 예시적인 화합물에 의한 CSES2 및 H9 인간 배아줄기세포(ESC)의 억제를 나타내는 산포도이다(r2 = 0.87, 데이터를 오직 60% 이상까지 상기 두 세포 유형 모두를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었음).
도 12a-C는 CSES2(도 12a-12c), CSES2-SO2/3(도 12a 및 12c) 및 H9(도 12c) 인간 배아줄기세포(ESCs) 및 BJ-iPS28 유도만능줄기세포(도 12b)에 대한, 예시적인 화합물들에 대한 pEC50 값(pEC50 = -logEC50, EC50 값은 M 단위이다, 도 12a 및 12b) 또는 20 μM의 예시적인 화합물에 의한 억제 퍼센트(도 12c)를 나타내는 2차원(도 12a 및 12b) 및 3차원(도 12c) 산포도이다.
도 13은 24 시간 동안(x-축) 및 48 시간 동안(y-축) CSES2 세포의 처리에 대해 획득된 바와 같은, 예시적인 화합물들에 대한 pEC50 값을 나타내는 산포도이다(pEC50 = -logEC50, EC50 값은 M 단위임).
도 14는 예시적인 만능세포(배아줄기(ES) 세포 및 유도만능줄기(iPS) 세포)와 예시적인 만능세포 또는 선조세포, 분화세포 및 암세포간의 관계를 나타내는 도해이다.
도 15는 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포(y-축) 및 심근세포(x-축)의 억제를 나타내는 산포도이다(r2 = 0.03, 데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(심근세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 16은 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 섬유아세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(섬유아세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 17은 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 간세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(간세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 18은 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 신경모세포종(켈리) 세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(신경모세포종 세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 19는 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 HeLa 세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(HeLa 세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 20은 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 Huh7 세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(Huh7 세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 21은 20 μM의 예시적인 화합물들에 의한 CSES2 세포 및 내배엽 선조세포의 억제를 나타내는 산포도이다(데이터를 오직 60% 이상까지 CSES2 세포를 억제하는 화합물에 대해서만 나타내었으며, CSES2 세포의 선택적인 억제제(내배엽 선조세포의 20% 미만의 억제)는 직사각형으로 나타낸음).
도 22는 분화전(0일째) 및 분화후(8일째) 유전학적으로 표지된 CSES2-SO2/3 세포에서 Oct-4(좌측)의 적색 형광-표지 및 SOX17(우측)의 녹색 형광 표지를 나타내는 형광 현미경검사 상을 나타낸다(스케일 바 = 200 ㎛).
도 23은 CSES2-SO2/3 세포의 98%가 분화후 CXCR4에 대해 형광 염색을 나타낸 반면, 3%는 분화전에 CXCR4에 대해 형광 염색을 나타냄을 나타내는 히스토그램이다.
도 24는 384-웰 분화 플레이트에서 도말 후 분화된 CSES2-SO2/3 세포 중 Oct-4의 적색 형광 표지(좌측, 형광은 보이지 않으며, 이는 Oct-4의 결여를 가리킨음) 및 SOX17의 녹색 형광 표지(우측)를 나타내는 형광 현미경검사 상을 나타낸다(스케일 바 = 200 ㎛).
도 25A 및 25B는 BJ-섬유아세포(도 25A, y-축) 및 BJ-섬유아세포-유래된 유도만능줄기세포(도 25B, x-축)뿐만 아니라 CSES2-SO2/3 배아줄기세포(도 25B, x-축) 및 CSES2-SO2/3-유래된 분화세포(도 25B, y-축)의 처리에 대해서 획득된, 예시적인 화합물들에 대한 pEC50 값을 나타내는 산포도이다(pEC50 = -logEC50, EC50 값은 M 단위임).
도 26a 및 26b는 예시적인 화합물 PluriSIn #1의 농도의 함수로서, CSES2 배아줄기세포(도 26a, 좌측) 및 분화된 CSES2-유래된 내배엽 선조세포(EPC)(도 26a, 우측)의 억제뿐만 아니라 BJ-섬유아세포(도 26b, 좌측) 및 BJ-섬유아세포-유래된 BJ-iPS28 유도만능줄기세포(도 26b, 우측)의 억제를 나타내는 그래프이다(농도 단위는 로그 규모로 나타내었음).
도 27은 15 개의 예시적인 화합물들 PluriSIn #1 내지 #15의 농도의 함수로서 CSES2-SO2/3 배아줄기세포(SO2/3 ESC), CSES2-SO2/3-유래된 분화세포(SO2/3 diff.), BJ-섬유아세포 및 BJ-iPS28 섬유아세포-유래된 유도만능줄기세포의 억제(%)를 나타내는 그래프이다(PluriSIn #는 각 패널의 상부 좌측 구석에 나타내며, 농도 단위는 로그 규모로 나타내었음).
도 28은 화합물들(각각의 화합물을 일렬로 나타낸음)에 의한 억제를 기준으로 세포 유형의 계층적 군집화를 나타내며, 오직 만능줄기세포(4 개의 상부열)만을 억제한 15 개 화합물(황색 직사각형으로 표시됨)을 추가로 나타내는 그래프이다(H = 높은 억제, L = 낮은 억제);
도 29는 메틸렌 블루 분석에 의해 측정된 바와 같은, 20 μM의 각각의 PluriSIn #1 내지 #11로 처리후 72 시간째에 생육성 H9 배아줄기세포(처리되지 않은 대조용 세포에 비해)의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 30은 20 μM의 각각의 PluriSIn #1 내지 #11로 처리후 72 시간째에 H9 배아줄기세포뿐만 아니라 처리되지 않은 대조용 세포를 나타내는 현미경 상들을 나타낸다.
도 31은 예시적인 화합물 PluriSIn #6, 음성 대조군(NC)으로서 0.5% DMSO 또는 세포독성 양성 대조군(PC)으로서 5 μM 암사크린 하이드로클로라이드에 의한 처리에 따른, CSES2-SO2/3 배아줄기세포 중 Oct-4의 적색 형광 표지(도 31a-31C) 및 CSES2-SO2/3-유래된 분화세포에서 SOX17의 녹색 형광 표지를 나타내는 형광 현미경검사 상을 나타낸다(스케일 바 = 100 ㎛).
도 32a 내지 32c는 예시적인 화합물 PluriSIn #1(우측 패널) 또는 DMSO 대조군(좌측 패널)에 의한 처리에 따른, CSES2-SO2/3 배아줄기세포 중 Oct-4의 적색 형광 표지(도 32a), CSES2-SO2/3-유래된 분화세포에서 SOX17의 녹색 형광 표지(도 32b) 및 CSES2-SO2/3 배아줄기세포 및 CSES2-SO2/3-유래된 분화세포의 혼합물 중 배아줄기세포의 적색 형광 표지 및 세포핵의 청색 형광 표지(도 32c)를 나타내는 형광 현미경검사 상을 나타낸다(스케일 바 = 100 ㎛).
도 33은 메틸렌 블루 분석에 의해 측정된 바와 같은, 20 μM의 PluriSIn #1로 처리후 72 시간째에 생육성 BJ-섬유아세포, HeLa 세포, HepG2 세포 및 켈리 세포(처리되지 않은 대조용 세포에 비해)의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 34는 20 μM의 PluriSIn #1로 처리후 72 시간째에 BJ-섬유아세포, HeLa 세포, HepG2 세포 및 켈리 세포뿐만 아니라 처리되지 않은 대조용 세포를 나타내는 현미경 상들을 나타낸다.
도 35는 PluriSIn #1, PluriSIn #6로 처리되거나 또는 처리되지 않은(대조군) 미분화 배아줄기세포(ESC) 및 ESC-유래된 분화 내배엽 선조세포의 유전자 발현-기재 계층적 군집화를 나타내는 그래프이며; 지도는 대조군과 처리 조건 간의 모든 차별적으로 발현된 유전자(>2 배)를 나타낸다(2 개 실험의 결과를 ESC 대조군 및 PluriSIn #1 처리된 ESC 각각에 대해서 나타내며, 적색은 높은(H) 발현을 가리키고, 청색은 낮은(L) 발현을 가리킨음).
도 36은 PluriSIn #1(ES PluriSIn #1) 또는 PluriSIn #6(ES PluriSIn #6)에 의한 배아줄기세포의 처리 또는 PluriSIn #1에 의한 ES-유래된 분화세포(Diff.PluriSIn #1)의 처리에 따른, 세포사멸과 관련된 유전자의 발현의 변화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 37a 및 37b는 아넥신-V-플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 형광 및 프로피디움 요오다이드(PI) 형광의 전형적인 FACS 분석(도 37a)을 나타내는 그래프 및 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1(도 37a, 기부 및 도 37b) 또는 대조군(0.2% DMSO; 도 37a, 상부 및 도 37b)에 의해 16 시간 동안 처리에 따른 배아줄기세포 세포사멸을 나타내는 막대 그래프(도 37b)를 나타낸다(*p < 0.05).
도 38은 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1 또는 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT, 양성 대조군)로 처리된 배아줄기세포 및 처리되지 않은 대조용 세포(β-카테닌 수준이 로딩 대조군으로서 제공되었음)에서 프로카스파제-3 및 절단된 카스파제-3의 수준을 나타내는 면역블럿의 상을 나타낸다.
도 39는 0, 25 또는 100 μM의 Z-VAD-FMK의 존재 하에서, 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1로 24 시간 동안 처리된 인간 배아줄기세포 및 처리되지 않은 대조용 세포의 생육력을 나타내는 막대 그래프이다(*p < 0.05; **p < 0.01).
도 40은 다이티오쓰레이톨(DTT, 일반적인 ER 스트레스 유도인자) PluriSIn #1(ES PluriSIn #1) 또는 PluriSIn #6(ES PluriSIn #1)에 의한 배아줄기세포의 처리 또는 PluriSIn #1에 의한 ES-유래된 분화세포(Diff.PluriSIn #1)의 처리에 따른, 소포체(ER) 스트레스 및 접히지 않은 단백질 반응(UPR)과 관련된 유전자의 발현의 변화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 41은 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1, 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT) 또는 대조군으로 12 시간 동안 처리에 따른, 배아줄기세포(ESC) 및 8-일 분화에 의해 ESC로부터 유래된 세포(ESC 8d diff.)에서 연접된 아이소폼 sXBP1(sRP2 수준에 대해 표준화됨)의 발현(대조용에 대한)을 나타내는 막대 그래프이다(*p = 0.007).
도 42는 20 μM PluriSIn #1, 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT) 또는 대조군(로딩 대조군으로서 제공된 α-튜불린)으로 처리된 배아줄기세포 및 분화세포 중 포스포-eIF2α 수준을 나타내는 면역블럿의 상을 나타낸다;
도 43은 20 μM PluriSIn #1, 10 μM의 사이클로헥스이미드 또는 대조군으로 12 시간 동안 처리에 따른, 35S-Met 결합에 의해 측정된 바와 같은(전체 단백질에 대해 표준화됨), 배아줄기세포(ES) 및 섬유아세포에서의 단백질 합성을 나타내는 막대 그래프이다(*p = 0.005);
도 44는 예시적인 화합물 PluriSIn #1 및 PluriSIn #6에 의한 배아줄기세포(ESC) 또는 ES-유래된 분화세포(Diff.)의 처리 및 SCD 억제제 A939572에 의한 H19299 암세포의 처리에 따른 예시적인 유전자들의 발현의 변화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 45는 20 μM PluriSIn #1 또는 대조군으로 12 시간 동안 처리에 따른 SCD1 활성(대조용 수준에 대해 표준화됨)을 나타내는 막대 그래프이다(*p = 2.1·10-6).
도 46은 100 μM 올레산(OA)의 존재 또는 부재 하에서 75 nM의 SCD1 억제제 A939572 및 CAY-10566 또는 대조군으로 48 시간 동안 처리에 따른 배아줄기세포 생육력(대조용 수준에 대해 표준화됨)을 나타내는 막대 그래프이다(*p ≤ 0.0003).
도 47은 올레산(OA) 또는 소 혈청 알부민(BSA)에 접합된 올레산의 농도의 함수로서, 20 μM PluriSIn #1 또는 2 μM 암사크린(ams)으로 처리된 또는 처리되지 않은(대조군) 만능줄기세포의 생육력(평균 대조용 값에 대한)을 나타내는 그래프이다.
도 48은 처리 없이(대조군) 또는 20 μM PluriSIn #1(3 개의 우측 컬럼), 0, 6.25, 25 및 100 μM의 소 혈청 알부민에 접합된 올레산으로 처리된 만능줄기세포를 나타내는 상들을 나타낸다.
도 49는 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1, #2, #3, #5 또는 #6으로, 100 μM의 소 혈청 알부민에 접합된 올레산(OA)으로 및 상기 올레산 없이 처리된 배아줄기세포의 생육력을 나타내는 막대 그래프이다(*p ≤ 0.006).
도 50은 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1, 100 ㎚의 A939572 또는 DMSO(대조군)으로 18 시간 동안 처리에 따른 아넥신-V-형광 아이소티오시아네이트(FITC) 형광 및 프로피디움 요오다이드(PI)의 전형적인 FACS 분석을 나타내는 그래프이다.
도 51은 100 ㎚ A939572 또는 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT)에 의한 처리에 따른, 배아줄기세포(ESC) 및 분화된 ESC-유래된 세포에서 연접된 아이소폼 sXBP1의 발현(대조군에 대해)을 나타내는 막대 그래프이다(*p < 0.05).
도 52는 20 μM PluriSIn #1, 100 ㎚ A939572, 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT)로 또는 대조군(로딩 대조군으로서 제공된 α-튜불린)으로 처리된 배아줄기세포(좌측) 및 ESC-유래된 분화세포(우측)에서 포스포-eIF2α 수준을 나타내는 면역블럿의 상을 나타낸다.
도 53은 100 ㎚ A939572, 10 μM의 사이클로헥스이미드 또는 대조군으로 12 시간 동안 처리에 따른, 35S-Met 결합에 의해 측정된 바와 같은(전체 단백질에 대해 표준화됨), 배아줄기세포에서의 단백질 합성을 나타내는 막대 그래프이다(*p < 0.05).
도 54는 1 mM 다이티오쓰레이톨(DTT) 또는 100 μM의 올레산(OA)과 함께 또는 상기 올레산 없는 10 μM의 사이클로헥스이미드(화합물) 또는 대조군으로 48 시간 동안 처리에 따른, 35S-Met 결합에 의해 측정된 바와 같은(전체 단백질에 대해 표준화됨), H9 배아줄기세포(ESC) 또는 BJ-섬유아세포(분화됨)에서의 단백질 합성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 55는 세포 작용 및 생육력에 대한 예시적인 화합물(예를 들어 PluriSIn #1), 팔미트산 및 올레산의 잠재적인 기전을 나타내는 도해이다.
도 56은 처리되지 않은(대조용) 세포의 경우에 대한, 20 μM의 예시적인 화합물 PluriSIn #1, #2, #4 또는 #6에 의한 처리에 따른 마우스 만능줄기세포의 생육력을 나타내는 막대 그래프이다.
도 57은 예시적인 화합물 PluriSIn #6, 음성 대조군(NC)으로서 0.5% DMSO 또는 세포독성 양성 대조군(PC)으로서 5 μM 암사크린 하이드로클로라이드에 의한 처리에 따른, 광학 현미경검사(하부 패널) 및 형광-표지된 Oct-4를 나타내는 형광 현미경검사(상부 패널)에 의해 획득된 R1 Oct4-GFP 마우스 배아줄기세포의 현미경 상을 나타낸다(스케일 바 = 100 ㎛).
도 58은 대조군(0.2% DMSO 또는 DMSO 없이)에 의한 처리에 따른 및 20 μM의 PluriSIn #1에 의한 처리에 따른 17 개 샘플 중 7 개에서 양호한 질(등급 A/B)의 배반포뿐만 아니라 20 μM의 PluriSIn #1(PluriSIn #1을 0.2% DMSO와 함께 투여한다, 스케일 바 = 100 ㎛)에 의한 처리에 따른 17 개 샘플 중 6 개에서 불량한 질(등급 C, 내세포집단(ICM) 없음)의 배반포 및 17 개 샘플 중 4 개에서 장애 배반포(상실배)를 나타내는, 교배후 4 및 4.5일째에 전형적인 마우스 배의 현미경 상을 나타낸다.
도 59는 100 μM의 올레산(OA)의 존재 또는 부재 하에서 대조군 또는 20 μM의 PluriSIn #1에 의한 처리에 따른 양호한 질(등급 A/B)의 배반포, 불량한 질(등급 C)의 배반포 및 장애 배반포의 비율을 나타내는 막대 그래프이다(*p = 0.0001).
도 60은 100 μM의 올레산(OA)의 존재 또는 부재 하에서 대조군으로 24 시간 동안 처리, 100 μM의 올레산(OA)과 함께 20 μM의 PluriSIn #1 또는 100 nm의 A939572에 의한 처리에 따른 7 개 샘플 중 5 개 및 100 ㎚ A939572 단독에 의한 처리에 따른 9 개 샘플 중 5 개에서 양호한 질(등급 A/B)의 배반포뿐만 아니라, 100 μM의 올레산(OA)과 함께 20 μM의 PluriSIn #1 또는 100 nm의 A939572에 의한 처리 또는 100 ㎚ A939572 단독 처리에 따른 일부 샘플 중 불량한 질(등급 C, 내세포집단(ICM) 없음)의 배반포 및 장애 배반포(상실배)를 나타내는, 교배후 4.5일째에 전형적인 마우스 배의 현미경 상을 나타낸다(스케일 바 = 100 ㎛).
도 61은 대조용으로 또는 100 μM의 올레산(OA)의 존재 또는 부재 하의 100 ㎚ A939572에 의해 24 시간 동안 처리에 따른 양호한 질(등급 A/B) 배반포, 불량한 질(등급 C) 배반포 및 장애 배반포의 비율을 나타내는 막대 그래프이다(*p = 0.007).
도 62는 20 μM의 PluriSIn #1에 또는 PluriSIn #1 없이(대조군) 24 또는 48 시간 동안 노출에 따른 6-웰 플레이트 중 H9 줄기세포의 현미경 상을 나타낸다(스케일 바 = 200 ㎛).
도 63a 및 63b는 20 μM의 PluriSIn #1(도 63b)에 또는 PluriSIn #1 없이(도 63a에 나타낸 샘플 중 도 63b) 48 시간 동안 노출에 따른, 배아줄기세포 배지가 있는 10-㎝ 플레이트 중 마우스 배섬유아세포상의 H9 줄기세포의 현미경 상을 나타낸다.
도 64는 PluriSIn #1(Tra-1-60 PluriSIn #1) 또는 DMSO(Tra-1-60 DMSO 대조군)(염색 없이, 단지 세포에 대한 결과를 또한 대조군으로서 나타낸음)에 의한 혼합된 세포 집단(분화 및 미분화 CSES2-SO2/3 세포)의 48 시간 처리에 따른, TRA-1-60에 대한 형광 염색의 함수로서 세포의 수를 나타내는 히스토그램이다.
도 65는 PluriSIn #1 또는 대조군에 의한 혼합된 세포 집단(분화 및 미분화 CSES2-SO2/3 세포)의 48 시간 처리에 따른, Oct-4의 형광 표지화를 나타내는 형광 현미경상을 나타낸다.
도 66a 및 66b는 CSES2-SO2/3 배아줄기세포(도 66a) 또는 BJ-iPS28 유도만능줄기세포(도 66b)가 양쪽에 주사된 마우스의 상을 나타내며, 여기에서 한쪽에 주사된 세포(주사 위치는 화살표로 표시되었음)는 PluriSIn #1로 전처리되었으며 기형종은 보이지 않고, 다른쪽에 주사된 세포는 전처리되지 않았으며 기형종(타원으로 표시되었으며; 우측 패널에 나타낸음)을 생성시켰다.
도 67a 및 67b는 분화 및 미분화 H9 배아줄기세포의 혼합물(도 67a) 또는 분화 및 미분화 BJ-iPS28 유도만능줄기세포(도 67b)가 양쪽에 주사된 마우스의 상을 나타내며, 여기에서 한쪽에 주사된 세포(주사 위치는 화살표로 표시되었음)는 PluriSIn #1로 전처리되었으며 기형종은 보이지 않고, 다른쪽에 주사된 세포는 전처리되지 않았으며 기형종(타원으로 표시되었으며; 우측 패널에 나타낸음)을 생성시켰다.
도 68은 헤마톡실린/에오신-염색된 ES-유래된 및 iPS-유래된 기형종의 조직학을 나타내는 상을 나타낸다.
도 69는 인간 배아줄기세포가 양쪽에 주사된 마우스의 상(좌측 패널)을 나타내며, 여기에서 한쪽에 주사된 세포(주사 위치는 화살표로 표시되었음)는 PluriSIn #1로 전처리되었으며 기형종은 보이지 않고, 다른쪽에 주사된 세포는 전처리되지 않았으며 기형종(타원으로 표시되었으며; 우측 패널에 나타낸음)을 생성시켰다.
도 70은 SCD1에 대한 siRNA 또는 모의 siRNA(녹색 형광 단백질에 대한 siRNA)에 의해 형질감염후 72 시간째에 인간 배아줄기세포의 전형적인 샘플들의 현미경 상을 나타낸다.
도 71은 형질감염후 72 시간째에, SCD1에 대한 40 nM 또는 80 nM siRNA, 100 μM 올레산(OA)과 함께 SCD1에 대한 80 nM siRNA 또는 대조용 siRNA(녹색 형광 단백질에 대한 siRNA)로 형질감염된 인간 배아줄기세포 및 처리되지 않은 인간 배아줄기세포의 상대적인 생육력을 나타내는 막대 그래프이다(*p < 0.05).
도 72는 72 시간 동안 PluriSIn #1에 대한 노출에 따른, 예시적인 화합물 PluriSIn #1의 농도의 함수로서 인간 텔로머라제 역전사효소(BJ + hTERT)의 발현에 의해 불멸화된 정상적인 BJ 섬유아세포 및 hTERT 및 H-RasV12의 발현 및 p53 및 망막모세포종 단백질의 억제에 의해 형질감염된 BJ 섬유아세포(BJ + hTERT - RB - P53)의 상대적인 세포 생육력을 나타내는 그래프이다(PluriSIn #1 부재하의 상대적인 생육력은 1로서 정의된음).
도 73은 72 시간 동안 PluriSIn #1에 대한 노출에 따른, 예시적인 화합물 PluriSIn #1의 농도의 함수로서 분화 및 미분화 줄기-유사 신경교종 세포(SLGC)의 상대적인 세포 생육력을 나타내는 그래프이다(PluriSIn #1 부재하의 상대적인 생육력은 1로서 정의된음).
본 발명은 그의 일부 실시태양들에서 치료법 및 보다 특히, 비제한적으로, 만능세포 및 미분화 암세포와 같은 미분화세포의 치료, 이에 적합한 신규의 화합물 및 이에 적합한 화합물의 식별 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기에 논의된 바와 같이, 분화 배양물로부터 잠재적으로 종양형성성인 잔류 만능줄기세포(PSC)를 제거하기 위해 앞서 제안된 방법들은 유전자 조작 또는 세포 분류에 근거한다. 상기와 같은 과정들은 일반적으로 세포 요법 목적에 적합하지 않다. 더욱 또한, 지금까지, 혼합된 배양물로부터 모든 미분화세포를 완전히 제거하는 세포 분류의 단일 주기 또는 단일 항체는 공지되지 않았다. 따라서 배양물로부터 미분화 만능줄기세포의 제거를 위한 보다 확고한 방법, 특히 세포 요법 목적에 적합한 방법이 필요하다.
또한 특히 증식성 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한, 미분화세포(예를 들어 미분화 암세포)를 제거할 수 있는 화합물이 필요하다.
본 발명자들은 만능줄기세포(PSC)에서 중요한 경로들을 선택적으로 섭동시키고 따라서 상기 세포에서만 세포사를 유도하는 작은 분자들을 식별함으로써 PSC의 개선된 제거를 획득할 수 있음을 구상하였다. 본 발명자들은 본 발명의 실행을 줄이면서, 소분자의 치우치지 않는 고속대량 선별을 설계하였다. 인간 PSC를 선택적으로 표적화하고, 분화된 유도체에 영향을 미치지 않으면서 배양물 중 모든 미분화세포를 효율적이고 확고히 제거하는 소분자를 선택하였다. 따라서, 본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 환자에게 이식에 앞서 분화세포의 배양물에 이들 소 분자를 적용하는 것은 잔류 미분화세포로 인한 종양 형성의 위험성을 상당히 감소시키고, 심지어 제거할 것이다.
본 발명의 일부 실시태양들에 근원하는 전략은 기존 전략에 비해 다수의 이점을 갖는다, 예를 들어 앞서 제안된 임의의 다른 방법보다 더 신속하고, 효율적이고, 확고하며 규모조정이 가능하다. 또한, 본 발명에 기술된 전략은 세포의 유전자 조작이나 단일 세포로의 해리를 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 실시태양은 유전학적으로 정상인 PSC가 복잡한 구조로 분화되게 유도하며, 상기 구조는 이식에 앞서 해체시킬 필요가 없다.
본 발명자들은 본 발명의 실행을 줄이면서, 분화된 유도체에 영향을 미치지 않고 미분화세포를 선택적으로 표적화하는 화합물이 미분화 암세포를 효율적이고 확고하게 제거할 수 있음을 추가로 밝혀내었다.
본 발명의 하나 이상의 실시태양을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 하기의 설명에 설명되거나 실시예에 의해 예시된 세부사항으로 그의 적용이 반드시 제한되는 것은 아님을 알아야 한다. 본 발명은 다른 실시태양이 가능하거나 또는 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)의 세포독성 억제제로서 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물들 중 임의의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)의 억제를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물들 중 임의의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)를 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물들 중 임의의 화합물과 접촉시킴으로써 수행되는, 만능줄기세포의 억제 방법을 제공한다.
일부 실시태양들에서, 상기 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)를 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물과 접촉시키는 것을 시험관내에서 수행한다.
일부 실시태양들에서, 접촉을 생체외에서 수행한다. 예를 들어, 일부 실시태양들에서, 접촉을 샘플 중 만능줄기세포(예를 들어 만능줄기세포 이외의 세포의)가 환자에게 투여되는 것을 억제하기 위해서 생체외에서 수행한다.
일부 실시태양들에서, 접촉을, 상기 화합물을 상기 화합물이 필요한 환자에게 투여함으로써 생체내에서 수행한다.
세포를 상기 억제제와 접촉시킴은 임의의 시험관내 조건에 의해서, 예를 들어 상기 억제제를 환자로부터 유래된 세포(예를 들어 1차 세포 배양물, 세포주) 또는 상기 억제제가 상기 세포와 직접 접촉하도록 상기 세포를 포함하는 생물학적 샘플(예를 들어, 상기 세포를 포함하는 유동 액체)에 가함으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 상기 환자의 세포를 상기 억제제와 함께 배양시킨다. 상기 세포의 배양에 사용되는 조건은 시간/세포의 농도/억제제의 농도/세포와 약물간의 비 및 상기 억제제가 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)에서 세포 변화를 유도할 수 있는 조건, 예를 들어 특정 유전자의 전사 및/또는 번역비율의 변화, 증식률, 분화, 세포사, 괴사, 세포사멸 등에 대해서 선택된다.
상기 억제제에 의해 유도된 세포 변화를 모니터하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 황색 염 MTT (3-(4,5-다이메틸티아졸릴-2)-2, 5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드)(시그마 알드리치(Sigma, Aldrich) 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 자색-청색 불용성 포르마잔 침전물로 환원시키는 살아있는 세포의 선택적 능력에 근거한 MTT 시험; BrdU 분석(세포 증식 ELISA BrdU 비색측정 키트)(롯슈(Roche), 독일 만하임 소재); TUNEL 분석(롯슈, 독일 만하임 소재); 애넥신(Annexin) V 분석(아포얼러트(ApoAlert)(등록상표) 애넥신 V 세포사멸 키트(클론테크 레보라토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 소재); 세네신(Senescence) 결합된-β-갈락토시다제 분석(Dimri et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:9363-9367 (1995)); 뿐만 아니라 본 발명에서 상기에 추가로 기술한 다양한 RNA 및 단백질 검출 방법들(발현 및/또는 활성의 수준을 검출한음)을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)의 세포독성 억제제로서 또는 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)의 억제 방법에 사용하기 위한 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물을 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물들 중 임의의 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물들 중 임의의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물을 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "미분화세포"란 어구는 발생("분화"로서 당해 분야에 공지된 과정) 중 정상 세포에 의해 획득되는 특정한 형태학적 및 작용적 특징이 없음을 특징으로 하는 세포를 기술된다. 발생 중 세포의 분화는 간단한 미분화 접합자로부터 유래된 상이한 조직 및 세포 유형들(상이한 크기, 모양, 막 전위, 대사 활성 및/또는 신호에 대한 응답성을 특징으로 한음)을 생성시킨다. 미분화세포는 결코 분화를 겪은 적이 없거나 또는 분화세포의 특정한 형태학적 및 작용적 특징을 제거하는 과정에 의해 상기 분화세포로부터 유래된 계통의 일부일 수 있다.
본 발명에 기술된 태양들 중 임의의 태양의 일부 실시태양들에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포를 포함한다.
본 발명에 기술된 태양들 중 임의의 태양의 일부 실시태양들에서, 상기 미분화세포는 미분화 암세포를 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 미분화 암세포는 암 줄기세포 및/또는 암 줄기-유사 세포를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "만능줄기세포"란 어구는 3 개의 배엽, 즉 내배엽, 중간엽 또는 외배엽 중 어느 하나로 분화되는 가능성을 갖는 줄기세포(즉 다양한 세포 유형들로 분열 및 분화할 수 있는 세포)를 기술된다. 당해 분야에 공지된 예는 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 포함한다.
본 발명 및 당해 분야에 사용되는 바와 같이, "미분화 암세포"란 어구는 매우 미성숙하고 주변 조직 중의 세포와 다른 것을 특징으로 하는 암세포, 예를 들어 역형성 세포를 기술된다. 미분화 암세포의 특성화는 당해 분야에 널리 공지되어 있다, 예를 들어 미분화세포는 미국 합동 암위원회의 지침을 사용하여 4 등급으로서 분류될 수 있다(AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer; 2010).
상기 미분화 암세포는 환자에서(예를 들어 종양에서) 다수의 암세포를 형성시킬 수 있다. 상기와 같은 암(예를 들어 미국 합동 암위원회(AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer; 2010)의 지침에 따른 4 등급 종양)을 본 발명 및 당해 분야에서 "미분화암"이라 칭한다.
또는, 미분화 암세포는 환자에서(예를 들어 종양에서) 작은 비율의 암세포를 형성시킬 수도 있다. 그러나, 소량에서조차, 미분화 암세포는, 예를 들어 암 줄기세포로서 작용함으로써 매우 높은 임상적 중요성을 가질 수 있다.
본 발명 및 당해 분야에 사용되는 바와 같이, "암 줄기세포" 및 "암 줄기-유사 세포"란 어구는 호환가능하며 특정한 암 샘플에서 발견되는 다양한 세포 유형을 생성시키는 능력을 갖는 암세포의 부분집합(예를 들어 종양 또는 혈액암 내에서 발견되는 세포)을 지칭한다. 상이한 암세포 유형을 생성시키는 상기 능력(상당한 종양-형성 능력을 생성시킨음)은 상이한 정상 세포 유형을 생성시키는 정상 줄기 세포의 성질과 유사하다.
암 줄기세포 및 상기 세포를 특성화하는 마커의 다수의 예들이 당해 분야에 공지되어 있다. 암 줄기세포의 식별에 적합한 마커들은 예를 들어 문헌[Medema, Nature Cell Biology 15:338-344 (2013)] 및 문헌[Visvader & Lindeman, Nature Reviews Cancer 8:755-768 (2008)]에 기술되어 있다. 예로서 비제한적으로 CD34 마커(CD38 마커는 아닌)를 발현하는 백혈병 세포(Bonnet & Dick, Nature Medicine 3: 730-737 (1997)); CD133 마커(Singh et al., Cancer Research 63:5821-5828 (2003)) 및/또는 CD15, CD90, α6-인테그린 및/또는 네스틴 마커를 발현하는 뇌암(예를 들어 신경교종) 세포; CD44(CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 및 CD140b("계통 마커들")는 아님)를 발현하고 CD24는 소량으로 또는 발현하지 않고/않거나(CD44+CD24-/low계통- 세포)(Al-Hajj et al., PNAS 100:3983-3988 (2003)), ALDH1, CD24, CD90, CD133, 헤지호그-Gli 활성 및/또는 α6-인테그린을 발현하는 유방암 세포; CD133(O'Brien et al., Nature 445:106-110), CD44(예를 들어, EpCAMhi/CD44+ 세포(Dalerba et al., PNAS 104:10158-10163 (2007))), ABCB5, ALDH1, β-카테닌 활성, CD24, CD26, CD29, CD166 및/또는 LGR5를 발현하는 결장암 세포; CD44 및 CD117(Zhang et al., Cancer Research 68:4311-4320 (2008)), CD24 및/또는 CD133을 발현하는 난소암 세포; CD44, CD24 및 상피-특이 항원(ESA)(Li et al., Cancer Research 67:1030-1037 (2007)), ABCG2, ALDH1, CD133, c-Met, CXCR4, 네스틴 및/또는 결절성 액티빈을 발현하는 췌장암 세포; CD133, α2β1 인테그린 및 CD144(α2β1 hi/CD133+/CD144+)(Maitland & Collins, Journal of Clinical Oncology 26:2862-2870 (2008) 및/또는 Lang et al., Journal of Pathology 217:299-306 (2009)), ALDH1, CD44, CD166, α6-인테그린 및/또는 Trop2를 발현하는 전립선암 세포; ABCB5(Schatton et al., Nature 451:345-349 (2008)) 및/또는 CD271(Boiko et al., Nature 466:133-137 (2010) 및/또는 Civenni et al., Cancer Research 71:3098-3109 (2011)) 및/또는 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA) 및 CD20(Schmidt et al., PNAS 108:2474-2479 (2011)) 및/또는 ALDH1 및/또는 CD133을 발현하는 흑색종 세포; CD13, CD24, CD44, CD90 및/또는 CD133을 발현하는 간암 세포; ABCG2, ALDH1, CD90, CD117 및/또는 CD133을 발현하는 폐암 세포; CD44를 발현하는 두경부암 세포; 훽스트(Hechst) 33342염료의 유출을 특징으로 하는 중간엽암 세포; 및 CD138을 발현하지 않는(CD138-)(Matsui et al., Blood 103:2332-2336 (2004)) 다발성 골수종 세포, 예를 들어 CD138-/CD20+/CD27+ 세포(Matsui et al., Cancer Research 68:190-197 (2008))가 있다.
본 출원으로부터 발달하는 특허의 수명 동안 많은 관련된 암 줄기세포 및 암 줄기-유사 세포들이 동정되고 특성화될 것으로 기대되며, "암 줄기세포" 및 "암 줄기-유사 세포"란 용어들의 범위는 선험적인 모든 상기와 같은 세포를 포함하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "미분화세포의 세포독성 억제제"는 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)와 접촉시, 상기 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하고/하거나 상기 세포의 적어도 일부를 살해함으로써 상기 세포의 집단을 감소시키는 화합물을 기술된다.
따라서 "미분화세포를 억제함"이란 어구는 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포)의 성장 및/또는 증식을 억제하고/하거나 상기 세포의 적어도 일부를 살해함으로써 상기 세포의 집단을 감소시킴을 기술된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"이란 어구는 치료되는 상태의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시키는, 투여되는 화합물의 양을 기술된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "환자"란 용어는 본 발명에 기술된 상태(예를 들어 증식성 질환 또는 장애)을 나타낼 위험성이 있는 개인을 포함하여, 상기 상태를 앓는 임의의 연령의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 환자는 미분화 암세포를 갖는 것으로서 진단된 개인이며, 상기 암세포는 상기 환자가 상기 미분화세포와 관련된 상태(예를 들어 증식성 질환 또는 장애)를 갖는 것으로 진단되거나 또는 상기 환자가 상기와 같은 상태를 나타낼 위험성이 있는 정도로 존재할 수 있다.
본 발명에 논의된 바와 같이, 만능줄기세포(PSC)의 억제는 상기 세포가 암성 세포로 성숙하는 것을 방지할 수 있으며, 따라서 환자에서 암의 위험성을 감소시키기 위해 줄기세포 요법(또는 다른 세포 요법)을 겪고 있는 상기 환자의 경우에 유리하다.
따라서, 일부 실시태양들에서, 본 발명에 기술된 방법 및 용도들 중 임의의 것들이 줄기세포 요법에 의해 치료되는 환자에서 암의 위험성을 감소시키기 위해 사용된다.
줄기세포 요법을 받는 환자들은 예를 들어 줄기세포 요법을 받기 전에, 줄기세포 요법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애을 앓았던 환자일 수 있다. 상기와 같은 질환 및 장애은 비제한적으로 암, I형 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 알쯔하이머병, 뇌 손상, 척수 손상, 셀리악병, 심부전, 심장 손상, 빈혈, 탈모, 난청, 시각상실, 시력 손상, 근위축성 측삭 경화증, 이식편대 숙주병, 크론병, 불임, 상처, 정형외과 질환 또는 장애, 근육 손상 및 신경학적 장애을 포함한다.
PSC의 억제는 또한 PSC의 증식으로 인해 환자가 줄기세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 발병의 위험이 있거나, 이미 발병한 경우에 유리하다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "증식성 질환 또는 장애"은 미분화세포(예를 들어 줄기세포, 미분화 암세포)의 비정상적인 증식과 관련된 임의의 의학적 상태를 기술된다. 상기와 같은 상태는 비제한적으로 양성 및 악성 종양형성(예를 들어 암), 원위치 암종 및 과형성을 포함한다.
미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 예는 비제한적으로 기형종, 미분화암, 백혈병, 뇌암(예를 들어 신경교종), 유방암, 결장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 폐암, 두경부암, 중간엽암 및 다발성 골수종을 포함한다.
일부 실시태양들에서, 상기 증식성 질환 또는 장애은 기형종 및/또는 미분화암이다.
일부 실시태양들에서, 상기 증식성 질환 또는 장애은 백혈병, 뇌암(예를 들어 신경교종), 유방암, 결장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 폐암, 두경부암, 중간엽암 및/또는 다발성 골수종과 같은 암이며, 상기 암은 암 줄기세포의 증식과 관련된다.
상기와 같은 증식성 질환 또는 장애의 발병 위험성이 있는 환자는 예를 들어 줄기세포 또는 줄기세포로부터 유래된 세포(예를 들어 분화에 의해)가 투여된(예를 들어 암 요법의 부분으로서) 환자이며, 여기에서 상기와 같은 세포는 만능줄기세포이거나, 만능줄기세포를 포함하는 것으로 공지되었거나 또는 하나 이상의 만능줄기세포를 포함할 위험성이 있다.
줄기세포의 증식과 관련된 질환 또는 장애을 앓고 있는 환자는 예를 들어 양성 또는 악성 생식세포 종양(예를 들어 비정상피성 생식세포 종양), 예를 들어 기형종이 있는 환자이다.
본 발명의 일부 실시태양들에 따라, 본 발명에 기술된 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용 가능한 화합물을 하기 화학식 I로 나타낸다:
화학식 I
Figure pct00007
상기 식에서,
R1은 수소이고,
R2는 수소,
2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
-NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
피리디닐카보닐(예를 들어 피리딘-4-일카보닐),
2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
(C1-6)알킬-카보닐(예를 들어 선형 알킬-카보닐, 비-치환된 알킬 카보닐),
N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
나프틸설포닐(예를 들어 2-나프틸설포닐) 및
N-하이드록시-아세트이미도일(-C(=NOH)CH3)로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는
R1은 벤조일이고 R2는 4-클로로벤즈아미도이며;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 할로, NH2, 바이페닐옥시메틸(예를 들어 ([1,1'-바이페닐]-4-일옥시)메틸) 및 (C1-4)알킬(예를 들어 선형 알킬, 비-치환된 알킬)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양들에서, 상기 할로는 클로로이다. 일부 실시태양들에서, 상기 알킬은 메틸이다.
일부 실시태양들에서, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소, 할로, NH2 또는 (C1-4)알킬이 아니다.
일부 실시태양들에서, R1은 수소이고, R2는 상기 본 발명에서 정의된 바와 같다.
일부 실시태양들에서,
R1은 수소이고,
R2는 2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
-NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
피리디닐카보닐,
2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
(C1-6)알킬-카보닐,
N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
나프틸설포닐 및
N-하이드록시-아세트이미도일로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 클로로, NH2 및 메틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일부 실시태양들에서, R1은 벤조일이고 R2는 4-클로로벤즈아미도이고;
R3 및 R4는 독립적으로 수소, 클로로, NH2 및 메틸로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일부 실시태양들에서, R2는 2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노, -NH-R5(본 발명에서 정의된 바와 같음) 및 4-클로로벤즈아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양들에서, R2는 -NH-R5(본 발명에서 정의된 바와 같음) 및 4-클로로벤즈아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양들에서, R2는 2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및 -NH-R5(본 발명에서 정의된 바와 같음)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양들에서, R2는 -NH-R5이다.
본 발명에 기술된 바와 같은 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용될 수 있는 예시적인 화합물은 하기 화학식 II 화합물이다:
화학식 II
Figure pct00008
본 발명에 기술된 바와 같은 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 화합물은 하기 화학식 III 화합물이다:
화학식 III
Figure pct00009
본 발명에 기술된 바와 같은 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 화합물은 하기 화학식 IV 화합물이다:
화학식 IV
Figure pct00010
본 발명에 기술된 바와 같은 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 화합물은 하기 화학식 V 화합물이다:
화학식 V
Figure pct00011
본 발명에 기술된 바와 같은 방법 및 용도 중 어느 하나에 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 화합물은 하기 화학식 VI 화합물이다:
화학식 VI
Figure pct00012
"알킬"이란 용어는 직쇄 및 분지쇄 그룹을 포함하는 지방족 탄화수소를 기술된다. 여기에서, 알킬기 중의 탄소 원자의 수를 나타낸다. 상기 알킬기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 일부 실시태양들에서, 상기 알킬은 달리 명백히 서술되지 않는 한, 비치환된다. 치환된 알킬은 하나 이상의 치환체를 가질 수 있으며, 이때 각각의 치환기는 독립적으로 예를 들어 아민, 할로, 설포네이트, 설폭사이드, 포스포네이트, 하이드록시, 알콕시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 시아노, 아이소시아네이트, 나이트로, 아조, 설폰아미드, 옥소, 카보닐, 카복시, 티오카바메이트, 유레아, 티오유레아, 카바메이트, 에폭사이드, 티이란, 아지리딘, 아미드 및 하이드라진일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "아민"이란 용어는 -NRxRy 기 및 -NRx- 기 모두를 기술하며, 여기에서 Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소, 메틸(CH3) 또는 에틸(CH2cH3)이다.
따라서 상기 아민기는 1차 아민(이때 Rx 및 Ry는 모두 수소임), 2차 아민(이때 Rx는 수소이고 Ry는 알킬임) 또는 3차 아민(이때 Rx 및 Ry는 각각 알킬임)일 수 있다.
"할라이드" 및 "할로"란 용어는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 기술된다.
"설폭사이드"란 용어는 -S(=O)Rx 기를 기술하며, 이때 Rx는 상기 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"설포네이트"란 용어는 -S(=O)2-Rx 기를 기술하며, 이때 Rx는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "설폰아미드"란 용어는 S-설폰아미드 및 N-설폰아미드 모두를 포함한다.
"S-설폰아미드"란 용어는 -S(=O)2-NRxRy 기를 기술하고, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다
"N-설폰아미드"란 용어는 RxS(=O)2-NRy-기를 기술하고, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "카보닐" 또는 "카보네이트"란 용어는 -C(=O)-Rx 기를 기술하며, 이때 Rx는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "옥소"란 용어는 =O 기를 기술된다.
"하이드록시" 및 "하이드록실"이란 용어는 -OH 기를 기술된다.
"알콕시"란 용어는 -O-(C1-2)알킬기를 기술된다.
"티오하이드록시"란 용어는 -SH 기를 기술된다.
"티오알콕시"란 용어는 -S-(C1-2)알킬 기를 기술된다.
"시아노" 및 "나이트릴"이란 용어는 -C≡N 기를 기술된다.
"아이소시아네이트"란 용어는 -N=C=O 기를 기술된다.
"나이트로"란 용어는 -NO2 기를 기술된다.
"아조"란 용어는 -N=NRx 기를 기술하며, 이때 Rx는 상기 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "카복시"란 용어는 C-카복시 및 O-카복시기 모두를 포함한다.
"C-카복시"란 용어는 -C(=O)-ORx 기를 기술하며, 이때 Rx는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"O-카복시"란 용어는 -OC(=O)-Rx 기를 기술하며, 이때 Rx는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"유레아"란 용어는 -NRxC(=O)-NRyRw 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"티오유레아"란 용어는 -NRx-C(=S)-NRyRw 기를 기술하며, 이때 Rx, Ry 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "아미드"란 용어는 C-아미드 및 N-아미드 모두를 포함한다.
"C-아미드"란 용어는 -C(=O)-NRxRy 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"N-아미드"란 용어는 RxC(=O)-NRy- 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 기술된 바와 같이 "카바메이트"란 용어는 N-카바메이트 및 O-카바메이트 모두를 포함한다.
"N-카바메이트"란 용어는 RyOC(=O)-NRx- 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"O-카바메이트"란 용어는 -OC(=O)-NRxRy 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "티오카바메이트"란 용어는 O-티오카바메이트 및 N-티오카바메이트 모두를 포함한다.
"O-티오카바메이트"란 용어는 -OC(=S)-NRxRy 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
"N-티오카바메이트"란 용어는 RyOC(=S)NRx- 기를 기술하며, 이때 Rx 및 Ry는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "에폭사이드"란 용어는
Figure pct00013
기를 기술하며, 이때 Rx, Ry 및 Rw는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "티이란"이란 용어는 에폭사이드의 산소 원자가 황 원자로 치환된, 상기 에폭사이드와 동등한 기를 기술된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "아지리딘"이란 용어는 에폭사이드의 산소 원자가 질소 원자로 치환되고, 상기 질소 원자가 2 개의 인접한 탄소 원자외에, Rq에 결합된, 상기 에폭사이드와 동등한 기를 기술하며, 여기에서 Rq는 Rx와 동일한 정의 따라 정의된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "하이드라진"이란 용어는 -NRx-NRyRw 기를 기술하며, 이때 Rx, Ry 및 Rw는 본 발명에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 기술된 방법 및 용도 중 임의의 것들에서, 미분화세포(예를 들어 PSC, 미분화 암세포)의 세포독성 억제제로서 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물을 그 자체로서 또는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물 내에서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 태양들에 따라서, 하나 이상의 본 발명에 기술된 화합물(예를 들어 세포독성 억제제) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약학 조성물"은 본 발명에서 제공된 화합물과, 다른 화학 성분들, 예를 들어 약학적으로 허용 가능하고 적합한 담체 및 부형제와의 제제를 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에의 화합물의 투여를 촉진하기 위한 것이다.
이후부터, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 유기체에 현저한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물 활성 및 성질을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 담체의 예는, 비 제한적으로, 프로필렌 글리콜, 염수, 유기 용매와 물과의 유화액 및 혼합물뿐만 아니라 고체(예를 들어 분말화된) 및 기상 담체이다.
본 발명에서 "부형제"란 용어는 화합물의 투여를 추가로 촉진하기 위해서 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예는 비제한적으로 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당 및 다양한 유형의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물의 제형화 및 투여 기법은 본 발명에 참고로 인용된 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에서 찾을 수 있다.
따라서 본 발명의 실시태양들에 따라 사용하기 위한 약학 조성물을 부형제 및 보조제(상기 화합물의 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진한음)를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 변한다. 상기 투여량은 사용되는 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량을 환자의 상태에 비추어 의사가 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1]을 참조하시오).
상기 약학 조성물을, 국소 치료를 선택하는지 혹은 전신 치료를 선택하는지에 따라서 및 치료되는 영역에 따라서 변하는 경로들 중 하나 이상으로 투여하기 위해 제형화할 수 있다. 투여를 경구로, 흡입에 의해서 또는 비경구로, 예를 들어 정맥내 점적 또는 복강내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해서 또는 국소로(예를 들어 안과적으로, 질로, 직장으로, 비내로) 수행할 수 있다.
국소 투여용 제형은 비제한적으로 로션, 연고, 젤, 크림, 좌약, 점적제, 액체, 스프레이 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수도 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 사셰, 환제, 당의정, 캡슐 또는 정제를 포함한다. 증점제, 희석제, 풍미제, 분산 보조제, 유화제 또는 결합제가 바람직할 수도 있다.
비경구 투여용 제형은 비제한적으로, 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 또한 함유할 수도 있는 멸균 용액을 포함할 수 있다. 서방출 조성물이 치료에 고려된다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료되는 환자, 질환의 중증도, 투여 방식, 주치의의 판단 등에 따라 변할 것이다.
본 발명의 실시태양들의 조성물을 경우에 따라 팩 또는 분배 장치, 예를 들어 FDA(미국 식품의약품 안전청) 승인된 키트(활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있음) 중에서 제공할 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어 비제한적으로 발포팩 또는 가압 용기(흡입용)를 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여 설명서를 동반할 수도 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 또한 상기 용기가 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태로 상기 용기에 결합된 게시문을 동반할 수 있으며, 상기 게시문은 인간 또는 가축 투여용 조성물 형태의 당국에 의한 승인을 반영한다. 예를 들어 상기와 같은 게시문은 처방 약물에 대한 미국 식품의약품 안전청에 의해 승인된 표지의 것이거나 또는 승인된 제품 삽입물의 것일 수 있다. 적합한 약학 담체 중에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 또한 제조하고, 적합한 용기에 넣고, 본 발명에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명에 기술된 상태(예를 들어 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애)의 치료에 대해서 표지할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시태양에 따라, 본 발명의 약학 조성물을 패키징 물질 중에 패키징하고, 본 발명에 기술된 상태(예를 들어 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애)의 치료에서의 용도에 대해 인쇄물에, 상기 패키징 물질 중에 또는 상기 물질 위에 나타낼 것이다.
본 발명에 제공된 방법, 용도 및 조성물 중 임의의 것의 추가의 실시태양에 따라, 본 발명의 화합물을, 본 발명에 기술된 상태(예를 들어 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애)의 치료에 통상적으로 사용되는 다른 활성 성분과 병용할 수 있다.
본 발명의 실시태양들의 또 다른 태양에 따라, 미분화세포(본 발명에 기술된 바와 같은 만능줄기세포 및/또는 미분화 암세포)의 억제에 사용하기 위해 식별되는 본 발명에 기술된 화합물을 제공한다.
본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 SCD(스테아로일-CoA 불포화효소)의 억제가 만능줄기세포의 선택적인 세포독성 억제를 생성시킴을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 세포독성 억제제로서 SCD 억제제의 용도를 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포의 억제를 위한 약제의 제조에서 SCD 억제제의 용도를 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 미분화세포를 SCD 억제제와 접촉시킴으로써 수행되는, 미분화세포의 억제 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 치료학적 유효량의 SCD 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양들에서, 상기와 같은 조성물을 본 발명에 기술된 바와 같이(예를 들어 본 발명에 기술된 화합물들에 대해서 본 발명에 기술된 바와 같이) 제형화하고, 사용을 위해 식별하고/하거나 패키징한다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD 억제제(본 발명의 태양들 중 임의의 것에 기술된 바와 같은)는 SCD1 억제제이다.
예시적인 SCD1 억제제는 A939572(4-(2-클로로페녹시)-N-(3-(메틸카바모일)-페닐)피페리딘-1-카복스아미드), CAY-10566(3-[4-(2-클로로-5-플루오로페녹시)-1-피페리디닐]-6-(5-메틸-1,3,4-옥사다이아졸-2-일)-피리다진), MF-438(2-메틸-5-[6-[4-[2-(트라이플루오로메틸)페녹시]피페리딘-1-일]피리다진-3-일]-1,3,4-티아다이아졸), CVT-11127(N-(2-(6-(3,4-다이클로로벤질아미노)-2-(4-메톡시페닐)-3-옥소피리도[2,3-b]피라진-4(3H)-일)에틸)아세트아미드), TOFA(5-(테트라데실옥시)-2-퓨로산) 및 GSK-993(N-(1-(5-클로로-2-아이소부톡시벤질)-5-메틸-1H-피라졸-3-일)-1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-6-카복스아미드(예를 들어 문헌[Issandou et al., Eur J Pharmacol. 618:28-36 (2009)] 및 문헌[Mason et al., PloS One 7:e33823 (2012)]에 기술된 바와 같음)를 포함한다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 MF-438, CAY-10566, A939572, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, CAY-10566, A939572, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, MF-438, A939572, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, MF-438, CAY-10566, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, MF-438, CAY-10566, A939572 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, A939572, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, A939572, MF-438 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, A939572, MF-438 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, MF-438, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, MF-438, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, MF-438 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, MF-438 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, MF-438 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566, MF-438 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, CAY-10566 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, MF-438 및/또는 CAY-10566이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572, CAY-10566 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, A939572 및/또는 CAY-10566이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, A939572 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, A939572 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, A939572 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, CAY-10566 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, CAY-10566 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, CAY-10566 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, MF-438 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, MF-438 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA, CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572 및/또는 CAY-10566이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 A939572 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CAY-10566 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 MF-438 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 MF-438 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 CVT-11127 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 CAY-10566이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 CVT-11127이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 GSK-993이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 MF-438이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD1 억제제는 TOFA 및/또는 A939572이다.
일부 실시태양에서, 상기 SCD 억제제는 SCD1에 대한 핵산 침묵화 서열(예를 들어 SCD1)이다. SCD1에 대한 siRNA는 예시적인 핵산 침묵화 서열이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산 침묵화 서열"이란 용어는 표적 유전자(예를 들어 SCD1)의 발현을 특이적으로 억제하거나 "침묵화"시킬 수 있는 서열을 포함하는 핵산(예를 들어 RNA)을 지칭한다. 몇몇 실시태양들에서, 상기 핵산 침묵화 서열은 전사-후 침묵화 기전을 통해 mRNA 분자의 완전한 가공(예를 들어 완전한 번역 및/또는 발현)을 방지할 수 있다. 핵산 침묵화 서열은 비암호화 RNA 분자, 예를 들어 짝을 이룬 가닥을 포함하는 RNA 듀플렉스뿐만 아니라 상기와 같은 작은 비암호화 RNA가 생성될 수 있는 전구체 RNA를 포함한다. 예시적인 RNA 침묵화 서열은 이중가닥 RNA(dsRNA), 예를 들어 siRNA, miRNA 및 shRNA를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 핵산 침묵화 서열은 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 침묵화 서열은 번역 억제를 매개할 수 있다.
본 발명의 실시태양에 따라, 상기 핵산 침묵화 서열은 표적 RNA(예를 들어 SCD1)에 대해 특이적이며 상기 표적 유전자와 99% 이하의 전체적인 상동성, 예를 들어 상기 표적 유전자에 대해 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% 미만의 전체적인 상동성을 나타내는 유전자 또는 연접 변체를 교차 억제하거나 침묵화하지 않는다.
RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 매개되는, 동물에서 서열-특이적인 전사-후 유전자 침묵화의 과정을 지칭한다.
세포 중 긴 dsRNA의 존재는 다이서라 칭하는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 자극한다. 다이서는 상기 dsRNA의, 짧은 간섭 RNA(siRNA)로서 공지된 dsRNA의 짧은 조각들로의 가공에 관련된다. 다이서 활성으로부터 유도된 짧은 간섭 RNA는 전형적으로 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오타이드이며 약 19 염기쌍 듀플렉스를 포함한다. 상기 RNAi 응답은 또한, 상기 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보성인 서열을 갖는 단일가닥 RNA의 절단을 매개하는, RNA-유도된 침묵화 복합체(RISC)로서 통상적으로 지칭되는 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 한다. 상기 표적 RNA의 절단은 상기 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보성인 영역의 가운데에서 발생한다.
따라서, 본 발명의 일부 실시태양들은 mRNA로부터 단백질 발현을 하향조절하는 dsRNA의 용도를 고려한다.
하나의 실시태양에 따라, 상기 dsRNA는 30 bp를 초과한다. 상기 긴 dsRNA(즉 30 bp 초과의 dsRNA)의 사용은 이중 가닥 RNA의 상기 보다 긴 영역이 인터페론의 유도 및 PKR 응답을 생성시킬 것이라는 믿음으로 인해 매우 제한되었다. 그러나, 긴 dsRNA의 사용은 상기 세포가 최적의 침묵화 서열을 선택하여 다수의 siRNA를 시험해야 할 필요성을 경감시킬 수 있고; 긴 dsRNA는 siRNA에 대해서 필요한 경우보다 덜 복잡한 침묵화 라이브러리를 허용할 것이며; 아마도 가장 중요하게는, 긴 dsRNA는 치료제로서 사용될 때 바이러스 탈출 돌연변이를 방지할 수 있다는 점에서 다수의 이점들을 제공할 수 있다.
다양한 연구들은 긴 dsRNA를 사용하여, 스트레스 반응을 유도하거나 현저한 표적 이탈 효과를 유발하지 않으면서 유전자 발현을 침묵화시킬 수 있음을 입증한다(Strat et al., Nucleic Acids Research, 34:3803-3810 (2006); Bhargava et al., Brain Res. Protoc. 13:115-125 (2004); Diallo et al., Oligonucleotides 13:381-392 (2003); Paddison et al., PNAS 99:1443-1448 (2002); Tran et al., FEBS Lett. 573:127-134 (2004)).
특히, 본 발명은 일부 실시태양들에 따라, 인터페론 경로가 활성화되지 않는 세포(예를 들어 배아세포 및 난모세포)에서 유전자 침묵화를 위해 긴 dsRNA(30 이상의 염기 전사물)의 도입을 고려한다(예를 들어 문헌[Billy et al. [PNAS 98:14428-14433 (2001)] 및 문헌[Diallo et al. [Oligonucleotides 13:381-392 (2003)]을 참조하시오).
본 발명은 일부 실시태양들에 따라, 유전자 발현을 하향조절하는 인터페론 및 PKR 경로를 유도하지 않도록 특이적으로 설계된 긴 dsRNA의 도입을 또한 고려한다. 예를 들어 시나그와와 이시이(Shinagwa and Ishii, Genes & Dev. 17:1340-1345 (2003))는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 프로모터로부터 긴 이중가닥 RNA를 발현하는 벡터(pDECAP라 명명함)를 개발하였다. pDECAP으로부터의 전사물은 세포질로의 ds-RNA 송출을 용이하게 하는 5'-캡 구조 및 3'-폴리(A) 꼬리가 모두 없기 때문에, pDECAP으로부터의 긴 ds-RNA는 인터페론 반응을 유도하지 않는다.
포유동물계에서 인터페론 및 PKR 경로를 회피하는 또 다른 방법은 형질감염 또는 내인성 발현을 통한 작은 억제성 RNA(siRNA)의 도입에 의해서이다.
"siRNA"란 용어는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제성 RNA 듀플렉스(일반적으로 18 내지 30 염기쌍)를 지칭한다. 전형적으로, siRNA는 중심의 19 bp 듀플렉스 영역 및 말단상에 대칭적인 2-염기 3'-돌출부를 갖는 21머로서 화학적으로 합성되지만, 최근에 25 내지 30 염기 길이의 화학 합성된 RNA 듀플렉스가 동일한 위치에서 21머에 비해 100 배 정도로 많은 효능 증가를 가질 수 있음이 기술되었다. RNAi 촉발에 있어서 보다 긴 RNA를 사용하여 획득된 상기 관찰된 증가된 효능은 다이서에 생성물(21머) 대신에 기질(27머)을 제공함으로부터 생성되며 이는 상기 siRNA 듀플렉스의 RISC내로의 진입 속도 또는 효율을 개선시키는 것으로 이론화된다.
상기 3'-돌출부의 위치는 siRNA의 효능에 영향을 미치며 안티센스 가닥상에 3'-돌출부를 갖는 비대칭 듀클렉스는 센스 가닥상에 3'-돌출부를 갖는 경우보다 일반적으로 더 효능이 있는 것으로 밝혀졌다(Rose et al., 2005). 이는 상기 안티센스 전사물의 표적화시 정반대의 효능 패턴이 관찰되는 바와 같이, RISC로의 비대칭 가닥의 로딩에 기인할 수 있다.
이중가닥 간섭 RNA(예를 들어 siRNA)의 가닥들은 연결되어 헤어핀 또는 줄기-고리 구조(예를 들어 shRNA)를 형성할 수 있다. 따라서, 언급한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시태양들의 핵산 침묵화 서열은 또한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "shRNA"란 용어는 상보성 서열의 제1 및 제2 영역을 포함하는 줄기-고리 구조를 갖는 RNA 작용제를 지칭하며, 상기 영역들의 상보성 및 배향 정도는 상기 영역들간에 염기 짝짓기가 발생하기에 충분하고, 상기 제1 및 제2 영역은 고리 영역에 의해 결합되며, 상기 고리는 상기 고리 영역내 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체) 간의 염기 짝짓기의 결여로부터 발생한다. 상기 고리 중 뉴클레오타이드의 수는 3 내지 23 또는 5 내지 15 또는 7 내지 13 또는 4 내지 9 또는 9 내지 11 및 이들 사이의 수이다. 상기 고리 중 뉴클레오타이드의 일부는 상기 고리 중 다른 뉴클레오타이드와의 염기-쌍 상호작용에 관련될 수 있다. 상기 고리의 형성에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp et al., Science 296:550 (2002)) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto et al. RNA 8:1454 (2002))을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 상기 생성되는 단쇄 올리고뉴클레오타이드가 상기 RNAi 기구와 상호작용할 수 있는 이중가닥 영역을 포함하는 줄기-고리 또는 헤어핀 구조를 형성함을 인지할 것이다.
본 발명의 일부 실시태양들에 사용하기에 적합한 핵산 침묵화 서열의 합성을 하기와 같이 수행할 수 있다. 먼저, 표적 mRNA 서열을 AA 다이뉴클레오타이드 서열에 대한 AUG 기술 코돈의 하류에서 스캐닝한다. 각각의 AA 및 3' 인접한 19 뉴클레오타이드의 발생을 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 기록한다. 바람직하게는, siRNA 표적 부위를, 번역되지 않은 영역(UTR)이 조절성 단백질 결합 부위에 풍부하기 때문에, 개방 판독 프레임으로부터 선택한다. UTR-결합 단백질 및/또는 번역 기술 복합체는 상기 siRNA 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 수 있다(Tuschl, ChemBiochem. 2:239-245 (2001)). 번역되지 않은 영역을 겨냥하는 siRNA가, 5' UTR을 겨냥하는 siRNA가 세포 GAPDH mRNA의 약 90% 감소를 매개하고 단백질 수준을 완전히 없애는 GAPDH에 대해 입증된 바와 같이, 또한 유효할 수 있음을 알 것이다.
둘 째로, 잠재적인 표적 부위를 임의의 서열 정렬 소프트웨어, 예를 들어 NCBI 서버로부터 입수할 수 있는 BLAST 소프트웨어를 사용하여 적합한 게놈 데이터베이스(예를 들어 인간, 마우스, 래트 등)와 비교한다. 다른 암호화 서열에 대해 상당한 상동성을 나타내는 추정적인 표적 부위를 걸러낸다.
한정적인 표적 서열을 siRNA 합성을 위한 주형으로서 선택한다. 바람직한 서열은 낮은 G/C 함량을 갖는 것들인데, 이들은 55% 초과의 G/C 함량을 갖는 것들에 비해 유전자 침묵화의 매개에 있어서 보다 유효한 것으로 입증되었기 때문이다. 다수의 표적 부위들을 바람직하게는 평가하기 위한 표적 유전자의 길이에 따라 선택한다. 상기 선택된 siRNA의 보다 양호한 평가를 위해서, 바람직하게는 음성 대조군을 함께 사용한다. 음성 대조군 siRNA는 바람직하게는 상기 siRNA와 동일한 뉴클레오타이드 조성을 포함하지만, 상기 게놈과 현저한 상동성은 없다. 따라서, 바람직하게는 상기 siRNA의 스크램블드 뉴클레오타이드 서열을 사용하나, 단 상기 서열은 임의의 다른 유전자에 대해 어떠한 현저한 상동성도 나타내지 않아야 한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 핵산 침묵화 서열을 단지 RNA만을 함유하는 분자들로 제한할 필요는 없으나, 상기 서열이 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드를 추가로 포함함을 알 것이다.
일부 실시태양들에서, 본 발명에 제공된 핵산 침묵화 서열을 세포-투과성 펩타이드와 작용상 결합시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "세포-투과성 펩타이드"는 세포의 혈장 및/또는 핵막을 가로질러 막-침투성 복합체의 수송과 관련된 에너지-의존적인(즉 비-세포 이물흡수성) 전좌 성질을 부여하는 짧은(약 12 내지 30 잔기) 아미노산 서열 또는 작용성 동기를 포함하는 펩타이드이다. 본 발명의 일부 실시태양들의 막-침투성 복합체에 사용되는 세포-투과성 펩타이드는 바람직하게는 하나 이상의 비-작용성 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 잔기는 자유롭거나 유도체화되어, 결합을 위해 변형된 이중가닥 리보핵산과 다이설파이드 결합을 형성한다. 상기와 같은 성질을 부여하는 전형적인 아미노산 동기는 미국특허 제 6,348,185 호에 나열되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본 발명에 명백히 참고로 인용된다. 본 발명의 일부 실시태양들의 세포-투과성 펩타이드는 바람직하게는 비제한적으로 페너트라틴, 트랜스포탄, pIsl, TAT(48-60), pVEC, MTS 및 MAP를 포함한다.
일부 실시태양들에 따라, 상기 핵산 침묵화 서열은 miRNA이다.
"미세RNA", "miRNA" 및 "miR"이란 용어들은 유의어이며 길이가 약 19 내지 28 뉴클레오타이드인 비암호화 단일가닥 RNA 분자의 콜렉션을 지칭하고, 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 광범위한 유기체 중에서 발견되며 발생, 항상성 및 질환 병인학에서 한 역할을 하는 것으로 나타났다.
일부 실시태양들에 따라 상기 핵산 침묵화 서열은 미세RNA 모방물질이다.
"미세RNA 모방물질"이란 용어는 상기 RNAi 경로에 진입할 수 있고 유전자 발현을 조절할 수 있는 합성 비-암호화 RNA를 지칭한다. miRNA 모방물질은 내인성 미세RNA(miRNA)의 작용을 모방하고 성숙한 이중가닥 분자 또는 모방 전구체(예를 들어 또는 프리-miRNA)로서 설계될 수 있다. miRNA 모방물질은 변형되거나 변형되지 않은 RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드 또는 또 다른 핵산 화학(예를 들어 LNA 또는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산(ENA))을 포함할 수 있다. 성숙한 이중가닥 miRNA 모방물질의 경우, 상기 듀플렉스 영역의 길이는 13 내지 33, 18 내지 24 또는 21 내지 23 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 상기 miRNA는 또한 총 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 뉴클레오타이드 이상을 포함할 수 있다. 상기 miRNA의 서열은 프리-miRNA의 처음 13 내지 33 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 miRNA의 서열은 또한 상기 프리-miRNA의 마지막 13 내지 33 뉴클레오타이드일 수 있다. miRNA 모방물질의 제조를 화학적 합성 방법에 의해서 또는 재조합 방법에 의해서 수행할 수 있다.
일부 실시태양들에서, 상기 SCD1 억제제는 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물(예를 들어 본 발명에 기술된 PluriSIn 화합물)이다. PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드) 및 #6(2-하이드록시-2-(티오펜-2-일)-2-페닐아세트산 4-메틸-N'-페닐하이드라지드)이 예시적인 SCD 억제제들이다.
일부 실시태양들에서, 상기 SCD 억제제는 화학식 II의 화합물(본 발명에 기술된 바와 같은) 및/또는 화학식 I의 화합물(본 발명에 기술된 바와 같은)이며, 여기에서 화학식 I의 R2는 2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노, -NH-R5(본 발명에 정의된 바와 같음) 및 4-클로로벤즈아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 상기와 같은 화합물들은 본 발명의 실시예 섹션에 예시된 바와 같이, SCD 억제와 관련된 구조인 페닐하이드라진 부분을 포함한다.
이들 실시태양들 중 일부에서, R2는 -NH-R5(본 발명에 정의된 바와 같음) 및 4-클로로벤즈아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이들 실시태양들 중 일부에서, R2는 2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및 -NH-R5(본 발명에 정의된 바와 같음)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이들 실시태양들 중 일부에서, R2는 -NH-R5이다.
본 발명의 실시태양들에 따라 사용하기에 적합한 추가적인 SCD 억제제는 예를 들어, 문헌[Behrouzian and Buist, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 68:107-112 (2003)]에 기술된 바와 같은 티아-지방산 기질 유사체(예를 들어 9-티아스테아르산); 문헌[Raju and Reiser, J Biol Chem 242:379-384 (1967)]에 기술된 바와 같은 사이클로프로페노이드 지방산(예를 들어 스테르큘산(8-(2-옥틸사이클로프로페닐)옥탄산) 및 말발산(7-(2-옥틸사이클로프로페닐)헵탄산); 문헌[Park et al., Biochim Biophys Acta 1486:285-292 (2000)]에 기술된 바와 같은 접합된 장쇄 지방산 이성질체; 문헌[Liu et al., J Med Chem 50:3086-3100 (2007)], 문헌[Zhao et al., Bioorg Med Chem Lett 17:3388-3391 (2007)] 및 문헌[Xin et al., Bioorg Med Chem Lett 18:4298-4302 (2008)]에 기술된 바와 같은 소분자 SCD1 억제제; 및 하기의 공개 번호들을 가진 국제 특허 출원들: WO 2005/011653, WO 2005/011654, WO 2005/011655, WO 2005/011656, WO 2005/011657, WO 2006/014168, WO 2006/034279, WO 2006/034312, WO 2006/034315, WO 2006/034338, WO 2006/034341, WO 2006/034440, WO 2006/034441, WO 2006/034446, WO 2006/086445, WO 2006/086447, WO 2006/101521, WO 2006/125178, WO 2006/125179, WO 2006/125180, WO 2006/125181, WO 2006/125194, WO 2007/044085, WO 2007/046867, WO 2007/046868, WO 2007/050124, WO 2007/130075, WO 2007/136746, WO 2008/074835, WO 2008/074835, WO 2008/074824, WO 2008/036715, WO 2008/044767, WO 2008/029266, WO 2008/062276, WO 2008/127349, WO 2006/130986, WO 2007/009236, WO 2007/056846, WO 2007/071023, WO 2007/134457, WO 2007/143823, WO 2007/143824, WO 2008/017161, WO 2008/046226, WO 2008/064474, WO 2008/003753, WO 2007/143697, WO 2008/024390, WO 2008/096746 및 WO 2008/056687 및 미국특허출원 제 2008/0182838 호 및 문헌[Liu, Expert Opinion on Therapeutic Patents 19:1169-1191 (2009)]에 기술된 바와 같은 SCD 억제제들을 포함한다. 일부의 실시태양들에서, SCD 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 문헌[Morgan-Lappe et al., Cancer Research 67:4390-4398 (2007)]에 기술된 바와 같은, SCD-1의 RNA 간섭을 수행하기에 적합한 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 인용된 서류들 모두의 교시는 본 발명에 충분히 설명되는 바와 같이 참고로 인용된다.
본 출원으로부터 발달하는 특허의 수명 동안 많은 관련된 SCD 억제제(예를 들어 SCD1 억제제)들이 개발될 것으로 기대되며, "SCD 억제제"란 용어의 범위는 선험적인 모든 상기와 같은 새로운 기술들을 포함하고자 한다.
일부 실시태양들에서, 상기 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)와 상기 SC 억제제의 접촉을 시험관내에서(예를 들어 본 발명에 기술된 화합물에 관하여 본 발명에 기술된 바와 같이) 수행한다.
일부 실시태양들에서, 접촉을 생체외에서(예를 들어 본 발명에 기술된 화합물에 관하여 본 발명에 기술된 바와 같이) 수행한다.
일부 실시태양들에서, 상기 SCD 억제제(본 발명의 태양들 중 임의의 것에 기술된 바와 같이)는 본 발명에 기술된 화합물이다. 일부 실시태양들에서, 상기 화합물은 치환되거나 또는 비치환된 페닐하이드라진 부분을 포함하고/포함하거나, 치환되거나 또는 비치환된 페닐하이드라진의 유도체이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, SCD 억제에 대한 민감성을 특징으로 하는 증식성 세포와 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료에 있어서 본 발명에 기술된 화합물(예를 들어 본 발명에 기술된 SCD 억제제)의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, SCD 억제에 대한 민감성을 특징으로 하는 증식성 세포와 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 기술된 화합물(예를 들어 본 발명에 기술된 SCD 억제제)의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, SCD 억제에 대한 민감성을 특징으로 하는 증식성 세포와 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법을, 미분화세포를 본 발명에 기술된 화합물(예를 들어 본 발명에 기술된 SCD 억제제)과 접촉시킴으로써 수행한다. 일부 실시태양들에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포이다.
본 발명의 일부 실시태양들의 태양에 따라, 치료학적 유효량의 본 발명에 기술된 화합물(예를 들어 본 발명에 기술된 SCD 억제제) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양들에서, 상기와 같은 조성물을 본 발명에 기술된 바와 같이 제형화하고, 사용을 위해 식별하고/하거나 패키징한다.
일부 실시태양들에서, SCD 억제에 대한 민감성을 특징으로 하는 증식성 세포와 관련된 증식성 질환 또는 장애은 암이다.
본 발명에 추가로 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 예를 들어 미분화세포의 유용한 억제제의 연구에서 선두 후보로서 사용될 수 있는, 미분화세포의 억제를 위한 화합물을 식별하기 위한 신규의 효율적인 기법을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명의 실시태양들의 또 다른 태양에 따라, 미분화세포의 억제를 위한 선두 후보의 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 다수의 미분화세포 샘플들을 제공하고, 이때 상기 샘플들은 각각 상이한 유형의 미분화세포를 포함하며;
(b) 상기 샘플을 후보 화합물과 접촉시키고;
(c) 상기 샘플 중 미분화세포의 생육력을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 샘플 중 적어도 2 개에서 감소되는 경우, 상기 후보 화합물을 미분화세포를 억제할 수 있는 것으로서 식별하고, 이에 의해 상기 선두 후보를 식별함을 포함한다.
예시적인 실시태양에서, 상기 미분화세포는 만능줄기세포이며, 상기 방법은 만능줄기세포의 억제를 위한 선두 후보를 식별하기 위한 것이다.
일부 실시태양들에서, 상기 다수의 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)의 샘플들은 3 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)는 4 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)는 적어도 5 개의 샘플을 포함한다.
일부 실시태양들에서, 생육력이 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)의 샘플 중 3 개 이상에서 감소한다. 일부 실시태양들에서, 생육력이 상기 샘플 중 4 개 이상에서 감소한다. 일부 실시태양들에서, 생육력이 상기 샘플 중 적어도 5 개에서 감소한다.
일부 실시태양들에서, 생육력이 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)의 상기 모든 샘플에서 또는 하나의 샘플을 제외한 모든 샘플에서 감소한다. 일부 실시태양들에서, 생육력이 상기 모든 샘플에서 감소한다.
일부 실시태양들에서, 상기 방법은 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)를 선택적으로 억제하기 위한 선두 후보를 식별하기 위한 것이며, 상기 방법은
(d) 하나 이상의 분화세포의 샘플을 제공하고;
(e) 상기 적어도 하나의 샘플을, 미분화세포 집단(예를 들어 만능줄기세포 집단)을 감소시킬 수 있는 것으로서 식별된 화합물과 접촉시키고;
(f) 상기 적어도 하나의 샘플 중의 상기 분화세포의 생육력을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 적어도 하나의 샘플에서 유지되는 경우, 상기 화합물을 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포)를 선택적으로 억제할 수 있는 것으로서 식별함을 추가로 포함한다.
일부 실시태양들에서, 상기 화합물을 다수의 분화세포 샘플과 접촉시킨다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 3 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 4 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 적어도 5 개의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 6 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 7 개 이상의 샘플을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 다수의 분화세포 샘플은 8 개 이상의 샘플을 포함한다.
일부 실시태양들에서, 생육력이 하나의 샘플을 제외하고, 상기 분화세포 샘플들 중 어느 것에서도 감소되지 않는다. 일부 실시태양들에서, 생육력이 상기 샘플들 중 어느 것에서도 감소되지 않는다.
적합한 미분화세포(예를 들어 만능줄기세포, 미분화 암세포) 및 분화세포는 하기 실시예에 기술된다.
일부 실시태양들에서, 상기 분화세포는 미분화세포로부터(예를 들어 만능줄기세포 및/또는 미분화 암세포의 분화에 의해서) 유래되거나 또는 이와 역으로 유래된다(예를 들어 분화된 세포의 다능성 및/또는 악성의 유도에 의해서).
일부 실시태양들에서, 다수의 후보 화합물들을 본 발명에 기술된 바와 같이 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 5 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 10 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 20 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 50 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 100 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 200 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 500 개 이상의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 1000 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 2000 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 5000 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 10000 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 20000 개의 후보 화합물을 시험한다. 일부 실시태양들에서, 적어도 50000 개의 후보 화합물을 시험한다.
생육력의 모니터링을 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 본 발명에 기술된 분석에 따라 수행할 수 있다.
일부 실시태양들에서, 생육력을 세포 생육력의 분광분석을 사용하여 모니터한다. 분광분석은 다수의 샘플들(예를 들어 상이한 세포 유형 및/또는 상이한 후보 화합물)을 효율적이고 비용이 들지 않는 방식으로 분석하는 능력을 제공할 수 있다.
"포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는", "갖는"이란 용어 및 이들의 활용어들은 "비제한적으로 포함하는"을 의미한다.
"로 이루어지는"이란 용어는 "포함하고 제한됨"을 의미한다.
"예시적인"이란 단어는 본 발명에서 "일례, 경우 또는 예시로서 제공됨"을 의미한다. "예시적인"으로서 기술되는 임의의 실시태양이 반드시, 다른 실시태양들보다 바람직하거나 유리한 것으로 해석되고/되거나 다른 실시태양들로부터의 특징들의 통합을 배제한다는 것은 아니다.
"임의로"란 단어는 본 발명에서 "일부 실시태양들에서는 제공되고 다른 실시태양들에서는 제공되지 않음"을 의미하는데 사용된다. 본 발명의 임의의 특정한 실시태양은 상기와 같은 특징들이 상충되지 않는한, 다수의 "임의의" 특징들을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "하나" (a, an) 및 "상기" (the)란 단수 형태들은 문맥상 분명히 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "화합물" 또는 "하나 이상의 화합물"이란 용어는 이들 화합물의 혼합물을 포함하여 다수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전체를 통해서, 본 발명의 다양한 실시태양들을 범위의 형식으로 나타낼 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편리함과 간략성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석해서는 안 됨은 물론이다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위들뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치들을 구체적으로 기술하는 것으로서 간주해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 숫자들, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 기술하는 것으로서 간주해야 한다. 이를 상기 범위의 폭과 상관없이 적용한다.
숫자 범위를 본 발명에 나타내는 경우, 상기 나타낸 범위내의 임의의 인용된 숫자(분수 또는 정수)를 포함하고자 한다. 첫 번째 지시 숫자와 두 번째 지시 숫자 "사이의 범위" 및 첫 번째 지시 숫자"에서부터" 두 번째 지시 숫자"까지의 범위"란 어구들은 본 발명에서 호환적으로 사용되며 상기 첫 번째와 두 번째 지시된 숫자 및 이들 사이의 분수 및 정수 모두를 포함하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "방법"이란 용어는 주어진 임무를 수행하기 위한 방식, 수단, 기법 및 과정, 예를 들어 비제한적으로 공지된 방식, 수단, 기법 및 과정으로부터 화학적, 약물학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 분야의 실행자들에게 공지되거나 또는 이들에 의해 쉽게 전개되는 상기 방식, 수단, 기법 및 과정을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 상태의 진행을 없애거나, 실질적으로 억제하거나, 늦추거나 또는 역전시키거나, 상태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선시키거나 또는 상태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 방지함을 포함한다.
명확성을 위해서, 별도의 실시태양들과 관련하여 기술되는 본 발명의 몇몇 특징들을 또한 단일 실시태양과 함께 제공할 수도 있는 것으로 이해한다. 환언하면, 간략성을 위해서 단일의 실시태양과 관련하여 기술되는 본 발명의 다양한 특징들을 또한 별도로 또는 임의의 적합한 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기술된 실시태양에서 적합한 대로 제공할 수 있다. 다양한 실시태양들과 관련하여 기술된 몇몇 특징들은 상기 실시태양이 상기 실시태양들의 요소들 없이는 효력이 없지 않는 한, 상기 실시태양의 필수적인 특징들로 간주되지 않는다.
본 발명에서 상기에 기술되고 하기 특허청구범위 섹션에 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시태양들 및 태양들은 하기의 실시예들에서 실험적인 지지를 발견한다.
실시예
이제 하기의 실시예들을 참조하며, 이들 실시예는 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 실시태양들을 비제한적인 방식으로 예시한다.
물질 및 방법
물질:
A939572는 바이오파인 인터내셔널(BioFine International)(캐나다 뱅쿠버 소재)로부터 수득하고;
액티빈 A는 R&D 시스템스로부터 수득하고;
암사크린 하이드로클로라이드는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수득하고;
소 혈청 알부민은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
CAY10566은 캐이만 케미칼(Cayman Chemical)로부터 수득하고;
2',7'-다이클로로플루오레세인은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
클로로포름은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
다이티오쓰레이톨(DTT)은 바이오랩(Bio-Lab)(이스라엘 소재)으로부터 수득하고;
DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지)은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
DMEM/F12(1:1) 배지는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
DMSO(다이메틸 설폭사이드)는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
소 태아 혈청은 바이오로지컬 인더스트리즈(Biological Industries)(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
FGF-2(섬유아세포 성장 인자 2)는 페프로테크(PeproTech)로부터 수득하고;
폴치(Folch) 용액은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
G418 제네티신 설페이트는 GIBCO로부터 수득하고;
글루타민은 바이오로지컬 인더스트리즈(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
글루타르알데하이드는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
hCG(인간 융모막 고나도트로핀)은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
아이소프로판올은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
녹아웃 DMEM 배지는 인비트로젠으로부터 수득하고;
녹아웃 혈청 교체물은 인비트로젠으로부터 수득하고;
백혈병 억제 인자(LIF)는 인비트로젠으로부터 수득하고;
β-머캅토에탄올은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
M2 배지는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
M16은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
매트리젤(상표) 매트릭스는 BD 바이오사이언시즈로부터 수득하고;
메탄올은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
메티오닌은 바이오로지컬 인더스트리즈(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
메틸렌 블루는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
미네랄 오일은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
mTeSR1 한정 배지는 스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies)(캐나다 뱅쿠버 소재)로부터 수득하고;
n-헥산은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
불필수 아미노산은 인비트로젠으로부터 수득하고;
올레산([1-14C]-표지 및 비표지된 및 올레산-알부민)은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
페니실린은 바이오로지컬 인더스트리즈(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
PMSG(임신한 암말의 혈청 고나도트로핀)는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
퓨로마이신은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
레티노산은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
RPMI-1640은 인비트로젠으로부터 수득하고;
S35-표지된 메티오닌은 아이조탑(Izotop)(헝가리 소재)으로부터 수득하고;
탈지유(분말)는 디프코(Difco)로부터 수득하고;
나트륨 부티레이트는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
나트륨 피루베이트는 시그마 알드리치로부터 수득하고;
스테아르산([1-14C]-표지 및 비표지된)은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
스트렙토마이신은 바이오로지컬 인더스트리즈(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
트라이클로로아세트산은 머크 밀리포어(Merck Millipore)로부터 수득하고;
트리톤 X-100은 시그마 알드리치로부터 수득하고;
트립신-EDTA는 바이오로지컬 인더스트리즈(이스라엘 베이트 하에멕 소재)로부터 수득하고;
Z-VAD-FMK는 산츠 크루즈 바이오테크놀로지(Santz Cruz Biotechnology)로부터 수득하였다.
세포주:
BJ 섬유아세포(불멸화된)는 클론테크 레보라토리즈(Clontech Laboratories)로부터 수득하고;
BJ-iPS28 유도만능줄기세포는 문헌[Pick et al., Stem Cells 27:2686-2690 (2009)]]에 기술된 바와 같이 유도되고;
CSES2 인간배아줄기세포는 문헌[Lavon et al., Stem Cells 26:1874-1882 (2008)]에 기술된 바와 같이 유도되고;
CSES2-SO2/3 배아줄기세포는 문헌[Kopper & Benvenisty, Stem Cell Research 8:335-345 (2011)]에 기술된 바와 같이 유도되고;
인간 배아줄기세포-유래된 간세포는 셀라티스(Cellartis)(스웨덴 고테보르크 소재)로부터 수득되고, 제조사의 설명에 따라 취급되며;
인간유도만능줄기세포-유래된 심근세포는 셀룰라 다이나믹스 인터내셔널(Cellular Dynamics International)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 수득되고, 제조사의 설명에 따라 취급되며;
Mel-1 인간배아줄기세포는 밀리포어로부터 수득되었다.
세포 배양물:
인간배아줄기(ES) 세포주 H9(Thomson et al. Science 282:1145-1147 (1998)), CSES2, CSES2-SO2/3 및 Mel-1 및 유도만능줄기(iPS) 세포주 BJ-iPS28을, 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 mTeSR1 한정 배지를 사용하여, 매트리젤(상표)로 미리-코팅된 셀스타(CELLSTAR)(등록상표) 10 ㎝ 조직 배양 디쉬(그레이너 바이오원(Greiner Bio-One)) 중에서 배양보조 세포 없이 배양하였다. 세포를 애큐타제(Accutase)(상표)(밀리포어)를 사용하여 계대배양하였다.
신경모세포종 세포주 켈리를 15% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
간암종 세포주 Huh-7을 10% FBS, 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 DMEM/F12(1:1) 배지에서 배양하였다.
경부암종 세포주 HeLa, 기형암종 세포주 NTERA-2 및 불멸화된 BJ 섬유아세포 세포주를 10% FBS, 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 DMEM에서 배양하였다.
CSES2-SO2/3 배아줄기세포를 확립된 프로토콜(Duan et al. Stem Cells 28:674-686 (2010))을 사용하여 내배엽 선조세포로 분화시켰다. 미분화세포를 mTeSR1 배지가 있는, 매트리젤(상표)-코팅된 플레이트상에서 10,000 세포/㎠의 밀도로 시딩하였다. 다음날(1일), 배지를 2 mM 글루타민, 100 ng/㎖ 액티빈 A 60 ㎍/㎖의 G418 제네티신 설페이트 및 0.3 ㎍/㎖의 퓨로마이신이 보충된 무혈청 RPMI-1640으로 대체하였다. 3 내지 8일째에, 동일한 배지를 또한 1xB27 보충물(인비트로젠) 및 0.5 mM 나트륨 부티레이트로 보충하였다. 내배엽 선조세포로서 상기 세포의 세포 밀도를, 구아바(Guava)(등록상표) 이지사이트(EasyCyte)(상표) 플러스 유식세포측정 시스템(밀리포어)을 사용하여, 녹색 SOX17+ 세포의 백분율 및 CXCR4+ 세포의 백분율을 정량분석함으로써 확인하였다. 초기 내배엽 표면 마커 CXCR4에 대한 항체(CXCR4-PE 항체, 1:25; BD 바이오사이언시즈)로 상기 세포를 형광염색하여 추가로 확인하였다. 상기 CXCR4+ 세포의 백분율을 또한 구아바(등록상표) 이지사이트(상표) 플러스 유식세포측정 시스템을 사용하여 정량분석하였다.
인간 ES 세포(SA001)를 문헌[Chambers et al., Nature Biotechnology 27:275-280 (2009)]에 기술된 바와 같은 이중 SMAD 억제 프로토콜을 사용하여 신경줄기세포(NSC)로 분화시켰다. hPSC(스템셀 테크놀로지스)로부터 신경 선조세포의 발생을 위한 프로토콜을, 신경 응집체가 5,000 이하의 세포를 포함하도록 조절하였으며; 신경상피세포 유도 배지는 0.2% SB431542 10 mM(토크리스(Tocris)), 0.2% 인간 노긴(Noggin) 133 ㎍/㎖(페프로테크) 및 0.05% 인간 FGF-2 10 ㎍/㎖이 보충된 N2b27(인비트로젠)이었다.
인간 ES 세포(SA001)를 문헌[Lai et al., Methods Mol Biol 698:141-150 (2011)]에 기술된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 중간엽줄기세포(MSC)로 분화시켰다. 프로토콜을, 세포가 녹아웃 DMEM, 20% FBS, 1% 불필수 아미노산, 1% 글루타맥스(인비트로젠), 0.1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 0.1% β-머캅토에탄올, 0.1% FGF-2 10 ㎍/㎖ 및 1% 아스코르브산 2-포스페이트(100 mM)와 함께 10 내지 15일 동안 증식하도록 조절하였다. 세포를 3 내지 6 회 계대배양하여 안정한 표현형을 획득하였다.
R1 Oct4-GFP 마우스 배아줄기세포(Yeom et al. Development 122:881-894 (1996))를 DMEM, 15% FBS, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 불필수 아미노산, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 1000 U/㎖ 백혈병 억제 인자(LIF)가 있는 젤라틴-코팅된 플레이트상에서 증식시켰다.
화학적 라이브러리 선별:
셀티터 글로(CellTiter-Glo)(등록상표) 발광 세포 생육력 분석(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 384-웰 포맷으로 화학적 라이브러리 선별을 위한 고속대량 선별(HTS)로서 실행하였다. 상기 분석의 DMSO 허용성을 평가하고, 최적의 세포수를 각 세포 유형에 대해서 측정한 후에, 하기 50 개의 상업적으로 입수할 수 있는 화합물을 사용하여 파일럿 선별을 수행하였다:
3-아세트아미도페놀, 4-아세트아미도페놀, 6-메틸쿠마린, 아세트아미노펜, 아세타졸라미드, 악티디온, 아만타딘 하이드로클로라이드, 아미노살리실산, 아모다이아퀸, 암사크린 하이드로클로라이드, 아즈트레오남, 카페인, 카보플라틴, 세파만돌 나트륨, 콜산, 시프로플록사신, 클로자핀, 쿠마린, 크로탈린, 디플루니살, 도파민, 독시사이클린, 에리쓰로마이신, 에스트라디올, 파모티딘, 페노피브레이트, 플루드로코르티손 아세테이트, 젠타미신, 이미프라민, 아이소니아지드, 아이소프로테레놀, 가나마이신, 케토코나졸, L-티록신, 메페남산, 나돌올, 날부핀 하이드로클로라이드 하이드레이트, 니자티딘, 노르에피네프린, 페노바비탈, 퀴닌 하이드로클로라이드, 살리실레이트, 나트륨 2-머캅토-에탄설포네이트, 설파살라진, 슐린닥, 테트라사이클린, 테트라에틸티아룸 다이설파이드, 티몰올 말리에이트, 발프로산 나트륨 및 WY-14643.
1차 선별을 위해서, 롯슈 내부 화합물("골든" 라이브러리로서 지칭됨)과 함께 조립된 52,448 화합물 선별 라이브러리를 384-웰 포맷으로 시험하였다. 화합물들을 0.5 ㎕의 4 mM DMSO 용액으로서 384-웰 플레이트에 분배하였다(플레이트당 352 화합물). 확인 선별, 역-선별 및 화합물 프로파일링 선별을 위해서, "적중"으로서 한정된 화합물들을 롯슈 소유 화합물 목록으로부터 수득하고, 8 ㎕의 5 mM DMSO 용액으로서 384-웰 포맷으로 분배하였다.
5,000 CSES2 세포를 웰메이트(WellMate) 세포 분배기(매트릭스(Matrix), 미국 뉴햄프셔주 허드슨 소재)를 사용하여 매트리젤(상표)로 미리-코팅된 검은색 384-웰 투명-바닥 플레이트(팔콘(Falcon) BD)에 웰당 50 ㎕의 mTeSR1 배지 중에 도말하였다. 도말후 24 시간째에, 배지를 상기 중간 화합물 희석 플레이트로부터 1% DMSO 중의 25 ㎕의 40 μM 화합물 배지 용액 및 25 ㎕의 새로운 배지로 대체하였다. 상기 플레이트를 37 ℃, 5% CO2 분위기에서, 액체 처리에 필요한 시간은 별개로, 상기 선별의 전체 지속기간 동안 배양하였다. 세포 생육력을, 셀티터 글로(등록상표) 발광 세포 생육력 분석 키트를 사용하여 화합물 처리후 24 시간째에 측정하였다. 50 ㎕의 셀티터 글로(등록상표) 시약을 상기 분석 플레이트의 각 웰에 가하고 충분히 혼합하였다. 실온에서 15 분간 배양 후, 25 ㎕의 액체를 각 웰로부터 백색 불투명-바닥 384-웰 플레이트(퍼킨엘머)로 옮기고, 엔비젼(EnVision)(등록상표) 플레이트 판독기(퍼킨엘머)를 사용하여 발광을 측정하였다. 16 개의 중성 대조용 웰(0.5% DMSO) 및 8 개의 양성 대조용 웰(5 μM 암사크린 하이드로클로라이드)을 사용하여 상기 화합물 효과를 표준화하였다. 모든 액체 이동 단계들을 바이오멕(Biomek)(등록상표) FXP 실험실 자동화 워크스테이션(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러톤 소재) 및 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi) 액체 분배기(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 매사추세츠주 월트햄 소재)로 처리하였다. 분석기(진데이터(Genedata), 스위스 바젤 소재)를 데이터 패턴 보정 및 계산에 사용하였다. 스폿파이어(Spotfire) 소프트웨어(스폿파이어, 미국 매사추세츠주 솜머빌 소재)를 데이터 예시를 위해 사용하였다.
상기 1차 선별로부터 적중으로서 식별된 화합물들을 확인 선별을 위해 3 개의 만능줄기세포주(CSES2, H9 및 CSES2-SO2/3)에 대해 20 μM의 농도로 재시험하였다.
상기 확인 선별로부터 696 개의 확인된 적중을 상술한 동일한 선별 프로토콜(배아줄기세포-유래된 신경줄기세포(NSC) 및 중간엽줄기세포(MSC)의 경우 제외, 이 경우에 대한 프로토콜은 하기에 기술된음)을 사용하여, 13 개의 상이한 세포유형의 패널에서 프로파일링에 대해 시험하였다. 하기에 논의되는 바와 같이, 화합물을 용량-의존적인 다중 농도 방식으로 또는 단일 농도 방식으로 시험하였다. CSES2 및 CSES2-SO2/3 세포주 및 상기 세포주로부터 유래된 초기 내배엽 선조세포(CSES2-SO2/3-분화된)를 1:3의 일련의 희석 단계로 50 μM 내지 23 nM 범위의 8 개 농도에서 선별하였다. BJ-iPS28 세포주 및 이로부터 유래된 BJ 섬유아세포를 1:3의 일련의 희석 단계로 50 μM 내지 200 nM 범위의 6 개 농도에서 선별하였다. 심근세포를 20 μM의 하나의 농도에서 선별하였다. HeLa 및 NTERA-2 세포주를 20 μM의 복제물에서 선별하였다. 켈리 및 Huh-7을 20 μM의 삼중 복제물에서 선별하였다. 간세포를, 상기 세포가 도달된 원래의 96-웰 플레이트(웰당 40,000 세포, 160 ㎕ 배지 중에서, 관련된 모든 시약들의 부피를 상응하게 조절하였음)에서 20 μM의 복제물에서 선별하였다. MSC 및 NSC를 12.5 μM의 복제물에서 선별하였다.
MSC 및 NSC를 폴리-오르니틴/라미닌으로 미리-코팅된 백색 384-웰 투명-바닥 플레이트(코닝 인코포레이티드)에 도말하였다. 세포를 38 ㎕의 배지 중에서 웰당 4,000 세포의 밀도로 시딩하였다. 4 시간 동안 배양 후, 2 ㎕의 미리-희석된 화합물을 상기 세포에 12.5 μM의 최종 농도로 0.25% DMSO와 함께 가하였다. 세포를 상기 화합물과 24 시간 동안 배양하고, 이어서 25 ㎕의 배지를 제거하고 15 ㎕의 셀티터 글로(등록상표) 시약을 상기 플레이트에 가하였다. 발광 신호가 1 시간 이내에 판독되었다.
각 웰에 대한 원 강도 데이터를, 동일한 플레이트상의 모든 양성 대조용 웰들에 걸쳐 중간 강도를 감하여 배경-보정하고, 이를 사용하여 세포주당 각 화합물의 억제 효과를 계산하였다. 진데이터 분석기 및 콘도세오(Condoseo)를 데이터 패턴 보정, 계산 및 IC50 곡선 피팅에 사용하였다. Z' 인자를 각 플레이트에 대해서 측정하였다.
알칼리성 포스파타제 염색, 면역세포화학 및 면역블럿팅:
알칼리성 포스파타제 염색을 백혈구 알칼리성 포스파타제 키트(시그마 알드리치)의 설명서에 따라 수행하였다.
면역세포화학 염색을 위해서, 세포를 PBS(포스페이트 완충 염수)로 2 회 세척하고, 실온에서 30 분 동안 4%(w/v) 파라포름알데하이드를 함유하는 PBS로 고정시키고, 0.2% 트리톤 X-100으로 투과시키고, 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 2 시간 동안 차단시켰다. 1차 항체에 의한 염색을 하기의 항체(지시된 바와 같이 차단 완충제 중에서 희석됨)로 수행하였다: 마우스 항-인간 Oct3/4(IgG, 1:200, 산타크루즈 바이오테크놀로지), 염소 항-인간 NANOG(IgG, 1:100, R&D 시스템스). 세포를 4 ℃에서 밤새 1차 항체와 배양하고, 세척하고, 2 시간 동안 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 2차 항체(인비트로젠)와 배양하였다.
면역블럿팅을 위해서, 10% 폴리아크릴아미드젤을 단백질 분리 및 검출에 사용하였다. 상기 젤을 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮기고 항체 하이브리드화 및 화학발광을 표준 과정에 따라 수행하였다. 상기 분석에서 1차 항체는 토끼 항-인산화된-eIF2α(1:250, 셀 시그널링 테크놀로지), 토끼 항 카스파제-3(1:1,000, 셀 시그널링 테크놀로지), 마우스 항 β-카테닌(1:10,000, BD 바이오사이언시즈) 및 마우스 항-α-튜불린(1:50,000, 시그마 알드리치)이었다. 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 및 항-마우스 2차 항체를 잭슨 임뮤노리써치 레보라토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories)로부터 수득하였다.
RNA 단리, 역전사 및 정량적인 PCR:
전체 RNA를 퍼펙트퓨어(PerfectPure)(상표) RNA 배양세포 키트(5 프라임)를 사용하여 추출하였다. 1 마이크로그램의 전체 RNA를 임프롬(ImProm)-II(상표) 역전사효소(프로메가)를 사용하여 역전사 반응에 사용하였다. 정량적인 실시간 PCR을, cDNA에 역전사된 1 ㎍의 RNA 및 파워 SYBR(등록상표) 그린 PCR 마스터 혼합물(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))로 수행하고 7300 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템스)으로 분석하였다. 연접된 XBP1(sXBP1)에 대한 프라이머 서열은 ctgctgagtccgcagcaggtgca(순방향) 및 ggtccaagttgtccagaatgc(역방향)이었으며; RPB1에 대한 프라이머 서열은 tgcgcaccatcaagagagtc(순방향) 및 ctccgtcacagacattcgctt(대조군)이었고; OCT4, NANOG 및 GAPDH에 대한 Taqman 탐침은: 각각 Hs 00005111_g1, Hs 02387400_g1 및 Hs 99999905_m1이었다.
세포 생육력 분석:
고속대량 선별을 위해서, 상대적인 세포수를 상기 본 발명에 기술된 바와 같은 셀티터 글로(등록상표) 발광 세포 생육력 분석을 사용하여 측정하였다. 달리, 상기 세포를 0.5% 글루타르다이알데하이드로 고정시키고 0.1 M 붕산(pH 8.5)에 용해된 메틸렌 블루로 염색하여 상대적인 세포수를 측정하였다. 색 추출을 0.1 M 염산을 사용하여 수행하였으며, 상기 염색(세포수에 비례한음)을 650 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로서 정량화하였다.
FACS 분석:
인간 배아줄기세포-유래된 내배엽 선조 세포의 정량분석을 위해서, 세포를 애큐타제(상표)(밀리포어)로 해리시키고, 40 μM 나일론 세포 스트레이너(팔콘 BD)로 여과하고, PBS로 2 회 세척하였다. 해리된 세포를 105 세포/㎖의 최종 농도로 현탁하였다. 세포를 얼음상에서 CXCR4-PE 항체(1:25 희석, BD 바이오사이언시즈)와 1 시간 동안 배양하고, PBS로 2회 세척하고, 2% FBS가 있는 PBS 중에 현탁시키고, 구아바(등록상표) 발현 소프트웨어(밀리포어)와 함께 구아바(등록상표) 이지사이트(상표) 플러스 유식세포계 시스템(밀리포어)을 사용하여 분석하였다.
처리후 나머지 미분화세포에 대한 정량분석을 위해서, 세포를 48 시간 또는 72 시간 동안 20 μM PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드)으로 처리하고, TrypLE(상표) 셀렉트(인비트로젠)를 사용하여 해리시키고, 10% FBS 및 0.05% 나트륨 아지드가 보충된 PBS로 세척하였다. 해리된 세포를 106 세포/㎖의 최종 농도로 현탁하였다. 세포를 얼음상에서 TRA1-60-PE 항체(1:40, BD 바이오사이언시즈)와 배양하고, 세척하고, FCS 발현 소프트웨어(드 노보 소프트웨어(De Novo Software), 미국 캘리포니아주 로스 앤젤레스 소재)와 함께 LSR II FACS(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 분석하였다.
세포사멸의 정량분석을 위해서, 애넥신 V-FITC 세포사멸 검출 키트(이바이오사이언스)를 사용하였다. 세포를 20 μM PluriSIn #1로 16 시간 동안 처리하고, TrypLE(상표) 셀렉트를 사용하여 해리시키고, 10% FBS 및 0.05% 나트륨 아지드가 보충된 PBS로 세척하였다. 해리된 세포를 2-5 x 105 세포/㎖의 최종 농도로 현탁하고, 제조사의 설명에 따라 처리하였다. 분석을 FCS 발현 소프트웨어와 함께 LSR II FACS를 사용하여 수행하였다.
현미경검사 영상화:
CSES2-SO2/3 형광 세포(mCherry+ 또는 EGFP+)의 하이 콘텐츠 영상화를 오페라 하이 콘텐츠 선별 영상화 플랫폼(퍼킨엘머)을 사용하여, 검은색 투명-바닥 384-웰 분석 플레이트(팔콘 BD)에서 수행하였다. 달리, 모든 세포의 광 및 형광 영상화를 올림푸스 CellR 영상화 스테이션을 사용하여 24-웰, 6-웰 또는 10 ㎝ 셀스타(CELLSTAR)(등록상표) 플레이트(그레이너 바이오원)에서 수행하였다. 발생하는 마우스 배의 광 영상화를 올림푸스 IX70 현미경을 사용하여 35 ㎜ 배양 디쉬(팔콘 BD)에서 수행하였다.
전체적인 유전자 발현 분석:
인간배아줄기세포 및 인간배아줄기세포로부터 유래된 초기 내배엽 선조세포를 12 시간 동안 화합물 PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드) 또는 PluriSIn #6(2-하이드록시-2-(티오펜-2-일)-2-페닐아세트산 4-메틸-N'-페닐하이드라지드) 또는 0.2% DMSO 대조군으로 처리하였다. 전체 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 퍼펙트퓨어(PerfectPure)(상표) RNA 배양세포 키트(5 프라임)를 사용하여 추출하고, 인간 게놈 U133a 2.0 미세배열 플랫폼(애피메트릭스(Affymetrix))을 사용하여 분석하고; 세척 및 스캐닝을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 원래의 미세배열 데이터를 수납 번호 GSE37040 하에서 NCBI 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스에서 입수할 수 있다.
배열을 애피메트릭스 발현 콘솔에서 MAS5 연산을 사용하여 표준화하였다. 대조군과 처리 조건 모두의 부재 하에서 탐침 세트를 MAS5 부재/존재 호출에 의해 걸러내었다. 50 미만의 발현 값을 갖는 탐침 세트를 상기 수준으로 상승시켰다. 2-배 한계를 사용하여, 차별적으로 발현된 유전자의 목록을 각 쌍의 조건에 포함시켰다: PluriSIn #1 대 대조군 처리된 배아줄기세포, PluriSIn #6 대 대조군 처리된 ESC 및 PluriSIn #1 대 대조군 처리된 내배엽 선조세포.
현저하게 과발현된 GO(유전자 온톨로지) 생물 과정을 검출하기 위해서, 차별적으로 발현된 유전자의 목록에 DAVID 작용성 주석 군집화 도구(wwwdotdaviddotabccdotncifcrfdotgov)를 수행하였다.
PluriSIn에 의해 유도된 유전자 발현 변경과 공지된 약물에 의해 유도된 것들간의 유사성을 밝히기 위해서, 차별적으로 발현된 유전자의 목록에 개발자의 설명(wwwdotbroadinstitutedotorg/cmap)에 따라, 연결성 지도(cmap) 분석을 수행하였다.
상기 차별적으로 발현된 유전자의 목록을 무감독 계층적 군집화를 위한 입력으로서 사용하였으며, 파텍 제노믹스 스위트(Partek Genomics Suite) 버전 6.3(파텍, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)으로 수행하였다.
단백질 합성의 대사적 표지화:
H9 배아줄기세포를 매트리젤(상표) 미리-코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에 2 x 105 세포/웰의 밀도로 시딩하고, mTeSR1 한정 배지를 사용하여 배양하였다. BJ 섬유아세포를 동일한 밀도로 6-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 10% FBS, 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 DMEM과 함께 배양하였다. 세포를 12 시간 동안 20 μM PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드) 또는 0.2% DMSO로 처리하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 1 시간 동안 메티오닌-결핍 배지를 다시 채웠다. 이어서 상기 세포의 대사적 표지화를 1 ㎖/웰의 10 μCi의 S35-표지된 메티오닌으로, 20 μM PluriSIn #1 또는 0.2% DMSO의 존재 하에서 수행하였다. 세포를 10 mM 메티오닌을 함유하는 PBS로 세척하고, 이어서 10 mM 메티오닌을 함유하는 30% 빙냉 트라이클로로아세트산(TCA) 0.4 ㎖ 중에 15 분간 용해시켰다. 3 MM 예비-필터 및 그의 상부의 GF/C 필터를 여과 장치에 설치하고, 스테인레스 강 실린더를 조립하였다. 상기 필터를 진공 하에서 10% TCA로 미리 습윤시켰다. TCA 침전물을, 각 웰의 내용물을 상기 필터에 통과시킴으로써 수거하고, 5% TCA로 3 회 및 에탄올로 1 회 세척하였다. 필터를 공기 건조시키고 이어서 트라이-카브(Tri-Carb)(등록상표) 2900TR 액체 섬광 분석기(퍼킨엘머)를 사용하여 액체 섬광 분광분석을 수행하였다. 전체 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 단백질 분석(시그마 알드리치)을 사용하여 측정하고, 방사성 측정을 상응하게 표준화하였다. 실험을 3 회 중복하여 수행하였다.
SCD1 활성 측정:
세포를 웰당 50,000 내지 100,000 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 도말하였다. 24 시간 후에, 20 μM PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드) 또는 0.2% DMSO(대조군)를 상기 세포에 가하였다. 37 ℃에서, 5% CO2 하에 12 시간 배양 후, 오래된 배지는 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 2.3 μM의 0.75 UCi의 [1-14C] 스테아르산을 함유하는 새로운 배지를 가하였다. 이어서 상기 세포를 37 ℃에서, 5% CO2 하에 4 시간 이하로 배양하였다.
상기 배양 기간 후에, 상기 배지를 버리고 상기 세포를 2 ㎖의 PBS로 3 회 세척하였다. 2 ㎖의 n-헥산:아이소프로판올 혼합물(3:2 v:v)을 가하고, 이어서 상기 세포를 37 ℃의 온도에서, 5% CO2 하에 30 분 동안 배양하였다. 후속으로 2 ㎖의 폴치 용액(2:1(v/v) 클로로포름:메탄올 혼합물)을 가하였다. 상기 액체를 1 ㎖의 물을 가하여 상 분할을 위해 튜브로 옮겼다. 하부 유기상을 증발시키고 액체 비누화 및 유리 [1-14C] 스테아르산(기질) 및 [1-14C] 올레산(형성된 생성물)의 TLC(박층 크로마토그래피) 분리에 사용하였다. 상기 세포로부터 추출된 액체를 10% AgNO3 중에 앞서 담근 TLC 플레이트에 적용하고 120 ℃의 온도에서 60 분간 활성화시켰다. 표지되지 않은 스테아르산 및 올레산을 담체로서 및 식별을 위한 내부 표준으로서 각각의 적용 시점에 가하였다. 이어서 상기 플레이트에 클로로포름:메탄올:아세트산:이차 증류수(DDW)(90:8:1:0.8)의 용매 혼합물을 흐르게 하였다. 상기 TLC를 2',7'-다이클로로플루오레세인 용액으로 분무후에 자외선 조명에 의해 유리 지방산을 검출하였다. 스테아르산 및 올레산에 상응하는 스폿들을 긁어내고 방사성을 팩카드(Packard) 트라이 카브(등록상표) 1600TR 섬광 카운터에서 카운트하였다. SCD1 불포화효소 활성을 기질의 생성물로의 전환 퍼센트로부터 계산하고 피코몰/분/106 세포로 전환시켰다. 실험을 3 회 중복 수행하였다.
올레산 구제 분석:
인간 배아줄기세포를 mTeSR1 한정 배지를 사용하여, 매트리젤(상표)로 미리 코팅된 셀스타(등록상표) 24-웰 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오원)에서 배양보조 세포 없이 배양하였다. 세포를 올레산-알부민 또는 알부민 단독의 존재 또는 부재 하에서 20 μM의 시험된 PluriSIn 화합물, 5 μM 암사크린 하이드로클로라이드 또는 0.02% DMSO로 처리하였다. 24 시간 후에, 상기 세포를 현미경 영상화하고 세포 생육력 측정을 수행하였다.
시험관내 배발생 실험:
고나도트로핀 주사에 의해 암컷 마우스(CB6Fl/OLAHSD 및 ICR:HSD(CD-1))에서 과잉배란을 유도하였다: 문헌[Najy et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003)]에 기술된 과정에 따라, 1:00 P.M.에서 5 IU PMSG(임신한 암말의 혈청 고나도트로핀)를 복강내 주사한 다음 47 시간 후에 5 IU hCG(인간 융모막 고나도트로핀)를 복강내 주사하였다.
암컷을 상기 두 번째 주사 직후에 수컷 마우스와 교미시켰으며, 다음날 아침 플러깅이 명백하였다. 임신한 암컷 마우스를 p.c.(교미후) 대략 36 시간째에 죽이고, 2-세포 배를 문헌[Najy et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003)]에 기술된 과정에 따라 수거하였다. 복강을 열고, 난관을 절단하여 실온에서 M2 배지를 함유하는 페트리 디쉬로 옮겼다. 상기 난관을 M2 배지로 플러싱시키고, 배를 피펫으로 집어 M2 배지에서 세척하여 찌꺼기를 헹구어냈다. 이어서 배를 M16 배지의 미세점적액으로 옮겼다. 금속 호일로 덮인, 40 ㎕ M16 배지 몇 방울을 함유하는 35 ㎜ 배양 디쉬(팔콘 FD)를 전날 준비하고, 37 ℃의 온도에서 5% CO2 하에 밤새 배양하였다. 이어서 배를 그의 수거에 이어서 상기 미세점적액으로 옮기고 37 ℃의 온도에서 5% CO2 하에 배양하였다. 상기 배의 발생을 광학 현미경 영상화를 사용하여 하루에 2회 검사하였다. 상실기(대략 3.5일 p.c.)에서, 배를 0.2% DMSO 중의 20 μM PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드)을 갖는 40 ㎕의 M16 배지의 미세점적액으로 또는 0.2% DMSO를 갖는 대조용 미세점적액으로 옮겼다. 다른 대조용 배를 원래의 미세점적액에 두어 상기 이동 자체의 가능한 효과를 통제하였다. 대략 4일 p.c. 및 4.5일 p.c.에서, 상기 배를 광학현미경 영상화를 사용하여 검사하고, 배반포를 문헌[Cortes et al., Stem Cells and Development 17:255-267 (2008)]에 기술된 바와 같이 등급화하였다.
기형종 형성:
인간배아줄기세포 및 유도만능줄기세포주를 mTeSR1 한정 배지를 사용하여, 매트리젤(상표)로 미리 코팅된 셀스타(등록상표) 6-웰 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오원)에서 배양보조 세포 없이 배양하였다. 세포를 0.2% DMSO 중의 20 μM PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드) 또는 0.2% DMSO로 24 시간 동안 처리한 다음 배지를 교체하고 추가로 24 시간 동안 두 번째 처리를 수행하였다. 상기 시험 화합물에의 초기 노출후 48 시간째에, 세포를 트립신-EDTA로 수확하고 1:1 mTeSR1:매트리젤(상표) 혼합물 중에 총 200 ㎕의 부피로 재현탁시켰다. 이어서 세포를 NOD-SCID IL2Rγ-/- 마우스(잭슨 레보라토리(Jackson Laboratory))의 등에 피하 주사하였다. 주사후 6 주째에 마우스를 죽이고, 종양 형성을 검사하고, 생성된 기형종을 사진촬영하고, 절제하고 O.C.T. 화합물(사쿠라 파인텍(Sakura Finetek), 미국 캘리포니아주 토랜스 소재) 중에서 저온보존하였다.
또는, 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 없이 15% 녹아웃 혈청 교체물, 1 mM 글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 1% 불필수 아미노산, 페니실린(50 U/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)이 보충된 85% 녹아웃 DMEM 배지가 있는 젤라틴-코팅된 배양 플레이트상에서 증식시킴으로써 10일의 기간 동안 배양물 중에서 자발적으로 분화시켰다. 레티노산을 1 μM의 최종 농도로 상기 배지에 가하였다. 10일 후에, 상기 분화세포를 수확하고 mTeSR1 한정 배지를 사용하여, 매트리젤(상표)로 미리 코팅된 셀스타(등록상표) 6-웰 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오원)에서 그의 미분화 모 세포와 1:1 비로 도말하였다. 세포를 20 μM PluriSIn #1 또는 0.2% DMSO로 24 시간 동안 처리한 다음 배지를 교체하고 추가로 24 시간 동안 두 번째 처리를 수행하였다. 상기 시험 화합물에의 초기 노출후 48 시간째에, 세포를 트립신-EDTA로 수확하고 카운테스(Countess) 자동화 세포 카운터(인비트로젠)를 사용하여 카운트하였다. 각각의 조건으로부터 100만개의 생육성 세포를 1:1 mTeSR1:매트리젤(상표) 혼합물 중에 총 200 ㎕의 부피로 재현탁시켰다. 이어서 세포를 NOD-SCID IL2Rγ-/- 마우스의 등에 피하 주사하였다. 각각의 마우스에게 그의 신체의 한쪽에 PluriSIn #1-처리된 세포를 주사하고 다른 쪽에는 대조군-처리된 세포를 주사하였다. 주사후 6 주째에 마우스를 죽이고, 종양 형성을 검사하고, 생성된 기형종을 사진촬영하고, 절제하고 O.C.T. 화합물 중에서 저온보존하였다.
SCD1 녹다운:
SCD1의 유전자 제거를 위해서, SCD1의 녹다운을 인간 SCD1에 대한 ON-TARGETplus SMART 풀 siRNA(다마콘(Dharmacon) RNAi 테크놀로지스, 미국 콜로라도주 라파예트 소재)을 사용하여 수행하였다. 인간 ES 세포에의 siRNA의 형질감염을 형질감염 시약 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여, 앞서 문헌[Ma et al., RNA 16:2564-2569 (2010)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. siRNA 올리고를 40 nM 또는 80 nM의 최종 농도로 사용하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 siRNA를 모의-siRNA(인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 미국 아이오와주 코랄빌 소재)로서 사용하였다. 세포 생육력을 형질감염후 72 시간째에 측정하였다.
통계:
유전자 발현 수준의 프로파일 및 화합물에 대한 반응의 프로파일에 의한 계층적 군집화를, 파텍 제노믹스 스위트 버전 6.3(파텍, 미국 미주리주 세이트루이스 소재)을 사용하여 수행하였다.
선택된 유전자의 유전자 발현 수준뿐만 아니라 대조군과 처리된 세포간의 SCD 및 단백질 합성 활성을 일방적 스튜던츠 t-시험을 사용하여 비교하였다.
DAVID 작용성 주석 분석을 위해서, 유의수준에 대한 한계를 벤자미니(Benjamini) 보정 적용후에 p = 0.05로서 측정하였다.
cmap 결과 중 PluriSIn 화합물 및 단백질 합성 억제제의 목록에서 페닐하이드라진을 갖는 화합물에 대한 농축 유의수준을 피어슨의 카이-제곱 적합도 시험을 사용하여 측정하였다. 시험관내 배발생 실험의 유의수준을 피셔의 정확성 시험을 사용하여 측정하였다.
Z' 인자를 하기 식에 따라 계산하였다:
1-[3(pos. con.의 d.s. - neg. con.의 d.s.)/|pos. con.의 평균 - neg. con.의 평균|]
상기에서, s.d.은 표준 편차이고; pos.은 양성이고; neg.은 음성이고; con.은 대조군이다.
실시예 1
줄기세포에 대한 세포독성의 선별
인간 만능줄기세포(hPSC)의 세포독성 억제제를 식별하기 위해서, 소분자의 고속대량 선별(HTS)을 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이 설계하고 사용하였다. 선별을 용이하게 하기 위해서, 384-웰 포맷에서 미분화 hPSC의 배양, 상기 세포 플레이트에 대한 소분자의 자동 적용 및 시험 화합물에의 세포 노출후 세포 생육력의 정확한 평가를 가능하게 하기 위한 프로토콜을 개발하였으며 상기를 위해 최적화하였다.
먼저, 인간배아줄기(ES) 세포 및 유도만능줄기(iPS) 세포를 무혈청 한정 배지(mTeSR1)를 사용하여, 배양보조세포 없이 매트리젤(상표)-코팅된 플레이트상에서 증식시켰다.
이러한 조건 하에서 상기 세포의 다능성을, 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이 상기 세포의 형태 검사, 알칼리성 포스파타제(AP)에 대한 염색 및 Oct-4에 대한 면역세포화학 염색에 의해 평가하였다.
도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 상기 세포는 정상적인 형태(도 1a)를 나타내었으며 Otc-4를 발현하였다(도 1b).
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 상기 세포는 알칼리성 포스파타제에 대해 양성 염색을 나타내었다.
이러한 결과는 상기 줄기세포의 다능성을 입증한다.
이어서 세포를 수확하고 384-웰 플레이트에, 웰당 5,000 세포의 밀도로 시딩하였다. 상기 세포가 이러한 조건 하에서 5일 이상 미분화된 채로 남아있는지를 확인하기 위해서 정량적인 PCR 및 Oct-4 및 NANOG에 대한 면역형광-염색을 수행하였다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 상기 세포는 상기 플레이트에서 증식하면서 그의 정상적인 형태를 유지하고, 콜로니를 형성하며 증식되었고, 5일이상 미분화된 채로 남아있었다.
ATP-기재 발광 세포 생육력 분석(셀티터 글로(등록상표))을 사용하여 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이, 미분화세포의 배양물 중에서 살아있는 세포의 양을 정확하게 측정하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 미분화세포에서 관찰된 ATP-기재 발광성은 측정 24 시간 전에 샘플에 시딩된 세포의 수와 강한 상관성이 있었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 메틸렌 블루 염색을 통한 미분화세포 생육력의 분석은 ATP-기재 발광성 세포 생육력 분석을 통해 획득된 결과와 유사한 결과를 제공하였다.
이러한 결과는 상기 APT-기재 발광성 세포 생육력 분석이 배양물 중 미분화세포의 생육력을 정확하게 측정함을 입증한다.
이어서 공지된 세포독성 화합물의 은행으로부터 무작위로 선택된 50 개의 상업적으로 입수할 수 있는 화합물(본 발명에서 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같음)로 파일럿 선별을 수행하였다. 세포를 4 개의 노출 지속기간(6, 24, 48 또는 72 시간) 동안 30 μM 내지 300 nM 범위의 5 개의 농도에서 상기 화합물들에 노출시키고 이어서 생육력 분석을 수행하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 관찰 가능한 세포독성을 나타낸 상기 시험 화합물들은 모두 24 시간째에 상기와 같은 활성을 나타내었다. 따라서 24 시간의 시험 기간이 다음의 1차 선별을 위해 선택되었다.
더욱 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 24 시간 이내에 모든 세포를 거의 죽이는 암사크린 하이드로클로라이드(DNA 국소이성화효소 억제제) 및 사이클로헥스이미드(번역 억제제, 또한 악티디온으로서 당해 분야에 공지된음)는 1 내지 3 μM의 농도에서 24 시간 후에 세포 생육력을 대략 50% 감소시켰다.
이러한 결과들을 근거로, 암사크린 하이드로클로라이드를 1차 선별에 대한 양성 대조군으로서 선택하였고, 사이클로헥스이미드(악티디온)를 EC50 대조군(즉 세포에 대해 50% 세포독성을 생성시키는 대조용 화합물)으로서 선택하였다.
hPSC의 세포독성 억제제에 대한 1차 선별에서, 52,448 개의 소분자를 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, 미분화 인간 ES 세포에 대해 선별하였다. 이들 분자는, 다양한 화학적 존재들로 구성된 호프만-라 롯슈의 "골든" 화합물 라이브러리에 속한다. 상기 라이브러리는 100만 개 이상의 별개의 분자들을 포함하는, 제약 회사의 전체 화합물 라이브러리를 나타내도록 설계된다.
상기 1차 선별을 위한 프로토콜을 도 8에 대략적으로 도시한다. 인간 ES 세포(CSES2)를 mTeSR1 한정 배지가 있는 매트리젤(상표)-코팅된 플레이트에서 증식시켰다. 384-웰 플레이트에 도말 전에, 상기 세포의 다능성을 그의 형태학 및 알칼리성 포스파타제 염색에 의해 확인하였다. 이어서 세포를 수확하고, 카운트하고, 웰당 5,000 세포의 밀도로 자동적으로 분배하였다. 상기 플레이트를 밤새 배양하여 상기 세포가 적합하게 침전되게 하였다. 상기 "골든" 라이브러리의 149 개 화합물 플레이트를 합치시키기 위해서 149 개의 상기와 같은 플레이트를 제조하였다. 세포 도말후 24 시간째에, 상기 화합물들을 희석하고, 상기 52,448 개의 화합물들이 각각 하나의 웰에 첨가되도록 상기 분석 플레이트로, 20 μM의 최종 농도(0.5% DMSO에 의해)에서 옮겼다. 상기 라이브러리로부터 352 개 화합물 외에, 각각의 분석 플레이트는 또한 그 자신의 대조군, 즉 오직 0.5% DMSO만을 갖는 16 개 웰(음성 대조군), 5 μM 암사크린 하이드로클로라이드를 갖는 8 개 웰(양성 대조군); 및 2 μM 사이클로헥스이미드를 갖는 8 개 웰(EC50 대조군)을 포함하였다. 화합물 첨가후 24 시간째에, 셀티터 글로(등록상표) 생육력 분석을 사용하여 각각의 웰 중의 살아있는 세포의 수를 정량분석하였다. 발광 강도를 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 발광 플레이트 판독기를 사용하여 각각의 웰에서 측정하고, 데이터를 표준화하고 분석하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 분석은 일관되게 높은 Z' 인자를 나타내었으며(0.078+/-0.06/384-웰 분석 플레이트), 이는 상기 1차 선별이 매우 확고함을 가리킨다.
적중을 60% 이상의 억제를 유도한 화합물로서 측정하였다. 상기 한계를 사용하여, 2,031 개 화합물(시험 화합물의 <4%)이 적중으로서 확인되었다. 상기 시험 화합물에 의해 나타난 억제의 분포를 도 10에 나타낸다.
이어서 상기 2,031 개의 적중을 4 개의 인간 ES 및 iPS 세포주에 대한 확인 및 입증 분석에서 재시험하기 위해 선택하였다. 첫 번째 확인 선별을 단일 농도(20 μM)에서 2 개의 인간 ES 세포주, CSES2 및 H9로 수행하였다. 상기 확인 선별은 상기 1차 선별로부터 거짓 양성 적중뿐만 아니라 세포주-특이성 효과를 갖는 화합물들을 제거하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 확인 선별은 CSES2 및 H9 세포 모두에 대해 세포독성인 696 개 적중을 생성시켰다.
이어서 상기 696 개의 확인된 적중을 8 개의 농도(일련의 1:3 희석단계에 의해 50 μM 내지 23 nM의 범위)에서 인간 ES 세포주 CSES2 및 그의 클론 CSES2-SO2/3에 대해 시험하였다.
도 12a 및 12c에 나타낸 바와 같이, 상기 다양한 시험된 인간 ES 세포주에서 상기 화합물들의 효능은 매우 고도로 상관되었다. 또한, 상기 화합물들의 세포독성 효과는 98% 이상의 경우에서 용량-의존성이었다.
도 12b에 추가로 나타낸 바와 같이, iPS 세포에서의 상기 화합물들의 효능은 ES 세포에 대해 획득된 것들과 고도로 상관되었다. 다른 세포 유형에 대해 유해한 영향을 미치지 않으면서 하나의 세포 유형에 대해서 세포독성인 화합물은 발견되지 않았다.
상기 화합물들의 억제 효과가 시간이 지남에 따라 지속됨을 입증하기 위해서, CSES2 세포를 48 시간의 지속 기간 동안 6 개의 농도에서 상기 화합물들에 노출시켰다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 시험 화합물들 각각의 세포독성 효과는 48 시간 동안 유지되었다. 상기 화합물들 중 어느 하나에의 노출에 이어서 세포 회수는 관찰되지 않았다.
이어서 인간 iPS 세포에 대한 상기 선택된 화합물들의 효과를 측정하였다. BJ-iPS28 세포를 상기 ES 세포와 정확하게 동일한 조건에서 증식시키고, 6 개의 농도(일련의 1:3 희석단계에 의해 50 μM 내지 200 nM의 범위)에서 시험하였다.
이들 결과는 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이 식별된 696 개 화합물이 인간 PSC의 효능있는 세포독성 억제제임을 가리킨다.
실시예 2
줄기세포에 대해 선택적인 세포독성을 나타내는 화합물(PluriSIn)에 대한 선별
hPSC의 고도로-선택적인 세포독성 억제제를 식별하기 위해서, 실시예 1에 기술된 바와 같이 식별된 hPSC의 696개 세포독성 억제제들을 모든 배엽층들 및 발생 단계들을 나타내는 다른 세포 유형들에 대해서, 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 역-선별하였다. 중요하게는, 이들 세포 유형 중 다수가 인간 ES 또는 iPS 세포로부터 분화되었다. 상기 선별된 세포 유형들은 ES-유래된 신경줄기세포(NSC), ES-유래된 중간엽줄기세포(MSC), ES-유래된 내배엽 선조세포, ES-유래된 간세포, iPS-유래된 심근세포, 기원(BJ 섬유아세포)의 iPS-유래된 섬유아세포 및 3 개의 암세포주, 즉 신경모세포종(켈리), 경부암(HeLa) 및 간암종(Huh7)을 포함하였다. 상기 세포 유형 및 줄기세포에 대한 이들의 관계를 도 14에 개략적으로 도시한다.
각각의 세포 유형을 상기 언급한 696 개 화합물 중 대부분 또는 전부에 대해서, 20 μM의 농도로 중복 또는 3 회 중복 선별하였다.
도 15 내지 21에 나타낸 바와 같이, hPSC에 대해 시험된 화합물의 세포독성과 심근세포(도 15), 섬유아세포(도 16), 간세포(도 17), 신경모세포종(켈리) 세포(도 18), HeLa 세포(도 19) 또는 Huh7 세포(도 20)에 대한 세포독성간에는 거의 상관성이 없었지만, 내배엽 선조세포들에 대한 세포독성과는 어느정도 더 상관성이 있었다(도 21).
이러한 결과는 상이한 유형의 hPSC에서 상기 화합물들의 효능이 고도로 상관됨을 가리키는 상기 언급한 결과와 현저한 대조를 나타낸다(도 15와 도 11 및 12a 내지 12c를 비교하시오).
식별된 화합물들의 선택적인 세포독성을 추가로 입증하기 위해서, 다수의 농도의 상기 화합물들을 분화세포뿐만 아니라 유전적으로 합치하는 미분화세포에 대해서 선별하였다.
CSES2-SO2/3은 다능성 특징 유전자 OCT-4의 프로모터 하에서 mCherry 및 초기 내배엽 마커 SOX17의 프로모터 하에서 GFP를 발현하는 유전자-표지된 세포주이다. 따라서, 이들 세포는 미분화된 동안 적색이고 내배엽 계통으로 분화시 녹색으로 된다(Kopper & Benvenisty, Stem Cell Research 8:335-345(2011). 녹색 초기 내배엽 선조세포를, 문헌[Duan et al., Stem Cells 28:674-686 (2010)]에 기술된 바와 같은 8-일 분화 프로토콜을 사용하여 적색 미분화세포로부터 발생시켰다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 상기 세포는 분화전에 적색이었으나, 8일 후, 상기 세포의 대부분은 녹색인 반면, 적색 미분화세포는 거의 검출할 수 없었다. 이러한 결과는 상기 분화 프로토콜이 매우 효율적임을 가리킨다.
상기 분화 프로토콜의 효율을 상기 내배엽 마커 CXCR4에 대한 FACS 분석에 의해 확인하였다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 상기 세포의 98%는 상기 초기 내배엽 마커 CXCR4를 발현하였으며, 이에 의해 상기 분화 프로토콜의 효율을 확인하였다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 상기 분화세포는 384-웰 플레이트에서 도말후 생육성이고 녹색으로 남아있었다. 이러한 결과는 상기 분화세포가 상기 소분자들에 대해서 선별될 수 있음을 가리켰다.
상기 식별된 화합물들을 미분화 적색 세포 및 분화 녹색 세포 모두를 사용하여 8 개의 농도에서 선별하였으며, 이에 의해 신뢰할 수 있는 EC50 값이 상기 유전학적으로 동일한 분화 및 미분화세포에 대해서 계산되었다.
또한, 상기 식별된 화합물을, 상기 iPS 주 BJ-iPS28이 유도된 BJ-섬유아세포를 사용하여 6 개의 농도에서 선별하였으며, 이에 의해 신뢰할 수 있는 EC50 값이 상기 iPS 세포 및 그의 기원 체세포 모두에 대해서 계산되었다.
도 25A 및 25B에 나타낸 바와 같이, 상기 시험 화합물들 중 다수는 BJ-iPS28(도 25A) 및 CSES2-SO2/3(도 25B) 만능줄기세포에 대해서 효능있는 세포독성을 나타내었지만, 유전학적으로 동일한 분화세포들(각각 BJ-섬유아세포(도 25A) 및 분화된 CSES2-SO2/3 세포(도 25B))에 대해서 상당히 적은 세포독성을 나타내었다.
hPSC에 대해 고도로 선택적인 세포독성을 나타내는 화합물을 식별하기 위해서, 상기 시험된 비-hPSC 세포 유형(ES 세포에 대해 비교적 유사한 ES-유래된 신경줄기세포는 예외임)에서 20% 미만의 억제(20 μM에서)와 함께, 상기 각각의 시험된 hPSC 유형에서 대략 80% 이상의 억제(20 μM에서)를 특징으로 하는 한계를 설정하였다. 더욱이, 상기 기준은 상기 EC50 값이 CSES2, CSES2-SO2/3 및 BJ-iPS28 세포에 대해서 대략 5 μM 이하이나, 8-일 분화된 CSES2-SO2/3 및 BJ-섬유아세포에 대해서는 50 μM을 초과할 것을 요구하였다.
하기 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 상기 언급한 기준을 충족한 15 개의 화합물들은 상기 언급한 기준(예를 들어 hPSC와 분화세포간의 EC50에서 10 배 초과의 차이를 나타내었음)의 충족에 근접하였으며 따라서 만능-특이성 억제제(PluriSIn)라 칭하였다. 15 개의 식별된 PluriSIn을 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 PluriSIn 중 다수(15 개 중 9 개)는 페닐하이드라진 부분을 포함한다. 상기 PluriSIn의 억제 효과를 표 2 및 3에 나타낸다.
PluriSIn 화합물 구조 및 화학명(공유된 부분 강도)
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019

PluriSIn 화합물들(20 μM에서)에 의한 다양한 세포 유형의 억제(%)
Figure pct00020
PluriSIn 화합물들에 의한 다양한 세포 유형의 억제에 대한 EC50 값(μM)
PluriSIn # 만능줄기세포 분화세포
CSES2 CSES2- SO2/3
24 시간		 BJ-iPS28
24 시간		 CSES2-SO2/3 내배엽 선조세포
24 시간		 BJ-섬유아세포
24 시간
24
시간		 48 시간
1 1.543 1.986 3.91 2.391 > 50 > 50
2 2.028 2.627 12.36 6.958 > 50 > 50
3 2.979 1.317 2.787 1.681 > 50 > 50
4 1.108 0.594 4.705 0.750 > 50 > 50
5 3.061 1.268 3.204 1.516 > 50 > 50
6 2.548 1.92 3.747 2.261 > 50 > 50
7 1.977 0.749 2.743 2.128 > 50 > 50
8 2.305 2.388 3.692 1.688 > 50 > 50
9 7.957 2.157 4.606 3.415 > 50 > 50
10 1.672 2.047 2.491 2.425 > 50 > 50
11 3.827 2.583 3.619 3.123 > 50 > 50
12 6.848 5.099 6.037 5.399 > 50 > 50
13 1.543 1.912 3.447 1.505 > 50 > 50
14 2.028 2.905 5.515 3.477 > 50 > 50
15 2.979 3.268 10 3.942 > 50 > 50
도 26a 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 ES 세포(CSES2 세포)는 CSES2-유래된 내배엽 선조세포(EPC)로 분화시 PluriSIn #1에 대한 민감성을 상실하였다.
유사하게, 도 26b 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 체세포(BJ-섬유아세포)는 iPS 세포(BJ-iPS28 세포)로 분화시 PluriSIn #1에 대한 민감성을 획득하였다.
유사하게, 도 27 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 ES 세포(CSES2-SO2/3 세포)는 내배엽 선조세포로 분화시 15 개의 PluriSIn 화합물들 각각에 대한 민감성을 상실하였고, BJ-섬유아세포는 iPS 세포(BJ-iPS28 세포)로 분화시 15 개의 PluriSIn 화합물들 각각에 대한 민감성을 획득하였다.
무감독 계층적 군집화를, 시험된 세포 유형의 화합물 억제 프로파일을 사용하여 수행하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, hPSC들은 소분자에 대한 그들의 반응에 의해 함께 군집하였으며, 이때 15 개 화합물들의 하위그룹은 hPSC에 대해 고도로 선택적인 세포독성을 나타내었다. 이러한 결과는 hPSC가 일반적으로, 다른 유형의 세포(예를 들어 분화세포)에 비해 상이한 화합물들에 대해 민감함을 가리킨다.
추가적인 분석에서 다양한 PluriSIn의 세포독성 효과를 확인하기 위해서, 세포를 PluriSIn으로 처리하고 ATP-독립적인 메틸렌 블루 생육력 분석을 수행하고, 고-콘텐츠 현미경 영상화에 의해 또한 검사하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 내지 #11은 각각, 메틸렌 블루 분석에 의해 측정된 바와 같이, H9 ES 세포의 생육력을 상당히 감소시켰다.
도 30에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 내지 #11은 각각, 현미경검사에 의해 관찰된 바와 같이, H9 ES 세포의 수를 상당히 감소시켰다.
현저하게, 상기 PluriSIn 중 어느 것도, HepG2 세포로 수행된 선행의 고-분해능 세포독성 선별에서 세포독성인 것으로서 확인되지 않았으며(데이터 도시 안 됨), 이는 상기 세포독성이 PSC에 대해 선택적임을 추가로 가리킨다.
상기 PluriSIn의 선택적을 추가로 입증하고 임의의 잠재적인 분석-관련 간섭을 제외시키기 위해서, 미분화 및 분화 CSES2-SO2/3 세포에 대해서 PluriSIn에의 24 시간 노출후 현미경 영상화를 수행하였다.
도 31에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #6은 녹색 분화세포에 대한 어떠한 검출 가능한 효과도 나타내지 않으면서 적색 미분화세포를 제거하였다. 상기 도면에 추가로 나타낸 바와 같이, 상기 미분화세포에 대한 상기 PluriSIn의 효과는, 세포독성 대조용 화합물로서 사용된 5 μM 암사크린 하이드로클로라이드의 효과에 필적하는 반면, 상기 PluriSIn-처리된 분화세포는 처리되지 않은 분화세포에 필적하였다.
유사하게, 도 32a 내지 32c에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 분화세포에 대해 어떠한 검출 가능한 효과도 나타내지 않으면서(도 32b) 미분화세포를 제거하였고(도 32a), 분화 및 미분화세포들의 혼합물에서 미분화세포를 또한 제거하였다(도 32c).
PluriSIn 세포독성의 민감성이 세포 배지-의존성이기 보다는 세포 유형-의존성임을 확인하기 위해서, 4 개의 비-만능세포 유형(BJ-섬유아세포, HeLa, HepG2 및 켈리 세포)을 인간배아줄기세포 배지에서 배양하고 PluriSIn #1에 72 시간 동안 노출시켰다. 이어서 세포 생육력을 본 발명에서 앞서 기술한 바와 같이, 메틸렌 블루 분석에 의해 측정하였다.
도 33 및 34에 나타낸 바와 같이, 상기 PluriSIn #1은 배아줄기세포 배지에서 배양된 비-만능세포의 생육력에 영향을 미치지 않았으며, 이에 의해 PluriSIn #1 세포독성이 세포 배지-의존성이기보다는 세포 유형-의존성임을 확인하였다.
상기 결과는 PluriSIn이 hPSC에 대해 현저하게 확고하고, 신속하며, 선택적인 세포독성 효과를 나타냄을 가리킨다.
실시예 3
PluriSIn의 작용 기전
본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이, 상기 15 개의 식별된 PluriSIn 중 9 개는 페닐하이드라진 부분(표 1 참조)을 포함한다. 구체적으로, PluriSIn #1, #5, #6, #9, #10 및 #14는 N'-페닐하이드라지드 부분(페닐하이드라진의 산 유도체)을 포함하고, PluriSIn #8 및 #13은 N'-페닐하이드라존 부분(페닐하이드라진의 케톤 또는 알데하이드 유도체)을 포함하며, PluriSIn#11은 N'-페닐하이드라존 부분으로 토오토머화 (tautomerizing)될 수 있는 N'-페닐하이드라진 부분을 포함한다.
상기 PluriSIn의 15개 중 9개에서 공통적인 페닐하이드라진 부분의 존재는 전체 "골든" 라이브러리에 비해 상기 부분의 대략 60-배 과잉-표시이며(p < 10-16), 이는 상기 부분이 상기 PluriSIn의 작용 또는 특이성의 기전에 관련될 수 있음을 암시한다.
상기 PluriSIn의 작용 기전을 추가로 추론하고자, 가장 효능있고 선택적인 화합물 PluriSIn #1(아이소니코틴산 N'-페닐하이드라지드)뿐만 아니라 PluriSIn #6(2-하이드록시-2-(티오펜-2-일)-2-페닐아세트산 4-메틸-N'-페닐하이드라지드)를 추가로 연구하였다.
독성유전체학 연구에서, 다양한 유형의 인간 ES 세포를 PluriSIn #1 또는 #6 또는 대조용 DMSO에 12 시간 동안 노출시켰으며, 상기 시점에서 세포사가 아직 관찰되지 않았다. 비교를 위해서, 인간 ES 세포로부터 유래된 초기 내배엽 선조세포(본 발명에서 상기에 기술된 바와 같이)를 마찬가지로 처리하였다. 이어서 RNA를 상기 세포로부터 유도하고, 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 유전자 발현 미세배열(애피메트릭스 U133a)을 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 이어서 다수의 생물정보학 도구를, 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, 섭동된 경로를 식별하기 위해서 상기 유전자 발현 변화의 분석에 적용하였다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 무감독 계층적 군집화는 처리되지 않은 대조군에 비해 상기 PluriSIn-처리된 미분화세포에서 현저한 유전자 발현 변화를 드러낸 반면, 처리된 분화세포에서는 상기와 같은 유전자 변화가 발생하지 않았다.
도 36에 나타낸 바와 같이, PluriSIn 처리는 세포사멸과 관련된 다수의 유전자 발현 변화(>2배 변화)를 생성시켰다.
통제해제된 유전자(>2배 변화)의 작용성 분석을 문헌[Huang et al., Nature Protocols 4:44-57 (2009)]에 기술된 바와 같이 DAVID 작용성 주석 도구를 사용하여 수행하였으며, 상기 분석은 세포사멸에 대한 현저한 강화(2.7배 강화, 벤자미니 보정후 p = 0.007)를 밝혀냈다.
세포사멸과 관련된 유전자 발현의 발견은 만능세포가 세포사멸을 일으키기 쉽다는 선행의 보고와 일치한다(Qin et al., Journal of Biological Chemistry 282:5842-5852 (2007); Momcilovic et al., PloS One 5:e13410 (2010)). 그러나, 만능세포는 또한 다른 유형의 세포사, 예를 들어 종양증(Tan et al., Stem Cells 27:1792-1801 (2009)) 및 자가포식현상(Alexander et al., PNAS 108:15828-15833 (2011))에 민감한 것으로 보고되었다. 따라서 PluriSIn #1에 의해 유도된 대량 hPSC 사망이 실제로 세포사멸인지를 확인하기 위해서 카스파제-3(세포사멸의 특징적인 집행자)에 대한 면역블럿팅 및 애넥신 V-FITC 검출 분석을 사용하였다.
도 37a 및 37b에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 처리는 처리후 16 시간째에 세포사멸 세포의 수를 대략 7 배 증가시킨다.
도 38에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 처리는 카스파제-3의 활성화를 증대시켰다.
PluriSIn #1-유도된 세포사에 대한 판카스파제 억제제 Z-VAD-FMK의 효과를 또한 검사하였다. 세포를 25 μM 또는 100 μM의 Z-VAD-FMK로 처리하고, 1 시간 후에 PluriSIn #1(20 μM)을 상기 배지에 가하였다. 24 시간후에, 상기 배양물에 대해, 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이 세포 생육력 측정을 수행하였다.
도 39에 나타낸 바와 같이, Z-VAD-FMK는 PluriSIn #1-유도된 세포사를 용량-의존적인 방식으로 현저하게 억제하였다.
이러한 결과는 세포사멸이 PluriSIn #1에 의해 유도된 세포사의 주요 기전임을 입증한다.
더욱 또한, 도 40에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 및 #6 처리는 소포체(ER) 스트레스 및 접히지 않은 단백질 반응(UPR)과 관련된 상당한 유전자 발현 변화를 생성시켰다. 일반적인 ER 스트레스 유도인자인 다이티오쓰레이톨(1 μM)에 의해 부여된 유전자 발현 변화를 양성 대조군으로서 사용하였다.
DAVID 작용성 분석은 ER 스트레스 반응에 대한 강화(12 배 강화)를 밝혀냈다.
PluriSIn 처리에 따라 가장 상향조절된 유전자는 UPR의 특징인 CHOP(또한 DDIT3로서 공지됨)이었다(9배 상향조절, p = 0.01).
UPR의 유의수준을 추가로 연구하기 위해서, UPR의 특징들인 XBP1 mRNA 연접 및 eIF2α 인산화를 추가로 검사하였다. 인간 ES 세포 및 ES-유래된 분화세포를 12 시간 동안 PluriSIn #1로 처리하고, 상기 연접된 아이소폼 sXBP1의 발현을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, 정량적인 PCR 및 면역블럿팅에 의해 측정하였다. 다이티오쓰레이톨(1 μM)에 의해 부여된 유전자 발현 변화를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 41에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 정량적인 PCR에 의해 측정된 바와 같이, 상기 연접된 아이소폼 sXBP1의 발현을 대략 3.5 배 증가시켰다.
도 42에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 면역블럿팅에 의해 측정된 바와 같이, hPSC 중 인산화된 eIF2α의 수준을 증가시켰다.
이들 결과는 PluriSIn #1이 hPSC 중 UPR을 유도함을 입증한다.
도 41 및 42에 각각 추가로 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 8-일 분화세포에서 eIF2α의 인산화 또는 상기 연접된 아이소폼 sXBP1의 발현을 증가시키지 않았다.
이어서 상기 유전자 발현 데이터를 연결성 지도(cmap), 생물활성 소분자로 처리된 배양된 인간 세포로부터의 전장 유전체 전사 발현 데이터의 데이터베이스를 사용하여 분석하였다. Cmap은 유사한 소분자가 부여하는 공통의 유전자 발현 변화를 근거로, 미지의 활성을 갖는 소분자에 의해 섭동된 경로의 발견을 촉진시키기 위해 개발되었다(Lamb et al., Science 313:1929-1935 (2006)). Cmap은 여러가지 기전들을 통해 작용하는 세포독성 화합물(예를 들어 세포주기 차단제, CDK 억제제, 국소이성화효소 억제제, 알칼로이드 등)을 포함하여, 1,309 개의 별도의 분자들을 나타내는 7,000 개 이상의 발현 프로파일을 포함한다. 상기 분석은 시험된 화합물과의 유사성을 기준으로 모든 화합물들을 나열하며, 유사성 정도를 나타내는 -1 내지 1의 "연결성 값"을 제공한다.
상기 cmap 데이터베이스는 PluriSIn #1으로 12 시간 처리에 따른 hPSC 중에서 상향조절되거나 하향조절된 2배 이상의 유전자들의 목록이 조회되었다. PluriSIn #1의 활성과 가장 유사한 활성을 나타내는 10 개 화합물을 기술하는 목록을 표 4에 제공한다. 유사한 조회를 PluriSIn #6에 대해서 수행하였으며, PluriSIn #6과 가장 유사한 활성을 나타내는 10 개 화합물을 기술하는 목록을 표 5에 제공한다.
PluriSIn #1에 대해서 높은 cmap 연결성 점수를 나타내는 상위 10 개 화합물(각각의 화합물에 대해서 p = 0.00000)
순위 Cmap 명칭 Cmap 점수
1 세파엘린(Cephaeline)** 0.897
2 사이클로헥스이미드(Cycloheximide)** 0.881
3 에메틴(Emetine)** 0.876
4 아니소마이신(Anisomycin)** 0.849
5 헬베티코사이드(Helveticoside) 0.766
6 고시폴(Gossypol) 0.735
7 라나토사이드(Lanatoside) C 0.733
8 디지톡시제닌(Digitoxigenin) 0.687
9 발리노마이신(Valinomycin)* 0.680
10 8-아자구아닌(Azaguanine)* 0.671
** 단백질 합성 억제제(cmap에서 정의된 바와 같음)
* 단백질 합성 억제제로서 cmap에서 정의되지 않았으나, 단백질 번역을 감소시키는 것으로 공지된 화합물들
PluriSIn #6에 대해서 높은 cmap 연결성 점수를 나타내는 상위 10 개 화합물(각각의 화합물에 대해서 p = 0.00000)
순위 Cmap 명칭 Cmap 점수
1 탑시가긴(Thapsigargin) 0.887
2 퓨로마이신(Puromycin)* 0.772
3 니클로스아미드(Niclosamide) 0.770
4 발리노마이신* 0.723
5 고시폴 0.702
6 에메틴** 0.681
7 알렉시딘(Alexidine) 0.673
8 세파엘린** 0.667
9 페녹시벤즈아민(Phenoxybenzamine) 0.648
10 5707885* 0.627
** 단백질 합성 억제제(cmap에서 정의된 바와 같음)
* 단백질 합성 억제제로서 cmap에서 정의되지 않았으나, 단백질 번역을 감소시키는 것으로 공지된 화합물들
표 4에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 활성은, 단백질 합성 억제제(PSI)가 상기 목록에서 매우 높은 연결성 점수로 가장 높은 순위이기 때문에, PSI의 활성과 매우 유사하다.
실제로, 오직 4 개의 화합물(세파엘린, 에메틴, 아니소마이신, 사이클로헥스이미드)만이 상기 cmap 데이터베이스(Iorio et al., PNAS 107:14621-14626 (2010))에서 진짜 PSI로서 분류되며, 이들은 모두 PluriSIn #1과 가장 유사한 10 개 화합물들 중에 나타났다(65-배 강화, p < 0.0001).
비교를 위해서, 상기 cmap 데이터베이스를 또한 PluriSIn #1으로 12 시간 처리에 따른 8-일 분화세포에서 2배 이상 상향조절되거나 하향조절된 유전자들의 목록에 대해 조회하였다. 상기 분석은 어떠한 소분자에 대해서도 유사성을 검출하지 못했으며, 이는 PluriSIn #1이 상기 세포에서 전체 유전자 발현을 변경시키지 않음을 입증한다.
유사하게, 표 5에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #6 활성은 단백질 합성 억제제(PSI)의 활성과 매우 유사하다.
PSI와 PluriSIn #1 및 #6간의 유사성은 UPR이 번역 감소를 도출할 수 있다는 사실과 일치한다. 이러한 연계성을 확인하기 위해서, 단백질 합성에 대한 PluriSIn #1의 효과를 측정하였다. 펄스-추적 방사성 표지 분석을 사용하여 PluriSIn #1의 존재 또는 부재 하에서 ES 세포 및 분화세포(섬유아세포)내로의 35S-Met의 결합을 측정하였다. 일반적인 단백질 합성 억제제인 사이클로헥스이미드(10 μM)를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 43에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 hPSC에서 단백질 합성을 대략 30%까지 감소시켰으나(p = 0.005), 분화세포(섬유아세포)에서는 효과를 나타내지 않았다.
상기 결과는 PluriSIn #1이 미분화세포에서 UPR 및 PSI를 도출하여, 이들 세포의 세포사멸을 발생시킴으로써 그의 세포독성 효과를 발휘함을 가리킨다. 더욱 또한, 전체적인 유전자 발현 변화가 상기 분화세포에서 확인되지 않았으며 세포사멸/UPR 유전자는 하향조절되지 않았다. PluriSIn #1이 분화세포에서 UPR 및 PSI를 유도하지 않기 때문에, PluriSIn #1은 미분화세포를 선택적으로 표적화하는 반면, 분화세포는 완전하게 남아있는다.
실시예 4
PluriSIn에 의한 SCD1의 억제
선행의 연구들은 PluriSIn 중 어느 것도 세포독성 효과를 나타내지 않음을 입증하였다(데이더 도시 안 됨). 그러나, PluriSIn #1 및 PluriSIn #6을 포함하여, 이들 화합물 중 3 개가 단일불포화 지방산(MUFA)의 생합성에서 핵심 효소인 SCD1의 가능한 직접적인 억제제로서 시험관내 생화학 선별에서 식별되었다. SCD1의 억제는 일부 인간암세포주에서 ER 스트레스 및 UPR을 유도하여, 상기 세포의 세포사멸을 도출하는 것으로 보고되었다(Roongta et al., Molecular Cancer Research 9:1551-1561 (2011); Minville-Walz et al., PloS One 5:e14363 (2010); Scaglia et al., PloS One 4:e6812 (2009); Hess et al., PloS One 5:e11394 (2010); Morgan-Lappe et al., Cancer Research 67:4390-4398 (2007); Mason et al., PloS One 7:e33823 (2012)).
PluriSIn이 SCD 억제를 통해 현저한 효과를 발휘하는지의 여부를 확인하기 위해서, PluriSIn #1에 의한 처리후 우리가 hPSC에서 관찰한 유전자 발현 변화를, 특정한 억제제 A939572에 의한 SCD1의 약물학적 억제에 따라 인간암세포주(H19299)에서 앞서 보고된 것들(Roongta et al., Molecular Cancer Research 9:1551-1561 (2011))과 비교하였다.
도 44에 나타낸 바와 같이, 문헌[Roongta et al., Molecular Cancer Research 9:1551-1561 (2011)]에 보고된 바와 같이, SCD1 억제에 따른 가장 현저한 발현 변화(p < 0.05, >2 배 변화)를 나타낸 18 개의 유전자 중 12 개가 또한 PluriSin #1 또는 #6 처리후 현저하게 하향조절되었다. 또한, 상기 언급한 유전자들 중 다수는 상기 ER 스트레스 경로와 관련되었다.
상기 결과는 PluriSIn에 의해 유도된 선택적 세포독성(및 ER 스트레스)이 SCD 억제를 통해 이행됨을 암시한다.
본 발명에 제공된 결과들은 SCD1 억제가, ER 샤프롱 GRP78의 발현에 영향을 미치지 않으면서 CHOP 발현의 예리한 증가를 특징으로 하는, 인간암세포주에서 독특한 UPR 활성화를 유도했다는 보고서와 일치한다(Minville-Walz et al., PloS One 5:e14363 (2010)). 실시예 3에 기술된 바와 같이, PluriSIn 처리는 접히지 않은 단백질 반응(UPR)을 유도하였으며, 이때 CHOP는 가장 상향조절된 유전자이다. 대조적으로, GRP78 발현은 PluriSIn 처리에 의해 그다지 변경되지 않았다(1.2-배, p = 0.13).
PluriSIn #1이 SCD 활성을 억제하는지의 여부 및 상기 억제가 만능세포로 제한되는지의 여부를 직접 검사하기 위해서, SCD1 활성을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 펄스-추적 표지 분석에 의해 측정하였다. 인간 ES 및 분화세포(각각 H9 및 BJ-섬유아세포)를 PluriSIn #1로 12 시간 동안 처리하고, 이어서 SCD1의 기질인 [1-14C] 스테아르산으로 표지하였다. 4 시간 이하로 배양한 다음, 지질을 정제하고, 이어서 효소 활성을 상기 SCD1 기질 및 생성물, [1-14C] 올레산의 방사성 강도의 직접 측정에 의해 평가하였다.
도 45에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 SCD1 활성을 ES 세포에서 대략 65% 감소까지 감소시켰다(p = 2.1 x 10-6).
hPSC 생육력이 실제로 작용성 SCD1 활성에 따라 변하는지의 여부를 측정하기 위해서, hPSC를 75 nM의 특정한 SCD1 억제제 A939572 및 CAY-10566에 48 시간 동안 노출시켰다. 세포사에 대한 올레산(SCD1 활성의 산물)의 외인성 보충 효과를 평가하기 위해서 일부 샘플에 100 μM 올레산을 보충하였다.
도 46에 나타낸 바와 같이, 상기 SCD1 억제제 A939572 및 CAY-10566은 각각 hPSC의 생육력을 상당히 감소시켰다(>80% 감소, A939572의 경우 p = 6.4 x 10-6, CAY-10566의 경우 p = 2 x 10-5). 상기 도면에 추가로 나타낸 바와 같이, 올레산은 SCD-1 억제제-유도된 세포사로부터 상기 세포를 완전하게 구하였다(A939572가 있는 올레산의 경우 p = 3 x 10-4, CAY-10566이 있는 올레산의 경우 p = 10-4).
이들 결과는 hPSC가 생존에 SCD 활성을 필요로 함을 입증한다.
hPSC 생육력에 대한 SCD 활성의 효과를 추가로 조사하기 위해서, PluriSIn-유도된 세포사멸로부터 세포를 구하는 올레산(SCD1의 직접적인 산물)의 외인성 보충 능력을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 과정을 사용하여 추가로 연구하였다. 세포를 증가하는 농도의 BSA-접합된 올레산(BSA-OA)의 존재 하에서 PluriSIn #1에 노출시켰다.
도 47 및 48에 나타낸 바와 같이, BSA-OA는 PluriSIn #1-유도된 세포사멸에 대해 세포를 용량-의존적인 방식으로 보호하였으며, 이때 고농도의 존재 하에서 완전한 구제가 발생한 반면, BSA 단독으로는 세포사멸에 대해 어떠한 보호도 제공하지 못했다. 상기 도면에 추가로 나타낸 바와 같이, 상기 보호는, BSA-OA가 대조용 세포에서 증식에 영향을 미치지 않았고 DNA-국소이성화효소 억제제(암사크린, 도 47)의 세포독성에 대해 세포를 보호하지 않았으므로, 특이적이었다.
비교를 위해서, 100 μM BSA-OA의 존재 하에서 20 μM의 PluriSIn #1, #2, #3 및 #6에 세포를 노출시켰다.
도 49에 나타낸 바와 같이, BSA-OA는 세포를 PluriSIn #1(p = 0.0004), PluriSIn #5(p = 0.0006) 또는 PluriSIn #6(p = 0.006)에 의해 유도된 세포사에 대해 보호하였으나, PluriSIn #2 또는 PluriSIn #3에 의해서 유도된 세포사에 대해서는 보호하지 못했다.
PluriSIn #1, PluriSIn #5 및 PluriSIn #6은 각각 페닐하이드라진 부분을 포함하고, PluriSIn #2 또는 PluriSIn #3은 상기와 같은 부분을 포함하지 않기 때문에, 상기 결과는 페닐하이드라진 부분을 포함하는 PluriSIn이 세포독성 기전을 공유함을 암시한다.
SCD1 억제가 PluriSIn #1에 대한 hPSC의 노출에 따라 관찰된 세포 섭동에 근원함을 확인하기 위해서, 상기 SCD1 억제제 A939572가 PluriSIn #1에 의해 유도된 세포 반응을 반복함을 확인하였다. ER 스트레스, 단백질 합성 억제 및 세포사멸을, PluriSIn #1 및 A939572로 모두 처리한 후에 상기 본 발명에 기술된 바와 같이 평가하였다.
도 50에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 및 A939572는 모두 미분화세포의 세포사멸을 유사한 방식으로 증대시켰다.
도 51에 나타낸 바와 같이, A939572는 연접된 아이소폼 sXBP1의 발현을, 정량적인 PCR에 의해 측정된 바와 같이 미분화 ES 세포에서 대략 2배까지 증가시켰으며 분화세포에서는 발현을 증가시키지 않았다.
도 52에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1 및 A939572는 모두 ES 세포에서 인산화된 eIF2α의 수준을, 면역블럿팅에 의해 측정된 바와 같이 유사한 방식으로 증가시켰으며, 분화세포에서는 발현을 증가시키지 않았다.
도 53에 나타낸 바와 같이, A939572는 ES 세포에서 단백질 합성을 대략 50%까지 감소시켰다.
도 54에 나타낸 바와 같이, 상기 ER 스트레스 유도인자 다이티오쓰레이톨 및 단백질 합성 억제제 사이클로헥스이미드는 배아줄기세포 및 분화세포(인간 섬유아세포) 모두에 대해 세포독성이며, 올레산은 세포를 그의 세포독성에 대해 보호하지 않는다.
상기 결과는 hPSC의 생존이 SCD1의 통상적인 활성에 의존하며, hPSC가 단일불포화 지방산(MUFA) 생합성 경로에서 섭동에 대단히 민감하고, hPSC에 대한 적어도 일부의 PluriSIn(예를 들어 페닐하이드라진 부분을 포함하는 PluriSIn)의 선택적인 세포독성은 SCD1 활성에 대한 그의 방해 및 SCD1 활성을 방해하는 상기 세포의 민감성과 관련됨을 가리킨다. 일부 암세포주와 유사하게, hPSC에서 SCD1 활성의 억제는 ER 스트레스 및 UPR을 유도한 다음, 번역 감소를 유도하고, 최종적으로 상기 세포의 세포사멸을 생성시킬 수 있다. 도 55는 상기와 같은 기전을 개략적으로 기술된다.
실시예 5
마우스 만능줄기세포 및 배반포에 대한 PluriSIn 세포독성의 효과
마우스 만능줄기세포(mPSC)는 다능성-관련된 연구에서 널리 사용되며, 따라서 mPSC-분화세포의 순수한 배양물을 생성시키는 것은 대단히 중요하다. 따라서 mPSC가 PluriSIn에 또한 민감한지의 여부를 측정하였다. R1 Oct4-GFP 마우스 ES 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고 PluriSIn #1, #2, #4 또는 #6에 20 μM의 농도에서 노출시켰으며, 이어서 상기 세포의 생육력을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, 발광성 생육력 분석 및 형광 현미경 영상화를 사용하여 24 시간, 48 시간 및 72 시간후에 평가하였다.
도 56에 나타낸 바와 같이, 상기 4 개의 시험된 PluriSIn은 각각 mPSC에서 상당한 정도의 세포사를 유도하였다. PluriSIn #6에 의해 유도된 세포사를 나타내는 전형적인 샘플을 도 57에 나타낸다. 이들 결과는 PluriSIn 민감성이 마우스 및 인간 PSC에 의해 공유됨을 가리킨다. PluriSIn에 의한 mPSC의 억제는 hPSC의 억제만큼 효율적이지 않았으며, 상기 화합물들에 대한 보다 긴 노출을 필요로 하였다. 이는 마우스와 인간 PSC간의 고유한 차이의 결과일 수 있으나, 또한 이들 세포 유형을 배양하는데 사용되는 상이한 배지 및 인자들에 기인할 수도 있다.
이어서 PluriSIn #1이 내세포 집단(ICM) 세포(이로부터 ES 세포가 유래된음)에 대해 세포독성인지의 여부를 확인하기 위해서 마우스 시스템을 사용하였다. SCD1 활성이 생체내에서 만능세포에 중요하다면, PluriSIn #1은 상기 ICM 세포에 대해 세포독성일 것이며 따라서 정상적인 배발생에 유해할 것임이 가정되었다.
상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, 일련의 독립적인 실험들을 2 개의 마우스 계통을 사용하여 수행하였으며, 여기에서 2-세포 배를 교미후 대략 1.5일째에 임신한 마우스의 난관으로부터 수거하고, 이어서 상기 배를 시험관내에서 발생되게 두었다. 상기 배는 교미후 대략 3.5일에 상실기에 도달했으며, 이어서 상기 배를 20 μM PluriSIn #1을 갖는 점적액(총 17 개의 배), 20 μM PluriSIn #1 및 100 μM 올레산을 갖는 점적액(총 7 개의 배) 또는 0.2% DMSO를 갖는 대조용 점적액(총 8 개의 배)으로 옮긴 반면, 다른 대조용 배들은 전혀 이동없이(총 10 개의 배) 발생되게 두었다. 광학현미경 영상화를 사용하여, 상기 배들의 발생을, 상기 배들이 성숙한 배반포로 될때까지(교미후 대략 4.5일째, 그 후에 모든 배는 배양물 중에서 붕해되었음) 추적하였다. 이어서 상기 배반포를 3 개의 별개의 범주들, 즉 (A) 크고 독특한 ICM을 갖는 양호한 질의 마우스 배반포; (B) 독특하지만 보다 작은 ICM을 갖는 마우스 배반포; 및 (C) 식별할 수 없는 ICM을 갖는 나쁜 질의 마우스 배반포로 분류하였다(Cortes et al., Stem Cells and Development 17:255-267 (2008)).
0.2% DMSO를 갖는 점적액으로 이동된 8 개의 대조용 배반포 모두 및 새로운 점적액으로 이동되지 않은 10 개의 대조용 배반포 모두, 독특한 ICM을 갖는 배반포로 발생하였다(범주 A/B).
대조적으로, PluriSIn #1에 노출된 배들 중 절반 미만(7/17)은 양호한 질(범주 A/B)의 배반포로 발생된 반면, 다른 배들(6/17)은 식별된 ICM이 없는 배반포(범주 C)로 발생되거나 또는 상실기(4/17)에 갇혔다. PluriSIn #1에의 노출후 배의 운명의 이러한 현저한 차이는 매우 유의수준이었다(p = 0.0001).
배반포의 전형적인 예들을 도 58에 나타내며, 상기 도면은 양호한 질의 대조용 배반포 및 PluriSIn-처리된 배반포, 나쁜 질의 PluriSIn-처리된 배반포 및 상실기에 갇힌 PluriSIn-처리된 배를 나타낸다.
도 59 및 60에 나타낸 바와 같이, 올레산 보충은 PluriSIn #1의 효과로부터 대부분의 배를 구제하였으며, 이때 7 개의 올레산-보충된 배 중 5 개(71%)는, 올레산 부재하에서의 17 개 중 7 개(41%)와 상반되게, 양질의 배반포로 발생하였다.
이어서, PluriSIn #1의 효과가 SCD1 활성의 억제와 관련있음을 입증하기 위해서, 마우스 배를 사용한 상기 실험들을 PluriSIn #1 대신에 SCD1 억제제 A939572를 사용하여 반복하고 PluriSIn #1에 의해 획득된 결과와 비교하였다.
도 60 및 61에 추가로 나타낸 바와 같이, A939572는 배반포의 발생을 현저하게 억제하였으며, 이때 A939572에 노출된 9 개의 배 중 단지 5 개(56%)만이, 18 개의 대조용 배 중 18 개와 상반되게, 양질의 배반포로 발생하였다(p = 0.007). 상기 도면에 추가로 나타낸 바와 같이, 올레산 보충은 양질의 배반포의 비율을 7 개 중 5 개(71%)로 증가시켰다.
이러한 결과는 PluriSIn #1이 ICM 세포에 대해 세포독성이고 따라서 상기 배반포의 통상적인 발생은 제외함을 가리킨다. 이러한 결과는 또한 SCD1에 대한 PSC의 의존성(예를 들어 실시예 4에 기술된 바와 같이)이 시험관내 및 생체내 모두에서 다능성 상태에 내재하며, ICM 세포에 대한 PluriSIn #1의 세포독성이 SCD1 활성의 억제와 관련됨을 가리킨다.
실시예 6
기형종에 대한 PluriSIn 세포독성의 효과
선택적인 hPSC 억제의 한 가지 특히 바람직한 목적은 배양물로부터 잔류 미분화세포의 효율적인 제거에 의해 기형종 형성을 방지하는 것이다. 따라서 상기와 같은 용도에 대한 PluriSIn의 유용성을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 시험하였다.
먼저 상기 PluriSIn을 다양한 배양 조건 및 노출 지속기간으로 시험하였다. 흥미롭게도, PluriSIn은 보다 큰(6-웰 또는 10 ㎝) 플레이트에서보다 보다 작은(384- 또는 96-웰) 플레이트에서 더 효능이 있었고 높은 세포 밀도에서보다 낮은 세포 밀도에서 더 효능이 있었으며, 이는 큰 콜로니에 의해 부여된 가능한 보호 효과를 암시한다.
따라서, 예를 들어 도 62에 나타낸 바와 같이, 20 μM PluriSIn #1에 대한 세포의 48 시간 노출이, 6-웰 플레이트에서 배양된 미분화세포의 완전한 제거에 필요하였다.
또한, 도 63a 및 63b에 나타낸 바와 같이, 정규의 ES 세포 배지와 함께 MEF(마우스 배아 섬유아세포)상에서 배양된 hPSC는 PluriSIn에 대해 덜 민감하였다. 이러한 결과는 상이한 배지 조성에 기인하거나 또는 상기 MEF의 보호 효과에 기인할 수 있다.
상기 시험된 조건 가운데, PluriSIn이 mTeSR1 한정된 배지를 사용하여 매트리젤(상표)-코팅된 플레이트상에서 배양보조세포 없이 배양될 때 가장 효능있게 hPSC를 제거하는 것으로 밝혀졌다.
이어서 시험관내에서 PluriSIn #1 적용후 배양물 중에 남아있는 잔류 미분화세포의 수를 평가하고, 상기와 같은 세포의 생체내 종양형성성을 측정하였다.
혼합된 세포 집단을 6-웰 플레이트에서 배양하고 PluriSIn #1에 48 시간 동안 노출시켰다. 이어서 상기 세포를 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이, FACS 분석에 의해, 다능성 마커 TRA-1-60에 대한 염색을 사용하여 및 OCT4의 형광 현미경 영상화에 의해 분석하였다.
도 64에 나타낸 바와 같이, 48 시간 동안 PluriSIn #1에 대한 노출은 FACS 분석에 의해 측정된 바와 같이, 배양물로부터 상기 만능세포의 99% 이상을 제거하였다.
도 65에 나타낸 바와 같이, 48 시간 동안 PluriSIn #1에 대한 노출은 CSES2-SO2/3 세포의 형광 현미경 영상화에 의해 측정된 바와 같이, 거의 모든 OCT4-발현 세포를 제거하였다.
이들 결과는 PluriSIn #1이 혼합된 세포 집단으로부터 만능세포를 제거함에 있어서 매우 유효함을 가리킨다.
생체내 종양형성성을 평가하기 위해서, hPSC를 PluriSIn #1의 존재 또는 부재 하에서 상기 언급한 조건 하에 배양하고, 이어서 상기 배양물을 면역-타협된 NOD-SCID IL2Rγ-/- 마우스(앞서 인간-유래된 종양에 특히 민감한 것으로 보고되었다(Quintana et al., Nature 456:593-598 (2008)))에게 피하 주사하였다. 마우스를 4 내지 6주 후에 죽이고, 이어서 기형종 형성을 평가하였다.
대조용 H9 ES 세포가 주사된 모든 마우스(3/3)는 기형종을 발생한 반면, PluriSIn #1-처리된 H9 ES 세포가 주사된 마우스 중 어느 것도(0/3) 기형종을 발생시키지 않았다.
유사하게, CSES2-SO2 및 BJ-iPS28 세포주를 면역-타협된 마우스(각 세포주에 대해서 2 마리 마우스)에게 주사하고, 이때 대조용 세포 및 처리된 세포는 상기 같은 동물의 신체 양쪽에 주사되었다.
상기 주사된 마우스는 모두(4/4) 대조용 hPSC를 주사한쪽에서만 기형종이 발생하였다. 도 66a 및 66b는 처리되지 않은 세포가 주사된쪽에서만 기형종이 발생한 전형적인 예를 나타낸다.
PluriSIn의 효과는 기형종 형성에 있었으며 이어서 이를 임상 환경을 시뮬레이션하도록 설계된 모델에서 평가하였다. 인간 ES 및 iPS 세포는 10일의 기간 동안 배양물 중에서 자발적으로 분화되었으며, 이어서 상기 분화세포를 수확하고 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 미분화 및 분화세포의 1:1 혼합물 중에서 미분화세포와 함께 도말하였다. PluriSIn #1에 48 시간 노출에 이어서, 세포를 수확하고 NOD-SCID IL2Rγ-/- 마우스에게 피하 주사하였으며, 이때 각각의 마우스에게 그의 신체 중 한쪽에 PluriSIn #1-처리된 세포를 주사하고 대조용 세포는 다른쪽에 주사하였다. 동일한 총 수의 세포를 양쪽에 주사하였다.
상기 주사된 마우스는 모두(4/4) 대조용 hPSC를 주사한 쪽에서만 기형종이 발생하였다. 도 67a 및 67b는 처리되지 않은 세포가 주사된 쪽에서만 기형종이 발생한 전형적인 예를 나타낸다. 도 68에 나타낸 바와 같이, 기형종 발생은 조직검사에 의해 확인되었다.
하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 합쳐서 생각하면, 어떤 기형종도(0/11) PluriSIn #1-처리된 hPSC의 이식시 마우스에서 발생하지 않은 반면, 처리되지 않은 세포는 이식시 항상 기형종을 발생시켰다(10/10). 유사하게, 어떤 기형종도(0/4) PluriSIn #1-처리된 분화 및 미분화 hPSC의 1:1 혼합물 이식시 마우스에서 발생하지 않은반면, 처리되지 않은 혼합물은 이식시 마우스에서 항상 기형종을 발생시켰다(4/4).
PluriSIn #1-처리되거나 처리되지 않은 hPSC의 주사에 따른 기형종 형성의 발생률
대조용(처리되지 않은 hPSC) PluriSIn #1-처리된 hPSC
미분화세포 단독 10/10 11/11
미분화 및 분화세포의 1:1 혼합물 4/4 0/4
상기 결과는 PluriSIn이 hPSC-유래된 세포의 배양물로부터 종양형성성 미분화세포를 제거하는데 효율적으로 사용될 수 있음을 가리킨다.
실시예 7
만능줄기세포 억제에 대한 SCD1 억제제의 효과
본 발명에서 상기에 기술한 바와같이, SCD1 억제제 A939572 및 CAY-10566은 만능줄기세포의 생육력에 있어서 상당한 감소를 유발하였으며, SCD 억제 효과를 나타내는 PluriSIn은 혼합된 세포 집단으로부터 만능세포를 제거하고 hPSC-유래된 세포의 배양물로부터 종양형성성 미분화세포를 제거함에 있어서 유효하였다.
종양형성성 미분화세포에 대한 SCD1 억제제의 효능을 확인하기 위해서, 특정한 SCD 억제제 A939572를 실시예 6에 기술된 바와 같은 과정을 사용하여 배아줄기세포의 이식에 따른 기형종 형성의 방지에 대해서 시험하였다.
도 69에 나타낸 바와 같이, A939572에 의한 처리는 마우스에서 배아줄기세포의 이식시 기형종 형성에 대한 보호 효과를 나타내었다.
상기 결과는 SCD1 활성의 억제가 hPSC-유래된 세포의 배양물로부터 종양형성성 미분화세포를 제거하는데 효율적으로 사용될 수 있음을 가리킨다.
종양형성성 미분화세포에 대한 SCD1 억제제의 효능을 추가로 확인하기 위해서, 추가적인 특정한 SCD 억제제(예를 들어 CAY-10566)를 본 발명에서 상기에 기술된 바와 같이, 배아줄기세포의 이식에 따른 기형종 형성의 예방에 대해서 시험한다.
실시예 8
만능줄기세포 억제에 대한 SCD1 발현의 siRNA 녹다운의 효과
본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이, SCD1 억제제 A939572 및 CAY-10566은 만능줄기세포의 생육력에 있어서 상당한 감소를 유발하였으며, 이는 PluriSIn의 SCD 억제 효과와 일치한다.
SCD1 억제가 일반적으로 만능줄기세포를 억제할 수 있음을 추가로 입증하기 위해서, SCD1 발현을 상기 물질 및 방법 섹션에 기술된 과정을 사용하여 상기 SCD1 유전자의 siRNA 녹다운을 사용하여 억제시켰다. 처리되지 않은 세포 및 모의 siRNA로 처리된 세포를 대조용으로서 사용하였다. 이어서 상기 만능줄기세포의 생육력을 측정하였다.
도 70 및 71에 나타낸 바와 같이, 상기 SCD1 유전자의 siRNA 녹다운은 줄기세포의 생육력을 상당히 감소시켰다(p = 0.002).
도 71에 나타낸 바와 같이, 상기 생육력의 감소는 siRNA의 용량에 따라 변하였다.
도 71에 나타낸 바와 같이, 올레산의 외인성 보충은 상기 세포를 상기 SCD1 유전자의 siRNA 녹다운으로부터 구하였다(p = 0.006).
이러한 결과들은 SCD1 억제가 일반적으로 만능줄기세포를 억제할 수 있고 상기 SCD1 억제가 핵산 침묵화 서열을 통해 수행될 수 있음을 추가로 입증한다.
실시예 9
미분화 암세포에 대한 PluriSIn 세포독성의 효과
미분화세포의 선택적인 억제는 암세포의 선택적인 억제, 예를 들어 암치료의 가능성을 허용한다. 따라서 미분화 암세포에 대한 PluriSIn #1의 효과를 시험하고 관련된 분화세포에 대한 효과와 비교하였다.
하나의 실험에서, 불멸화된 BJ 섬유아세포를 분화세포로서 제공하였으며 세포 형질전환을 겪도록 유도된 BJ 섬유아세포(미분화 암성 대응물로서 제공되었음)와 비교하였다. 섬유아세포를 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)의 발현에 의해 불멸화시키고, 문헌[Scaffidi & Misteli, Nature Cell Biology 13:1051-1061 (2011)]에 기술된 과정에 따라, hTERT 및 발암성 돌연변이체 H-RasV12의 발현과, 유인원 바이러스 40(SV40) 대-T(LT) 및 소-T(ST) 항원에 의한 p53 및 망막모세포종 단백질(RB)의 억제의 동반적인 조합에 의해 형질전환시켰다.
두 번째 실험에서, 미분화 줄기-유사 신경교종세포(SLGC)를 문헌[Campos et al., Clinical Cancer Research 16:2715-2728 (2010)]에 기술된 과정에 따라, 단층 부착 및 1 주일 동안 1 μM 레티노산에의 노출에 의해 분화된 SLGC와 비교하였다. SLGC의 분화는 종양형성성의 감소와 관련된다(Campos et al., Clinical Cancer Research 16:2715-2728 (2010)).
상기 분화 및 미분화세포를 낮은(2%) 소 태아 혈청 조건 하에서 72 시간 동안 100 μM 이하의 농도의 PluriSIn #1에 노출시켰다. 이어서 상기 세포의 생육력을 본 발명에서 상기에 기술한 바와 같이 메틸렌 블루 생육력 분석을 사용하여 측정하였다.
도 72에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 형질전환된 BJ 섬유아세포에 대해 고도로 세포독성인 반면, 정상(불멸화된) BJ 섬유아세포에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았다.
상기 결과는 암세포를 생성시키는 세포 형질전환이 PluriSIn #1에 대한 세포 민감성을 현저하게 증가시킴을 가리킨다.
도 73에 나타낸 바와 같이, PluriSIn #1은 미분화 SLGC에 대해 고도로 세포독성이었지만, 분화된 SLGC에 대해서는 뚜렷한 효과가 없었다.
상기 결과는 암세포는 단지 1 주일의 분화후조차도, 비-종양형성성 세포로 분화시 PluriSIn #1에 대한 그의 민감성을 상실함을 가리킨다.
상기 결과는 PluriSIn이 만능줄기세포에 대해 선택적으로 세포독성인 것과 같은 방식으로, 미분화 암세포(예를 들어 암 줄기-유사 세포)에 선택적으로 세포독성임을 암시한다.
본 발명을 그의 특정한 실시태양들과 함께 기술하였지만, 다수의 대안, 변형 및 변화들이 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것은 분명하다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 진의 및 넓은 범위내에 있는 상기와 같은 모든 대안적인 변형 및 변화들을 포함하고자 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 본 발명에 참고로 인용됨을 구체적이고 개별적으로 가리키는 바와 같은 정도로, 내용 전체가 상기 명세서에 참고로 인용된다. 또한, 본 출원의 어떠한 참고문헌에 대한 인용이나 확인을, 상기와 같은 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 유효하다는 승인으로서 해석해서는 안 된다. 섹션 표제를 사용하는 경우에, 상기 표제를 반드시 제한으로서 해석해서는 안 된다.

Claims (22)

  1. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 I 화합물의 용도:
    화학식 I
    Figure pct00021

    상기 식에서,
    R1은 수소이고,
    R2는 수소,
    2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
    2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
    -NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
    피리디닐카보닐,
    2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
    (C1-6)알킬-카보닐,
    N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
    나프틸설포닐 및
    N-하이드록시-아세트이미도일로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는
    R1은 벤조일이고 R2는 4-클로로벤즈아미도이며;
    R3 및 R4는 독립적으로 수소, 할로, NH2, 바이페닐옥시메틸 및 (C1-4)알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되나, 단
    R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소, 할로, NH2 또는 (C1-4)알킬이 아니다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 수소이고,
    R2가 2,4-다이옥소-5-플루오로피리미딘-1-일카보닐,
    2-메틸벤조퓨란-3-일메틸렌아미노 및
    -NH-R5로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 R5는
    피리디닐카보닐,
    2-하이드록실-2-페닐-2-티오펜-2-일-아세틸,
    (C1-6)알킬-카보닐,
    N-(에톡시카보닐메틸)-2,4-다이옥소-피롤리딘-3-일리덴-메틸,
    나프틸설포닐 및
    N-하이드록시-아세트이미도일로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나; 또는
    R1이 벤조일이고 R2가 4-클로로벤즈아미도이며;
    R3 및 R4가 독립적으로 수소, 클로로, NH2 및 메틸로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 용도.
  3. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 II 화합물의 용도:
    화학식 II
    Figure pct00022
  4. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 III 화합물의 용도:
    화학식 III
    Figure pct00023
  5. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 IV 화합물의 용도:
    화학식 IV
    Figure pct00024
  6. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 V 화합물의 용도:
    화학식 V
    Figure pct00025
  7. 미분화세포의 세포독성 억제제로서 하기 화학식 VI 화합물의 용도:
    화학식 VI
    Figure pct00026
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화세포가 만능줄기세포를 포함하는 것인, 용도.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화세포가 미분화 암세포를 포함하는 것인, 용도.
  10. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 미분화세포의 억제에 사용하기 위해 식별된 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 미분화세포가 만능줄기세포를 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 미분화세포가 미분화 암세포를 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위해 식별된 조성물.
  15. 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하는 방법으로, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은 화합물을 투여함을 포함하는 방법.
  16. 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은 화합물의 용도.
  17. 미분화세포의 증식과 관련된 증식성 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환 또는 장애을 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에에 기술된 바와 같은 화합물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환 또는 장애이 기형종, 미분화암, 백혈병, 뇌암, 유방암, 결장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 폐암, 두경부암, 중간엽암 및 다발성 골수종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 조성물, 방법, 용도 또는 화합물.
  19. 만능줄기세포의 억제를 위한 선두 후보의 식별 방법으로,
    (a) 다수의 만능줄기세포 샘플을 제공하고, 이때 상기 샘플들은 각각 상이한 유형의 만능줄기세포를 포함하고;
    (b) 상기 샘플을 후보 화합물과 접촉시키고;
    (c) 상기 샘플에서 상기 줄기 세포의 생육력을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 샘플 중 적어도 2 개에서 감소하는 경우, 상기 후보 화합물을 만능줄기세포를 억제할 수 있는 것으로서 식별하고, 이에 의해 선두 후보를 식별함을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (d) 적어도 하나의 분화세포 샘플을 제공하고;
    (e) 상기 적어도 하나의 샘플을, 만능줄기세포 집단을 감소시킬 수 있는 것으로서 식별된 화합물과 접촉시키고;
    (f) 상기 적어도 하나의 샘플에서 상기 분화세포의 생육력을 모니터하고, 이때 상기 생육력이 상기 적어도 하나의 샘플에서 유지되는 경우, 상기 화합물을 만능줄기세포를 선택적으로 억제할 수 있는 것으로서 식별함을 또한 포함하는, 만능줄기세포의 선택적인 억제를 위한 선두 후보의 식별 방법.
  21. 만능줄기세포의 세포독성 억제제로서 SCD1(스테아로일-CoA 불포화효소-1) 억제제의 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 SCD1 억제제가 A939572, CAY-10566, MF-438, CVT-11127, GSK-993, 5-(테트라데실옥시)-2-퓨로산 및 SCD1에 대한 핵산 침묵화 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.




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