CN104749275A

CN104749275A - 利用高效液相色谱法检测白沙蒿黄酮成分的方法

Info

Publication number: CN104749275A
Application number: CN201510115741.9A
Authority: CN
Inventors: 刘权; 傅华; 南志标
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-16
Also published as: CN104749275B

Abstract

本发明提供了一种利用高效液相色谱法检测白沙蒿中黄酮成分与含量的方法。以质量百分数0.2%醋酸水和甲醇为流动相，流动相总流速为0.3~1.5 mL/min，检测波长为275 nm，可以对白沙蒿黄酮成分的种类和含量进行准确有效的分析和检测。本发明样品处理简单，重复性好，检测精度高，检测成本低，对于深入研究白沙蒿抗逆性以及科学合理开发白沙蒿资源具有非常重要的意义。

Description

利用高效液相色谱法检测白沙蒿黄酮成分的方法

技术领域

本发明涉及一种白沙蒿中黄酮成分种类和含量的检测方法，尤其涉及利用高效液相色谱法检测白沙蒿黄酮成分的方法。

背景技术

白沙蒿Artemisia sphaerocephala Kraschen是菊科蒿属植物，又名圆头沙蒿，半灌木，生于荒漠及半荒漠带的流动沙丘及半固定沙丘。由于长期生活在气候干燥、日照强烈、昼夜温差大和多风沙的恶劣环境中，白沙蒿形成了自身独特的适应机制。有研究报道，从白沙蒿中分离得到多种黄酮类化合物，具有明显的抗氧化活性，能够清除自由基，降低恶劣环境对植物的损失。此外，白沙蒿所含的黄酮成分还具有调节心血管系统、保护神经系统、抗过敏及治疗皮炎、抗细菌及微生物、抗癌及基因毒性、提高其他药物生物利用度等多种功能与应用（李林玺，2007. 白沙蒿化学成分研究. 硕士毕业论文，河南大学）。然而到目前为止，关于白沙蒿成分的检测方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用高效液相色谱法检测白沙蒿黄酮成分的方法。

一、白沙蒿黄酮成分的检测

1、试验样品的处理（提取白沙蒿有效成分）：采集新鲜白沙蒿植物样品，阴干，粉碎，过100目筛；称取0.1~0.8 g溶于5~30 mL乙醇中，超声提取20~80 min；采用1.5 mL离心管离心3~5 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，为待测液。

2、白沙蒿黄酮成分的检测方法

高效液相色谱条件：采用Agilent-1100高效液相色谱仪，GraceSmart RP18反相色谱柱；以质量百分数0.2%醋酸水（A）和甲醇（B）为流动相，流动相总流速为0.6 mL/min，检测波长为275nm。

流动相的体积配比、检测顺序及保留时间依次为：

30%B、70%A，0-5 min；

30-50%B、50-70%A，5-10 min；

50%B、50%A，10-20 min；

50-60% B、40-50%A，20-30 min；

60%B、40%A，30-45 min；

60-70%B、30-40%A，45-50 min；

70%B、30%A，50-60min。

二、检测方法的评价

1、线性考察

以购于试剂公司的药品芦丁为对照品，溶解于80%甲醇溶液中，配置为1.0 mg/mL浓度，通过0.45 μm滤膜过滤，备用。分别取该对照品溶液加入不同体积的色谱纯甲醇，稀释至0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01和0.005 mg/mL。每种溶液各进样20 μL。按上述色谱条件测定峰面积积分值, 以峰面积积分值为纵坐标, 以对照品浓度为横坐标, 经线性回归处理得标准曲线，r>0.9993，线性范围为0.5-0.005 mg/mL。结果表明，线性关系良好，符合测定要求。

2、精密度的考察

精密吸取白沙蒿样品溶液20 μL，连续进样6 次，测定峰面积积分值，RSD 为0.76 %。表明仪器精密度良好。

3、重复性的考察

取同一地点同一时间段所采白沙蒿样品5 份，精密称定同一质量，按同样的方法超声提取，利用以上测定方法重复测定, 计算得RSD 为1.37 %。表明该方法的重复性良好。

4、稳定性的考察

精密吸取白沙蒿样品溶液20 μL，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h 测定峰面积, 计算RSD 为0.90 %，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

5、回收率试验

精密称取同一地点同一时间段所采白沙蒿样品0.1 g，加入10 mL 无水乙醇和0.1mg/mL芦丁标准对照液1.0 mL，超声提取30min，通过0.45 μm微孔滤膜过滤，取溶液20 μL，测定芦丁的峰面积，计算回收率。平行重复5次。结果见表1。该方法回收率>98%，RSD为1.08 %，回收率高，能准确反映样本中黄酮的实际含量。

综上所述，本发明中的检测方法可以对白沙蒿体内黄酮成分的种类和含量进行准确有效的分析和检测，且样品处理简单，重复性好，检测精度高，检测成本低，对于深入研究白沙蒿抗逆性以及科学合理开发白沙蒿资源具有非常重要的意义。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明检测白沙蒿黄酮成分的具体方法做进一步说明。

实例1、对生长在半流动沙丘的白沙蒿进行黄酮成分检测

试验样品处理：采集生长在半流动沙丘的白沙蒿新鲜植物样品，阴干，粉碎后过100目筛子。称取样品0.20 g，溶于20 mL乙醇中，超声提取30 min；取1.25 mL于1.5 mL离心管中，离心5 min，取上清液微孔滤膜（0.45 μm）滤过，为待测液。

液相色谱条件：Agilent-1100高效液相色谱仪；GraceSmart RP18反相色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）。流动相：质量百分数0.2 %醋酸水（A相）和甲醇（B相），总流速为0.6 mL/min，检测波长为275nm。

流动相的体积配比、检测顺序及保留时间：依次为：

0-5 min，组分B的体积比为30%，流速为0.18 mL/min，组分A的体积比为70%，流速为0.42 mL/min；

5-10 min，组分B的体积比逐步从30%增大到50%，流速从0.18增大到0.30 mL/min，组分A的体积比逐步从70%减小到50%，流速从0.42减小到0.30 mL/min；

10-20 min，组分B的体积比为50%，流速为0.30 mL/min，组分A的体积比为50%，流速为0.30 mL/min；

20-30 min，组分B的体积比逐步从50%增大到60%，流速从0.30增大到0.36 mL/min，组分A的体积比逐步从50%减小到40%，流速从0.30减小到0.24 mL/min；

30-45 min，组分B的体积比为60%，流速为0.36 mL/min，组分A的体积比为40%，流速为0.24 mL/min；

45-50 min，组分B的体积比逐步从60%增大到70%，流速从0.36增大到0.42 mL/min，组分A的体积比逐步从40%减小到30%，流速从0.24减小到0.18 mL/min；

50-60min，组分B的体积比为70%，流速为0.42 mL/min，组分A的体积比为30%，流速为0.18 mL/min。

检测结果：生长在半流动沙丘的白沙蒿黄酮成分见表2。

实施例2、对生长在半干旱黄土高原的白沙蒿进行黄酮成分检测

试验样品处理：采集生长在半干旱黄土高原的白沙蒿新鲜植物样品，阴干，粉碎后过100目筛子。称取样品0.20 g，溶于20 mL乙醇中，超声提取30 min；取1.25 mL于1.5 mL离心管中，离心5 min，取上清液微孔滤膜（0.45 μm）滤过，为待测液。

液相色谱条件：Agilent-1100高效液相色谱仪；GraceSmart RP18反相色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）。流动相：质量百分数0.2%醋酸水（A相）和甲醇（B相），总流速为0.6 mL/min，检测波长为275nm。

色谱方法同实例1。

检测结果：生长在黄土高原的白沙蒿黄酮成分见表3。

比较实施例1和2的检测结果，可以明显看到，白沙蒿由于面对恶劣的环境形成其独特的自我保护策略，在半流动沙丘中其体内黄酮成分种类和含量均远高于生长在环境相对优越的黄土高原上。而且，黄酮成分比例也差别较大。该结果也印证了黄酮成分在提高白沙蒿自身抗逆性中起到了非常重要的作用，同时说明本发明的方法对于研究不同生境白沙蒿生态竞争优势以及进一步开发利用白沙蒿资源具有重要意义。

实施例3、对生长在半流动沙丘环境中的白沙蒿在不同时期的黄酮成分检测

试验样品处理：分别采集生长半流动沙丘环境中的不同时期（7、8和9月）白沙蒿新鲜植物样品，阴干，粉碎后过100目筛子。称取样品0.20 g，溶于20 mL乙醇中，超声提取30 min；取1.25 mL于1.5 mL离心管中，离心5 min，取上清液微孔滤膜（0.45 μm）滤过，为待测液。

色谱方法同实例1。

检测结果：生长在半流动沙丘的白沙蒿黄酮成分见表4。

实施例3的检测结果表明，不同生长时期的白沙蒿体内黄酮成分的含量有非常大的变化，这些都将与其处在不同生理期及气候环境的变化息息相关，尤其是在生长旺盛期，体内黄酮成分含量得到了大量的合成和积累，其含量增长幅度非常大。

本方法有助于深入研究白沙蒿的生理特性及对环境响应的生存策略，而且对于合理科学地开发白沙蒿资源具有重要的指导意义。

Claims

1.利用高效液相色谱法检测白沙蒿黄酮成分的方法，其工艺步骤如下：

试验样品的处理：采集新鲜白沙蒿植物样品，阴干，粉碎，过100目筛；称取0.1~0.8 g溶于5~30 mL乙醇中，超声提取20~80 min；采用离心管离心3~5 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，得待测液；

高效液相色谱条件：采用Agilent-1100高效液相色谱仪，反相硅胶色谱柱，以质量百分数0.2%醋酸水（A相）和甲醇（B相）为流动相，流动相总流速为0.3~1.5 mL/min，检测波长为275nm；

流动相的体积配比、检测顺序及保留时间依次为：

30%B，70%A，0-5 min；

30-50%B，50-70%A，5-10 min；

50%B，50%A，10-20 min；

50-60% B，40-50%A，20-30 min；

60%B，40%A，30-45 min；

60-70%B，30-40%A，45-50 min；

70%B，30%A，50-60min。