TW202307196A - 改良式模擬神經病症之培養系統及方法 - Google Patents

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Abstract

本申請提供一種多能幹細胞衍生的神經元培養系統，該神經元培養系統用於模擬神經退化性疾病、藥物篩選及標的探索；以及從多能幹細胞產生同質、終末分化的神經元培養物之方法，及由其產生之組成物；以及維持神經元細胞之長期分化、成熟及/或生長的自動化細胞培養系統，該自動化細胞培養系統用於模擬神經退化性疾病。

Description

改良式模擬神經病症之培養系統及方法
本揭露一般而言涉及自動化培養系統、使用該等自動化培養系統產生完全分化的子代細胞之同質族群 (homogenous population) 的方法及神經疾病模型，以及用於模擬神經病症及疾病的改良系統。
目前的囓齒動物阿滋海默症 (AD) 模型重演了與澱粉樣蛋白斑塊相關的病理，然而，澱粉樣蛋白介導之 tau 病理及神經元喪失尚未得到穩健模擬，從而排除了對 Aβ 誘導之 Tau 病理事件的研究以及對人類患者的轉譯。轉譯藥物開發需要開發能夠穩健地模擬 AD 病理生理學的臨床前模型。人類誘導多能幹細胞 (iPSC) 神經元及小神經膠質細胞分化方案的進步已為使用生理相關細胞進行臨床前人類疾病模擬創造了新的可能性，並且可以結合強有力的遺傳及分子工具來發現新的標的及藥物篩選。然而，iPSC 分化及培養方案冗長且多變，對保持一致性提出了挑戰。此外，儘管已經產生了許多 iPSC 模型，但尚未觀察到穩健的澱粉樣斑塊形成、磷酸化 Tau 或神經元喪失表型。在這裡，我們產生了一個自動化、一致及長期的人類 iPSC 神經元、星狀膠質細胞及小神經膠質細胞培養平台，用於高通量、高內容成像及疾病模擬。使用該平台，我們產生了人類 iPSC AD 模型，該模型在一個模型中表現出多個關鍵的人類 AD 病理特徵，包括澱粉樣蛋白-β (Aβ) 斑塊、斑塊周圍的營養不良神經突 (neurite)、突觸喪失、樹突回縮、軸突片段化、磷酸化 Tau 誘導及神經元細胞死亡。使用該模型，我們證明了人類 iPSC 小神經膠質細胞內化並壓縮 Aβ 以產生並圍繞斑塊，從而賦予一些神經保護。即使斑塊形成增加，該保護在神經炎性培養條件下也喪失了。抗 Aβ 抗體保護神經元免受此等病理的影響，並且在 pTau 誘導之前最有效。我們執行定向篩選 (focused screen)，並鑑定 AD 訊號傳導途徑中的幾種已知激酶，諸如 GSK3、DLK、Fyn，顯示病理訊號傳導事件保留在該系統中。總之，此等結果表明該模型可用於標的探索及藥物開發。
在一些態樣中，本揭露提供一種用於促進神經元分化及/或提升長期神經元生長之自動化細胞培養系統，其中該自動化細胞培養系統包含一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。在一些實施例中，該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；及/或該細胞培養系統包含一個或多個 96 孔盤；或一個或多個 384 孔盤。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端 (pipet tip) 抽吸，其中：在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中：在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中：在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中：(a) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；以及/或 (b) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中：(a) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 的速度插入孔內；以及/或 (b) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之從孔中退出。在一些實施例中，該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架 (rack of 384-pipet tips) 且自動接合新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中：該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：(a) 在分配之前，移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處；以及/或 (b) 在分配期間，移液管尖端以約 1 mm/s 的速度從孔中退出。在一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：在分配之前及/或期間，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。在一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。在一些實施例中，該細胞培養系統包含 384 孔組織盤；其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：(a) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1 mm 之該孔的第一側；以及/或 (b) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角。在一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：(a) 培養基分配之速度不超過約 1.5 µl /s；(b) 培養基分配之加速度為約 500 µl /s 2；(c) 培養基分配之減速度為約 500 µl /s 2；以及/或 (d) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。在一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：(a) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (b) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。在一些實施例中，該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在一些態樣中，本揭露提供一種從多能幹細胞產生同質且終末分化的神經元之方法，其包含：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養 (replating) 該等 PSC 衍生的神經元；(d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些態樣中，本揭露提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少 95% 之該等神經元表現：Map2；突觸蛋白 (Synapsin) 1 及/或突觸蛋白 2；以及 β-III 微管蛋白。在一些態樣中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中：(a) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或 (b) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1；以及/或 (c) 神經元之至少 100 個突觸後末端係與其他神經元之突觸前末端重疊及/或該神經元之至少 100 個突觸前末端係與其他神經元之突觸後末端重疊。在一些實施例中，至少 95% 之該等神經元表現兩個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或兩個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。在一些實施例中，至少 95% 之該等神經元表現一種或多種上層皮質神經元標記，視需要其中不超過 5% 之該等神經元表現一種或多種下層皮質神經元標記。在一些實施例中，至少 95% 之神經元表現 CUX2，視需要其中不超過 5% 之神經元表現 CTIP2 或 SATB2。在一些實施例中，從多能幹細胞衍生終末分化之神經元的方法包含：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在表現 NGN2 及 ASCL1 的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元；(d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。在一些實施例中，該等神經元以高度可複製性方式表現樹突、細胞體、軸突及突觸之代表性標記。在一些實施例中，在神經元中的樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性，其中 MAP2、CUX2、Tau 及突觸蛋白 1/2 中的每一者之 z 因數至少為 0.4。
在一些態樣中，本揭露提供一種用於模擬神經退化性疾病之多能幹細胞衍生的神經元培養系統，其中該培養系統包含實質上確定的培養基，並且其中該培養系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。在一些實施例中，該神經退化性疾病為阿滋海默症，其中：(a) 該等疾病相關成分包含可溶性 Aβ 物質；(b) 該疾病相關成分包含突變 APP 之過表現，視需要其中該等疾病相關成分包含突變 APP 之可誘導過表現；(c) 該疾病相關成分包含促炎性細胞激素；(d) 該神經保護成分包含抗 Aβ 抗體；(e) 該神經保護成分包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑；以及/或 (f) 該神經保護成分包含小神經膠質細胞。在一些實施例中，該系統不包含基質膠 (matrigel)。在一些實施例中，該系統包含完全確定的培養基及/或基質。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物及/或可溶性 Aβ 原纖維。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：神經元培養物中之 Tau 蛋白在 S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 殘基中之一者或多者中為過度磷酸化。在一些實施例中，該培養系統包含一種或多種包含可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示增加的神經元毒性。在一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少。在一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：當與不包含可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少。在一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示神經元中之 Tau 磷酸化的增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度；當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度；當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度；並且當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度。在一些實施例中，該第一濃度高於該第二、第三及第四濃度；以及/或該第二濃度高於該第三及第四濃度；以及/或該第三濃度高於該第四濃度。在一些實施例中，該第一濃度為約 5 μM，該第二濃度為約 2.5 μM，該第三濃度為約 1.25 μM，且該第四濃度為約 0.3 μM。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，其中當與不包含可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 表現及/或該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 片段化。在一些實施例中，該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中：該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構。在一些實施例中，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良 (neuritic dystrophy)。在一些實施例中，至少該甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突圍繞，視需要其中該等神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及/或磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡 (blebbing) 標記，進一步視需要其中該等神經突為營養不良的。在一些實施例中，經神經突圍繞之斑塊或斑塊樣結構表現出：位於澱粉樣斑塊中之 ApoE 表現及/或在該等神經突之膜中的 APP。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該培養系統包含：包含可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分、包含神經炎性細胞激素的疾病相關成分及包含小神經膠質細胞的神經保護成分。在一些實施例中，該小神經膠質細胞為 iPSC 衍生的小神經膠質細胞並且表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。在一些實施例中，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。在一些實施例中，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。在一些實施例中，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出神經元毒性變化小於 10%。在一些實施例中，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 sAβ 斑塊締合及/或增加的 sAβ 斑塊形成。在一些實施例中，該神經元培養系統包含疾病相關成分，該疾病相關成分包含 (1) 包含可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，以及 (2) 包含小神經膠質細胞的神經保護成分。在一些實施例中，該等神經元表現出 DLK、GSK3、CDK5 及 Fyn 激酶訊號傳導中之一者或多者。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該神經元培養物包含來自多能幹細胞之同質且終末分化的神經元，其中該等來自多能幹細胞之同質且終末分化的神經元在包含以下步驟的方法中產生：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養 (replating) 該等 PSC 衍生的神經元；(d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
在根據本文所述同質族群、方法或神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，使 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。在一些實施例中，該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；及/或其中該細胞培養系統包含一個或多個 384 孔盤。在一些實施例中，該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5 µl /s；(e) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 200ms；(f) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述同質族群、方法或細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在分配期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 1.5 µl /s；(h) 培養基分配之加速度為約 500 µl /s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 500 µl /s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述同質族群、方法或神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該細胞培養系統包含 384 孔盤，進一步其中：(a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中：(a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述同質族群、方法或細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，(a) 兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，(a) 兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在一些態樣中，提供一種篩選增加神經保護的化合物的方法，其包含：使該化合物與所述神經元培養系統中之任一者中的神經元培養物接觸，以及量化神經保護中之改善。在一些實施例中，神經保護中之改善包含：增加該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突。在一些實施例中，該方法包含量化在該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量的增加：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突，其中：(a) 樹突之數量係藉由該神經元培養物中 MAP2 的水平來測量；(b) 突觸之數量係藉由該神經元培養物中突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2 的水平來測量；(c) 細胞計數之數量係藉由該神經元培養物中 CUX2 的水平來測量；以及/或 (d) 軸突之數量係藉由該神經元培養物中 β III 微管蛋白的水平來測量。在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：(a) 該神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%；(b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%；(c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%；當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：(a) 該神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%；(b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%；(c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%；當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。
相關申請之交叉引用
本申請主張 2021 年 6 月 17 日申請的美國臨時申請第 63/212,063 號的優先權權益，其內容藉由引用方式全文併入本文。
在一些態樣中，提供一種用於模擬神經退化性疾病 (諸如阿滋海默症) 之多能幹細胞衍生的神經元培養系統，其中該培養系統包含實質上確定的培養基，並且其中該培養系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。還提供使用此神經元培養系統用於神經退化性疾病的藥物篩選及標的探索的方法。進一步提供從多能幹細胞產生同質、終末分化的神經元培養物之方法，由此所得之組成物，以及此類神經元培養物及組成物用於神經退化性疾病及模擬的用途。此外，還揭露維持神經元細胞的長期分化、成熟及/或生長的自動化細胞培養系統，以及此類系統在產生用於模擬神經退化性疾病及藥物篩選之終末分化的神經元培養物中的用途。 一般技術
本文所述或引用之技術和程序為本領域中的技術人員一般眾所周知並通常使用常規方法來實施的，例如，以下文獻中所述之得到廣泛應用的方法： Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al.，第 4 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)； Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等人主編，2003)；叢書 Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)； PCR 2: A Practical Approach(M.J. MacPherson，B.D.Hames 和 G.R.Taylor 主編，1995)； Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)； Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第 6 版，J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait 主編，1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E.Cellis 主編，Academic Press，1998)； Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather 和 P.E.Roberts，Plenum Press，1998)； Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle，J.B.Griffiths 和 D.G.Newell 主編，J. Wiley and Sons，1993-8)； Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 主編，1996)； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller 和 M.P. Calos 主編，1987)； PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis 等人主編，1994)； Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan 等人主編，1991)； Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人主編，J. Wiley and Sons，2002)； Immunobiology(C.A.Janeway 等人，2004)； Antibodies(P. Finch, 1997)； Antibodies: A Practical Approach(D. Catty. 主編，IRL Press，1988-1989)； Monoclonal Antibodies: A Practical Approach(P. Shepherd 和 C. Dean 主編，Oxford University Press，2000)； Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow 和 D. Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)； The Antibodies(M. Zanetti 和 J. D. Capra 主編，Harwood Academic Publishers，1995)；及 Cancer: Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita 等人主編，J.B.Lippincott Company, 2011) 定義
為了解釋本說明書的目的，將應用以下定義，並且只要合適，以單數形式使用的術語亦將包括複數，反之亦然。如果下文示出之任何定義與通過引用併入本文之任何文件相衝突，則所示之定義為準。
如本文所用，單數形式的「一種 (a)」、「一個 (an)」和「該 (the)」包括複數指示內容，除非上下文指出。
應理解，本文所述之本發明之態樣及具體實例包括「包含」態樣及具體實例、「由」態樣及具體實例「組成」及「基本上由」態樣及具體實例「組成」。
如本文所用，術語「約」係指本技術領域技術人員易於知曉的各個值的通常誤差範圍。本文提及「約」值或參數包括 (和描述) 針對該值或參數本身的實施例。
如本文所用，「處理/治療」為用於獲得有益或期望的臨床結果的方法。如本文所用，「處理/治療」包括對哺乳動物 (包括人類) 之疾病的處理劑的任何投予或應用。對於本發明之目的，有益或期望的臨床結果包括但不限於以下任一者或多者：減弱一種或多種症狀、減輕疾病程度、阻止或延緩疾病的擴散 (例如，轉移，例如轉移至肺或轉移至淋巴結)、阻止或延緩疾病的復發、延緩或減緩疾病進展、改善疾病狀態、抑制疾病或疾病進展，抑制或減緩疾病或其進展、阻止其發展、以及緩解 (無論部分的或總體的)。「處理/治療」還涵蓋減少增生性疾病的病理後果。本發明之方法涵蓋治療的這些方面中的任何一個或多個。
在神經退化性疾病的上下文中，術語「處理/治療」包括以下任一者或全部：抑制患病細胞的生長、抑制患病細胞的複製、縮減整體疾病進展以及改善與疾病相關的一種或多種症狀。
如本文所用之術語「均質性」係指在整個結構或組成上一致或均勻的對象。在一些實例中，該術語指代在給定族群內具有一致的成熟狀態、標記表現或表型的細胞。
如本文所用，術語「禁止」可以指阻斷、減少、消除或以其他方式拮抗特定標靶之存在或活性的行為。例如，抑制 Tau 蛋白的磷酸化可指代導致降低、減少、拮抗、消除、阻斷或以其他方式減少 Tau 蛋白的磷酸化之任何行為。禁止可以指部分禁止或完全禁止。在其他實例中，對核酸表現之抑制可包括但不限於核酸轉錄之減少、mRNA 豐度之降低 (例如，緘默化 mRNA 轉錄)、mRNA 之降解、mRNA 轉譯之抑制，依此類推。
如本文所用，術語「抑制」可以指降低、減少、禁止、限制、縮小或以其他方式減少特定標靶之存在或活性的行為。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，阻抑 Tau 蛋白的磷酸化可指代導致 Tau 蛋白的磷酸化降低、減少、禁止、限制、縮減或以其他方式減少的任何行為。在其他實例中，對核酸表現之阻抑可包括但不限於核酸轉錄之減少、mRNA 豐度之降低 (例如，緘默化 mRNA 轉錄)、mRNA 之降解、mRNA 轉譯之抑制，依此類推。
如本文所用，術語「增強」可以指改善、增強、增加或以其他方式提高特定標靶之存在或活性的行為。例如，增強神經元健康可指代導致神經元健康改良、補益、升高或以其他方式增加的任何行為。
如本文所用，術語「調節」可以指改變、修改、變化或以其他方式修改特定標靶之存在或活性的行為。例如，調節疾病相關成分可以包括但不限於導致變革、改變、變動或以其他方式修改疾病相關成分之數量的任何行為。在一些實例中，「調節」指代增強特定標的之存在或活性。在一些實例中，「調節」指代阻抑特定標的之存在或活性。例如，調節疾病相關成分的數量可以包括但不限於阻抑或增強疾病相關成分的數量。
如本文所用，術語「誘導」可以指引發、促進、刺激、建立或以其他方式產生結果的行為。例如，誘導突變基因之表現可指代導致啟動、促進、刺激、建立或以其他方式產生該突變基因之所期望表現的任何行為。在其他實例中，誘導核酸之表現可包括但不限於引發核酸之轉錄、引發 mRNA 翻譯，依此類推。
如本文所用，「幹細胞」，除非進一步定義，否則指代任何非體細胞。任何不是終末分化或終末定型細胞的細胞皆可以稱為幹細胞。這包括胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、造血幹細胞、前驅細胞及部分分化的前驅細胞。幹細胞可以是全能、多能或多潛能幹細胞。就本申請之目的而言，任何具有分化為兩種不同類型細胞之潛能的細胞皆視為幹細胞。
如本申請所用，「藥學上可接受的」或「藥理上相容的」是指不是生物學上或其他方面不期望的材料，例如，該材料可以摻入投予患者的藥物組成物中而不會引起任何顯著的不期望的生物學效應或以有害的方式與其中所含組成物的任何其他組分相互作用。藥學上可接受的載劑或賦形劑較佳的是滿足毒理學和製造測試的要求標準和/或包括在美國食品和藥物管理局編制的非活性成分指南中。
對於本文中所述之任何結構和功能特徵，確定這些特徵的方法為本領域中已知的。 PSC 衍生的神經元之衍生、分化及成熟
人類 iPSC 已成為模擬人類疾病的強大工具，且在標的探索及藥物開發的轉譯研究中具有巨大潛力。人類 iPSC 衍生的神經元為敏感的，且需要延長培養時間 (80 天) 才能發展出成熟的神經元特徵 (Shi et al., 2012)。使用傳統手動技術進行長期神經元細胞維持具有挑戰性，因此，大多數小分子及 CRISPR 篩選係使用培養少於 30 天的神經元執行 (Boissart et al., 2013；Tian et al., 2019；Wang et al., 2017)。鑑於許多神經退化性疾病為成人發病的，諸如阿滋海默症 (AD)，高通量篩選平台結合更長的神經元培養時間可能更具轉譯相關性。隨著現代自動化技術的發展及人類 iPSC 用於疾病模擬之用途的增加，預期對 iPSC 神經元的自動化培養平台的需求及實施將會增加。
阿滋海默症 (AD) 之特徵在於澱粉樣蛋白-β (Aβ) 斑塊、神經原纖維纏結、星狀膠質細胞增生及神經元喪失的病理特徵。Aβ 斑塊由聚集的 Aβ 肽組成，經常由磷酸化 Tau (pTau) 陽性營養不良神經突 (神經炎性斑塊) 及活化的小神經膠質細胞圍繞。神經原纖維纏結含有經過度磷酸化的 Tau，在幾個氨基酸位點處之磷酸化增加 (Braak and Braak, 1991；Goedert et al., 2006；Petry et al., 2014；Spillantini and Goedert, 2013；Yu et al., 2009)。其他先前鑑定的 AD 病理包括腦血管澱粉樣血管病變、小神經膠質細胞增生、神經發炎及主要突觸改變 (Crews and Masliah, 2010；Katzman, 1986；McGeer et al., 1988；Spillantini and Goedert, 2013)。
澱粉樣蛋白假說提出，異常折疊的 Aβ 肽啟動因果級聯反應，從 Aβ 寡聚物聚集成斑塊開始，然後除非 Tau 過度磷酸化及神經原纖維纏結形成，最終導致神經元細胞死亡 (De Strooper and Karran, 2016；Hardy and Selkoe, 2002)。該假說已經是針對 AD 的大量動物模型之生成、診斷及藥物開發計劃的理論基礎 (De Strooper and Karran, 2016)。支持該假說的一些態樣，囓齒動物 AD 模型經常過度表現引起家族性 AD (FAD) 的基因 APP及/或 PSEN的突變形式，導致 Aβ 肽之過度產生、廣泛的澱粉樣斑塊形成、神經發炎及一些突觸功能障礙 (Ashe and Zahs, 2010；LaFerla and Green, 2012)。然而，AD 病理學的重要態樣，諸如 p-Tau 誘導及嚴重的神經元喪失尚未得到充分建立 (Crews and Masliah, 2010；Kokjohn and Roher, 2009；Morrissette et al., 2009)。最近許多抗 Aβ 療法的失敗已使人們對澱粉樣蛋白假說產生了一些懷疑 (Long and Holtzman, 2019；McDade and Bateman, 2017；von Schaper, 2018)。因此，現有囓齒動物模型與 AD 藥物開發的相關性仍然存在爭議 (Ashe and Zahs, 2010；Morrissette et al., 2009；Sasaguri et al., 2017)。如果沒有穩健的動物、細胞或轉譯模型，Aβ 寡聚物藉以觸發 p-Tau 誘導及神經元死亡的機制仍然難以捉摸；因此，儘管進行了 40 年的深入研究，但目前尚無針對 AD 的疾病改良療法。
出於該原因，開發更穩健地模擬人類 AD 病理生理學的改進模型系統對於藥物開發及轉譯非常重要。開發人類誘導多能幹細胞 (iPSC) 神經元及小神經膠質細胞分化方案的創新為人類疾病的轉譯模型開闢了新的可能性 (Penney et al., 2020)。最近的研究表明，在活體外過表現突變 APP 的人類神經元之 3D 培養物導致 pTau 誘導 (Choi et al., 2014)。此外，將人類 iPSC 神經元植入 AD 小鼠模型中，重演了以前在傳統小鼠模型中未觀察到的 pTau 誘導及人類神經元敏感性表型 (Espuny-Camacho et al., 2017)。雖然在轉譯上更相關，但上述技術可能是勞動密集型且高度可變的，因此不適合藥物篩選及開發。
先前的研究結果指示，人類神經元可能與 AD 病理學更具轉譯相關性。本文揭露一種人 iPSC 神經元培養平台，該平台為量化的、高通量的、多路復用的、系統性的及可重複的，以允許進行藥理學研究、機制研究及篩選工作。本文還呈現一種新穎的、高通量的基於人類 iPSC 的 AD 模型，該模型重演了歷史上難以在一個模型系統中複製的關鍵特徵性病理。該模型首次在活體外重演了圍繞有 pTau 陽性營養不良神經突及人類 iPSC 小神經膠質細胞的穩健 Aβ 斑塊形成。與 AD 病理學一致，在該系統中觀察到嚴重的突觸喪失、軸突退化及 pTau 誘導，導致嚴重的神經元喪失。本文還揭露一種定向化合物庫篩選。我們鑑定了先前已牽涉到 AD 中的已知激酶途徑，諸如肝醣合成酶激酶 3 (GSK3)、Fyn 及雙白胺酸拉鏈激酶 (DLK)，從而驗證該系統為有用的篩選工具。該平台可適合用於探索小神經膠質細胞驅動的斑塊形成機制。此外，該模型平台還可用於研究抗 Aβ 療法的作用機制 (MOA)，且研究結果強調了早期投予及高曝露量治療性化合物的重要性。(Kaufman et al., 2015；Leclerc et al., 2001；Patel et al., 2015)。在一些態樣中，本文公開一種穩健的平台，該平台可以促進針對潛在治療的 AD 研究中的標的探索、藥物開發及有影響力的 MOA 研究。 自動化細胞培養系統
鑑於許多神經退化性疾病為成人發病的，諸如阿滋海默症 (AD)，高通量篩選平台結合更長的神經元培養時間可能更具轉譯相關性。在一些態樣中，本發明提供一種用於促進神經元分化及/或提升長期神經元生長的自動化細胞培養系統，其中該自動化細胞培養系統包含一輪或多輪自動化培養基更換。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
在一些實施例中，該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：20、25、30、35,40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190 或 200 天。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89 或 90 天。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：55 至 60、60 至 65、65 至 70、70 至 75、75 至 80、80 至 85、85 至 90、或 90 至 100 天。
在一些實施例中，該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充。在一些實施例中，每輪自動化培養基更換包含一輪或多輪自動化培養基抽吸及一輪或多輪自動化培養基補充。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個組織培養容器。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個多孔組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個 96 孔組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個 384 孔組織培養盤。 自動化培養基抽吸
在根據本文所述實施例中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸。在一些實施例中，該移液管尖端包含末端，其中該末端為錐形端。在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處。在一些實施例中，在抽吸之前，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0 mm。在一些實施例中，在抽吸期間，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0 mm。在一些實施例中，在抽吸之後，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0 mm。在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端之末端係在以下者中之任一者處：孔的底面上方約 0.1 至 0.2、0.2 至 0.3、0.3 至 0.4、0.4 至 0.5、0.5 至 0.6、0.6 至 0.7、0.7 至 0.8、0.8 至 0.9、0.9 至 1.0、1.0 至 1.1、1.1 至 1.2、1.2 至 1.3、1.3 至 1.4、1.4 至 1.5、1.5 至 1.6、1.6 至 1.7、1.7 至 1.8、1.8 至 1.9、1.9 至 2.0、2.0 至 2.5、2.5 至 3.0、或 3.0 至 5.0 mm。
在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。在一些實施例中，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端約呈以下中之任一角度：30°、40°、50°、60°、70°、80° 或 90°。在一些實施例中，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端約呈以下中之任一角度：70°、72°、74°、76°、78°、80°、82°、84°、86°、88°、90°。在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端成以下中之任一角度：約 30° 至 40°、40° 至 50°、50° 至 60°、60° 至 70°、70° 至 80°、或 80° 至 90°。在一些實施例中，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端成以下中之任一角度：約 70° 至 75°、75° 至 80°、80° 至 82°、82° 至 84°、84° 至 86°、86° 至 88°、或 88° 至 90°。
在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約 0.1mm 之位移。在一些實施例中，在抽吸之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約以下者中之任一者之位移：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 或 0.2 mm。在一些實施例中，在抽吸之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約以下者中之任一者之位移：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 或 0.2 mm。在一些實施例中，在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。
在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，培養基抽吸之速度不超過約 7.5μl/s。在一些實施例中，培養基抽吸之速度不超過約以下者中之任一者：0.5、1、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、12、15、20、25 或 30 µl/s。在一些實施例中，培養基抽吸之速度不超過以下者中之任一者：約 0.5 至 1、1 至 2、2 至 3、3 至 4、4 至 5、5 至 6、6 至 7、7 至 8、8 至 9、9 至 10、10 至 12、12 至 15、15 至 20、20 至 25、或 25 至 30 µl/s。在一些實施例中，培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。在一些實施例中，培養基抽吸之開始係在約以下者中之任一者：移液管尖端經放置在孔的底面上方 x mm 之後 5、10、20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 ms，其中 x 為以下者中之任一者：約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0。在一些實施例中，培養基抽吸之開始係在以下者中之任一者：移液管尖端經放置在孔的底面上方 x mm 之後約 5 至 10、10 至 20、20 至 50、50 至 80、80 至 100、100 至 150、150 至 200、200 至 250、250 至 300、300 至 350、350 至 400、400 至 450、450 至 500、500 至 600、600 至 700、700 至 800、800 至 900 或 900 至 1000 ms，其中 x 為以下者中之任一者：約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0。
在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內。在一些實施例中，在抽吸之前，移液管尖端以約以下中任一者之速度插入孔內：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25 或 30 mm/s。在一些實施例中，在抽吸之前，移液管尖端以以下中任一者之速度插入孔內：約 0.5 至 1、1 至 2、2 至 3、3 至 4、4 至 5、5 至 6、6 至 7、7 至 8、8 至 9、9 至 10、10 至 12、12 至 15、15 至 20、20 至 25、或 25 至 30 mm/s。
在一些實施例中，其中自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在抽吸之後，移液管尖端以約以下中任一者之速度從孔中退出：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25 或 30 mm/s。在一些實施例中，在抽吸之後，移液管尖端以以下中任一者之速度從孔中退出：約 0.5 至 1、1 至 2、2 至 3、3 至 4、4 至 5、5 至 6、6 至 7、7 至 8、8 至 9、9 至 10、10 至 12、12 至 15、15 至 20、20 至 25、或 25 至 30 mm/s。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含 N孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 N移液管尖端架且自動接合新的 N移液管尖端架，其中 N為 6、12、24、48、96、182 或 384 之整數。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 N孔盤，其中每批包含複數個以 y行且 z列排列之 N孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 ( y 乘 z個) 相對應之用過的 N移液管尖端架且自動接合至高達 ( y 乘 z個) 相對應之新的 N移液管尖端架，其中 N為 6、12、24、48、96、182 或 384 之整數，其中 y為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20 之整數，並且其中 z為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20 之整數。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。 自動化培養基分配
在根據本文所述任何實施例的一些實施例中，自動化培養基補充包括用移液管尖端分配培養基。在一些實施例中，該移液管尖端包含末端，其中該末端為錐形端。在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處。在一些實施例中，在分配之前，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0 mm。在一些實施例中，在分配期間，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、12.4、13、14、15、16、17、18、19 或 20 mm。在一些實施例中，在分配之後，該移液管尖端之末端係在約以下者中之任一者處：孔的底面上方 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、12.4、13、14、15、16、17、18、19 或 20 mm。在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端之末端係在以下者中之任一者處：孔的底面上方約 0.1 至 0.2、0.2 至 0.3、0.3 至 0.4、0.4 至 0.5、0.5 至 0.6、0.6 至 0.7、0.7 至 0.8、0.8 至 0.9、0.9 至 1.0、1.0 至 1.1、1.1 至 1.2、1.2 至 1.3、1.3 至 1.4、1.4 至 1.5、1.5 至 1.6、1.6 至 1.7、1.7 至 1.8、1.8 至 1.9、1.9 至 2.0、2.0 至 2.5、2.5 至 3.0、或 3.0 至 5.0 mm。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配期間，移液管尖端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端以約以下中任一者之速度從孔中退出：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0 mm/s。在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配期間，移液管尖端以以下中任一者之速度從孔中退出：約 0.1 至 0.2、0.2 至 0.3、0.3 至 0.4、0.4 至 0.5、0.5 至 0.6、0.6 至 0.7、0.7 至 0.8、0.8 至 0.9、0.9 至 1.0、1.0 至 1.1、1.1 至 1.2、1.2 至 1.3、1.3 至 1.4、1.4 至 1.5、1.5 至 1.6、1.6 至 1.7、1.7 至 1.8、1.8 至 1.9、1.9 至 2.0、2.0 至 2.5、2.5 至 3.0、或 3.0 至 5.0 mm/s。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端約呈以下中之任一角度：30°、40°、50°、60°、70°、80° 或 90°。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端約呈以下中之任一角度：70°、72°、74°、76°、78°、80°、82°、84°、86°、88°、90°。在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端成以下中之任一角度：約 30° 至 40°、40° 至 50°、50° 至 60°、60° 至 70°、70° 至 80°、或 80° 至 90°。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端成以下中之任一角度：約 70° 至 75°、75° 至 80°、80° 至 82°、82° 至 84°、84° 至 86°、86° 至 88°、或 88° 至 90°。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約 0.1mm 之位移。在一些實施例中，在分配之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約以下者中之任一者之位移：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 或 0.2 mm。在一些實施例中，在分配之前、期間以及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過約以下者中之任一者之位移：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 或 0.2 mm。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，移液管尖端在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約以下中任一者之孔的第一側：0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5 或 5.0 mm，該位移在孔的底面上方約以下中任一者之高度處進行：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、12.4、13、14、15、16、17、18、19 或 20 mm，位移速度為約以下者中之任一者： 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450 或 500 mm/s。在一些實施例中，移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心 1mm 之該孔的第一側。在一些實施例中，移液管尖端在第二方向上位移 (諸如橫向移位) 以接觸離中心約以下者中之任一者之孔的第二側：0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5 或 5.0 mm，該位移在孔的底面上方約以下中任一者之高度處進行：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、12.4、13、14、15、16、17、18、19 或 20 mm，位移速度為約以下者中之任一者： 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450 或 500 mm/s。在一些實施例中，移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側。在一些實施例中，該第一方向相對於該第二方向約呈以下中之任一角度：30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、140°、150°、160°、170°、180°、190°、200°、210°、220°、230°、240°、250°、260°、270°、280°、290°、300°、310°、320°、330° (或其間之任何角度)。在一些實施例中，該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，培養基分配之速度不超過約 1.5μl/s。在一些實施例中，培養基分配之速度不超過約以下者中之任一者：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、5.0、7.5 或 10.0 µl/s。在一些實施例中，培養基分配之速度不超過以下者中之任一者：約 0.1 至 0.2、0.2 至 0.3、0.3 至 0.4、0.4 至 0.5、0.5 至 0.6、0.6 至 0.7、0.7 至 0.8、0.8 至 0.9、0.9 至 1.0、1.0 至 1.1、1.1 至 1.2、1.2 至 1.3、1.3 至 1.4、1.4 至 1.5、1.5 至 1.6、1.6 至 1.7、1.7 至 1.8、1.8 至 1.9、1.9 至 2.0、2.0 至 2.5、2.5 至 3.0、3.0 至 5.0、5.0 至 7.5、或 7.5 至 10.0 µl/s。在一些實施例中，培養基分配之加速度為約以下者中之任一者：20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000 µl/s 2或其間之任何值，視需要其中培養基分配之加速發生在分配開始時。在一些實施例中，培養基分配之減速度為約 20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000 µl/s 2或其間之任何值，視需要其中培養基分配之減速發生在分配結束時。在一些實施例中，培養基分配之加速度為約 500 μl/s 2，視需要其中培養基分配之加速發生在分配開始時。在一些實施例中，培養基分配之減速度為約 500 μl/s 2，視需要其中培養基分配之減速發生在分配開始時。
在一些實施例中，培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。在一些實施例中，培養基分配之開始係在約以下者中之任一者：移液管尖端經放置在孔的底面上方 x mm 之後 5、10、20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 ms，其中 x 為以下者中之任一者：約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0。在一些實施例中，培養基分配之開始係在以下者中之任一者：移液管尖端經放置在孔的底面上方 x mm 之後約 5 至 10、10 至 20、20 至 50、50 至 80、80 至 100、100 至 150、150 至 200、200 至 250、250 至 300、300 至 350、350 至 400、400 至 450、450 至 500、500 至 600、600 至 700、700 至 800、800 至 900 或 900 至 1000 ms，其中 x 為以下者中之任一者：約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0 或 5.0。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內。在一些實施例中，在分配之前，移液管尖端以約以下中任一者之速度插入孔內：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25 或 30 mm/s。在一些實施例中，在分配之前，移液管尖端以以下中任一者之速度插入孔內：約 0.5 至 1、1 至 2、2 至 3、3 至 4、4 至 5、5 至 6、6 至 7、7 至 8、8 至 9、9 至 10、10 至 12、12 至 15、15 至 20、20 至 25、或 25 至 30 mm/s。
在一些實施例中，其中自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端以約以下中任一者之速度從孔中退出：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25 或 30 mm/s。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端以以下中任一者之速度從孔中退出：約 0.5 至 1、1 至 2、2 至 3、3 至 4、4 至 5、5 至 6、6 至 7、7 至 8、8 至 9、9 至 10、10 至 12、12 至 15、15 至 20、20 至 25、或 25 至 30 mm/s。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含 N孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 N移液管尖端架且自動接合新的 N移液管尖端架，其中 N為 6、12、24、48、96、182 或 384 之整數。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 N孔盤，其中每批包含複數個以 y行且 z列排列之 N孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 ( y 乘 z個) 相對應之用過的 N移液管尖端架且自動接合至高達 ( y 乘 z個) 相對應之新的 N移液管尖端架，其中 N為 6、12、24、48、96、182 或 384 之整數，其中 y為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20 之整數，並且其中 z為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20 之整數。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，該系統包含約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20 或 25 輪中之任一者的自動更換培養基。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
在根據本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60%之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 中之任一者之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在根據本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。 產生完全成熟的 PSC 衍生的神經元之方法
在一些態樣中，本發明提供一種從前身細胞產生同質及/或終末分化的神經元的之方法。在一些實施例中，提供一種從神經幹細胞 (NSC) 產生同質及/或終末分化的神經元之方法。在一些實施例中，該方法包含：(a) 使 NSC 分化為 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。在一些實施例中，該方法包含：(a) 在增加 NGN2 及 ASCL1 的水平的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該等 NSC 至少約 7 天，從而產生 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 NSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，提供一種從多能幹細胞 (PSC) 產生同質及/或終末分化的神經元之方法。在一些實施例中，從多能幹細胞 (PSC) 產生同質及/或終末分化的神經元之方法包含：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元；以及/或 (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含在上述自動化細胞培養系統中之任一者中使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟。在一些實施例中，使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含在上述自動化細胞培養系統中之任一者中使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟。
在一些實施例中，使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含使用自動化細胞培養系統進行一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：20、25、30、35,40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190 或 200 天。在一些實施例中，使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含使用自動化細胞培養系統進行一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。在一些實施例中，使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含使用自動化細胞培養系統進行一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約 60 天。
在一些實施例中，該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個多孔組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個 96 孔組織培養盤。在一些實施例中，該自動化細胞培養系統包含一個或多個 384 孔組織培養盤。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 15 µl /s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 200ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 160° 至約 200° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 5 µl /s；(h) 培養基分配之加速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl /s；(h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，該方法包含約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20 或 25 輪中之任一者的自動更換培養基。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60%之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 中之任一者之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
本文所述方法中之任一者用於在用於模擬神經退化性疾病之系統中獲得分化的神經元的用途，其中該系統包含實質上確定的培養基，並且其中該系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。 完全成熟的 PSC 衍生的神經元
在一些態樣中，本發明提供一種衍生自前身細胞之終末分化神經元的同質族群。在一些實施例中，提供一種衍生自神經幹細胞 (NSC) 之終末分化神經元的同質族群。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 之該等神經元表現：Map2；突觸蛋白 (Synapsin) 1 及/或突觸蛋白 2；以及 β-III 微管蛋白。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 95% 之該等神經元表現：Map2；突觸蛋白 (Synapsin) 1 及/或突觸蛋白 2；以及 β-III 微管蛋白。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 之該等神經元表現 Map2。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 之該等神經元表現突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 之該等神經元表現 β-III 微管蛋白。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 80% 之該等終末分化神經元表現 Map2，表現之水平為至少約以下者中之任一者：比非終末分化的神經元高 20%、50%、80%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 80% 之該等終末分化神經元表現突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2，表現之水平為至少約以下者中之任一者：比非終末分化的神經元高 20%、50%、80%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 80% 之該等終末分化神經元表現 β-III 微管蛋白，表現之水平為至少約以下者中之任一者：比非終末分化的神經元高 20%、50%、80%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 中之任一者之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：20、30、50、80、100、200、300、500、800 或 1000 個突觸後末端係與其他神經元的突觸前末端重疊，以及/或至少約以下者中之任一者：20、30、50、80、100、200、300、500、800 或 1000 個突觸前末端係與其他神經元的突觸後末端重疊。在一些實施例中，神經元之至少 100 個突觸後末端係與其他神經元之突觸前末端重疊及/或該神經元之至少 100 個突觸前末端係與其他神經元之突觸後末端重疊。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 中之任一者之該等神經元表現兩個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 95% 之該等神經元表現兩個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 中之任一者之該等神經元表現兩個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約 95% 之該等神經元表現兩個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 中之任一者之該等神經元表現一種或多種上層皮質神經元標記。在一些實施例中，至少約 95% 的神經元表現一種或多種上層皮質神經元標記。在一些實施例中，不超過約以下者中之任一者：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40% 或 50% 的神經元表現一種或多種下層皮質神經元標記。在一些實施例中，不超過約 5% 的神經元表現一種或多種下層皮質神經元標記。在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少約以下者中之任一者：50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98% 中之任一者之該等神經元表現 CUX2。在一些實施例中，至少約 95% 的神經元表現 CUX2。在一些實施例中，不超過約以下者中之任一者：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40% 或 50% 的神經元表現 CTIP2 及/或 SATB2。在一些實施例中，不超過約 5% 的神經元表現 CTIP2 以及/或 SATB2。
在一些實施例中，該等神經元以高度可複製性方式表現樹突、細胞體、軸突及突觸之代表性標記。在一些實施例中，神經元中樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及/或突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性。在一些實施例中，在神經元中的樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性，其中 MAP2、CUX2、Tau 及突觸蛋白 1/2 中的一或多者之 z 因數為至少約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 或 0.6。在一些實施例中，在神經元中的樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及/或突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性，其中 MAP2、CUX2、Tau 及突觸蛋白 1/2 中的每一者之 z 因數至少為 0.4。
在一些實施例中，終末分化神經元的同質族群在包含以下之方法中衍生：(a) 使 NSC 分化為 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。在一些實施例中，該方法包含：(a) 在增加 NGN2 及 ASCL1 的水平的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該等 NSC 至少約 7 天，從而產生 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 NSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，提供一種衍生自多能幹細胞 (PSC) 的終末分化神經元之同質族群。在一些實施例中，終末分化神經元的同質族群在包含以下之方法中衍生：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元；以及/或 (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，衍生終末分化神經元之同質族群的步驟包含在上述自動化細胞培養系統中之任一者中使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟。在一些實施例中，使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含在上述自動化細胞培養系統中之任一者中使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 15 µl/s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 200ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 160° 至約 200° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 5 µl/s；(h) 培養基分配之加速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl /s；(h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，該方法包含約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20 或 25 輪中之任一者的自動更換培養基。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60%之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 中之任一者之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在根據本文所述終末分化神經元之同質族群中之任一者的一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
本文所述終末分化神經元的同質族群中之任一者用於模擬神經退化性疾病的用途，其中該培養系統包含實質上確定的培養基，並且其中該培養系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。 用於模擬神經退化性疾病的神經元培養物及其用途 阿滋海默症模擬
阿滋海默症 (AD) 之特徵在於澱粉樣蛋白-β (Aβ) 斑塊、神經原纖維纏結、星狀膠質細胞增生及神經元喪失的病理特徵。AD 模型的準確性可以藉由使用更具有轉譯相關性的終末分化神經元以及允許模組化 (允許在整個模擬過程中有效添加或去除組件) 及致病因素及神經保護因素之可調式 (允許有效控制組件的數量) 輸入的系統來改良。在活體內 AD 模型中，即使不是不可能，也很難實現高度模組化及可調式系統。三維 (3D) AD 類器官模型系統可以允許一定程度的操作，但在一些情況下可能缺乏對於快速調整致病因素以及/或神經保護因素的精確控制，並且在成像、分析及篩選方面存在更多障礙。在本揭露中，提供一種量化、高通量、多路復用、系統性及可再現的活體外 AD 模型系統，以允許進行藥理學研究、機理研究及篩選工作。在本揭露之前，此類新穎、高通量的基於人類 iPSC 的 AD 模型重演了歷史上難以在一個模型系統中複製的關鍵特徵性病理。本文所述系統可以以 2D 組織培養格式配置，該格式促進組織培養及圖像分析方面的高通量自動化。提供一種模型系統，該模型系統演示 AD 的關鍵特徵性病理學，以及在活體外用 2D 人類 iPSC 培養物首次演示某些特徵，諸如穩健的神經炎性斑塊樣形成。 用於模擬神經退化性疾病的神經元培養系統
在一些態樣中，提供一種用於模擬神經退化性疾病的神經元培養系統，其中該培養系統包含實質上確定的培養基，並且其中該培養系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。在一些實施例中，該神經元培養系統為神經幹細胞衍生的。在一些實施例中，該神經元培養系統為多能幹細胞衍生的。在一些實施例中，提供一種用於模擬神經退化性疾病的神經元培養系統，其中該培養系統包含實質上確定的培養基，並且其中該培養系統可適於以下中之模組化及可調式輸入：一種或多種疾病相關成分以及/或一種或多種神經保護成分。
在一些實施例中，該神經退化性疾病為阿滋海默症。在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經退化性疾病為阿滋海默症，該疾病相關成分包含可溶性 Aβ 物質。在一些實施例中，該疾病相關成分包含突變 APP 之過表現，視需要其中該疾病相關成分包含突變 APP 之可誘導過表現。在一些實施例中，該疾病相關成分包含促炎性細胞激素。在一些實施例中，該神經保護成分包含抗 Aβ 抗體。在一些實施例中，該神經保護成分包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑、JNK 抑制劑以及/或 Fyn 抑制劑。在一些實施例中，該神經保護成分包含小神經膠質細胞。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經退化性疾病為阿滋海默症，其中：(a) 該等疾病相關成分包含可溶性 Aβ 物質；(b) 該疾病相關成分包含突變 APP 之過表現，視需要其中該等疾病相關成分包含突變 APP 之可誘導過表現；(c) 該疾病相關成分包含促炎性細胞激素；(d) 該神經保護成分包含抗 Aβ 抗體；(e) 該神經保護成分包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 抑制劑；以及/或 (f) 該神經保護成分包含小神經膠質細胞。
在一些實施例中，該系統不包含未確定的培養基。在一些實施例中，該系統不包含未確定的基質。在一些實施例中，該系統不包含基質膠 (matrigel)。在一些實施例中，該系統包含未完全確定的培養基。在一些實施例中，該系統包含未確定的基質。在一些實施例中，該系統包含基質膠。在一些實施例中，該系統包含完全確定的培養基。在一些實施例中，該系統包含完全確定的基質。
在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 單體。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 單體及/或可溶性 Aβ 寡聚物。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 原纖維、可溶性 Aβ 單體及/或可溶性 Aβ 寡聚物。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該神經元培養物中之 Tau 蛋白在 S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 殘基中之一者或多者中為過度磷酸化。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養物中之 Tau 蛋白在 S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 殘基中之一者或多者處的增加約以下者中之任一者：20%、50%、80%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示增加的神經元毒性。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統中的神經元毒性增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示 MAP2 陽性神經元的減少。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，MAP2 陽性神經元之數量減少約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，MAP2 陽性神經元的數量減少 100%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，MAP2 陽性神經元之數量減少約以下者中之任一者：10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元的減少。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，突觸蛋白陽性神經元之數量減少約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，突觸蛋白陽性神經元的數量減少 100%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，MAP2 陽性神經元之數量減少約以下者中之任一者：10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍或更多。在一些實施例中，該突觸蛋白為突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2。
在一些實施例中，Aβ 誘導的神經毒性表型為劑量依賴性及進行性的。在一些實施例中，更高的劑量導致更快的病理發展及神經元喪失。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示神經元中的 Tau 磷酸化增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度。在一些實施例中，當與不包含可溶性 Aβ 種類的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度。在一些實施例中，當與不包含可溶性 Aβ 種類的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度。在一些實施例中，當與不包含可溶性 Aβ 種類的培養系統相比，該神經元培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度。在一些實施例中，當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統神經元中之 Tau 磷酸化的增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度。在一些實施例中，Aβ 之濃度係藉由 Aβ 原纖維之濃度確定。在一些實施例中，Aβ 之濃度係藉由可溶性 Aβ 物質之濃度確定。在一些實施例中，Aβ 之濃度係藉由可溶性 Aβ 物質及/或 Aβ 原纖維之濃度確定。
在根據上述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該第一濃度高於該第二、第三及第四濃度；以及/或該第二濃度高於該第三及第四濃度；以及/或該第三濃度高於該第四濃度。在一些實施例中，該第一濃度為約 2 µM 至約 20 µM。在一些實施例中，該第一濃度為約以下者中之任一者：2、3、4、5、6、7、8、9 10、12、14、16、18 或 20 µM。在一些實施例中，該第二濃度為約 5 µM。在一些實施例中，該第二濃度為約 1 µM 至約 10 µM。在一些實施例中，該第二濃度為約以下者中之任一者：1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µM。在一些實施例中，該第二濃度為約 2.5 µM。在一些實施例中，該第三濃度為約 0.25 µM 至約 5 µM。在一些實施例中，該第三濃度為約 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5 或 5 µM 中之任一者。在一些實施例中，該第三濃度為約 1.25 µM。在一些實施例中，該第四濃度為約 0.05 µM 至約 2 µM。在一些實施例中，該第三濃度為約 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2.0 µM 中之任一者。在一些實施例中，該第三濃度為約 0.3 µM。在一些實施例中，該第四濃度為約 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2.0 µM 中之任一者。在一些實施例中，該第四濃度為約 0.3 µM。在一些實施例中，該等神經元與所述濃度的 Aβ 接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該神經元與所述濃度的 Aβ 接觸約 7、14 或 21 天。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統神經元中之 Tau 磷酸化的增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度；以及/或當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度，進一步其中該第一濃度高於該第二、第三及第四濃度；以及/或該第二濃度高於該第三及第四濃度；以及/或該第三濃度高於該第四濃度。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該等神經元與該疾病相關成分 Aβ 接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該等神經元與約任何以下者中之任一者：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2、3、4、5、6、7、8、9 10、12、14、16、18 或 20 µM Aβ 接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，當與在不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 表現。在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，當與在不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 片段化。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，當與在不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出 GFAP 表現增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，當與在不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出 GFAP 片段化增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構的增加。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，神經元培養系統中的神經元毒性增加，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構增加約以下中之至少一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。在一些實施例中，至少該甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突圍繞。在一些實施例中，至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 99% 的甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構經神經突圍繞。在一些實施例中，至少該甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突圍繞，其中該等神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及/或磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡標記。在一些實施例中，至少該甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突圍繞，其中該等神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及/或磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡標記，進一步其中該等神經突為營養不良的。在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，經神經突圍繞的斑塊或斑塊樣結構表現出定位於澱粉樣斑塊中的 ApoE 表現。在一些實施例中，經神經突圍繞之斑塊或斑塊樣結構表現出在營養不良神經突之膜中的 APP。在一些實施例中，經神經突圍繞之斑塊或斑塊樣結構表現出定位於澱粉樣斑塊中的 ApoE 表現及在營養不良神經突之膜中的 APP。在一些實施例中，該等神經突為營養不良的。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良的增加。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良，當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分；包含神經炎性細胞激素的疾病相關成分、及包含小神經膠質細胞的神經保護成分。在一些實施例中，該培養系統包含含有可溶性 Aβ 種類的疾病相關成分；疾病相關成分神經炎性細胞激素及神經保護成分小神經膠質細胞。在一些實施例中，該小神經膠質細胞係衍生自多能幹細胞 (諸如但不限於胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞)。在一些實施例中，該小神經膠質細胞表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。在一些實施例中，該小神經膠質細胞為 iPSC 衍生的小神經膠質細胞並且表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約 25%。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 Aβ 斑塊形成增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分；及包含小神經膠質細胞的神經保護成分。在一些實施例中，該培養系統包含含有可溶性 Aβ 種類的疾病相關成分；及神經保護成分小神經膠質細胞。在一些實施例中，該小神經膠質細胞為 iPSC 衍生的小神經膠質細胞並且表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 Aβ 斑塊形成增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、8 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍或更多。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性變化小於約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、15%、20% 或 30%。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞，當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性變化小於約 10%。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約 50% 至約 99%。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出降低的 p-Tau 誘導。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 p-Tau 誘導降低約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 p-Tau 誘導降低約 50% 至約 95%。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出增加的 MAP2 及/或突觸蛋白的水平。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 MAP2 及/或突觸蛋白的水平增加約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍、100000 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、10000 倍。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 抗 Aβ 抗體，當與不包含抗 Aβ 抗體之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出 MAP2 及/或突觸蛋白的水平增加約 100 倍。
在根據上述神經元培養系統的一些實施例中，抗 Aβ 抗體與可溶性 Aβ 物質之間的化學計量比為約 1:2。在根據上述神經元培養系統的一些實施例中，抗 Aβ 抗體與可溶性 Aβ 物質之間的莫耳比為約 1:2。在一些實施例中，突觸救援的 IC50 在約 5 μM 可溶性 Aβ 物質時為約 1.4 μM 抗 Aβ 抗體。在一些實施例中，突觸救援的 IC50 在約 4 μM 可溶性 Aβ 物質時為約 1 μM 抗 Aβ 抗體。
在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質，及 (2) DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑，當與不包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質，及 (2) DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑，當與不包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約以下者中之任一者：1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 99%。在一些實施例中，其中該神經元培養系統包含 (1) 可溶性 Aβ 物質，及 (2) DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑，當與不包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑或 Fyn 激酶抑制劑之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統表現出神經元毒性降低約 25%。
在根據本文所述細胞培養系統中之任一者的一些實施例中，該等神經元表現以下者中之一者或多者：DLK、GSK3、CDK5、JNK 及 Fyn 激酶訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元低不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 DLK 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元低不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 GSK3 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元低不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 CDK5 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元低不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 Fyn 激酶訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 DLK 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 GSK3 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 CDK5 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高不超過約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 Fyn 激酶訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 DLK 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 GSK3 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 CDK5 訊號傳導。在一些實施例中，該神經元培養系統中之神經元以比阿滋海默症患者之神經元高至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍的水平表現 Fyn 激酶訊號傳導。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該神經元培養系統包含分化的神經元，視需要其中該神經元培養系統包含終末分化神經元之同質族群。
在一些實施例中，該神經元培養系統包含在包括以下的方法中衍生之分化的神經元：(a) 使 NSC 分化為 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。在一些實施例中，該方法包含：(a) 在增加 NGN2 及 ASCL1 的水平的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該等 NSC 至少約 7 天，從而產生 NSC 衍生的神經元；(b) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 NSC 衍生的神經元；(c) 在自動化細胞培養系統中使該等 NSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，該神經元培養系統包含在包括以下的方法中衍生之分化的神經元：(a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株；(b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元；(c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元；以及/或 (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟至少約 60 至約 90 天。
在一些實施例中，衍生終末分化神經元的步驟包含在本文所述自動化細胞培養系統中之任一者中使 PSC 衍生的神經元分化及/或成熟。在一些實施例中，使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟的步驟包含在上述自動化細胞培養系統中之任一者中使 NSC 衍生的神經元分化及/或成熟。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 15 µl/s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，進一步其中：(a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；(f) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方約 1mm 處之後約 200ms；(g) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (h) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 0.8 mm 至約 1.2 mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 80° 至約 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.2 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 10mm 至約 15mm 之高度處以約 50 mm/s 至約 200 mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 0.8 mm 至約 1.2 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 160° 至約 200° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 5 µl/s；(h) 培養基分配之加速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 200 µl /s 2至約 1000 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 100 ms 至約 500 ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 1 mm/s 至約 10 mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，進一步其中：(a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；(b) 在移液期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 之速度從孔中退出；(c) 在分配期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角；(d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移，視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)；(e) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第一側；(f) 移液管尖端在孔的底面上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移 (諸如橫向位移) 以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角；(g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl /s；(h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2；(i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2；(j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms；(k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 之速度從孔中退出。在一些實施例中，在分配之前、期間及/或之後，移液管尖端位移 (諸如橫向位移)。在一些實施例中，在分配期間，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在分配之後，移液管尖端橫向位移。在一些實施例中，在從孔中退出之前及/或期間，移液管尖端橫向位移。
在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。在一些實施例中，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，該方法包含約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20 或 25 輪中之任一者的自動更換培養基。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。在一些實施例中，兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。在一些實施例中，連續兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60%之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 中之任一者之培養基經更換。在一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
在根據本文所述神經元培養系統中之任一者的一些實施例中，在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：40%、42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58% 或 60% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中：約 30% 至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60% 至 70%、或 70% 至 80% 之培養基經更換。在一些實施例中，在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。 幹細胞
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該等神經元細胞 (諸如神經元) 係衍生自多能幹細胞。如本文所用，多能幹細胞為具有自我更新能力的細胞，藉由分裂及發育成早期胚胎的三個初級生殖細胞層並因此發育成成人身體的全部細胞。在一些實施例中，該等多能幹細胞不能發育成胚胎外組織，諸如胎盤。如本文所用，多能幹細胞還可以涵蓋具有發育成三個胚層以及胚胎外組織之潛力的細胞，諸如外胚層衍生的幹細胞。在一些實施例中，該等多能幹細胞為胚胎幹細胞。在一些實施例中，該等胚胎幹細胞係從胚胎 (諸如人類或小鼠胚胎) 中分離並作為細胞株經維持。在一些實施例中，該等多能幹細胞為誘導多能幹細胞 (iPSC)。如本文所用，誘導多能幹細胞可指代藉由重新程式化非多能細胞獲得的任何多能細胞。重新計畫性的細胞可藉由重新計畫任何胚胎或胚胎外組織譜系的前驅細胞、部分分化的細胞或完全分化的細胞來產生。例如，誘導多能幹細胞可藉由在分化的細胞諸如纖維母細胞中過表現轉錄因子 (諸如包括 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc) 來產生。在一些實施例中，該等神經元可藉由使用結合的小分子抑制、或轉錄因子的活化而衍生自多能幹細胞。在一些實施例中，該等神經元可藉由 ASCL1 及/或 NGN2 的活化而衍生自多能幹細胞。
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該等神經元細胞 (諸如神經元) 係衍生自神經幹細胞 (也稱為神經前驅細胞)。在一些實施例中，該等神經幹細胞係藉由涉及 EB 形成或與基質細胞株共培養的方法衍生自多能幹細胞 (諸如胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞)。在一些實施例中，該等神經幹細胞係藉由確定的無血清誘導而衍生自多能幹細胞。人類誘導多能幹細胞衍生的神經幹細胞 (HIP-NSC) 也可商購獲得 (HIP TM神經幹細胞，BC1 株，MTI-GlobalStem)。在一些實施例中，該等神經元可藉由轉錄因子的活化而衍生自神經幹細胞。在一些實施例中，該等神經元可藉由 ASCL1 及/或 NGN2 的活化而衍生自神經幹細胞。在一些實施例中，可誘導型 NSC 株可以從在可誘導型啟動子下表現 NGN2 及 ASCL1 的 HIP-NSC 產生。在一些實施例中，可以將 cumate 誘導 NGN2/ASCL1 系統引入 HIP-NSC 株內，其中 cumate 誘導在 NSC 株內結合細胞週期抑制 (PD0332991) 可以產生同質之 iPSC 衍生的神經元。在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該等神經元係衍生自哺乳動物細胞 (諸如哺乳動物幹細胞)。在一些實施例中，該等神經元係衍生自靈長類動物細胞。在一些實施例中，該等神經元係衍生自非人靈長類動物 (例如猴、狒狒及黑猩猩) 細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、牛細胞、馬細胞、貓細胞、狗細胞、豬細胞、兔細胞或山羊細胞。在一些實施例中，該等神經元係衍生自人類細胞。 神經元培養系統的應用 疾病形態學
本文所述神經元培養系統可用於研究及驗證神經退化性疾病諸如阿滋海默症的疾病表型及作用機制。在一些實施例中，該神經元培養系統在添加疾病相關成分後在神經元中表現出以下一種或多種一致的 AD 病理：突觸喪失、pTau 誘導 (過度磷酸化) 及神經元喪失。在一些實施例中，該神經元培養系統揭示一系列退化事件，該等事件以突觸喪失、軸突片段化及樹突萎縮開始，隨後為 p-Tau 誘導，導致嚴重的神經元喪失。在一些實施例中，在添加促炎性細胞激素後，該神經元/小神經膠質細胞共培養系統揭示小神經膠質細胞數目增加，如經由離子化鈣結合銜接分子 1 (IBA1) 陽性細胞計數所測量，表明小神經膠質細胞增生反應。 藥物篩選及標的探索
本文所述神經元培養系統可用於篩選 (諸如包括但不限於探索、確定、偵測、驗證) 提供神經保護的化合物。本文所述神經元培養系統可用於探索 (諸如包括但不限於探索、確定、偵測、驗證) 誘導疾病進展之標的途徑或防止疾病進展之標的途徑。
在一些實施例中，提供一種篩選增加神經保護的化合物的方法，其包含：使該化合物與本文所述神經元培養系統中之任一者接觸，以及量化神經保護中之改善。在一些實施例中，神經保護中之改善包含：增加該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突。在一些實施例中，該方法包含量化在該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量的增加：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突，其中：(a) 樹突之數量係藉由該神經元培養物中 MAP2 的水平來測量；(b) 突觸之數量係藉由該神經元培養物中突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2 的水平來測量；(c) 細胞計數之數量係藉由該神經元培養物中 CUX2 的水平來測量；以及/或 (d) 軸突之數量係藉由該神經元培養物中 β III 微管蛋白的水平來測量。
在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：神經元培養物中之 MAP2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：神經元培養物中之突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：神經元培養物中之 CUX2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：神經元培養物中之 β III 微管蛋白的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。
在一些實施例中，該化合物經歷進一步測試，包括但不限於標的探索及類似物分析。
在一些實施例中，若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試：(a) 該神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%；(b) 該神經元培養物中突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%；(c) 該神經元培養物中 CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) 該神經元培養物中 β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%；當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。
在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：神經元培養物中之 MAP2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：神經元培養物中之突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：神經元培養物中之 CUX2 的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：神經元培養物中之 β III 微管蛋白的水平增加至少約以下者中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2 倍、3 倍、5 倍、10 倍、20 倍，當其係與未與該化合物接觸的相對應神經元培養物相比時。
在一些實施例中，若有以下條件則確定化合物為神經保護的：(a) 該神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%；(b) 該神經元培養物中突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%；(c) 該神經元培養物中 CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) 該神經元培養物中 β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%，當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。 疾病相關成分及神經保護成分
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該疾病相關成分對於細胞培養物中的神經元為外源的。在一些實施例中，該神經保護成分對於細胞培養物中的神經元為外源的。在一些實施例中，該疾病相關成分之效應為劑量依賴性的。在一些實施例中，該神經保護成分之效應為劑量依賴性的。 疾病相關成分——可溶性 Aβ 物質
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該等可溶性 Aβ 物質係藉由以下產生：將凍乾的 Aβ 單體 (諸如 Aβ42 單體) 重新懸浮於 PBS 中並在 4℃ 孵育單體約以下者中之任一者：14、24、48、72 小時，然後冷凍以停止寡聚化過程。在一些實施例中，該等可溶性 Aβ 物質係藉由以下產生：將凍乾的 Aβ 單體 (諸如 Aβ42 單體) 重新懸浮於 PBS 中並 在4℃ 孵育單體約以下者中之任一者：7 至 14、14 至 24、24 至 48、48 至 72 或 72 至 96 小時，然後冷凍以停止寡聚化過程。在一些實施例中，該等可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物。在一些實施例中，該等可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物、Aβ 原纖維及/或 Aβ 單體。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 誘導的神經毒性對哺乳動物神經元為特異性的。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 誘導的神經毒性對靈長類動物神經元為特異性的。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 誘導的神經毒性對人類動物神經元為特異性的。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、50 或 100 µM 可溶性 Aβ 物質。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.1、0.2、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7.5 或 10 µM 可溶性 Aβ 物質。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與可溶性 Aβ 物質接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與可溶性 Aβ 物質接觸約以下者中之任一者：2、5、7、14、21、28、30、40、或 60 天。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質的接觸包含約每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每天一次的可溶性 Aβ 物質處理。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質為可在整個篩選或疾病模擬期間添加、去除及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質為可調式成分，其中可溶性 Aβ 物質之濃度可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (增加或減少) 一次或多次。在一些實施例中，該可溶性 Aβ 物質成分的模組化及可調性質係藉由本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。 疾病相關成分——突變 APP 的過度表現
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該突變 APP 過表現可以是突變 APP 的可誘導型過表現。在一些實施例中，該突變 APP 過表現為可在整個篩選或疾病模擬期間添加、去除及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，該突變 APP 過表現為可調式成分，其中突變 APP 過表現之數量可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (增加或減少) 一次或多次。在一些實施例中，該突變 APP 過表現成分的模組化及可調性質係藉由過表現之誘導劑的模組化來控制，其數量繼而藉由本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。 疾病相關成分——促炎細胞激素
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該促炎細胞激素包含干擾素-γ (IFNγ)、間白素 1β (IL-1β)、脂多醣 (LPS) 或其任何組合。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 ng/mL IFNγ。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 ng/mL IL-1β。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000 或 2000 ng/mL LPS。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與促炎性細胞激素接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與促炎性細胞激素接觸約以下者中之任一者：2、5、7、14、21、28、30、40、或 60 天。在一些實施例中，該促炎性細胞激素的接觸為約每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每天一次。在一些實施例中，該等促炎性細胞激素 (諸如 IFNγ、IL-1β、LPS) 中之每一者為可在整個篩選或疾病模擬期間添加、去除及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，該等促炎性細胞激素中之每一者為可調式成分，其中促炎性細胞激素之濃度可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (增加或減少) 一次或多次。在一些實施例中，該促炎性細胞激素成分的模組化及可調性質係藉由本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。在一些實施例中，該促炎性細胞激素為神經炎性細胞激素。 神經保護成分：抗 Aβ 抗體
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該抗 Aβ 抗體為克瑞珠單抗。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18 或 20 µM 抗 Aβ 抗體。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7.5 或 10 µM 抗 Aβ 抗體。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與抗 Aβ 抗體接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與抗 Aβ 抗體接觸約以下者中之任一者：2、5、7、14、21、28、30、40、或 60 天。在一些實施例中，該抗 Aβ 抗體的接觸包含約每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每天一次的抗 Aβ 抗體處理。在一些實施例中，該抗 Aβ 抗體為可在整個篩選或疾病模擬期間添加、去除及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，該抗 Aβ 抗體為可調式成分，其中抗 Aβ 抗體之濃度可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (增加或減少) 一次或多次。在一些實施例中，該抗 Aβ 抗體成分的模組化及可調性質係藉由本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。 神經保護成分：DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 抑制劑
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該神經保護成分為 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑、JNK 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑。在一些實施例中，該 DLK 抑制劑為 DLKi、VX-680、GNE-495、PF06260933。在一些實施例中，該 GSK3β 抑制劑為靛玉紅-3'-單肟。在一些實施例中，該 CDK5 抑制劑為靛玉紅-3'-單肟。在一些實施例中，該 JNK抑制劑為 JNK1/2/3 抑制劑，視需要其中該 JNK 抑制劑為 JNK-IN-8。在一些實施例中，該 Fyn 激酶抑制劑為 AZD0530。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8 或 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18 或 20 μM 的一種或多種上述抑制劑。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞與約以下者中之任一者接觸：0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7.5 或 10 µM 的一種或多種上述抑制劑。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞係與一種或多種上述抑制劑接觸約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，該等神經元、星狀膠質細胞及/或小神經膠質細胞係與一種或多種上述抑制劑接觸約以下者中之任一者：2、5、7、14、21、28、30、40、或 60 天。在一些實施例中，該抑制劑的接觸包含約每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每天一次的抑制劑處理。在一些實施例中，上述抑制劑中之每一者為可在整個篩選或疾病模擬期間添加、去除及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，上述抑制劑中之每一者為可調式成分，其中每種抑制劑之濃度可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (增加或減少) 一次或多次。在一些實施例中，上述抑制劑中之每一者的模組化及可調性質係藉由本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。 神經保護成分：小神經膠質
在根據本文所述神經元細胞培養物、方法及神經元族群中之任一者的一些實施例中，該等小神經膠質細胞係根據公開的方案諸如 Abud et al., 2017 中所述者衍生自 PSC (諸如 iPSC 或 ESC)。在一些實施例中，產生小神經膠質細胞的方法包含用 BMP、FGF 及活化素處理 iPSC 2 至 4天以誘導中胚層命運(fate)，然後用 VEGF 及支持性造血細胞激素處理 6 至 10 天以產生造血前驅細胞 (HPC)，其中將 HPC 接種到塗有基質膠的燒瓶上，並用 IL-34、IDE1 (TGF β1 促效劑) 及 M-CSF 進一步處理 3 至 4 週以分化成小神經膠質細胞。在一些實施例中，神經元及/或星狀膠質細胞係與小神經膠質細胞接觸 (諸如共培養) 約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、28、30、35、40、50 或 60 天。在一些實施例中，神經元及/或星狀膠質細胞係與小神經膠質細胞接觸 (諸如共培養) 約以下者中之任一者： 2、5、7、14、21、28、30、40、或 60 天。在一些實施例中，該小神經膠質細胞的接觸包含約每月一次、每三週一次、每兩週一次、每 10 天一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每天一次接種小神經膠質細胞。在一些實施例中，該小神經膠質細胞為可在整個篩選或疾病模擬期間添加及/或修改一次或多次的模組化成分。在一些實施例中，該小神經膠質細胞為可調式成分，其中小神經膠質細胞之濃度可以在整個篩選或疾病模擬期間修改 (諸如增加) 一次或多次。在一些實施例中，該小神經膠質細胞成分的模組化及可調性質係藉由細胞接種使用本文所述自動化細胞培養系統中之任一者的自動化培養基去除及/或自動化培養基補充來促進。 系統及套組
在一些態樣中，本發明提供一種整合系統，其包含本文所揭露之自動化細胞培養系統、PSC 衍生的 NSC 株、分化的神經元、神經元培養系統模型、疾病相關成分及/或神經保護成分中之一者或多者。該系統可包括針對上文所揭露之方法描述的任何實施例，包括產生完全分化的神經元之方法、模擬 AD 之方法及/或本文所述藥物篩選及標的探索之方法。在一些實施例中，分化、成熟、疾病相關成分及/或神經保護成分的參數 (諸如成分投予的濃度及間隔、分化及成熟的持續時間) 以及細胞培養基的參數 (例如，滲透壓、鹽濃度、培養基的血清含量、細胞濃度、pH 等) 針對 AD 模擬及藥物篩選經優化。
還提供用於模擬 AD 的套組或製品。在一些實施例中，該套組包含包含本文所揭露之自動化細胞培養系統、PSC 衍生的 NSC 株、分化的神經元、神經元培養系統模型、疾病相關成分及/或神經保護成分。在一些實施例中，該等套組包含在合適包裝中的本文所述組成物 (例如，PSC 衍生的 NSC 株、分化的神經元、疾病相關成分及/或神經保護成分)。合適的包裝材料為本領域中已知的，且包括例如小瓶 (諸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、廣口瓶、柔性包裝 (例如，密封的 Mylar 或塑膠袋) 等。這些製成品可經過進一步消毒和/或密封。
本發明還提供包含本文所述方法之成分的套組，並且可以進一步包含用於進行該等模擬神經退化性疾病或藥物篩選的方法之說明。本文所述套組可進一步包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、移液管尖端、組織培養盤、自動化培養系統及藥品仿單，其帶有進行本文所述任何方法之說明的；例如，模擬神經退化性疾病或藥物篩選的方法。 例示性實施例
實施例 1.   一種用於促進神經元分化及/或提升長期神經元生長之自動化細胞培養系統，其中該自動化細胞培養系統包含一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
實施例 2.   如實施例 1 之自動化細胞培養系統， 其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 96 孔盤；或一個或多個 384 孔盤。
實施例 3.   如實施例 2 之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處。
實施例 4.   如實施例 2 或 3 之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。
實施例 5.   如實施例 2 至 4 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移； 視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。
實施例 6.   如實施例 2 至 5 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；以及/或 (b) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。
實施例 7.   如實施例 2 至 6 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (b) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 8.   如實施例 2 至 7 中任一者之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
實施例 9.   如實施例 2 至 7 中任一者之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
實施例 10. 如實施例 2 至 9 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處；以及/或 (b) 在分配期間，移液管尖端以約 1 mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 11. 如實施例 2 至 10 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： 在分配之前及/或期間，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角。
實施例 12. 如實施例 2 至 11 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)。
實施例 13. 如實施例 2 至 12 中任一者之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔組織盤；其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第一側；以及/或 (b) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側， 視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角。
實施例 14. 如實施例 2 至 13 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (b) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (c) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2；以及/或 (d) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。
實施例 15. 如實施例 2 至 14 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (b) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 16. 如實施例 2 至 15 中任一者之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
實施例 17. 如實施例 2 至 16 中任一者之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤； 進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
實施例 18. 如實施例 1 至 17 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。
實施例 19. 如實施例 1 至 18 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
實施例 20.       如實施例 1 至 19 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
實施例 21. 如實施例 1 至 19 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
實施例 22. 如實施例 1 至 21 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
實施例 23. 如實施例 1 至 21 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
實施例 24. 一種從多能幹細胞產生同質且終末分化的神經元之方法，其包含： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
實施例 25. 如實施例 24 之方法，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含使用自動化細胞培養系統進行一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
實施例 26. 如實施例 25 之方法，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個組織培養盤。
實施例 27. 如實施例 26 之方法，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (f) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 28. 如實施例 26 或 27 之方法，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在分配期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 從孔中退出； (c) 在分配之前及/或期間，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (e) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第一側； (f) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 29. 如實施例 26 至 28 中任一項之方法，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
實施例 30. 如實施例 26 至 29 中任一者之方法，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
實施例 31. 如實施例 26 至 30 中任一項之方法，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
實施例 32. 如實施例 26 至 31 中任一項之方法，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
實施例 33. 一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中至少 95% 之該等神經元表現：Map2；突觸蛋白 (Synapsin) 1 及/或突觸蛋白 2；以及 β-III 微管蛋白。
實施例 34. 一種衍生自多能幹細胞的終末分化神經元之同質族群，其中： (a) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或 (b) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1；以及/或 (c) 神經元之至少 100 個突觸後末端係與其他神經元之突觸前末端重疊及/或該神經元之至少 100 個突觸前末端係與其他神經元之突觸後末端重疊。
實施例 35. 如實施例 34 之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現： 兩個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或 兩個或多個選自以下者之的突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。
實施例 36. 如實施例 33 至 35 中任一項之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現一種或多種上層皮質神經元標記，視需要其中不超過 5% 之該等神經元表現一種或多種下層皮質神經元標記
實施例 37. 如實施例 33 至 36 中任一項之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現 CUX2，視需要其中不超過 5% 之神經元表現 CTIP2 或 SATB2。
實施例 38. 如實施例 33 至 37 中任一項之族群，其中從多能幹細胞衍生終末分化的神經元之方法包含： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在表現 NGN2 及 ASCL1 的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
實施例 39. 如實施例 38 之族群，其中該等神經元以高度可複製性方式表現樹突、細胞體、軸突及突觸之代表性標記。
實施例 40. 如實施例 39 之族群，其中在神經元中的樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性，其中 MAP2、CUX2、Tau 及突觸蛋白 1/2 中的每一者之 z 因數至少為 0.4。
實施例 41. 如實施例 38 至 40 中任一項之方法，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
實施例 42. 如實施例 41 之族群，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 384 孔盤。
實施例 43. 如實施例 42 之族群，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (f) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 44. 如實施例 42 或 43 之族群，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在分配期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 從孔中退出； (c) 在分配之前及/或期間，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (e) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第一側； (f) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 45. 如實施例 42 至 44 中任一項之族群，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
實施例 46. 如實施例 42 至 45 中任一者之族群，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
實施例 47. 如實施例 42 至 46 中任一項之族群，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
實施例 48. 如實施例 42 至 47 中任一項之族群，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
實施例 49. 一種用於模擬神經退化性疾病的多能幹細胞衍生的神經元培養系統， 其中該培養系統包含實質上確定的培養基，以及 其中該培養系統可適於以下者之模組化及可調式輸入： 一種或多種疾病相關成分及/或 一種或多種神經保護成分。
實施例 50. 如實施例 49 之神經元培養系統，其中該神經退化性疾病為阿滋海默症，其中： (a) 該等疾病相關成分包含可溶性 Aβ 物質； (b) 該疾病相關成分包含突變 APP 之過表現，視需要其中該疾病相關成分包含突變 APP 之可誘導過表現； (c) 該疾病相關成分包含促炎性細胞激素； (d) 該神經保護成分包含抗 Aβ 抗體； (e) 該神經保護成分包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5 抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑；以及/或 (f) 該神經保護成分包含小神經膠質細胞。
實施例 51. 如實施例 49 或 50 之神經元培養系統，其中該系統不包含基質膠。
實施例 52. 如實施例 49 至 51 中任一項之神經元培養系統，其中該系統包含完全確定的培養基及/或基質。
實施例 53. 如實施例 50 至 52 中任一項之培養系統，其中該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物及/或可溶性 Aβ 原纖維。
實施例 54  如實施例 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 神經元培養物中之 Tau 蛋白在 S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 殘基中之一者或多者中為過度磷酸化。
實施例 55. 如實施例 50 至 54 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含一種或多種包含可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示增加的神經元毒性。
實施例 56. 如實施例 50 至 55 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 當與不包含可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少。
實施例 57. 如實施例 50 至 56 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 當與不包含可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少。
實施例 58. 如實施例 50 至 57 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示神經元中 Tau 磷酸化的增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度； 當與不包含可溶性 Aβ 物質的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度； 當與不包含可溶性 Aβ 物質的培養系統相比，該神經元培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度；以及 當與不包含可溶性 Aβ 物質的培養系統相比，該神經元培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度。
實施例 59. 如實施例 58 之神經元培養系統，其中： 該第一濃度高於該第二、第三及第四濃度；以及/或 該第二濃度高於該第三及第四濃度；以及/或 該第三濃度高於該第四濃度。
實施例 60. 如實施例 59 之神經元培養系統，其中該第一濃度為約 5 μM，該第二濃度為約 2.5 μM，該第三濃度為約 1.25 μM，且該第四濃度為約 0.3 μM。
實施例 61. 如實施例 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，其中當與不包含可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 表現及/或該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 片段化。
實施例 62. 如實施例 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，其中： 該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構。
實施例 63. 如實施例 62 之神經元培養系統，其中該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良。
實施例 64. 如實施例 62 之神經元培養系統，其中至少一部分甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突圍繞，視需要其中該等神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及/或磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡標記，進一步視需要其中該等神經突為營養不良的。
實施例 65. 如實施例 64 之神經元培養系統，其中經神經突圍繞之斑塊或斑塊樣結構表現出： 位於澱粉樣斑塊中之 ApoE 表現及/或在該等神經突之膜中的 APP。
實施例 66. 如實施例 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該培養系統包含： 包含可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分、包含神經炎性細胞激素的疾病相關成分及包含小神經膠質細胞的神經保護成分。
實施例 67. 如實施例 50 或 66 之神經元培養系統，其中該小神經膠質細胞為 iPSC 衍生的小神經膠質細胞並且表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。
實施例 68. 如實施例 66 至 67 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。
實施例 69. 如實施例 66 至 68 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。
實施例 70. 如實施例 66 至 69 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出神經元毒性變化小於 10%。
實施例 71. 如實施例 66 至 70 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞的神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 sAβ 斑塊締合及/或增加的 sAβ 斑塊形成。
實施例 72. 如實施例 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含疾病相關成分，該疾病相關成分包含 (1) 包含可溶性 Aβ 物質的疾病相關成分，以及 (2) 包含小神經膠質細胞的神經保護成分。
實施例 73. 如實施例 49 至 72 中任一項之神經元培養系統，其中該等神經元表現出 DLK、GSK3、CDK5 及 Fyn 激酶訊號傳導中之一者或多者。
實施例 74. 如實施例 49 至 73 中之任一者之神經元培養系統，其中該神經元培養物包含來自多能幹細胞之同質且終末分化的神經元，其中該等來自多能幹細胞之同質且終末分化的神經元在包含以下步驟的方法中產生： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
實施例 75. 如實施例 74 之神經元培養系統，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含一輪或多輪自動化培養基更換；並且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞的分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
實施例 76. 如實施例 74 或 75 之神經元培養系統，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 384 孔盤。
實施例 77. 如實施例 76 之神經元培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (c) 在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1mm 之位移；視需要其中在抽吸之前、期間及/或之後，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms (f) 在抽吸之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 78. 如實施例 76 或 77 之其中神經元培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，移液管尖端的末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在分配期間，移液管尖端的末端以約 1 mm/s 從孔中退出； (c) 在分配之前及/或期間，移液管尖端相對於孔的底面約呈 90° 角； (d) 在分配之前及/或期間，移液管尖端具有離孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在分配之前及/或期間，移液管尖端係在孔的中心處 (無位移)； (e) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心約 1mm 之該孔的第一側； (f) 移液管尖端在孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心約 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在移液管尖端經放置在孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入孔內；以及/或 (l) 在分配之後，移液管尖端以約 5mm/s 的速度從孔中退出。
實施例 79. 如實施例 76 至 78 中任一項之神經元培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
實施例 80. 如實施例 76 至 79 中任一者之神經元培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
實施例 81. 如實施例 76 至 80 中任一項之神經元培養系統，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
實施例 82. 如實施例 76 至 81 中任一項之神經元培養系統，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
實施例 83. 一種篩選增加神經保護的化合物之方法，其包含：使化合物與如實施例 50 至 82 中任一項之神經元培養系統中的神經元培養物接觸，並量化神經保護中之改善。
實施例 84. 如實施例 83 之方法，其中該等神經保護中之改善包含：增加該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突。
實施例 85. 如實施例 84之方法，其中該方法包含量化在該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量的增加：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突，其中： (a) 樹突之數量係藉由神經元培養物中 MAP2 的水平來測量； (b) 突觸之數量係藉由神經元培養物中突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2 的水平來測量； (c) 細胞計數之數量係藉由神經元培養物中 CUX2 的水平來測量；以及/或 (d) 軸突之數量係藉由神經元培養物中 β III 微管蛋白的水平來測量。
實施例 86. 如實施例 84 之方法，其中若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試： (a) 神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%； (b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%； (c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%； 當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。
實施例 87. 如實施例 84 或 86 之方法，其中若有以下條件則確定化合物為神經保護的： (a) 神經元培養物中 MAP2 的水平增加 ≥30%； (b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%； (c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%； 當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。 實例
藉由參考以下非限制性實例可以更好地理解本申請，該等實例係作為本申請的示例性實施例提供。以下實例係經提供以便更全面地說明實施例，但絕不應將其解釋為限制本申請的廣泛範疇。儘管本申請之某些實施例已展示及描述於本文中，但此類實施例係僅藉由實例方式提供為顯而易見的。熟習此項技術者將構想出諸多變化、改變及取代，此並不悖離本發明之精神及範疇。應理解，本文所述實施例的各種替代形式可用於實踐本文所述之方法。 實例 1. 生成高通量、自動化 iPSC 衍生的人類神經元培養平台。
本實例展示高通量、自動化 iPSC 衍生的人類神經元培養平台之工作流程及示例性應用。
圖 1A 展示當應用於本文所述方法的高通量、自動化 iPSC 衍生的人類神經元培養平台之工作流程。工作流程 (圖 1A) 以大批量 (1 億至 2 億個細胞) 誘導 iPSC 神經元分化開始，然後將其重新接種到 384 孔成像盤中。Fluent ®自動化工作站 (Tecan) 用於多個液體處置步驟，諸如細胞平板培養、培養基變更、實驗處理及細胞固定，以實現系統、可重複及精確的神經元處置。然後使用自動化高內容成像系統 (IN 細胞分析儀 6000；GE Healthcare) 對多重染色的細胞進行掃描及量化。
為了實現加速、同步及同質分化，生成了兩種不同的人類 iPSC 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株，該等神經幹細胞株在 cumate 可誘導系統下表現 NGN2、ASCL1 及綠色螢光蛋白 (GFP) 報告基因。為了生成 NSC 細胞株，獲得了多個人類誘導多能幹細胞衍生的神經幹細胞株 (iPSC-NSC)，並小規模測試了基礎 NSC 維持及內在神經元分化品質 (Axol、Millipore、Thermofisher、MTI global、Tempo Bioscience，羅氏 (Roche))。基於以下標準選擇來自 MTI Global Stem (HIPTM 神經幹細胞，BC1 株) 及羅氏 (來自 Christoph Patsch, Roche (Basel, Switzerland) 的贈與) 的 iPSC-NSC：1) 能夠維持同質 NSC 形態超過 40 代；2) ＞80% 的神經元分化效率；3) 生長速度快，至少 1:3 的擴張/分流比率；以及 4) 分化後沒有剩餘的前驅細胞。轉染 NSC 以穩定並表現可誘導型 ASCL1 及 NGN2，此等轉錄因子的表現已被證明結合分化培養基來增加分化效率。將轉錄因子 ASCL1、NGN2 及 EGFP 選殖到含有 cumate 可誘導型啟動子 (Systembio) 的載體中，然後使用 Neon 電穿孔穩定地轉染。根據製造商的說明培養兩種細胞株。簡而言之，將細胞在塗有 1:100 Geltrex (Thermofisher) 溶液的燒瓶中在 37℃ 細胞培養箱中培養至少 1 小時。使細胞在神經幹細胞生長培養基 (0.5X DMEM/F12、0.5X Neurobasal TM(ThermoFisher)、無維生素的 1X B27、1X N-2、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL FGF-basic、20 ng/ mL EGF、0.5 mM GlutaMAX TM(Gibco)、0.11 mM β-巰基乙醇、1X 諾莫星 (normocin)、50 U/mL 青黴素-鏈黴素) 及 0.75 μg/mL 嘌呤黴素選擇標記中在 37℃ 5% CO 2細胞培養箱中生長。當使用 TrypLE TM表現酶 (Gibco) 匯合時，細胞每 3 至 4 天傳代一次，並根據細胞密度以不超過 1:3 的比率分流。
然後分化生成的 NSC 細胞株。簡而言之，使 NAG-NSC 生長至匯合，然後使用 TrypLE TM表現酶 (Gibco) 分離並平板培養到塗有 50 μg/mL 聚-D-離胺酸及 10 μg/mL 小鼠層連結蛋白的 T-650 燒瓶上。將細胞以 0.7 x 10 8至 1.0 x 10 8個細胞/燒瓶的密度在以 100 μg/mL cumate、1 μM PD0332991 細胞週期抑制劑及 10 μM Y27632 Rock 抑制劑補充的神經元分化培養基 (0.5X DMEM/F12、0.5X Neurobasal TM(Thermofisher)、具維生素 A 的1X B27、1X N2、5 μg/mL 膽固醇、1 mM 肌酸、100 μM 抗壞血酸、0.5 mM cAMP、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、1 μg/mL 層連結蛋白、0.5 mM GlutaMAX TM(Thermofisher)、1X 諾莫星、50 U/mL 青黴素-鏈黴素) 中平板培養。使細胞分化 5 至 7 天，每 3 天更換一半體積的分化培養基。分化後，使用以 5% 海藻糖二水合物、1U 木瓜蛋白酶、10 μM Y27632 及 8 mM 犬尿喹酸補充的 AccuMAX TM(Innovative Cell Technologies) 分離細胞。使用 Tecan Fluent ®自動化工作站將細胞在塗有 50 μg/mL 聚 D-離胺酸及 20 μg/mL 重組人類層連結蛋白的 384 孔或 96 孔 CellCarrier Ultra 成像盤 (PerkinElmer) 中在以 10 μM Y276342 Rock 抑制劑及 1X RevitaCell TM(Gibco) 補充的神經元分化培養基中進行平板培養。
初代人類星狀膠質細胞係根據製造商的說明在初代人類星狀膠質細胞培養基 (1X DMEM/F12，1X N-2，10% FBS，1X normocin，50 U/mL 青黴素-鏈黴素) 中在塗被有 1:100 Geltrex TM(Thermofisher) 溶液的 T-650 燒瓶上在 37℃ 於細胞培養箱中培養及傳代至少 1 小時。每 3 至 4 天更換一次全體積培養基，直到細胞匯合。細胞在匯合時使用 TrypLE TM表現酶 (Thermofisher) 進行傳代，並以至高達 1:6 的比率分流。
然後驗證星狀膠質細胞。簡而言之，初代人類星狀膠質細胞係使用 Accumax (Innovative Cell Technologies) 分離，並在 37℃ 細胞培養箱中接種到塗有 1:100 Geltrex TM(Thermofisher) 溶液的 384 孔盤上達至少 1 小時。將細胞以 2,000 個細胞/孔的密度接種在神經元維持培養基 (1X BrainPhys TMBasal (StemCell Technology)、具維生素 A 之 1X B27、1X N-2、5 μg/mL 膽固醇、1 mM 肌酸、10 nM β-雌二醇、200 nM 抗壞血酸、1 mM cAMP (Sigma-Aldrich)、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、1 μg/mL 層連結蛋白、0.5 mM GlutaMAX TM(Thermofisher)、1 ng/mL TGF-β1、1X 諾莫星、50 U/mL 青黴素-鏈黴素) 中。將細胞放置於 37℃ 細胞培養箱中 24 小時以允許附著。如其他實例中所述添加 Aβ42 及抗體處理。星狀膠質細胞增生係藉由以下標記的免疫染色驗證：豚鼠抗 GFAP (1:500)、兔抗 EAAT1(1:500)、兔抗波形蛋白 (1:500)、兔 ALDH1L1 (1:500)。
正如預期，在兩個 NSC 株中，Cumate 誘導結合細胞週期抑制 (PD0332991) 在 7 天內產生了同質 iPSC 神經元 (圖 1B 至 1C)。在神經元分化及再平板培養後，在神經元再平板培養後 5 至 10 天，將初代人類星狀膠質細胞 (Thermofisher) 添加到培養物中以促進神經元健康及成熟。星狀膠質細胞係使用 AccuMAX TM(Innovative Cell Technologies) 分離，並使用 Tecan Fluent ®自動化工作站平板培養到分別含有 4,000 或 20,000 個細胞/孔的密度之分化及再平板培養的神經元之 384 孔或 96 孔盤中。在後續實驗之前，將神經元及星狀膠質細胞在 384 或 96 孔 Cell Carrier Ultra 盤 (PerkinElmer) 中在神經元維持培養基中共培養，每 3 至 4 天使用 Tecan Fluent ®A自動化 液體處置工作站更換一半體積的培養基，持續至少 8 週且長達 6 個月。TecanFluent ®自動化工作站經程式化以利用其自動加載尖端、去除蓋及抽吸一半體積的培養基並一次為至高達 30 個盤添加新培養基的特性。條碼操作的培養盤存儲培養箱技術經整合到用於盤組織及檢索的系統中。
Fluent ®自動化工作站用於維持在 384 孔盤中的長期 iPSC 神經元培養。自動化工作站的便利特性允許無人值守實施，以保持一致且健康的神經元長達 6 個月 (圖 1D 至 1J)。
來自兩個 NSC 株的神經元係藉由免疫螢光染色評估。簡而言之，使用 Bravo 自動化將細胞在室溫用 4% PFA 及 4% 蔗糖固定 20 分鐘。然後使用 Biotek 406 微孔盤清洗機 (Beckman Coulter) 用 PBS 洗滌固定細胞 2 次，然後藉由與含有 1X PBS、0.1% Triton X-100、2% 驢血清及 1% BSA 的溶液在室溫孵育 30 分鐘進行透化 (permeabilization) 及阻斷。去除阻斷溶液，並將細胞與阻斷溶液中的一級抗體在 4℃ 孵育隔夜。在 Biotek 406 細胞盤清洗機 (Beckman Coulter) 上用 PBS 洗滌 6 次後，然後將細胞與螢光團結合的二級抗體在室溫避光孵育 1 小時以避免光漂白。然後在成像前用 PBS 再洗滌細胞 6 次。使用 IN Cell 6000 共聚焦顯微鏡 (GE Healthcare Life Sciences) 捕獲螢光圖像。使用 IN Cell 6000 分析軟體進行圖像分析。
來自兩個 NSC 株的所得神經元為同質的上層皮質神經元，且超過 95% 的該等神經元表現 CUX2，而僅 2-5% 表現 CTIP2 或 SATB2 (圖 1K) (圖 19A)。神經元還具有廣泛的突觸連接，並表現了幾種突觸前及突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、vGLUT2、突觸蛋白 1/2、PanSAPAP 及 NR1 (圖 1L 至 1R) (圖 19B 至 19H)。使用 384 孔盤可以同時測試多個實驗條件，每個實驗條件有四個生物學重複 ( n=4)。IN 細胞分析與 6000 及 ImageXpress Micro Confocal 用於自動化共聚焦圖像採集。每個孔成像九個視野，覆蓋 70% 的面積，並捕獲超過 1,000 個神經元 (圖 1S)。圖像分析腳本提供對感興趣標記的精確分割，該等標記包括樹突 (MAP2)、細胞體 (CUX2)、軸突 (Tau、p-Tau) 及突觸 (突觸蛋白 1/2) (圖 1T 至 1Y) (圖 19I 至 19N)。為了表徵檢定性能的可變性，從上述檢定的多個批次及實驗 (總計約 10 至 20 個) 計算平均 Z 因數 (檢定可靠性的量度)。如圖 1Z 所示，平均 Z 因數範圍為 0.5 至 0.7。 實例 2. 阿滋海默症 (AD) 的活體外人類神經元模型重演了 AD 病理學特徵及動力學。
本實例展示，阿滋海默症 (AD) 可以在受控的活體外人類神經元系統中進行研究。特定而言，本實例展示，人類神經元的活體外系統可以有效地重演 AD 病理學特徵及動力學。
為了研究是否可以在受控的活體外人類神經元系統中研究 AD 病理學，用合成的 Aβ42 寡聚物處理經培養之人類 iPSC 衍生的神經元，該寡聚物係藉由 Aβ42 單體在 4℃ 遵循先前公開方案的寡聚化來製備 (圖2A；遵循 Stine et al., 2011)。簡而言之，將 AggreSureᵀᴹ 人類 β-澱粉樣蛋白 (1-42) 單體 (Anaspec) 重新懸浮在 DMSO 中，然後懸浮在 PBS 以形成 100 µM 溶液。隨後將 Aβ42 單體在 4℃ 孵育 24 小時，然後在 -80℃ 冷凍以停止寡聚化過程。一次篩選 5 到 6 個批次的 Aβ42 單體並評估神經毒性及毒性的程度。在 4 年的進程中篩選了大約二十個批次。對於螢光 Aβ42 寡聚物實驗，使用 HiLyteᵀᴹ Fluor 555 標記的人類 β-澱粉樣蛋白 (1-42) (Anaspec)。對於 pHrodo 實驗，根據製造商的方案，用 pHrodo™ Green AM 細胞內 pH 指示劑 (Invitrogen) 標記人類 β-澱粉樣蛋白 (1-42)。
為了減少 Aβ42 寡聚物製劑之間的變異性，優化了寡聚化持續時間，並選擇了在處理後在神經元中表現出一致的 AD 病理學的 Aβ42 單體批次，其顯示：突觸喪失、pTau 誘導及神經元喪失 (圖 2A 至 2J)。另外開發了 Aβ 寡聚物選擇性及 Aβ 原纖維選擇性 ELISA 以確認寡聚物物質的產生 (圖 2E 至 2G)。簡而言之，為了檢偵測寡聚 Aβ42 的存在，使用了 6E10-6E10 檢定，該檢定利用相同的抗 Aβ42 (6E10) 作為捕獲及偵測兩者，以選擇性地與含有一個以上曝露之 6E10 結合位點的寡聚物物質結合。為了進一步測試寡聚物物質，使用了 GT622-6E10 檢定，該檢定使用 Aβ-寡聚物特異性抗體 (GT622) 作為捕獲，使用泛 Aβ 抗體 (6E10) 作為偵測。最後，使用 Aβ 原纖維選擇性抗體殖株 (OC) 作為捕獲及泛 Aβ 抗體 (6E10) 作為偵測來測試原纖維物質的存在。
如先前在實例 1 中所述製備待測試的 Aβs。透明、平底免疫非無菌 maxisorp 384 孔盤用在 0.05 M 碳酸鈉緩衝液 (pH 9.6)中之 100 ng/mL 不同的抗 Aβ42 抗體 (6E10；GTX622；OC) 塗被，並放置隔夜。將盤用 1X PBS 中的 0.05% Tween-20 洗滌 3X，然後在 1X PBS，pH 7.4 中的 0.5% BSA + 15PPM proclin 中阻斷 1 小時。全部樣品皆針對 Aβ42 單體進行量化，該單體在 0.5% BSA + 0.05% Tween-20 + 0.35M NaCl + 0.25% CHAPS + 5mM EDTA 在 1X PBS，pH 7.4 (檢定緩衝液) 中稀釋至 1 µg/mL，然後稀釋兩倍至 15.625 ng/mL。樣品 Aβ42 寡聚物在檢定緩衝液中稀釋至 1 µg/mL，然後稀釋三倍至 37 nM。然後將經阻斷之盤在 1X PBS 中的 0.05% Tween-20 中洗滌 3X，然後添加樣品、標準品及對照，並在 4℃ 孵育隔夜。樣品孵育後，將盤用 1X PBS 中的 0.05% Tween-20 洗滌 6 次，然後添加在檢定緩衝液 (6E10) 中的 100 ng/mL 結合抗體並在室溫孵育 1 小時。孵育後，將盤用 1X PBS 中的 0.05% Tween-20 洗滌 6 次，然後以 1:10,000 的稀釋度添加檢定緩衝液中的鏈黴親和素-聚 80 HRP 偵測抗體，並在室溫孵育 45 分鐘。孵育後，將盤用 1X PBS 中的 0.05% Tween-20 洗滌 6 次，並將 TMB 受質添加到每個孔中，然後孵育 10 至 15 分鐘。經適當顯色後，添加 1M H 3PO 4以淬熄反應。最後，在 450 至 630 nm 處讀取盤光密度 (O.D.)。
製備物經確定為含有可溶性寡聚物及原纖維兩者的異質混合物，因此稱為「可溶性 Aβ42 物質」(Aβs)。Aβs 誘導的神經毒性對人類神經元為特異性的，因為用幾種不同批次的 Aβ42 寡聚物製劑處理的初代大鼠皮層神經元未展示出樹突或突觸的減少 (圖 2N 至 2O)。
在實驗之前，含有神經元的孔中之培養基體積與液體處置自動化 (Bravo) 相平衡，以確保精確控制濃度。全部 Aβ42 寡聚物、抗 Aβ、小分子、炎性細胞激素皆以 10X 濃度製備，並以適當體積添加到神經元培養基中。對於重複給藥實驗，在每次給藥時首先將培養基更新 50%，然後添加指定最終濃度的 Aβ42 寡聚物及/或抗 Aβ 抗體。
圖 3A 至 3Y 及圖 4A 至 4W 展示，與 5 μM Aβs 孵育的神經元在 7 天時展示出顯著的突觸喪失、樹突減少、軸突片段化、tau 過度磷酸化 (S396/404) 的誘導及顯著的細胞死亡。在用 Aβ42 寡聚物處理時，在 AD、S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 中觀察到的幾個額外的 tau 磷酸化位點經過度磷酸化 (圖 4V 至 4Z)。此外，進行 300 nM Aβs 可溶性物質的重複處理達 3 週使 3R 重複序列陽性之 Sarkosyl 不溶性部分中的總 tau (HT7) 增加 (圖 4Z)。在此時，iPSC 神經元對 4R 重複 tau 呈陰性 (資料未展示)。有趣的是，在不溶於 sarkosyl 的部分中觀察到 tau 片段化及微弱的較高分子 tau 帶，表明形成了不溶於洗滌劑的較高分子量 tau 聚集體。藉由與抗 Aβ 抗體共同處理以劑量依賴性方式阻斷神經毒性，指示在活體外人類神經元模型中觀察到的 AD 之病理特徵為 Aβ 特異性的 (圖 3C、3H、3L、3P 及 3R)。使用該量化平台，產生了用於抗 Aβ 抗體救援 MAP2、突觸蛋白及 pTau 誘導的半最大抑制濃度 (IC50) (圖 3R)。結果指示突觸救援為線性的，而 MAP2 及 p-Tau 誘導救援更能指示具有急劇轉變的閾值化反應。此外，在 5 μM 可溶性 Aβ42 物質下，突觸救援的 IC50 為 ~1.4 μM，表明抗 Aβ 抗體與 Aβs 之間存在化學計量關係，導致完全阻斷所需的莫耳比為 1:2。
為了表徵可溶性 Aβ42 物質對神經毒性的動力學及效應，進行了單劑量之遞增 Aβs 濃度的 21 天時間進程實驗。與 Aβs 神經毒性相關的表型呈劑量依賴性及進行性；更高的劑量導致更快的病理發展及神經元喪失 (圖3D、3E、3I、3M 及 3Q)。最敏感且最早出現的表型為突觸喪失。在 0.3 μM Aβs 下突觸減少 25%，而其他神經退化性標記不受影響 (圖 3D、3E、3I 及 3Q)。在這種最低的突觸損傷下，神經元可以在 21 天後恢復。有趣的是，樹突及軸突減少對 Aβs 的神經毒性反應具有閾值效應，其中在 1.25 μM 下，即使存在突觸及 CUX2 核表現的持續喪失，對樹突或軸突減少也沒有效應 (圖 3D、3E、3M 及 3Q,)。pTau 誘導的誘導似乎更接近於神經元死亡，因為當神經元在高 sAβ42s 濃度下迅速死亡時，我們無法捕捉到 pTau 的初始誘導。此等發現也在第二個 iPSC 衍生的神經元株 (圖 6A 至 6M) 中得到重演，指示表型的穩健性。
此等資料表明，該模型不僅表現出因應於可溶性 Aβ42 物質的人類 AD 病理學之特徵，而且還揭示一系列退化事件，以突觸喪失、軸突片段化及樹突萎縮開始，然後為 p-Tau 誘導，導致嚴重的神經元喪失 (圖 5O)。
因應於 CNS 損傷及神經退化，經常可以觀察到星狀膠質細胞增生，其通常以星狀膠質細胞中的明顯結構性變化為特徵，該等結構性變化導致神經膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 上調，且已經證明為 AD 的潛在血清生物標記。在 AD 的活體外人類神經元模型中的人類星狀膠質細胞培養物類似地展示出以特徵性星狀膠質細胞形態表現多種星狀膠質細胞標記，諸如 GFAP、波形蛋白、ALDH1L1 及 EEAT1 (圖 7A 至 7C) (圖 25A 至 25C)。在與人類 iPSC 神經元進行擴展培養後，觀察到越來越精緻化的星狀膠質細胞過程 (圖 7D)。因應於 sAβ42s，人類星狀膠質細胞在單一培養及與神經元共培養中皆展示出 GFAP 表現升高 2 至 3 倍 (圖 7E 至 7J)。另外觀察到增加的 GFAP 片段化 (圖 7G 至 7J)，其已經證明為在 CNS 損傷期間由半胱天冬酶切割。 實例 3. iPSC 衍生的神經元及星狀膠質細胞重演 Aβ 斑塊形成。
本實例展示 iPSC 衍生的神經元及星狀膠質細胞重演 Aβ 斑塊形成。
在觀察用 Aβ 寡聚物處理後的活體外人類神經元模型中的特徵 AD 病理學後，接下來評估該模型重演 Aβ 斑塊形成的能力。在 iPSC 衍生的神經元及初代星狀膠質細胞存在下，Aβ 聚集結構對甲氧基-X04 呈陽性，甲氧基-X04 為一種常用的 Aβ 斑塊結合小分子染料 (圖 5A) (圖 23A)。為了確認斑塊樣結構係由細胞形成，還對用 Aβ 寡聚物處理的空培養孔進行染色。在空培養孔中觀察到較小的、形態上不同的 Aβ 聚集體，該等聚集體為 X04 染料陰性 (圖 9A) (圖 26A)。此等不同的聚集體可能是 Aβ 寡聚物繼續寡聚化並從溶液中掉落到培養盤上的結果。相比之下，與具有 Aβs 的 Hela 細胞孵育不形成與我們在人類 iPSC 神經元中所觀察者相同的甲氧基-X04 陽性 Aβ 聚集結構 (圖 10) (圖 27)。
進一步的表徵表明，X04 陽性 Aβ 斑塊樣結構之子集經營養不良神經突圍繞，該等營養不良神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡標記 (圖 5B 至 5E) (圖 23B 至 23E)。此等結構與在人類 AD 死後腦切片中觀察到的具有神經炎性營養不良的 Aβ 斑塊非常類似。重要的是，在第二個 iPSC NSC 株衍生的神經元中也觀察到神經炎性斑塊樣結構 (圖 6A 至 6M)，指示該表型的穩健性。
活體外 AD 神經炎性斑塊樣結構對 ApoE 及 APP 也是陽性的 (圖 6C 至 6D)。為了進一步表徵該發現，進行遞增濃度之 Aβs 的時間進程實驗。時間進程分析表明，個別 Aβ 斑塊的尺寸增加，然後歷經 7 天達到峰值 (圖 5F 至 5L)。Aβ 斑塊的生長伴隨著在斑塊形成後 3 天出現營養不良神經突標記形態，這種現象隨著時間推移而惡化，指示神經元可能形成營養不良神經突作為對直接 Aβ 斑塊曝露的反應 (圖 5F 至 5N)。有趣的是，星狀膠質細胞單一培養物也對可溶性 Aβ 物質具有反應性，並形成大的 X04 陽性 Aβ 結構。此等結構大且呈纖維狀 (圖 7E) (圖 25D)，並且不具有特徵性的密集的神經炎性斑塊形態。
總之，資料表明，在神經元及星狀膠質細胞存在下，Aβ42 可溶性物質導致 X04 陽性神經炎性斑塊形成，最終導致神經炎性營養不良。 實例 4. 人類 iPSC 衍生的小神經膠質細胞在神經炎性環境中喪失神經保護。
本實例展示，在神經炎型環境中，諸如在人類 AD 中觀察到的圍繞 Aβ 斑塊的環境中，人類 iPSC 衍生的神經元之小神經膠質細胞喪失神經保護。
由於在人類 AD 中觀察到的 Aβ 斑塊在神經炎性環境中經常經小神經膠質細胞圍繞，因此研究了單獨之 iPSC 衍生的人類小神經膠質細胞是否可以產生及圍繞 Aβ 斑塊，以及神經炎性細胞激素是否可以調節小神經膠質細胞的行為。
獲得 iPSC 衍生的小神經膠質細胞並篩選小神經膠質細胞標記表現。然後使 iPSC 小神經膠質細胞分化。簡而言之，將 iPSC 用 BMP、FGF 及活化素處理 2 至 4 天以誘導中胚層命運，然後用 VEGF 及支持性造血細胞激素處理 6 至 10 天以產生造血前驅細胞 (HPC)。將 HPC 接種到塗有基質膠的燒瓶上，並用 IL-34、IDE1 (TGF-β1 促效劑) 及 M-CSF 處理 3 至 4 週以分化成小神經膠質細胞。人類 iPSC 小神經膠質細胞係藉由以下標記的免疫染色驗證：山羊抗 TREM2 (1:500)、小鼠抗 MERTK (1:500)、兔抗 IBA1 (1:1000)、兔抗 TMEM119 (1:500)、CD33 (1:500)、CX3CR1 (1:500)、CD64 (1:500)、P2RY12 (1:500)、CD32 (1:500)、PU.1 (1:500)。
將冷凍細胞解凍並立即以 8,000 個細胞/孔的密度接種到 384 孔盤中之處於小神經膠質細胞培養基 (BrainPhys TM神經元培養基 (Stem Cell Technologies)，以具維生素 A 之 1X B27、1X N2 Plus 培養基補充物 (R&D Systems)、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、1 mM 肌酸、200 nM L-抗壞血酸、1 µg/mL 小鼠層連結蛋白、0.5 mM GlutaMAX TM(Thermofisher)、0.5X 青黴素-鏈黴素、1X 諾莫星、5 ng/mL TGF-β、100 ng/mL 人類 IL-34、1.5 µg/mL 膽固醇、1 ng/mL 巨頭鯨魚酸 (gondoic acid)、100 ng/mL 油酸、460 µM 硫甘油、1X 胰島素-運鐵蛋白-硒、25 ng/mL rhM-CSF、5.4 µg/mL 人類胰島素溶液補充) 中的 8 週齡神經元-星狀膠質細胞共培養物上。
本研究中使用之 iPSC 衍生的小神經膠質細胞表現已知標記並表現出典型的分枝形態 (圖 8A 至 8E)，並且還能夠以劑量依賴性方式活體外生成及環繞 X04 陽性 Aβ 斑塊 (圖 9C 及 9E)。用促炎性細胞激素干擾素-γ (IFNγ)、間白素 1β (IL-1β) 及脂多醣 (LPS) 刺激之 iPSC 衍生的小神經膠質細胞顯示出增加的斑塊形成 (如藉由總 X04 陽性面積及強度所測量)，且另外更緊密地圍繞 Aβ 斑塊 (圖 9C 及 9E)。此外，小神經膠質細胞數目增加，如經由離子化的鈣結合銜接分子 1 (IBA1) 陽性細胞計數所測量，表明小神經膠質細胞增生反應 (圖 9F)。
在確認 iPSC 小神經膠質細胞顯示出與活體內觀察結果相似的行為後，將小神經膠質細胞與神經元-星狀膠質細胞 AD 模型條件共培養，並添加炎性細胞激素，以了解炎性 Aβ 神經毒性環境中的細胞-細胞動力學。在三重培養中，觀察到為小神經膠質細胞所圍繞之神經炎性斑塊形成 (圖 9D)，類似於在人類 AD 死後腦切片中觀察到的。向共培養系統中添加小神經膠質細胞賦予了 ~25% 神經元健康基礎保護，並形成了三倍多的 Aβ斑塊，表明 Aβ 斑塊形成及壓實可能是神經保護的 (圖 9H 至 9I)。當將促炎性細胞激素及 Aβ42 寡聚物添加到三重培養系統中時，小神經膠質細胞-斑塊締合增加，且斑塊形成增加六倍，但神經保護喪失 (圖 9D 及 9G 至 9I)。這表明，因應於 Aβ 的小神經膠質細胞活化可能有益於斑塊壓實及神經保護，但過度活化可能透過有毒的小神經膠質細胞活動諸如細胞激素分泌來抵消此等益處。
此等發現表明，iPSC 衍生的神經元及小神經膠質細胞能夠成功模擬經 pTau 陽性營養不良神經突圍繞並經與斑塊緊密接觸的小神經膠質細胞包圍之神經炎性 Aβ 斑塊形成；這是 AD 病理學的關鍵特徵。此等效應在神經炎性狀態下會變重，類似於在晚期人類 AD 病理學中所觀察者。 實例 5. 定向小分子篩選鑑定， DLK-JNK-cJun 途徑抑制保護人類神經元免受 Aβ 寡聚物毒性。
本實例展示一種定向小分子藥物篩選，以進一步驗證 AD 模型並表明該平台的可篩選性。特定而言，本實例表明，DLK-JNK-cJun 途徑抑制可以保護人類神經元免受 Aβ 寡聚物毒性。
為了證明該系統的可篩選性並研究觀察到的 AD 病理學是否保留了先前在 AD 中顯示出的分子訊號傳導事件，對 70 個小分子執行定向篩選，此等小分子先前已經證明在除 AD 之外的多種神經毒性環境中賦予神經保護 (表 1)。 表 1. 定向篩選中使用的小分子。
編號 名稱 目錄號 廠商 生物活性資訊 / 說明 劑量 神經保護引文
1 PD0325901 4192 Tocris MEK1/2 抑制劑；阻止由氧化壓力引起的神經元死亡 5 mg/kg Ku et al. 2018
2 LM22A4 4607 Tocris TrkB 促效劑；神經營養的 0.001 至 1000 nM Massa et al. 2010
3 7,8-二羥基黃酮 3826 Tocris TrkB 促效劑。神經營養的 5 mg/kg Andero et al. 2012
4 LM11A 31 二鹽酸鹽 5046 Tocris p75NTR 促效劑；增加存活訊號傳導並抑制 β-澱粉樣蛋白誘導的退化訊號傳導 50 mg/kg    Simmons et al. 2014
5 (S)-(-)-布雷他汀 (Blebbistatin) 1852 Tocris 肌凝蛋白 II ATP 酶抑制劑；阻止氧化壓力誘導的神經元凋亡 1 µM Wang et al. 2017
6 BI-6C9 Sc-210915A Santa Cruz Biotech tBID 抑制劑；保護以免於麩胺酸誘導的神經元死亡 10 µM Landshamer et al. 2008
7 米酵菌酸 (Bongkrekic acid) 溶液 B6179 Sigma ANT 抑制劑；保護以對抗 NMDA 受體介導的神經元凋亡 4 至 16 µg/kg Muranyi et al. 2005
8 丁酸鈉 3850 Tocris HDAC 抑制劑；抗炎及神經保護的 1.2 g/kg Kilgore et al. 2010
9 曲古抑菌素 (Trichostatin) A 1406 Tocris HDAC 抑制劑；抗炎及神經保護的 5 至 10 mg/kg Fleiss et al. 2012   
10 Calpeptin sc-202516 Santa Cruz Biotech 鈣蛋白酶 (Calpain)-2 抑制劑；阻止神經元凋亡 2 µM Das et al. 2006
11 犬尿喹酸 鈉鹽 3694 Tocris 刺激性胺基酸受體的非特異性拮抗劑；保護以免於麩胺酸誘導的神經元死亡 300 mg/kg Leib et al. 1996
12 Necrostatin-1 sc-200142 Santa Cruz Biotech RIPK1 抑制劑；阻斷壞死性凋亡並保護多巴胺神經元 0.1 至 100 µM Degterev et al. 2005
13 BAX 抑制 肽 V5 B1436 Sigma BAX 抑制劑；抑制神經元凋亡 5 µL，5 mg/mL    Wang et al. 2010
14 Ivachtin 2788-5 BioVision 凋亡蛋白酶-3 抑制劑；抑制神經元凋亡 0.5-50 µM Poksay et al. 2017
15 Cdk2 抑制劑 II 219445 Calbiochem CDK2 抑制劑；抑制由 CDK 之不當活化觸發的神經元凋亡 4 µM    Ye et al. 2010
16 SB 218078 2560 Tocris Chk1 抑制劑 5 µM Gonzalez et al. 2015
17 PD 0332991 羥乙基磺酸鹽 4786 Tocris CDK 抑制劑；抑制由 CDK 之不當活化觸發的神經元凋亡 100 mg/kg Marathe et al. 2015   
18 Purvalanol A 1580 Tocris CDK 抑制劑；抑制由 CDK 之不當活化觸發的神經元凋亡 75 nM Kuruva et al. 2016
19 奧羅莫星 (Olomoucine) 1284 Tocris CDK 抑制劑；抑制由 CDK 之不當活化觸發的神經元凋亡 1-100 µM Di Giovanni et al. 2005
20 GW8510 G7791 Sigma CDK2 抑制劑；抑制由 CDK 之不當活化觸發的神經元凋亡 1-10 µM    Johnson et al. 2005
21 SB216763 S1075 Selleckchem GSK-3β 抑制劑；保護以對抗軸突退化 3 µM    Liang and Chuang 2006
22 TDZD-8 ALX-270-354-M005 Enzo GSK-3β 抑制劑；保護以對抗軸突退化 3.3 & 10 µM Martinez et al. 2002
23 IM-12 SML0084 Sigma GSK-3β 抑制劑；保護以對抗軸突退化 1 µM Shan et al. 2017
24 CHIR 99021 三鹽酸鹽 4953 Tocris GSK-3β 抑制劑；保護以對抗軸突退化 3.1-25 mg/kg    Pan et al. 2011
25 塞卡替尼 (Saracatinib) (AZD0530) S1006 Selleckchem Fyn 抑制劑；神經保護的 2 至 1000 nM Nygaard, Dyck and Strittmatter 2014
26 SU6656 S7774 Selleckchem Fyn 抑制劑；神經保護的 5 µM Johnson et al. 2005
27 sun11602 4826 Tocris Fyn 抑制劑；神經保護的 1 & 3 µM Murayama et al. 2013
28 GM 6001 2983 Tocris 基質金屬蛋白酶抑制劑 5 µg/小鼠 Shichi et al. 2011
29 靛玉紅-3'-單肟 1813 Tocris GSK3β 及 CDK 抑制劑；保護以對抗軸突退化；抗凋亡及神經保護的 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
30 AS601245 ALX-270-443-M005 Tocris JNK 抑制劑；抗炎及神經保護的 0.04-20 µM    Rudhard et al. 2015
31 P7C3 4076 Tocris NAMPT 活化劑； 促神經生成及神經保護的 5-40 mg/kg + J33F3 3:I33F33:H33 Pieper et al. 2010
32 道諾黴素 鹽酸鹽 1467 Tocris 增加神經節苷脂(尤其是 GQ1b) 在分化神經元細胞中的表現 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
33 MG-132 1748 Tocris 鈣蛋白酶及蛋白酶抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
34 辣椒平 (Capsazepine) 0464 Tocris 類香草素受體拮抗劑；抗炎的 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
35 SU 11248 3768 Tocris 多受體轉導激酶抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
36 SU 6668 3335 Tocris PDGFR、VEGFR 及 FGFR 抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
37 Ac-Leu-Leu-Nle-CHO BML-P120-0005 Tocris 鈣蛋白酶 I、鈣蛋白酶 II、組織蛋白酶 L 抑制劑；阻止神經元凋亡 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
38 MDL 28170 1146 Tocris 鈣蛋白酶及組織蛋白酶 B 抑制劑；阻止神經元凋亡 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
39 SB 239063 1962 Tocris p38 MAPK 抑制劑；保護以對抗軸突退化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
40 BAY 11-7082 1744 Tocris NF-κB 抑制劑；抗炎的及神經保護的 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
41 葉黃酮 2874 Tocris 抗炎、抗氧化及自由基清除劑。 誘導 Nrf2 並抑制凋亡蛋白酶-3 活化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
42 替尼泊苷 (Teniposide) SML0609 Sigma 拓撲異構酶 II 抑制劑；抑制 DNA 合成 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
43 2-TEDC 0645 Tocris 5-、12-、-15-脂肪加氧酶抑制劑；保護以對抗軸突退化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
44 SB 415286 1617 Tocris GSK-3β 抑制劑；保護以對抗軸突退化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
45 FK 506 3631 Tocris 鈣調磷酸酶 (Calcineurin) 抑制劑； 神經保護的 0.5-1 mg/kg Sierra-Paredes 和 Sierra-Marcuno
46 STEARDA 2204 Tocris 5-LO (5-脂肪加氧酶)抑制劑；保護以對抗軸突退化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
47 牛蒡子甙元 (Arctigenin) 1777 Tocris MKK1 及 IKBa 抑制劑，藉由與紅藻氨酸受體結合而為神經保護的 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
48 石蒜鹼 鹽酸鹽 HY-N0289 MedChemExp ress p21CIP1/WAF1 活化劑；抑制凋亡蛋白酶-3 並阻止凋亡 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
49 NKH 477 1603 Tocris 腺苷酸環化酶活化劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
50 地美環素 (Demeclocycline) 鹽酸鹽 HY-17560 MedChemExp ress 鈣蛋白酶抑制劑；阻止神經元凋亡 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
51 PDI 抑制劑 16F16 SML0021 Sigma PDI 抑制劑。阻止由錯誤折疊之蛋白質誘導的細胞凋亡 0.5-100 µM    Hoffstrom et al. 2010
52 JWH 015 1341 Tocris 大麻素 (CB2) 受體促效劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
53 GW 5074 1381 Tocris cRaf1 激酶抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
54 GBR 12783 二鹽酸鹽 0513 Tocris 多巴胺攝取抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
55 貝加因 (Baicalein) 1761 Tocris 5-、及 12-脂肪加氧酶 抑制劑；保護以對抗軸突退化 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
56 GNE-3511 HY-12947 MedChemExp ress DLK 抑制劑；保護以對抗神經元及突觸喪失 0.04-20 µM Pichon et al
57 依達拉奉 (Edaravone) 0786 Tocris 自由基清除劑；保護以免於 ROS 誘導的神經毒性 1 & 3 mg/kg Kawasaki et al. 2007
58 C 646 4200 Tocris p300/CBP (HAT) 抑制劑 20 µM Formisano et al. 2015
59 Zileuton 3308 Tocris 5-脂肪加氧酶 (5-LOX) 抑制劑 0.04-20 µM Rudhard et al. 2015
60 TRO 19622 2906 Tocris 粒線體通透性轉變孔抑制劑； 神經保護的 0.1-10 µM    Bordet et al. 2007
61 白藜蘆醇 1418 Tocris 環氧合酶抑制劑。抗氧化的，神經保護的抗 Aβ 相關的神經毒性 0.1-50 µM    Bastianetto, Menard, and Quirion
62 IU1 4088 Tocris 去泛素化酶 USP14 抑制劑；減少蛋白質聚集體並保護以免於神經元喪失 400 µg/kg Min et al. 2017   
63 ISR 抑制劑，ISRIB 509584 Calbiochem 整合壓力反應 (ISR)抑制劑；透過抑制澱粉樣蛋白 β 誘導的 ATF4 誘導來阻止神經元細胞死亡 0.5-100 nM Hosoi et al. 2016
64 CTPB ALX-420-033-M005 Enzo Life Sciences p300 組蛋白乙醯轉移酶(HAT) 活化劑 0.5-200 µM    Hegarty et al. 2016
65 氟蓓薩羅丁 (Fluorobexarotene) 4064 Tocris RXR 促效劑；刺激 Aβ 的代謝清除 20 mg/kg Bachmeier et al. 2013   
66 AK 7 4754 Tocris SIRT2 抑制劑； 在亨丁頓氏(Huntington's)及帕金森氏(Parkinson's)鼠類模型中為神經保護的 10、20 & 30 mg/kg Chopra et al. 2012
67 表兒茶素 HY-N0001 MedChemExp ress 抗氧化及抗炎的； 神經保護的 10 mg/kg Pinto et al 2015
68 沒藥甾酮 (Guggulsterone) 2013 Tocris 類固醇受體拮抗劑；在小神經膠質細胞中為抗炎的 30 & 60 mg/kg    Chen, Huang, Ding 2016
69 凝聚素 (Clusterin) 蛋白 2937-HS R&D systems 阻止 Aβ 聚集及纖維化；抗凋亡的    Pucci et al. 2008
70 Neuropathiazol 5186 Tocris 神經元分化在海馬神經前驅細胞中的誘導劑 0.6-5 µM Wurdak et al. 2010   
在雙重 (神經元、星狀膠質細胞) 及三重 (神經元、星狀膠質細胞、小神經膠質細胞) 培養物中，表 1 中列出的每個小分子皆在 AD 模型範例中以至高達四種濃度進行了測試。以在樹突面積 (MAP2)、突觸計數 (突觸蛋白 1/2) 或細胞計數 (CUX2) 或軸突面積 (β III 微管蛋白；「BT3」) 的四項測量結果中之任何一項中具有 ≥30% 救援為特徵的分子經分類為命中 (圖 11A 至 11D，表 2 及表 3)。 表 2. 定向篩選結果。
編號 ( 來自表 1) 化合物 已知的軸突保護效應？ Conc. (µM) % MAP2 救援 % Cux2 救援 % 突觸救援 % B3T 救援
5 (S)-(-)-布雷他汀 (Blebbistatin) 否 50 34% 23% 12% 49%
25 34% 5% 13% 38%
12.5 25% 3% 15% 34%
6.25 21% 10% 19% 41%
43 2-TEDC 是 50 22% 16% 10% 31%
3 7,8-二羥基黃酮 否 50 6% 42% -2% -14%
37 Ac-Leu-Leu-Nle-CHO 是 50 23% 78% 2% 0%
25 20% 87% -5% -11%
12.5 18% 87% -4% 0%
6.25 31% 85% 0% 14%
10 Calpeptin 是 50 36% 96% 15% 20%
25 39% 91% 9% 7%
12.5 27% 79% 11% 4%
6.25 22% 70% 6% 9%
50 地美環素 (Demeclocycline) 鹽酸鹽 是 50 39% 33% 27% 63%
25 23% 6% 15% 35%
38 MDL 28170 是 50 26% 57% 23% 47%
25 36% 84% 11% 25%
12.5 33% 74% 9% 22%
6.25 33% 81% 10% 18%
66 AK 7 否 50 -17% 0% -5% 42%
30 AS601245 是 50 64% 123% 19% -16%
25 73% 32% 36% 11%
12.5 67% 13% 57% 20%
6.25 49% 9% 37% 14%
40 BAY 11-7082 是 25 17% 82% -13% 14%
12.5 36% 85% -3% 31%
6.25 34% 70% -2% 38%
41 葉黃酮 是 50 55% 19% 37% 66%
25 26% 12% 13% 29%
33 MG-132 是 50 25% 90% 4% 57%
25 26% 91% 8% 30%
12.5 24% 87% 4% 7%
6.25 18% 80% -6% -3%
58 C 646 否 50 54% 25% 19% 49%
32 道諾黴素 鹽酸鹽 是 50 -124% -39% -27% 101%
25 -122% -23% -27% 73%
56 GNE-3511    是 50 87% 81% 47% 58%
25 49% 36% 14% 17%
6.25 32% 18% 7% 15%
53 GW 5074 是 50 54% 162% 8% 48%
25 19% 115% 8% 14%
12.5 12% 76% 6% 9%
6.25 17% 95% 8% 16%
20 GW8510    否 50 52% -22% 49% 47%
25 37% -18% 38% 31%
12.5 37% 16% 38% 20%
6.25 48% -1% 52% 32%
17 PD 0332991 羥乙基磺酸鹽 否 50 -97% -37% -15% 69%
12 Necrostatin-1 是 50 37% 10% 15% 11%
49 NKH 477 是 50 44% 45% -5% 38%
25 43% 21% -4% 35%
12.5 45% 24% 5% 38%
6.25 39% 21% 7% 38%
51 PDI 抑制劑 16F16 否 50 -12% 34% -13% -22%
25 -10% 66% -8% -46%
12.5 1% 45% -1% 3%
6.25 6% 46% 5% 27%
25 塞卡替尼 (Saracatinib) (AZD0530) 否 25 65% 18% 10% 30%
12.5 71% 13% 34% 56%
6.25 61% 7% 32% 62%
26 SU6656    否 50 3% 106% 11% -188%
25 3% 126% 15% -37%
12.5 4% 120% 11% 3%
6.25 5% 101% 13% 4%
16 SB 218078 否 50 -92% -39% -15% 72%
44 SB 415286 是 50 19% -13% 12% 39%
35 SU 11248 是 25 16% 59% 4% -19%
50 7% 115% 21% 4%
42 替尼泊苷 (Teniposide) 是 50 21% -18% 6% 34%
表 3. 定向篩選結果：三重培養物。
編號 ( 來自表 1) 化合物 已知的軸突保護效應？ Conc. (µM) % MAP2 救援 % 突觸救援 % B3T 救援
60 TRO 19622 否 12.50 -36 -13% 33%
3.13 -25% -10% 34%
66 AK 7    否 50.00 28% 17% 56%
12.50 53% 42% 81%
3.13 18% 13% 77%
0.78 1% 3% 79%
61 白藜蘆醇 否 50.00 84% 78% 78%
12.50 57% 49% 54%
3.13 33% 27% 30%
0.78 33% 24% 27%
67 表兒茶素 否 50.00 28% 20% 30%
62 IU1 否 12.50 32% 23% 41%
68 沒藥甾酮 (Guggulsterone) 否 50.00 19% 17% 36%
63 ISR 抑制劑，ISRIB 否 50.00 31% 21% 22%
58 C 646 否 50.00 37% 39% 53%
12.50 41% 38% 42%
0.78 37% 28% 27%
70 Neuropathiazol    否 50.00 27% 28% 35%
12.50 44% 42% 35%
65 氟蓓薩羅丁 (Fluorobexarotene) 否 12.50 40% 33% 33%
3.13 43% 34% 50%
56 GNE-3511    是 50.00 66% 56% 65%
12.50 102% 81% 82%
3.13 95% 77% 81%
0.78 91% 79% 85%
37 Ac-Leu-Leu-Nle-CHO       是 12.50 48% 18% 44%
3.13 55% 38% 57%
0.78 21% 14% 38%
43 2-TEDC 是 50.00 48% 40% 73%
12.50 25% 17% 43%
3.13 22% 15% 40%
49 NKH 477 是 50.00 53% 38% 81%
12.50 9% 8% 49%
3.13 17% 12% 42%
38 MDL 28170    是 50.00 47% 41% 73%
12.50 31% 8% 33%
0.78 19% 10% 30%
44 SB 415286 是 50.00 42% 40% 78%
45 FK 506 否 12.50 34% 34% 52%
51 PDI 抑制劑 16F16       否 50.00 -5% -1% 42%
12.50 -6% 8% 43%
3.13 44% 43% 71%
40 BAY 11-7082 是 50.00 21% -1% 44%
46 STEARDA    否 12.50 24% 21% 33%
3.13 28% 24% 33%
0.78 30% 24% 27%
52 JWH 015 否 50.00 38% 26% 42%
12.50 50% 43% 60%
41 葉黃酮 是 50.00 73% 75% 91%
42 替尼泊苷 (Teniposide) 是 50.00 -19% 3% 52%
12.50 -17% 3% 50%
3.13 -10% 5% 42%
0.78 -7% 1% 35%
48 石蒜鹼鹽酸鹽    是 50.00 88% 75% 79%
12.50 93% 77% 83%
3.13 99% 80% 77%
0.78 57% 43% 37%
19 奧羅莫星 (Olomoucine) 否 50.00 -8% -15% 69%
25 塞卡替尼 (AZD0530)    否 12.50 -12% -2% 35%
3.13 73% 65% 99%
0.78 72% 65% 99%
31 P7C3 否 50.00 -8% 2% 43%
3.13 2% 3% 30%
20 GW8510    否 50.00 -8% -15% 63%
12.50 28% 32% 68%
3.13 15% 25% 70%
0.78 -4% 8% 45%
26 SU6656    否 50.00 40% 36% 48%
12.50 53% 49% 71%
3.13 72% 64% 92%
0.78 58% 51% 80%
32 道諾黴素鹽酸鹽 是 0.78 74% 52% 68%
21 SB216763 否 50.00 -24% -15% 46%
27 sun11602    否 50.00 14% 11% 47%
12.50 19% 15% 43%
3.13 10% 11% 33%
33 MG-132 是 50.00 25% -11% 46%
12.50 18% -7% 35%
22 TDZD-8 否 50.00 -29% -8% 54%
34 辣椒平 (Capsazepine) 是 12.50 44% 44% 50%
29 靛玉紅-3'-單肟 是 50.00 23% 34% 49%
12.50 37% 44% 74%
3.13 6% 9% 31%
35 SU 11248 是 3.13 88% 77% 74%
0.78 73% 68% 69%
24 CHIR 99021 三鹽酸鹽 否 50.00 58% 46% 66%
30 AS601245    是 50.00 95% 45% 44%
12.50 74% 26% 26%
3.13 54% 17% 18%
36 SU 6668    否 50.00 80% 75% 77%
3.13 31% 26% 34%
10 Calpeptin 是 50.00 34% 34% 66%
16 SB 218078 否 50.00 53% 19% -11%
0.78 10% 14% 38%
6 BI-6C9 否 50.00 58% 55% 65%
1 PD0325901 否 50.00 27% 27% 59%
12.50 8% 8% 43%
3.13 23% 21% 52%
0.78 19% 15% 48%
13 BAX抑制肽V5 否 12.50 -6% 14% 32%
9 曲古抑菌素 (Trichostatin) A 否 50.00 -13% 1% 41%
12.50 -18% 2% 31%
5 (S)-(-)-布雷他汀 (Blebbistatin) 否 50.00 24% 20% 36%
17 PD 0332991 羥乙基磺酸鹽 否 50.00 -79% -29% 90%
18 Purvalanol A 否 3.13 15% 24% 33%
觀察到來自雙重及三重培養物的重疊命中，指示彼等小分子有望獲得最高命中。兩種篩選中的九個命中皆用雙重培養物中的 IC50 曲線確認，包括 AD 中眾所周知的活性激酶抑制劑，諸如 DLKi、靛玉紅-3'-單肟 (GSK3β 及 CDK5 抑制劑) 及 AZD0530 (Fyn 抑制劑)。重要的是，GSK3、CDK5 及 Fyn 為已知的 Tau 作用激酶，且兩種天然產物葉黃酮及薑黃素已展示出在 AD 中提供保護效應。薑黃素及其衍生物 J147 係用 IC50 曲線驗證 (圖 12A 至 12G、表 2、表 3)。此外，鑑定了來自初級篩選的多種鈣蛋白酶抑制劑，並且用 IC50 曲線驗證了鹽酸地美環素 (demeclocycline HCl) (圖 11E 至 11G、圖 12A 至 12G、表2、表3)。
由於 DLK 抑制為最具保護性的化合物，並且 JNK 抑制 (AS601245) 在雙重及三重培養物的定向篩選中也具有較小程度的保護，下一步是驗證該途徑並研究 DLK-JNK-cJun 訊號傳導途徑是否在 AD 模型中經活化。當用 Aβ42 寡聚物處理人類神經元時，觀察到 cJun 磷酸化的誘導 (圖 11J)。該效應為持續的 (長達 13 天)，並且隨著可溶性 Aβ42 物質濃度的增加而以劑量依賴性方式增加 (圖 11H 至 11K)。
為了進一步驗證該途徑，我們測試了 DLK 訊號途徑中幾種已知的激酶抑制劑，以確定它們是否也可以在 AD 模型中為神經保護的。用 VX-680 (一種不同的 DLK 抑制劑)、GNE-495 (DLK 上游的 MAP4K4 抑制劑)、PF06260933 (一種不同的 MAP4K4 抑制劑) 及 JNK-IN-8 (JNK1/2/3 抑制劑) 進行抑制，全部賦予以劑量依賴性方式對抗 Aβ 的神經元保護 (圖 11L 至 11O)。
定向篩選導致鑑定及驗證幾種在人類 AD 的幾種已知機制中靶向蛋白質的化合物，諸如 DLK、GSK3、CDK5 及 Fyn 激酶，該等全部為當前藥物開發中感興趣的途徑。結果表明，基於活體外人類神經元的 AD 模型不僅顯示出以前在活體外未見的 AD 表型，而且還重演了促成此等觀察到的表型之重要病理訊號傳導事件。總體而言，對先前經證明為重要藥物靶的之已知分子訊號傳導途徑的驗證表明，活體外人類神經元 AD 模型為一種轉譯相關的分子神經生物學，且可用為可促進標的探索及表徵以及更大的藥物開發工作之高通量篩選工具。 實例 6. 小神經膠質細胞澱粉樣斑塊形成的細胞機制。
本實例展示 AD 模型系統中小神經膠質細胞斑塊形成的細胞過程。
由於 AD 模型系統穩健地重演了澱粉樣蛋白斑塊形成，下一步為了解斑塊形成的細胞過程。為了觀察由小神經膠質細胞進行的斑塊形成，用小神經膠質細胞以 30 分鐘間隔執行為期 7 天的時間流逝研究，並與類似的細胞類型 (例如，人類 CD14 衍生的巨噬細胞) 進行比較。HiLyte TM-555 標記的 Aβ42 單體用於產生紅色可溶性 Aβ42 物質 (圖 13A)。與巨噬細胞相比，小神經膠質細胞在斑塊形成期間及之後具有獨特的高度運動性，延伸及縮回其等之突起並動態地移動出入斑塊 (圖 7C)。Aβ 斑塊形成似乎在小神經膠質細胞簇內在細胞外形成並且變大 (圖 13B)。相比之下，人類巨噬細胞相對靜止並持續內化紅色 Aβ42 寡聚物。然後將 pHrodo ®綠色染料併入經 HiLyte TM-555 標記的寡聚物中，以允許同時觀察 Aβ42 內化 (綠色) 及斑塊形成 (紅色) (圖 14A)。在斑塊形成之前，小神經膠質細胞首先內化 Aβs (圖 14B 至 14C)。綜合此等結果表明，小神經膠質細胞可能首先內化可溶性 Aβ42 物質，然後胞吐並將它們包裝成斑塊結構 (圖 10)。
為了進一步確認時間流逝結果，進行了免疫染色時間進程研究。小神經膠質細胞在 30 分鐘內攝取了 Aβs (圖 14D)。6 小時後，小的內化斑塊消失，並且在靠近每個細胞的邊緣處出現較大的、微弱的 X04 陽性之 Aβ42 聚集體(圖 14D)。1 天後，在小神經膠質細胞旁邊觀察到具有較高 X04 染色強度之較大的 Aβ42 聚集體，並且額外的小神經膠質細胞開始圍繞此等聚集體。在第 4 天，X04 染料陽性斑塊結構呈現為經小神經膠質細胞圍繞。該行為似乎為小神經膠質細胞所獨有，因為人類巨噬細胞似乎不斷內化 Aβs，然後似乎死亡 (圖 15)。最後，為了測試內吞作用是否牽涉到該過程中，用發動蛋白抑制劑處理小神經膠質細胞，該等抑制劑減少內吞作用。用發動蛋白處理後，斑塊形成減少了 75%，指示小神經膠質細胞對 Aβ42 的內化對於澱粉樣斑塊形成至關重要 (圖 14E)。 實例 7. 模擬 AD 進展及抗 Aβ 抗體干預。
本實例展示 AD 進展模型及連續 Aβ 曝露，可以對其進行調節以生成具有神經退化速度精確時間控制的進行性 AD 疾病模型。特定而言，本實例展示大分子治療性抗 Aβ 抗體的作用機制，並進一步優化該 AD 模型，以使用減少 8 倍的 Aβs 來模擬 AD 進展並評估抗 Aβ 抗體干預。
為了模擬 AD 的進展及生理濃度下的連續 Aβ 曝露 (例如，歷經延伸時間的較低升高之 Aβ42 寡聚物，而非單次高劑量的 Aβs (5 µM))，歷經 21 天時間進程研究，每週兩次在培養基更換後，將重複劑量的 Aβ 寡聚物以多種濃度 (0.3 μM 至 5 μM) 添加至神經元/星狀膠質細胞培養物中。與單次曝露相比，重複之低劑量給藥的 Aβ42 寡聚物導致延長的、增加的神經元毒性 (圖 16A 至 16C，實線與虛線)。選擇 0.625 μM 的重複劑量來模擬 AD 進展，這需要 21 天以引起細胞死亡。
如早前觀察到的，在 Aβ 曝露開始時 (預防性地) 添加高濃度的抗 Aβ 抗體為保護性的。然而，在臨床環境中，在治療性干預的時間之前可能已經發生了某種程度的神經元損傷。為了測試在治療性處理之前已發生 Aβ 誘導的神經毒性時抗 Aβ 抗體處理是否有效，創建了一種抗體干預模型，其中抗 Aβ 處理在不同長度的 Aβs 曝露後開始 (圖 16D)。在疾病進展進程的三分之二左右存在一個窗口，在該窗口處，抗 Aβ 抗體處理在樹突、突觸及 pTau 誘導中提供神經保護 (圖 16E 至 16G)。有趣的是，針對 pTau 誘導的保護窗口比突觸蛋白短 (分別為 7 天與 14 天)，表明抗 Aβ 抗體可能在 pTau 誘導之前最有效。此外，當藉由使用按雙週劑量遞增之數量的 Aβs 加速神經退化時，干預窗口縮短 (圖 17A 至 17I)。
接下來，執行 MAP2 面積的時間進程分析作為神經元健康的量度，其中甲氧基-X04 染色用於斑塊形成，且 pTau (S235) 作為 pTau 誘導及營養不良神經突的量度 (圖 16H 至 16K)。與抗 gD 對照抗體相比，抗 Aβ 抗體減少了神經退化及斑塊形成的進展 (圖 16I 至 16K)。
此等資料表明，可以調節 AD 模型以生成具有神經退化速度精確時間控制的進行性 AD 疾病模型。當評估抗 Aβ 抗體的神經保護能力時，表明早期干預賦予更大的保護。 實例 8. 抗 Aβ 抗體藉由將 Aβ 寡聚物保留在可溶性上清液中來保護神經元。
本實例展示，抗 Aβ 抗體藉由將 Aβ 寡聚物限制在上清液中來賦予神經元保護，其中該等寡聚物在上清液中保持可溶性並與抗體結合。
為了研究抗 Aβ 抗體如何在具有小神經膠質細胞、神經元及星狀膠質細胞的完整三重培養系統中賦予神經元保護，用 Aβ42 寡聚物、幾種抗 Aβ 抗體及具有不同效應功能的抗 gD 抗體對照 (免疫球蛋白 G1 (IgG1；高效應功能) 及無效應 (LALAPG) 抗體) 處理該三重培養模型。計算抗體 IC50 作為神經元保護的量度。抗 gD 抗體係在小神經膠質細胞存在或不存在下經評估以了解小神經膠質細胞基線保護，並且抗體展示出 ~25–40% 的神經突觸及樹突保護 (圖 18A 至 18B)。抗 Aβ 抗體在小神經膠質細胞存在下也展示出增加的保護，表明小神經膠質細胞神經保護及抗 Aβ 抗體保護為相加的 (圖 18A 至 18B)。與具有效應功能或無效應功能的抗體進行的比較揭示沒有顯著差異，表明抗體效應功能可能在該模型中不起作用。
為了確定在小神經膠質細胞存在下神經炎性環境是否影響抗體保護，將促炎性細胞激素 IFNγ、IL-1β 及 LPS 添加至培養物中以活化小神經膠質細胞，並測量神經元健康 (MAP2) 及斑塊形成 (甲氧基-X04)。對照抗 gD 抗體重複了先前的觀察結果 (圖 11G 至 11I)，即小神經膠質細胞神經保護在神經炎性狀態下喪失 (圖 18C)。有趣的是，觀察到抗 Aβ 抗體在兩種情況下皆為保護性的，且 IC50 曲線向右移位，可能是由於小神經膠質細胞保護的喪失 (圖 18C)。
由於抗 Aβ 抗體的假定作用機制為與 Aβ 結合，因此研究了 Aβs 是否保持溶解在上清液中、與抗 Aβ 抗體結合、以及/或經中和以免引起對神經元的毒性。用遞增抗體濃度分析含有 5 μM Aβs 的上清液，並表明抗 Aβ 抗體增加了上清液中的可溶性 Aβ，同時降低了與盤結合的 Aβ (圖 18E)。在小神經膠質細胞存在下，上清液中存在的可溶性 Aβ 減少，最可能是由於增加的斑塊形成 (圖 9C)。然而，隨著抗體濃度的增加，上清液中的 Aβ 增加到 5 μM 的原始輸入值。這表明抗 Aβ 抗體與 Aβ 結合並溶解 Aβ，減少與神經元及小神經膠質細胞的接觸，從而賦予獨立於小神經膠質細胞的神經元保護 (圖 18D 至 18E)，這與抗 Aβ 抗體處理導致斑塊形成減少的觀察結果一致。
總之，結果表明成功生成了由人類神經元、星狀膠質細胞及小神經膠質細胞組成的活體內人類 iPSC AD 模型。在該高通量、三重培養系統中，添加 Aβ42 寡聚物不僅重演了 AD 的特徵，而且以類似於人類 AD 疾病進展的事件順序發展 (圖 18F)。
無
本發明的代表性實施例係藉由參考以下附圖來揭露。應理解，所描繪的實施例不限於所示的精確細節。 [圖1A] 展示人類誘導多能幹細胞 (iPSC) 神經元分化、平板培養 (plating)、維持及成熟的示意性工作流程，其中使用 Fluent ®液體處置器 (Tecan) 進行自動化培養基變更。成熟的培養物 (12 週或更長時間) 已準備好用於多種實驗性處理及條件。在實驗結束時，使用自動洗盤機對經固定之細胞進行免疫染色處理，然後經由 IN 細胞分析儀 6000 (GE) 用高內容圖像分析進行量化。 [圖1B] 展示非同步、異質野生型 (WT) iPSC衍生的神經元幹細胞 (NSC) 分化之代表性圖像 (實線箭頭指示分化的神經元；空心箭頭指示未分化的 NSC)。比例尺 = 50 μm。 [圖1C] 展示 cumate 誘導 NGN2/ASCL1/GFP (NAG) 構建體之穩定表現及用細胞週期抑制劑處理使人類 iPSC 神經元分化同步且同質化。比例尺 = 50 μm。 [圖1D至1J] 展示高通量、自動化人類 iPSC 衍生的神經元分化及培養平台的代表性工作流程。圖 1D 展示使用 Fluent ®自動化工作站 (Tecan) 變更 20 個培養盤培養基。圖 1E 展示 Fluent ®384 尖端液體處置器頭，其一致地且系統地去除舊培養基並向每個盤的全部孔中添加新培養基。圖 1F 展示整合培養箱及帶條碼的盤，可實現自動化的盤追蹤及管理。圖 1G 展示從圖 1F 的整合培養箱中自動彈出盤。圖 1H 展示抓取圖 1G 的盤的夾持臂。圖 1I 展示將圖 1G 的盤放置在盤承板 (plate deck) 上以用於後續的培養基變更之圖 1H 的夾持臂。圖 1J 展示在培養基變更期間將蓋子取下並放置在盤蓋暫存架上的夾持臂。 [圖1K] 展示分化的 NAG 神經元表現樹突標記 MAP2 (紅色)、II/III 層皮質標記 CUX2 (綠色)，其中表現 V/VI 層標記 CTIP2 (藍色) 之小的亞族群由白色箭頭指示。比例尺 = 50 μm。 [圖19A] 為圖 1K 的灰度版本，其展示分化的 NAG 神經元表現樹突標記 MAP2、II/III 層皮質標記 CUX2，其中表現 V/VI 層標記 CTIP2 之小的亞族群如由白色箭頭所指示。比例尺 = 50 μm。 [圖1L至1R] 展示，成熟的 NAG 神經元表現多種細胞標記：MAP2 (藍色)、突觸標記 VGLUT2 (紅色) 及 Shank (綠色)，比例尺 = 20 μm (圖 1L)；突觸蛋白 (紅色) 及 PSD95 (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1M)；泛 SHANK (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1N)；泛 SAPAP (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1O)；GluR1 (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1P)；GluR2 (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1Q)；以及 NR1 (綠色)，比例尺 = 10 μm (圖 1R)。 [圖19B至19H] 分別為圖 1L 至 1R 的灰度版本，其展示成熟的 NAG 神經元表現多種細胞標記：MAP2 (細胞體及分支)、突觸標記 VGLUT2 及 Shank (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 20 μm (圖 19B)；突觸蛋白及 PSD95 (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19C)；泛 SHANK (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19D)；泛 SAPAP (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19E)；GluR1 (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19F)；GluR2 (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19G)；以及 NR1 (沿細胞分支的亮點)，比例尺 = 10 μm (圖 19H)。 [圖1S] 展示說明高內容圖像分析係由覆蓋 70% 孔面積的 384 孔盤中的 9 個視野/孔進行的示意圖。 [圖1T至1Y] 展示使用 IN Cell Developer 工具箱配套軟體以自動化、系統性及無偏倚方式來量化表型的示例性圖像分析。開發了精確的指令來分離確切的感興趣區域，該等區域在右側組圖中以紅色顯示。對每個標記進行多種測量，諸如總面積、總強度及計數。細胞表型的代表性圖像包括樹突 (圖 1T 至 1U)、突觸 (圖 1V 至 1W) 及軸突 (圖 1X 至 1Y)。 [圖19I至19N] 分別為圖 1T 至 1Y 的灰度版本。細胞表型的代表性圖像包括樹突 (圖 19I-19J)、突觸 (圖 19K-19L) 及軸突 (圖 19M-19N)。 [圖1Z] 展示使用神經元培養平台及高內容圖像分析軟體從圖 1T 至 1Y 的結果計算之 Z 因數。Z 因數係在 0.5 至 0.75 的範圍內，並且為使用不同批次的神經元進行之 10 至 20 次不同實驗的平均值。每個實驗有四個孔，1,000+ 個神經元/孔經量化。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖2A] 展示描述可溶性 Aβ 物質產生過程的示意圖。藉由將凍乾的 Aβ42 單體重新懸浮於 PBS 中並在 4℃ 孵育單體 14、24、48、72 小時，然後冷凍以停止寡聚化過程，產生可溶性 Aβ 物質。 [圖2B至2D] 展示經寡聚化 14、24、48 及 72 小時之 Aβ42 單體的樹突毒性 (MAP2) (圖 2B)、突觸喪失 (突觸蛋白 1/2)(圖 2C) 及 p-Tau 誘導 (S396/S404) (圖 2D)。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖2E至2G] 展示使用 Aβ 寡聚物選擇性及 Aβ 原纖維選擇性 ELISA 檢定對經寡聚化 24 小時之可溶性 Aβ 物質進行寡聚及原纖維構形的表徵。圖 2E 展示使用相同的抗 Aβ42 (6E10) 進行捕獲及偵測以選擇性地與寡聚 Aβ42 物質結合的 6E10-6E10 檢定。圖 2F 展示使用 Aβ 寡聚物特異性抗體殖株 GT622 作為捕獲及泛 Aβ 抗體殖株 (6E10) 作為偵測的 T622-6E10 寡聚物檢定。圖 2G 展示使用 Aβ 原纖維選擇性抗體殖株 OC 作為捕獲及泛 Aβ 抗體殖株 (6E10) 作為偵測的 OC-6E10 檢定。全部值皆經歸一化為 Aβ42 單體陰性對照，並在37℃ 藉由寡聚化產生 Aβ42 原纖維作為陽性對照，以證明該檢定的特異性。 [圖2H至2J] 展示針對劑量反應在 0、2.5、5 μM 測試之 Aβ42 單體及混雜對照的樹突毒性 (MAP2) (圖 2H)、突觸喪失 (突觸蛋白 1/2) (圖 2I) 及 p-Tau 誘導 (S396/S404) (圖 2J)。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖2K] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之大鼠皮質神經元的示例性圖像。大鼠神經元形成許多斑塊樣、甲氧基-X04 陽性結構 (藍色)，且少許此等斑塊樣結構經 NFL-H 的營養不良神經突樣起泡 (綠色)、及磷酸化 Tau (AT270，紅色) 圍繞。神經炎性斑塊由虛線白框指示。比例尺 = 100 µM。 [圖2L至2M] 展示圖 2K 的放大圖像，其展示 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04；藍色) 周圍之軸突中的軸突腫脹 (NFL-H；綠色) 及 p-Tau 誘導 (S235；紅色)。在相同時間 (7天) 內，神經炎性營養不良的程度明顯小於 iPSC 人類神經元。比例尺 = 20 µM。 [圖20A] 為圖 2K 的灰度版本，其展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之大鼠皮質神經元的示例性圖像。大鼠神經元形成許多斑塊樣、甲氧基-X04 陽性結構，且少許此等斑塊樣結構經 NFL-H 的營養不良神經突樣起泡、及磷酸化 Tau (AT270) 圍繞。神經炎性斑塊由虛線白框指示。比例尺 = 100 µM。 [圖20B至20C] 分別為圖 2L 至 2M 的灰度版本，其展示圖 20A 的放大圖像，展示 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04；第二組圖) 周圍之軸突中的軸突腫脹 (NFL-H；第三組圖) 及 p-Tau 誘導 (S235；AT270，第四組圖)。在相同時間 (7天) 內，神經炎性營養不良的程度明顯小於 iPSC 人類神經元。比例尺 = 20 µM。 [圖2N至2O] 展示，在樹突 (MAP2) 喪失 (圖 2N) 及嚴重的突觸喪失 (突觸蛋白 1/2) (圖 2O) 方面，與人類神經元相比，大鼠神經元在對許多 Aβ42 寡聚物製劑的反應中沒有展示出 Aβ42 寡聚物毒性。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖3A至3B] 展示，與無處理條件 (圖 3A) 相比，當用可溶性 Aβ 物質處理 7 天 (圖 3B) 時，分化的 NAG 神經元 (12 週 +) 展示出樹突 (MAP2，綠色) 及細胞體 (CUX2，紅色) 的喪失。 [圖3C] 展示用抗 Aβ 抗體與可溶性 Aβ 物質共同處理阻斷 Aβ 誘導的細胞死亡。比例尺 = 50 μm。 [圖21A至21C] 分別為圖 3A 至 3C 的灰度版本。圖 21A 至 21B 展示，與無處理條件 (圖 21A) 相比，當用可溶性 Aβ 物質處理 7 天 (圖 21B) 時，分化的 NAG 神經元 (12 週 +) 展示出樹突 (MAP2，伸長之分支) 及細胞體 (CUX2，圓形細胞體) 的喪失。圖 21C 展示用抗 Aβ 抗體與可溶性 Aβ 物質共同處理阻斷 Aβ 誘導的細胞死亡。比例尺 = 50 μm。 [圖3D] 展示劑量依賴性、進行性分化的 NAG 神經元細胞死亡，如藉由歸一化為未經處理之對照的經 Aβ 處理之細胞體 (CUX2) 數量的百分比所量化。 [圖3E] 展示劑量依賴性的進行性樹突狀 (MAP2) 喪失，如藉由歸一化為未經處理之對照的經 Aβ 處理之分化的 NAG 神經元中 MAP2 面積的百分比所量化。 [圖3F至3G] 展示分化的 NAG 神經元之 Aβ42 處理誘導 Tau 的磷酸化 (p-Tau 396-404，白色) 及錯誤定位至細胞體。 [圖3H] 展示分化的 NAG 神經元之抗 Aβ 抗體與 sAβ42s 共同處理阻斷 Aβ 誘導的 Tau 過度磷酸化。比例尺 = 50 μm。 [圖3I] 展示分化的 NAG 神經元中之 tau 在 S396/404 處磷酸化的劑量依賴性及時間進程。磷酸化 Tau 誘導在 5 µM Aβ 處理時增加，然後發生與細胞死亡相關的減少，如藉由歸一化為未經處理之對照的在經 Aβ 處理之分化的 NAG 神經元中之 p-tau 396/404 倍數染色所量化。 [圖3J至3K] 展示分化的 NAG 神經元之 Aβ42 處理導致神經元中的突觸喪失 (突觸蛋白，綠色)。 [圖3L] 展示分化的 NAG 神經元之抗 Aβ 抗體與 sAβ42s 共同處理阻斷突觸喪失表型。比例尺 = 5 μm。 [圖21D至21F] 分別為圖 3J 至 3L 的灰度版本。圖 21D 至 21E 展示分化的 NAG 神經元之 Aβ42 處理導致神經元中的突觸喪失 (突觸蛋白，沿細胞分支的亮點)。圖 21F 展示分化的 NAG 神經元之抗 Aβ 抗體與 sAβ42s 共同處理阻斷突觸喪失表型。比例尺 = 5 μm。 [圖3M] 展示歸一化為未經處理之對照的經 Aβ 處理之分化的 NAG 神經元培養物中的突觸 (突觸蛋白 1/2) 喪失之劑量反應及時間進程。 [圖3N至3O] 展示分化的 NAG 神經元之 sAβ42s 處理誘導軸突片段化 (β-3 微管蛋白 Tuj1，白色)。 [圖3P] 展示分化的 NAG 神經元之抗 Aβ 抗體共同處理阻斷軸突片段化。比例尺 = 50 μm。 [圖3Q] 展示軸突片段化的劑量反應及時間進程，如藉由歸一化為未經處理之對照的經 Aβ 處理之分化的 NAG 神經元中軸突 (NFL-H) 面積的百分比所量化。 [圖3R] 展示分化的 NAG 神經元之抗 Aβ 抗體處理以劑量依賴性方式救援全部三個標記，並且可以繪製並計算 IC50 曲線 (由 Prism 軟體擬合的 IC50 曲線)。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖4A至4D] 展示分化的 NAG 神經元之 5 μM Aβ42處理誘導 tau 的體樹突狀蓄積 (與 MAP2 重疊，第三幅圖) 及在 S202/T205 處的磷酸化並且如藉由 AT8 抗體 (綠色) 所偵測。比例尺 = 50 μm。 [圖4E至4T] 展示經 5 μM Aβ42 處理之分化的NAG 神經元之 Tau 磷酸化位點 S217 (圖 4E 至 4H)、位點 S235 (圖 4I 至 4L)、位點 S400/T403/S404 (圖 4M 至 4P) 及位點 T181 (AT270) (圖 4Q 至 4T) 的染色。比例尺 = 50 μm。 [圖22A至22T] 分別為圖 4A 至 4T 的灰度版本。圖 22A 至 22D 展示分化的 NAG 神經元之 5 μM Aβ42 處理誘導 tau 的體樹突狀蓄積 (與 MAP2 重疊，第三幅圖) 及在 S202/T205 處的磷酸化並且如藉由 AT8 抗體所偵測。比例尺 = 50 μm。圖 22E 至 22T 展示經 5 μM Aβ42 處理之分化的NAG 神經元之 Tau 磷酸化位點 S217 (圖 22E 至 22H)、位點 S235 (圖 22I 至 22L)、位點 S400/T403/S404 (圖 22M 至 22P) 及位點 T181 (AT270) (圖 22Q 至 22T) 的染色。比例尺 = 50 μm。 [圖4U至4Y] 展示經 Aβ42 處理之分化的 NAG 神經元的磷酸化 Tau 誘導之量化，該誘導對 Aβ 處理濃度之劑量響應如所指定地增加。誘導倍數係藉由經 Aβ 處理之誘導中的 p-Tau 面積與總 Tau (HT7) 面積之比率除以未經處理之對照中的 p-Tau 面積與總 Tau (HT7) 的比率來計算。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖4Z] 展示西方印漬圖像，其展示從 iPSC 神經元及星狀膠質細胞獲得的蛋白質溶胞產物的可溶性 (右) 及不溶性 (左) 部分，該等神經元及星狀膠質細胞每週兩次用 0、0.3、0.6 或 1.25μM sAβ42s 處理三週，然後探測 3R Tau 蛋白，總 Tau (HT7) 及加載對照 (loading control) 組蛋白 H3。在用可溶性 Aβ 物質處理後，不溶性 3R 及總 Tau 呈劑量依賴性增加，並且此等蛋白質從可溶性部分中耗盡。在高濃度的可溶性 Aβ 物質中，有較低分子量的經截斷之 Tau 蛋白 (三角形) 及較大分子量的 Tau 聚集體 (黑色星號)。 [圖5A至5B] 展示 iPSC 衍生的神經元及初代星狀膠質細胞的代表性圖像，此等神經元及初代星狀膠質細胞用 2.5 μM可溶性 Aβ 物質處理 7 天，並對 Aβ 斑塊結構進行染色。圖 5A 展示甲氧基-X04 (藍色) 及 6E10 (Aβ；綠色)，且圖 5B 展示軸突 (NFL-H；綠色) 及 p-Tau (S235；紅色)，其中神經炎性斑塊由虛線白框指示。 [圖5C至5E] 展示圖 5B 的放大圖像，其展示 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04；藍色) 周圍之軸突中的軸突腫脹 (NFL-H；綠色) 及 p-Tau 誘導 (S235；紅色)。 [圖5F至5K] 展示用 2.5 μM 可溶性 Aβ 物質處理並歷經 21 天時間進程分析軸突片段化 (NFL-H；綠色)、p-Tau 誘導 (S235；紅色) 及斑塊形成 (甲氧基-X04；藍色)的神經元之代表性圖像。觀察到由圍繞 X04 陽性 Aβ 斑塊之 NFL-H 及 p-Tau 腫脹組成的營養不良神經突。比例尺 = 50 μm。 [圖23A至23K] 分別為圖 5A 至 5K 的灰度版本。圖 23A 至 23B 展示 iPSC 衍生的神經元及初代星狀膠質細胞的代表性圖像，此等神經元及初代星狀膠質細胞用 2.5 μM可溶性 Aβ 物質處理 7 天，並對 Aβ 斑塊結構進行染色。圖 23A 展示甲氧基-X04 及 6E10 (Aβ)，且圖 23B 展示軸突 (NFL-H) 及 p-Tau (S235)，其中神經炎性斑塊由虛線白框指示。圖 23C 至 23E 展示圖 23B 的放大圖像，其展示 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04) 周圍之軸突中的軸突腫脹 (NFL-H) 及 p-Tau 誘導 (S235)。圖 23F 至 23K 展示用 2.5 μM 可溶性 Aβ 物質處理並歷經 21 天時間進程分析軸突片段化 (NFL-H)、p-Tau 誘導 (S235) 及斑塊形成 (甲氧基-X04)的神經元之代表性圖像。觀察到由圍繞 X04 陽性 Aβ 斑塊之 NFL-H 及 p-Tau 腫脹組成的營養不良神經突。比例尺 = 50 μm。 [圖5L至5N] 展示在第 0 天用 5μM、2.5 μM、1.25 μM、0.6 μM 及 0.32 μM 濃度的可溶性 Aβ 物質處理之神經元培養物的表型。隨後在第 1、3、7、10、14 及 21 天固定神經元，並對多種標記染色。斑塊形成 (甲氧基-X04 染料陽性區域) 係在 Aβ 寡聚物處理後早期開始，並且總斑塊面積 (圖 5L) 隨著高 Aβ 寡聚物濃度且隨著時間推移而增加，而平均斑塊面積 (圖 5M) 隨著時間推移保持相對一致。神經元表現出營養不良神經突形成 (如藉由 S235 p-Tau 及 NFL-H 陽性軸突面積所測量)，並且此等神經炎性斑塊的數目隨著高 Aβ 寡聚物濃度及時間的推移而增加 (圖 5N)。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖5O] 展示了示意圖，其展示假設的神經退化、斑塊及營養不良神經突形成的順序事件之總結。 [圖6A至6D] 展示 NAG-NSC 株 2 及用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之初代星狀膠質細胞的經染色之 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04；藍色)、軸突 (NFL-H；綠色) 及 p-Tau (AT270；紅色)。圖 6C 及 6D 各自展示神經炎性斑塊的放大圖像。比例尺 = 50μm。 [圖6E] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之 NAG-NSC 株 2 及初代星狀膠質細胞的樹突之喪失 (MAP2，藍色) 及突觸之喪失 (突觸蛋白，綠色)，與右側的無處理之對照相比。 [圖24A至24E] 分別為圖 6A 至 6E 的灰度版本。圖 24A 至 24D 展示 NAG-NSC 株 2 及用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之初代星狀膠質細胞的經染色之 Aβ 斑塊結構 (甲氧基-X04)、軸突 (NFL-H) 及 p-Tau (AT270)。圖 24C 及 24D 各自展示神經炎性斑塊的放大圖像。比例尺 = 50μm。圖 24E 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之 NAG-NSC 株 2 及初代星狀膠質細胞的樹突之喪失 (MAP2，細胞分支) 及突觸之喪失 (突觸蛋白，沿細胞分支的亮點)，與右側的無處理之對照相比。 [圖6F及6K] 分別展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天的 NAG-NSC 株 2 及初代星狀膠質細胞中 MAP2 及突觸蛋白的量化。結果展示樹突 (MAP2) 及突觸 (突觸蛋白) 之劑量依賴性及時間依賴性喪失，並且兩者皆可經由用抗 Aβ 抗體 (克瑞珠單抗 (Crenezumab)) 處理來救援。 [圖6I至6J] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之 NAG-NSC 株 2 及初代星狀膠質細胞的樹突之喪失 (MAP2，藍色)、Tau 片段化 (HT7，紅色)、以及磷酸化 Tau (pS396-404，綠色) 之從軸突到細胞體及樹突的上調及錯誤定位 (圖6J)。 [圖24F] 為圖 6I 的灰度版本，其展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理 7 天之 NAG-NSC 株 2 及初代星狀膠質細胞的樹突之喪失 (MAP2)、Tau 片段化 (HT7)、以及磷酸化 Tau (pS396-404) 之從軸突到細胞體及樹突的上調及錯誤定位。 [圖6L至6M] 展示磷酸化 Tau p396-404 (圖 6L) 及磷酸化 Tau p400-403-404 (圖 6M) 倍數誘導，說明磷酸化 Tau 以劑量及時間依賴性方式上調，且說明這可以經由抗 Aβ 抗體 (克瑞珠單抗) 的處理來阻斷。 [圖7A至7C] 展示，在神經元維持培養基中單獨培養的初代人類星狀膠質細胞表現星狀膠質細胞標記 GFAP (綠色)、波形蛋白 (Vimentin) (紅色，圖7A)、ALDH1L1 (紅色，圖7B) 及 EAAT1 (紅色，圖7C)。比例尺 = 100 µm。 [圖25A至25C] 分別為圖 7A 至 7C 的灰度版本，其展示在神經元維持培養基中單獨培養的初代人類星狀膠質細胞表現星狀膠質細胞標記 GFAP、波形蛋白 (圖 25A)、ALDH1L1 (圖 25B) 及 EAAT1 (圖 25C)。比例尺 = 100 µm。 [圖7D] 展示在神經元維持培養基中與神經元共培養的初代人類星狀膠質細胞發展出精緻的突起及更成熟的形態 (GFAP，白色)。比例尺 = 100 µm。 [圖7E] 展示，在用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理後，在神經元維持培養基中單獨培養的初代人類星狀膠質細胞上調 GFAP (右，白色；左，綠色)，該上調在 3 次分裂 (3DIV) 時開始；使 Aβ 聚集 (6E10，藍色)；以及形成擴散性染料陽性結構 (甲氧基-X04，紅色)，該結構在形態上與小神經膠質細胞形成的染料陽性結構不同。在 1DIV 時 (頂部)，我們觀察到 Aβ 的小聚集體在細胞突起 (cell processes) 周圍生長並開始導致一些細胞死亡，這一觀察結果在 7 次分裂 (7DIV) 時惡化。黃色箭頭指示具有增加的 GFAP 表現之星狀膠質細胞。紅色箭頭指示死亡/垂死的細胞。白色虛線框指示在右側放大的區域。比例尺 = 100 µm。 [圖25D] 為圖 7E 的灰度版本，其展示，在用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理後，在神經元維持培養基中單獨培養的初代人類星狀膠質細胞上調 GFAP，該上調在 3 次分裂 (3DIV) 時開始；使 Aβ 聚集 (6E10)；以及形成擴散性染料陽性結構 (甲氧基-X04)，該結構在形態上與小神經膠質細胞形成的染料陽性結構不同。在 1DIV 時 (頂部)，我們觀察到 Aβ 的小聚集體在細胞突起 (cell processes) 周圍生長並開始導致一些細胞死亡，這一觀察結果在 7 次分裂 (7DIV) 時惡化。白色虛線框指示在右側放大的區域。比例尺 = 100 µm。 [圖7F] 展示平均 GFAP 強度/細胞 (單獨培養的初代人類星狀膠質細胞) 的量化，其表明用可溶性 Aβ 物質處理之星狀膠質細胞在 3DIV 時上調 GFAP，並且該上調經抗 Aβ 抗體 (克瑞珠單抗) 處理阻斷。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01。 [圖7G] 展示，使用 GFAP 藉由細胞體 (單獨培養的初代人類星狀膠質細胞) 片段化來量化的細胞死亡表明，用可溶性 Aβ 物質處理之初代人類星狀膠質細胞在 3DIV 時展示出顯著的細胞死亡，這一結果在 7DIV 時惡化。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01。 [圖7H至7J] 展示，用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理之與神經元共培養的初代人類星狀膠質細胞也以劑量及時間依賴性方式表現出類似的 GFAP 上調 (圖 7I) 及指示細胞死亡的細胞片段化 (圖 7J) 。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01。比例尺 = 100 µm。 [圖25E] 為圖 7H 的灰度版本，其展示，用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理之與神經元共培養的初代人類星狀膠質細胞也以劑量及時間依賴性方式表現出類似的 GFAP 上調及指示細胞死亡的細胞片段化 。[圖8A至8E] 展示用以下針對小神經膠質細胞標記的抗體染色之 iPSC 衍生的小神經膠質細胞：TREM2、TMEM119、CXCR1、P2RY12、PU.1 (第一組圖)；MERTK、CD33、CD64、CD32 (第二組圖)；IBA1 (第三組圖)。結果表明，人類 iPSC 小神經膠質細胞表現常見的小神經膠質細胞標記並具有典型的分枝形態。比例尺 = 50 μm。 [圖9A至9B] 展示空孔 (圖 9A；比例尺 = 20 μm) 或 12 週齡 iPSC 神經元 (圖 9B；比例尺 = 50 μm) 的代表性圖像，該等空孔及神經元用所指示濃度的可溶性 Aβ 物質處理並用 X04 (藍色)、Aβ (綠色)、NFL-H (綠色) 及 p-Tau S235 (紅色) 染色。空孔展示出 Aβ 沉澱，但沒有 XO4 陽性結構 (圖 9A)。在 iPSC 神經元孔中，展示出 X04 染色的劑量依賴性增加 (圖 9B)。XO4 的一個子集也經營養不良神經突 (NFL-H 及 S235 陽性軸突腫脹) 圍繞。 [圖26A至26B] 為圖 9A 至 9B 的灰度版本，其展示空孔 (圖 26A；比例尺 = 20 μm) 或 12 週齡 iPSC 神經元 (圖 26B；比例尺 = 50 μm) 的代表性圖像，該等空孔及神經元用所指示濃度的可溶性 Aβ 物質處理並用 X04、Aβ、NFL-H 及 p-Tau S235 染色。空孔展示出 Aβ 沉澱，但沒有 XO4 陽性結構 (圖 26A)。在 iPSC 神經元孔中，展示出 X04 染色的劑量依賴性增加 (圖 26B)。XO4 的一個子集也經營養不良神經突 (NFL-H 及 S235 陽性軸突腫脹) 圍繞。 [圖9C] 展示用 0 至 5 μM 範圍內的可溶性 Aβ 物質處理並且還結合 INFγ 進行處理之小神經膠質細胞的代表性圖像。底部組圖顯示放大的部分。Aβ 斑塊經 X04 (藍色) 染色，小神經膠質細胞用肌動蛋白 (綠色) 及 IBA1 (紅色) 標記。比例尺 = 50 μm。 [圖9D] 展示來自神經元與星狀膠質細胞共培養，以及神經元、星狀膠質細胞及小神經膠質細胞之三重培養的所指示之條件的代表性圖像，該等條件用可溶性 Aβ 物質結合或不結合促炎性細胞激素 (IFNy+IL1b+LPS) 處理。底部組圖顯示放大的部分。Aβ 斑塊用 X04 (藍色) 染色，營養不良神經突腫脹用 NFL-H (綠色) 染色，且小神經膠質細胞用 IBA1 (紅色) 標記。在三重培養中，添加 Aβ 寡聚物導致 Aβ 斑塊形成經營養不良神經突圍繞並經小神經膠質細胞包圍，類似於活體內斑塊呈現。比例尺 = 20 μm。 [圖26C至26D] 分別為圖 9C 至 9D 的灰度版本。圖 26C 展示用 0 至 5 μM 範圍內的可溶性 Aβ 物質處理並且還結合 INFγ 進行處理之小神經膠質細胞的代表性圖像。底部組圖顯示放大的部分。Aβ 斑塊經 X04 染色，小神經膠質細胞用肌動蛋白及 IBA1 標記。比例尺 = 50 μm。圖 26D 展示來自神經元與星狀膠質細胞共培養，以及神經元、星狀膠質細胞及小神經膠質細胞之三重培養的所指示之條件的代表性圖像，該等條件用可溶性 Aβ 物質結合或不結合促炎性細胞激素 (IFNy+IL1b+LPS) 處理。底部組圖顯示放大的部分。Aβ 斑塊用 X04 染色，營養不良神經突腫脹用 NFL-H 染色，且小神經膠質細胞用 IBA1 標記。在三重培養中，添加 Aβ 寡聚物導致 Aβ 斑塊形成經營養不良神經突圍繞並經小神經膠質細胞包圍，類似於活體內斑塊呈現。比例尺 = 20 μm。 [圖9E至9F] 展示 IFNγ 增加斑塊形成及斑塊相互作用，如從圖 9C 中所示的圖像所量化。圖 9E 展示 X04 強度的量化，且圖 9F 展示圖 9C 中所示圖像之 IBA1 數目的量化。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＞ 0.0001。 [圖9G] 展示圖 9D 中 IBA1 與 X04 重疊之面積的量化。促炎性細胞激素增加小神經膠質細胞與斑塊締合。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＞ 0.0001。 [圖9H] 展示圖 9D 中 X04 染色之總面積的量化。小神經膠質細胞增加 X04 斑塊面積，且促炎性細胞激素的添加進一步增加斑塊面積。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＞0.0001。 [圖9I] 展示圖 9D 中 MAP2 染色之總面積的量化。添加 Aβ 寡聚物引起神經元培養物的嚴重減少，且小神經膠質細胞培養提供 25% MAP2 保護以免受 Aβ 寡聚物的影響。當添加促炎性細胞激素時，該保護喪失。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA **** P＞0.0001。 [圖10] 展示，(左) 未接受處理的人類 iPSC 衍生的小神經膠質細胞 (IBA1，紅色) 展示出沒有 Aβ (6E10，藍色) 之蓄積，沒有斑塊樣結構 (甲氧基-X04，綠色)。中圖展示，用 2.5 μM 可溶性 Aβ 物質 (6E10，藍色) 處理之人類 iPSC 衍生的小神經膠質細胞 (IBA1，紅色) 展示出經細胞環繞之離散斑塊樣結構 (甲氧基-X04，綠色) 的蓄積。右圖展示，用 2.5 μM 可溶性 Aβ 物質 (6E10，藍色) 處理的 HeLa 細胞 (蠅虎蕈鹼 (Phalloidin)，紅色) 展示出 Aβ 的低表面結合，但未表現出在人類 iPSC 衍生的小神經膠質細胞中觀察到的離散斑塊結構 (甲氧基-X04，綠色)。總體而言，圖 10 展示澱粉樣蛋白斑塊樣結構係由人類 iPSC 小神經膠質細胞而非由 HeLa 細胞所產生。圖 27 為圖 10 的灰度版本。 [圖11A至11D] 展示，在用 5 μM sAβ42s 及來自已知神經保護劑之定向篩選的小分子以多個濃度 (50 μM、25 μM、12.5 μM 及 6.25 μM (雙重培養)、50 μM、12.5 μM、3.1 μM 及 0.78 μM (三重培養)) 處理的神經元及星狀膠質細胞 (圖 11A 及 11C) 或神經元、星狀膠質細胞及小神經膠質細胞 (圖 11B 及 11D) 中，突觸 % 救援與 MAP2 % 救援 (圖 11A 至 11B) 以及 β III 微管蛋白 % 救援與 MAP2 % 救援 (圖 11C 至 11D)。阻止樹突 (MAP2)、突觸 (突觸蛋白 1/2)、細胞計數 (CUX2) 或軸突 (NFL-H) 中之毒性達到或超過 30% 的小分子視為命中 (紅色虛線)。抗 Aβ 抗體用為阻止全部類型之毒性的陽性對照。 [圖11E至11G] 展示針對 MAP2、突觸蛋白 1/2、CUX2 及 NFL-H，藉由 IC50 曲線對來自定向篩選的熱門命中 DLKi (圖 11E)、靛玉紅-3'-單肟 (圖 11F) 及 AZD0530 (圖 11G) 之進一步驗證。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。IC50 曲線由 Prism 軟體擬合。 [圖11H] 展示 Aβ42 寡聚物處理誘導細胞核 (HuCD，紅色) 中之 p-cJun (綠色) 的表現。比例尺 = 50 μm。圖 28 為圖 11H 的灰度版本。 [圖11I] 展示 MAP2、HuC/D、p-c-Jun 染色的量化。結果指示 c-Jun 磷酸化隨著 Aβ42 寡聚物處理的延長而增加。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖11J] 展示用 Aβ42 寡聚物處理之 22 週齡 iPSC 神經元培養物顯示 c-Jun 的劑量依賴性、持續磷酸化，如西方印漬所示。GAPDH 用作加載對照。 [圖11K] 展示對來自圖 11J 之西方印漬的量化。p-c-Jun 誘導經歸一化為 GAPDH。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。 [圖11L至11O] 展示使用小分子 VX-680 (圖 11L)、GNE-495 (圖 11M)、PF06260933 (圖 11N) 及 JNK-IN-8 (圖 11O) 抑制 DLK-JNK-c-Jun 途徑的成分，以劑量依賴性方式在全部所測量之標記中阻止 Aβ42 寡聚物誘導的神經毒性。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。IC50 曲線由 Prism 軟體擬合。 [圖12A至12G] 展示其中來自定向篩選的命中 (圖 11A 至 11O) 係在劑量反應曲線中針對標記 MAP2、突觸蛋白、CUX1/2、NF-H 進行測試的結果。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4個孔。IC50 曲線係使用 Prism 軟體擬合。 [圖13A] 為示意圖，其展示使用 5% HiLyte-555 標記之 Aβ42 單體製備的可溶性 Aβ 物質。 [圖13B] 展示從 Incucyte Zoom 軟體歷經 7 天時間流逝拍攝的代表性圖像，其展示相同的視野以在所指示之時間範圍內追蹤由白色箭頭指示的一個 Aβ42 斑塊 (紅色) 的小神經膠質細胞形成。比例尺 = 50 μm。 [圖29A] 為圖 13B 的灰度版本，其展示相同視野的 7 天時間流逝以在所指示之時間範圍內追蹤由白色箭頭指示的一個 Aβ42 斑塊的小神經膠質細胞形成。 [圖13C] 展示斑塊周圍小神經膠質細胞運動的示例性圖像。在該 2 小時窗口內發生斑塊形成 2 天後，一些小神經膠質細胞加入由黃色箭頭指示的斑塊，而一些離開斑塊的細胞由綠色箭頭指示。比例尺 = 50 μm。 [圖29B] 為圖 13C 的灰度版本，其展示斑塊周圍小神經膠質細胞運動的示例性圖像。在該 2 小時窗口內發生斑塊形成 2 天後，一些小神經膠質細胞加入由完整箭頭指示的斑塊，而一些離開斑塊的細胞由小箭頭指示。 [圖14A] 展示了示意圖，其描繪由 HiLyte555 及 pHrodo Green 標記的可溶性 Aβ 物質連續發出紅色螢光，但在細胞內 pH 5 條件下僅發出綠色螢光。 [圖14B] 展示對紅色 Aβ 斑塊面積及綠色經內化之 Aβ 的量化分析。經內化之綠色 Aβ 超越紅色細胞外 Aβ 斑塊形成，指示活躍 Aβ 攝取貫穿該等 7 天並發生在紅色 Aβ 斑塊出現之前。 [圖14C] 展示斑塊形成時間流逝動態影像的示例性圖像。回顧性地標記了四種不同的斑塊形成。可溶性 Aβ 物質首先經小神經膠質細胞 (綠色) 內化，然後在所培養的小神經膠質細胞中心形成斑塊 (紅色)。比例尺 = 50 μm。圖 30A 為圖 14C 的灰度版本。 [圖14D] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理之 iPSC 衍生的小神經膠質細胞，並在處理後 30 分鐘、6 小時、1 天及 4 天固定並染色。小神經膠質細胞 (IBA1，紅色) 在 30 分鐘後內化由白色小箭頭 (綠色) 指示的小 Aβ 斑點 (綠色；白色 - 第二行)，然後將此等斑點外化為用白色箭頭指示的呈微弱 X04 陽性的大聚集體 (藍色；白色 - 下圖)，然後在處理後 1 至 6 天形成經小神經膠質細胞圍繞的大的細胞外 X04 陽性斑塊結構。比例尺 = 50 μm。圖 30B 為圖 14D 的灰度版本。 [圖14E] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質及多種發動蛋白抑制劑 (Dynasore、Dynole 4a、Dynole 34-2) 以 0.6 μM 處理 24 小時之人類 iPSC 衍生的小神經膠質細胞，以及經量化為相對於未經處理之對照的百分比的斑塊樣結構 (甲氧基-X04 陽性)。在全部條件下，用發動蛋白抑制劑處理使斑塊形成減少大約 4 倍。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA *** P＜0.001，** P＜0.01。 [圖14F] 展示小神經膠質細胞斑塊形成的所提出之步驟的總結。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔；ANOVA *** P＜0.001，** P＜0.01。 [圖15] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理，然後在 30 分鐘、6 小時、1 天及 4 天後固定並染色之人類 CD14 衍生的巨噬細胞的代表性圖像。該等圖像表明，巨噬細胞 (IBA1，紅色) 歷經 4 天之進程持續內化 Aβ (綠色；白色 - 第二行) 並形成細胞內 X04 陽性 (藍色；白色 - 底行) 聚集體。圖 31 為圖 15 的灰度版本。 [圖16A至16C] 展示，在所指示之濃度，用單劑量可溶性 Aβ 物質 (實線) 與重複劑量之 Aβ42 以相同濃度 (虛線) 處理之 12 週齡 iPSC 神經元的時間進程比較。MAP2 面積 (圖 16A)、突觸計數 (圖 16B) 及 p-Tau 396-404 誘導倍數 (圖 16C) 係經量化。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4個孔；ANOVA **** P＞0.0001，*** P＞0.001，** P＞0.01，* P＞0.05。 [圖16D] 展示用 0.6 μM Aβ 進行之 12 週齡 iPSC 神經元的重複給藥方案。抗 Aβ 抗體給藥方案係在所指示之時間點開始。全部細胞皆在相同盤中經處理，並在第一劑量後 21 天經固定。 [圖16E至16G] 展示對經基於圖 16D 的給藥方案處理之 iPSC 神經元的 MAP2 面積 (圖 16E)、突觸蛋白計數 (圖 16F) 及 p-Tau誘導倍數 (圖 16G) 的量化。抗 gD 抗體係經類似於圖 16D 的時間表作為對照 (藍色條) 連同抗 Aβ 抗體 (紅色條) 一起給藥。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4個孔；ANOVA **** P＞0.0001，*** P＞0.001，** P＞0.01，* P＞0.05。 [圖16H] 展示抗Aβ抗體重複給藥的時間進程研究設計。Aβ 寡聚物係在每個所指示之時間點添加。抗 Aβ 抗體係在第0 天 (紅色) 作為保護模型或在第 7 天 (綠色) 作為干預模型添加。抗 gD 抗體用為對照 (藍色)。 [圖16I] 展示來自所指示之實驗處理的代表性圖像，基於圖 16H 的給藥方案。在 7DIV 及 21DIV 時對神經元進行樹突標記 MAP2 (紅色) 及核標記 CUX2 (綠色) 染色。下圖展示 Aβ 斑塊染色 (X04，白色) 及 p-Tau S235 (紅色) 染色。比例尺 = 50 μm。誤差條 +/- s.e.m. 且 n= 4 個孔。圖 32 為圖 16I 的灰度版本。 [圖16J至16K] 展示來自圖 16I 中的圖像之 MAP2 面積隨時間推移 (圖 16J) 及斑塊面積 (圖 16K) 的量化。結果表明，抗 Aβ 干預模型能夠減緩神經元退化及斑塊形成。 [圖17A至17C] 展示，在用一週兩次給藥之 0.625 μM 的可溶性 Aβ 物質進行經培養的 12 週齡人類 iPSC 神經元之重複給藥方案後，對 MAP2 面積 (圖 17A)、突觸蛋白計數 (圖 17B) 及 p-Tau 誘導倍數 (圖 17C) 的量化。0.625 μM 抗 Aβ 抗體或抗 gD 對照抗體係在所指示之添加，用於重複給藥方案。全部細胞皆在相同盤中經處理，並在第一劑量後 21 天經固定。 [圖17D至17F] 展示，在用一週兩次給藥之 1.25 μM 的可溶性 Aβ 物質進行經培養的 12 週齡人類 iPSC 神經元之重複給藥方案後，對 MAP2 面積 (圖 17D)、突觸蛋白計數 (圖 17E) 及 p-Tau 誘導倍數 (圖 17F) 的量化。1.25 μM μM 抗 Aβ 抗體或抗 gD 對照抗體係在所指示之添加，用於重複給藥方案。全部細胞皆在相同盤中經處理，並在第一劑量後 21 天經固定。 [圖17G至17I] 展示，在用一週兩次給藥之 2.5 μM 的可溶性 Aβ 物質進行經培養的 12 週齡人類 iPSC 神經元之重複給藥方案後，對 MAP2 面積 (圖 17D)、突觸蛋白計數 (圖 17H) 及 p-Tau 誘導倍數 (圖 17F) 的量化。2.5 μM 抗 Aβ 抗體或抗 gD 對照抗體係在所指示之添加，用於重複給藥方案。全部細胞皆在相同盤中經處理，並在第一劑量後 21 天經固定。 [圖18A至18B] 展示 iPSC 神經元及星狀膠質細胞的樹突保護 (MAP2 面積) (圖 18A) 及突觸保護 (突觸蛋白計數) (圖 18B)，該等神經元及星狀膠質細胞用 5 μM 可溶性 Aβ 物質處理，隨後在具有及不具有 iPSC 小神經膠質細胞的情況下用抗 gD 以及具有 IgG1 及 LALAPG 主鏈的抗 Aβ 抗體之連續稀釋物進行處理。結果係使用 Prism 軟體經由 IC50 曲線擬合進行分析。當添加小神經膠質細胞 (單獨的 gD IgG1；gD IgG1 + 小神經膠質細胞) 時，小神經膠質細胞提供基線保護，如藉由抗 gD 曲線圖之上移所示。在不具有小神經膠質細胞 (抗 Aβ IgG1；抗 Aβ LALAPG) 及具有小神經膠質細胞 (抗 Aβ IgG1；抗 Aβ LALAPG) 的情況下，抗 Aβ 抗體主鏈類似地保護樹突及突觸。誤差條 +/- s.e.m.。 n=4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01，* P＜0.05。 [圖18C至18D] 展示神經元、星狀膠質細胞、小神經膠質細胞三重培養物的基樹突保護 (MAP2 面積) (圖 18C) 及斑塊形成 (甲氧基 X04 總強度) (圖 18D)，該三重培養物用 5μM 可溶性 Aβ 物質及促炎性細胞激素處理，隨後添加 gD 抗體及抗 Aβ 抗體的連續稀釋物。圖 18C 展示，在神經炎性環境中基樹突保護 (MAP2 面積) 喪失，並且抗 Aβ 處理展示出劑量依賴性功效。圖 18D 展示，斑塊形成 (甲氧基 X04 總強度) 在促炎性條件下增加，然而抗 Aβ 處理展示出類似的斑塊減少。誤差條 +/- s.e.m.。 n=4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01，* P＜0.05。 [圖18E] 展示用 5 μM 可溶性 Aβ 物質及抗 Aβ 抗體的連續稀釋物處理之 iPSC 小神經膠質細胞中的總 Aβ 濃度，如從上清液所測量；無細胞的孔用為對照。抗 Aβ 抗體處理增加培養物上清液中存在的可溶性 Aβ 物質。誤差條 +/- s.e.m.。 n=4 個孔；ANOVA **** P＜0.0001，*** P＜0.001，** P＜0.01，* P＜0.05。 [圖18F] 展示 iPSC AD 模型中順序事件的總結。

Claims (87)

  1. 一種用於促進神經元分化及/或提升長期神經元生長之自動化細胞培養系統，其中該自動化細胞培養系統包含一輪或多輪自動化培養基更換；且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
  2. 如請求項 1 之自動化細胞培養系統， 其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 96 孔盤；或一個或多個 384 孔盤。
  3. 如請求項 2 之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端 (pipet tip) 抽吸，其中： 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端之末端係在該孔的底面上方約 1mm 處。
  4. 如請求項 2 或 3 之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角。
  5. 如請求項 2 至 4 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1mm 之位移； 視需要其中在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)。
  6. 如請求項 2 至 5 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s；以及/或 (b) 培養基抽吸之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。
  7. 如請求項 2 至 6 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在抽吸之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (b) 在該抽吸之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  8. 如請求項 2 至 7 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架 (rack of 384-pipet tips) 且自動接合新的 384 移液管尖端架。
  9. 如請求項 2 至 7 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
  10. 如請求項 2 至 9 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在該分配之前，該移液管尖端之末端係在該孔的底面上方約 1mm 處；以及/或 (b) 在該分配期間，該移液管尖端以約 1mm/s 之速度從該孔中退出。
  11. 如請求項 2 至 10 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角。
  12. 如請求項 2 至 11 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該分配之前及/或期間，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)。
  13. 如請求項 2 至 12 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔組織盤；其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1 mm 之該孔的第一側；以及/或 (b) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側， 視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角。
  14. 如請求項 2 至 13 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (b) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (c) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2；以及/或 (d) 培養基分配之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms。
  15. 如請求項 2 至 14 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在分配之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (b) 在該分配之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  16. 如請求項 2 至 15 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
  17. 如請求項 2 至 16 中任一項之自動化細胞培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤； 進一步其中該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在兩輪培養基更換之間的時間間隔為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天。
  19. 如請求項 1 至 18 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在兩輪培養基更換之間的時間間隔為約 3 或 4 天。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
  21. 如請求項 1 至 19 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在每輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
  23. 如請求項 1 至 21 中任一項之自動化細胞培養系統，其中在每輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
  24. 一種從多能幹細胞（pluripotent stem cell）產生同質且終末分化的神經元之方法，其包含： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養 (replating) 該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
  25. 如請求項 24 之方法，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含使用自動化細胞培養系統進行一輪或多輪自動化培養基更換；且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
  26. 如請求項 25 之方法，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個組織培養盤。
  27. 如請求項 26 之方法，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (c) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (f) 在抽吸之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  28. 如請求項 26 或 27 之方法，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在該分配之前，該移液管尖端之末端係在該孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該分配期間，該移液管尖端之末端以約 1 mm/s 從該孔中退出； (c) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (d) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該分配之前及/或期間，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (e) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1 mm 之該孔的第一側； (f) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (l) 在分配之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  29. 如請求項 26 至 28 中任一項之方法，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
  30. 如請求項 26 至 29 中任一項之方法，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
  31. 如請求項 26 至 30 中任一項之方法，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
  32. 如請求項 26 至 31 中任一項之方法，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
  33. 一種衍生自多能幹細胞之終末分化神經元的同質族群 (homogenous population)，其中至少 95% 之該等神經元表現：Map2；突觸蛋白 1 (Synapsin 1) 及/或突觸蛋白 2；以及 β-III 微管蛋白。
  34. 一種衍生自多能幹細胞之終末分化神經元的同質族群，其中： (a) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或 (b) 至少 95% 之該等神經元表現一個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1；以及/或 (c) 神經元之至少 100 個突觸後末端係與其他神經元之突觸前末端重疊及/或該神經元之至少 100 個突觸前末端係與其他神經元之突觸後末端重疊。
  35. 如請求項 34 之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現： 兩個或多個選自以下者之突觸前標記：vGLUT2、突觸蛋白 1 及突觸蛋白 2；以及/或 兩個或多個選自以下者之突觸後標記：PSD95、SHANK、PanSHANK、GluR1、GluR2、PanSAPAP 及 NR1。
  36. 如請求項 33 至 35 中任一項之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現一種或多種上層皮質神經元標記，視需要其中不超過 5% 之該等神經元表現一種或多種下層皮質神經元標記。
  37. 如請求項 33 至 36 中任一項之族群，其中至少 95% 之該等神經元表現 CUX2，視需要其中不超過 5% 之該等神經元表現 CTIP2 或 SATB2。
  38. 如請求項 33 至 37 中任一項之族群，其中從多能幹細胞衍生終末分化神經元之方法包含： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在表現 NGN2 及 ASCL1 的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
  39. 如請求項 38 之族群，其中該等神經元以高度可複製性方式表現樹突、細胞體、軸突及突觸之代表性標記。
  40. 如請求項 39 之族群，其中在神經元中的樹突標記 MAP2、細胞體標記 CUX2、軸突標記 Tau 及突觸標記突觸蛋白 1/2 之表現在重複實驗間為高度可複製性，其中 MAP2、CUX2、Tau 及突觸蛋白 1/2 中的每一者之 z 因數至少為 0.4。
  41. 如請求項 38 至 40 中任一項之族群，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含一輪或多輪自動化培養基更換；且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
  42. 如請求項 41 之族群，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 384 孔盤。
  43. 如請求項 42 之族群，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (c) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (f) 在抽吸之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  44. 如請求項 42 或 43 之族群，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在該分配之前，該移液管尖端之末端係在該孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該分配期間，該移液管尖端之末端以約 1 mm/s 從該孔中退出； (c) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (d) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該分配之前及/或期間，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (e) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心 1 mm 之該孔的第一側； (f) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心 1mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (l) 在分配之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  45. 如請求項 42 至 44 中任一項之族群，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
  46. 如請求項 42 至 45 中任一項之族群，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
  47. 如請求項 42 至 46 中任一項之族群，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
  48. 如請求項 42 至 47 中任一項之族群，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
  49. 一種用於模擬神經退化性疾病之多能幹細胞衍生的神經元培養系統， 其中該培養系統包含實質上確定的培養基，以及 其中該培養系統可適於以下者之模組化及可調式輸入： 一種或多種疾病相關成分，以及/或 一種或多種神經保護成分。
  50. 如請求項 49 之神經元培養系統，其中該神經退化性疾病為阿滋海默症，其中： (a) 該等疾病相關成分包含可溶性 Aβ 物質； (b) 該疾病相關成分包含突變 APP 之過表現，視需要其中該疾病相關成分包含突變 APP 之可誘導過表現； (c) 該疾病相關成分包含促炎性細胞激素； (d) 該神經保護成分包含抗 Aβ 抗體； (e) 該神經保護成分包含 DLK 抑制劑、GSK3β 抑制劑、CDK5抑制劑及/或 Fyn 激酶抑制劑；以及/或 (f) 該神經保護成分包含小神經膠質細胞。
  51. 如請求項 49 或 50 之神經元培養系統，其中該系統不包含基質膠 (matrigel)。
  52. 如請求項 49 至 51 中任一項之神經元培養系統，其中該系統包含完全確定的培養基及/或基質。
  53. 如請求項 50 至 52 中任一項之培養系統，其中該可溶性 Aβ 物質包含可溶性 Aβ 寡聚物及/或可溶性 Aβ 原纖維。
  54. 如請求項 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 神經元培養物中的 Tau 蛋白在 S396/404、S217、S235、S400/T403/S404 及 T181 殘基中之一者或多者中為過度磷酸化。
  55. 如請求項 50 至 54 中任一項之神經元培養系統，其中該培養系統包含該一種或多種包含可溶性 Aβ 物質之疾病相關成分，其中： 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示增加的神經元毒性。
  56. 如請求項 50 至 55 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之相對應的神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少。
  57. 如請求項 50 至 56 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少。
  58. 如請求項 50 至 57 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示神經元中之 Tau 磷酸化的增加，其中 Aβ 之濃度不小於一第一濃度； 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該神經元培養系統顯示突觸蛋白陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第二濃度； 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該培養系統顯示 CUX2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 之濃度不小於一第三濃度；以及 當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統相比，該培養系統顯示 MAP2 陽性神經元之減少，其中 Aβ 不小於一第四濃度。
  59. 如請求項 58 之神經元培養系統，其中： 該第一濃度高於該第二、第三及第四濃度；以及/或 該第二濃度高於該第三及第四濃度；以及/或 該第三濃度高於該第四濃度。
  60. 如請求項 59 之神經元培養系統，其中該第一濃度為約 5 μM，該第二濃度為約 2.5 μM，該第三濃度為約 1.25 μM 且該第四濃度為約 0.3 μM。
  61. 如請求項 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 該神經元培養系統進一步包含共培養的星狀膠質細胞，其中當與不包含該可溶性 Aβ 物質之神經元培養系統中共培養的星狀膠質細胞相比，該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 表現及/或該等星狀膠質細胞表現出增加的 GFAP 片段化。
  62. 如請求項 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，其中： 該神經元培養系統表現出甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構。
  63. 如請求項 62 之神經元培養系統，其中該神經元培養系統表現出神經炎性營養不良 (neuritic dystrophy)。
  64. 如請求項 62 之神經元培養系統，其中至少該甲氧基 X04 陽性 Aβ 斑塊或斑塊樣結構之子集經神經突 (neurite) 圍繞，視需要其中該等神經突經神經絲重鏈 (NFL-H) 軸突腫脹及/或磷酸化 Tau (S235) 陽性起泡 (blebbing) 標記，進一步視需要其中該等神經突為營養不良的。
  65. 如請求項 64 之神經元培養系統，其中經神經突圍繞之該等斑塊或斑塊樣結構表現出： 位於澱粉樣斑塊中之 ApoE 表現及/或在該等神經突之膜中的 APP。
  66. 如請求項 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該培養系統包含： 包含可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分、包含神經炎性細胞激素之該疾病相關成分及包含小神經膠質細胞之該神經保護成分。
  67. 如請求項 50 或 66 之神經元培養系統，其中該小神經膠質細胞為 iPSC 衍生的小神經膠質細胞且表現以下者中之一者或多者：TREM2、TMEM 119、CXCR1、P2RY12、PU.1、MERTK、CD33、CD64、CD32 及 IBA-1。
  68. 如請求項 66 至 67 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞之該神經元培養系統表現出降低的神經元毒性。
  69. 如請求項 66 至 68 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質及 (2) 小神經膠質細胞之該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 Aβ 斑塊締合及/或增加的 Aβ 斑塊形成。
  70. 如請求項 66 至 69 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞之該神經元培養系統表現出神經元毒性變化小於 10%。
  71. 如請求項 66 至 70 中任一項之神經元培養系統，其中當與不包含小神經膠質細胞之相對應的神經元培養系統相比，包含 (1) 可溶性 Aβ 物質、(2) 神經炎性細胞激素及 (3) 小神經膠質細胞之該神經元培養系統表現出增加的小神經膠質細胞 sAβ 斑塊締合及/或增加的 sAβ 斑塊形成。
  72. 如請求項 50 至 53 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養系統包含含有以下者之該疾病相關成分：(1) 包含可溶性 Aβ 物質之該疾病相關成分，以及 (2) 包含小神經膠質細胞之該神經保護成分。
  73. 如請求項 49 至 72 中任一項之神經元培養系統，其中該等神經元表現 DLK、GSK3、CDK5 及 Fyn 激酶訊號傳導中之一者或多者。
  74. 如請求項 49 至 73 中任一項之神經元培養系統，其中該神經元培養物包含來自多能幹細胞之同質且終末分化的神經元，其中來自多能幹細胞之該等同質且終末分化的神經元在包含以下步驟之方法中產生： (a) 在可誘導系統下產生表現 NGN2 及 ASCL1 之多能幹細胞 (PSC) 衍生的神經幹細胞 (NSC) 株； (b) 在誘導 NGN2 及 ASCL1 表現的條件下，結合細胞週期抑制劑培養該 NSC 株至少約 7 天，從而產生 PSC 衍生的神經元； (c) 在初代人類星狀膠質細胞的存在下再平板培養該等 PSC 衍生的神經元； (d) 在自動化細胞培養系統中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟至少約 60 至約 90 天。
  75. 如請求項 74 之神經元培養系統，其中使該等 PSC 衍生的神經元分化及成熟之步驟包含一輪或多輪自動化培養基更換；且其中該自動化細胞培養系統維持神經元細胞之分化、成熟及/或生長達至少約以下者中之任一者：30、60、80、90、120 或 150 天。
  76. 如請求項 74 或 75 之神經元培養系統，其中該自動化培養基更換包含自動化培養基抽吸及自動化培養基補充；以及/或 其中該細胞培養系統包含一個或多個 384 孔盤。
  77. 如請求項 76 之神經元培養系統，其中該自動化培養基抽吸包含用移液管尖端抽吸，其中： (a) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端之末端係在孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (c) 在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該抽吸之前、期間及/或之後，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (d) 培養基抽吸之速度不超過約 7.5µl/s； (e) 培養基抽吸之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (f) 在抽吸之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (g) 在抽吸之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  78. 如請求項 76 或 77 之神經元培養系統，其中該自動化培養基補充包含用移液管尖端分配培養基，其中： (a) 在該分配之前，該移液管尖端之末端係在該孔的底面上方約 1mm 處； (b) 在該分配期間，該移液管尖端之末端以約 1 mm/s 從該孔中退出； (c) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端相對於該孔的底面約呈 90° 角； (d) 在該分配之前及/或期間，該移液管尖端具有離該孔的中心不超過 0.1 mm 之位移；視需要其中在該分配之前及/或期間，該移液管尖端係在該孔的中心處 (無位移)； (e) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第一方向上位移以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第一側； (f) 該移液管尖端在該孔的底部上方約 12.40mm 之高度處以約 100mm/s 之速度在第二方向上位移以接觸離中心約 1 mm 之該孔的第二側，視需要其中該第一方向相對於該第二方向約呈 180° 角； (g) 培養基分配之速度不超過約 1.5µl/s； (h) 培養基分配之加速度為約 500 µl/s 2； (i) 培養基分配之減速度為約 500 µl/s 2； (j) 培養基分配之開始係在該移液管尖端經放置在該孔的底面上方 1mm 處之後約 200ms； (k) 在分配之前，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度插入該孔內；以及/或 (l) 在分配之後，該移液管尖端以約 5mm/s 之速度從該孔中退出。
  79. 如請求項 76 至 78 中任一項之神經元培養系統，其中該細胞培養系統包含 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄用過的 384 移液管尖端架且自動接合新的 384 移液管尖端架。
  80. 如請求項 76 至 79 中任一項之神經元培養系統，其中該細胞培養系統包含一批或多批 384 孔盤，其中每批包含至高達二十五個以 5 行且 5 列排列之 384 孔盤；進一步其中： (a) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基抽吸之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架；以及/或 (b) 該自動化細胞培養系統包含在每輪培養基分配之後自動丟棄至高達 25 個相對應之用過的 384 移液管尖端架且自動接合至高達 25 個相對應之新的 384 移液管尖端架。
  81. 如請求項 76 至 80 中任一項之神經元培養系統，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約以下者中之任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約以下者中之任一者：30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 之培養基經更換。
  82. 如請求項 76 至 81 中任一項之神經元培養系統，其中： (a) 在兩輪培養基更換之間的時段為約 3 或 4 天；以及/或 (b) 在一輪或多輪培養基更換中，約 50% 之培養基經更換。
  83. 一種篩選增加神經保護的化合物之方法，其包含：使該化合物與如請求項 50 至 82 中任一項之神經元培養系統中的神經元培養物接觸，以及量化神經保護中之改善。
  84. 如請求項 83 之方法，其中該神經保護中之改善包含：增加該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突。
  85. 如請求項 84 之方法，其中該方法包含量化在該神經元培養物中之以下者中的一者或多者之數量的增加：樹突、突觸、細胞計數及/或軸突，其中： (a) 樹突的數量係藉由該神經元培養物中之 MAP2 的水平來測量； (b) 突觸的數量係藉由該神經元培養物中之突觸蛋白 1 及/或突觸蛋白 2 的水平來測量； (c) 細胞計數的數量係藉由該神經元培養物中之 CUX2 的水平來測量；以及/或 (d) 軸突的數量係藉由該神經元培養物中之 β III 微管蛋白的水平來測量。
  86. 如請求項 84 之方法，其中若有以下條件則選擇化合物用於進一步測試： (a) 在該神經元培養物中之 MAP2 的水平增加 ≥30%； (b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%； (c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%； 當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。
  87. 如請求項 84 或 86 之方法，其中若有以下條件則確定化合物為神經保護的： (a) 在該神經元培養物中之 MAP2 的水平增加 ≥30%； (b) 突觸蛋白 1 或突觸蛋白 2 的水平增加 ≥30%； (c) CUX2 的水平增加 ≥30%；以及/或 (d) β III 微管蛋白的水平增加 ≥30%； 當其係與未與該化合物接觸之相對應的神經元培養物相比時。
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