CN104730014B - 一种血清脂肪酶测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种血清脂肪酶测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种血清脂肪酶测定试剂盒及其制备方法，旨在提供一种稳定性好，批间差小且测量范围宽的血清脂肪酶测定试剂盒。此种血清脂肪酶测定试剂盒包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，按2∶1的比例组成，试剂Ⅰ：N,N‑双(2‑羟乙基)‑甘氨酸缓冲液50mmol/L；辅脂酶0.5‑2.0mg/L；去氧胆酸钠0.42‑0.83g/L；氯化钙1.47g/L；胆酸钠1g/L；生物防腐剂适量。试剂Ⅱ：酒石酸缓冲液10mmol/L；牛磺去氧胆酸2.3‑9.2g/L；聚乙二醇40000.5‑1.5g/L；胆酸钠1g/L；磷脂0.05‑0.2g/L；色团底物[1,2‑邻‑二月桂‑外消旋‑甘油基‑3‑戊二酸‑(6‑甲基试卤灵)酯]150‑200mg/L；生物防腐剂适量。本发明还对乳化过程的工艺作了优化，使底物充分乳化，保证了生成的微胶乳颗粒大小合适均一，使试剂的稳定性好，批间差小，并扩展了线性范围。

Description

一种血清脂肪酶测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物试剂，具体涉及一种体外诊断试剂盒，尤其涉及一种血清脂肪酶测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清脂肪酶测定和血清α淀粉酶测定都是诊断各种胰腺疾病的重要的临床指标。作为急性胰腺炎的诊断，二者都有很高的灵敏度，但脂肪酶的特异性要优于α淀粉酶。急性胰腺炎时，在4-8小时内，脂肪酶的活性就会增高，24小时左右将达到峰值。随疾病的好转8-14天后降至正常水平。
血清脂肪酶(Lipase)测定方法很多，曾在临床实验室中应用的有比浊法、紫外法、比色法和干化学法等。比浊法的缺点是底物的乳化批间差大，直接影响测定结果，且稳定性差，不易保存。紫外法和比色法均为酶联速率法，须用多个工具酶，价格昂贵。Kodak干化学技术原理与比色法类似，与pH-Stat法比较有一个较大的负截距(-101U/L)。
目前，临床实验室中应用的脂肪酶测定试剂大都为Roche公司发展的脂肪酶测定(色团底物法)。其反应原理如下：
570nm波长测定△A，根据甲基试卤灵的摩尔消光系数或对照校准物可计算出脂肪酶的活力单位。
此法经欧洲，美国和日本七个实验中心评价：灵敏度较比浊法高4-5倍，不出现负值；不需要工具酶；反应线性时间大于5分钟，线性范围相对较宽(为320U/L，是正常人高限的5倍)；精密度好；几乎不存在内源性干扰等优点。但还存在不足之处：如1.色团底物的乳化是影响试剂的批间差和稳定性的关键，须进一步优化。2.线性范围虽已达320U/L，但在临床检测时还有部份高值样本超过此值，须稀释后重复测定，增加了工作量和费用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种稳定，批间差小和线性范围宽的血清脂肪酶测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种血清脂肪酶测定试剂盒，该试剂盒由下列试剂I和试剂II按2∶1的比例组成；
试剂I：N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液50mmol/L、辅脂酶0.5-2.0mg/L、去氧胆酸钠0.42-0.83g/L、二水氯化钙1.47g/L、胆酸钠1g/L；
试剂II：酒石酸缓冲液10mmol/L、牛磺去氧胆酸3.4-7.1g/L、胆酸钠1g/L、聚乙二醇4000为0.5-1.5g/L、磷脂0.05-0.2g/L、色团底物150-200mg/L；
所述N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液的pH值为8.0，所述酒石酸缓冲液的pH值为4.0；
所述试剂I和试剂II还添加有去污剂和防腐剂。
本发明的另一目的是提供了血清脂肪酶测定试剂盒的制备方法，
所述试剂盒由下列试剂I和试剂II按2∶1的比例组成；
试剂I：pH8.0的N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液50mmol/L、辅脂酶0.5-2.0mg/L、去氧胆酸钠0.42-0.83g/L、二水氯化钙1.47g/L、胆酸钠1g/L；
试剂II：pH4.0的酒石酸缓冲液10mmol/L、牛磺去氧胆酸3.4-7.1g/L、胆酸钠1g/L、0.5-1.5g/L聚乙二醇4000、磷脂0.05-0.2g/L、色团底物150-200mg/L；
所述制备方法包括下列步骤，以试剂I4L，试剂II2L为例：
(一)试剂I制备(4L)
(1)先配制N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.5g，1500转/分，搅拌10分钟，使N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解，用4N NaOH调pH至8.0，去离子水补足到4.0L，加生物防腐剂适量；
(2)将下例组份，去氧胆酸钠1.68-3.32g、二水氯化钙5.88g、胆酸钠4g和辅脂肪酶2-8mg分别加入到上述缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
(二)试剂II制备(2L)
(1)先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水、加酒石酸1.0g、酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10分钟溶解，测pH应为4.0；
(2)将下例组份：牛磺去氧胆酸6.8-14.2g、胆酸钠2g、聚乙二醇40001-3g、磷脂0.1-0.4g加入到酒石酸缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
(3)称取色团底物300-400mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
(4)底物的乳化：搅拌试剂II基础液，搅拌速度控制在基础液不出现气泡情况下的最快搅拌转速，用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到连续搅拌的试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂II为桔黄色微乳浊液。此步骤至关重要，将决定生成的微胶乳颗粒大小和均一性，直接影响试剂的稳定性和批间差。必需保证试剂II基础液的搅拌速度和底物有机溶剂溶液从液面下加入的速度。搅拌速度，要求试剂II基础液在不出现气泡情况下的最快搅拌转速；在上述持续搅拌试剂II基础液的状况下，用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂为桔黄色微乳浊液。
脂肪酶的测定程序：
反应类型：速率法；温度：37℃；单位：U/L；波长：570nm(主)/700nm(次)。
脂肪酶的反应模式：胆酸盐附着于底物-水的界面，并和辅脂酶形成聚合物，使辅脂酶的结构改变，并打开脂肪酶高亲和力的特异结合位点，形成脂肪酶-辅脂酶-胆酸盐聚合物，固定在底物表面，然后发挥脂肪酶的脂解作用，Ca2+是脂肪酶的活化剂，可增加脂肪酶的活性。
根据上述反应模式，本发明对各种胆酸盐作了筛选，并对几种胆酸盐，辅脂酶和Ca2+的浓度作了优化，使脂肪酶的水解作用充分发挥。
本发明还对几种辅乳化剂和稳定剂进行筛选，发现磷脂的辅乳化作用最佳，聚乙二醇4000，去氧胆酸钠和牛磺去氧胆酸是必不可少稳定剂。另外，还对乳化的工艺过程作了优化，如控制搅拌器的合适转速和通过恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，这些改进的综合作用使底物充分乳化，并保证了生成的微胶乳颗粒大小合适均一，稳定性好，使试剂稳定且批间差小。加之测定程序的改进，使本发明血清脂肪酶测定试剂盒的线性范围达650U/L，使稀释后重复测定的样本降至最低。
具体实施方式
以下实施例所用试剂原料均通过市售得到。
原料名称 购买公司
N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液 南京旋光公司
辅脂酶 Roche公司
去氧胆酸钠 Signa公司
氯化钙 国药集团上海试剂公司
聚乙二醇4000 国药集团上海试剂公司
生物防腐剂 国药集团上海试剂公司
酒石酸和酒石酸钠 国药集团上海试剂公司
牛磺去氧胆酸 Signa公司
磷脂 Signa公司
色团底物 Roche公司
实施例1制备血清脂肪酶测定试剂盒：
(一)制备试剂I(4L为例)
(1)先配制N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.4g，1500转/分，搅拌5分钟，使N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解，用4N NaOH调pH至8.0，去离子水补足到4.0L，加生物防腐剂适量；(2)将下例组份：去氧胆酸钠1.68g、氯化钙(二水)5.88g、胆酸钠4g，和辅脂肪酶2mg分别加入到上述缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
(二)试剂II制备(2L)
(1)先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水；加酒石酸1.0g，酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10分钟溶解，测pH应为4.0；
(2)将下例组份：牛磺去氧胆酸4.6g、胆酸钠2g，聚乙二醇40001g、磷脂0.1g加入到酒石酸缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
(3)称取色团底物300mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
(4)色团底物的乳化：搅拌速度，要求试剂II基础液在不出现气泡情况下的最快搅拌转速；用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂为桔黄色微乳浊液。
实施例2制备血清脂肪酶测定试剂盒：
(一)制备试剂I(4L为例)
(1)先配制N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.4g，1500转/分，搅拌5分钟，使N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解溶解，用4N NaOH调pH至8.0，去离子水补足到4.0L，加生物防腐剂适量；
(2)将下例组份：去氧胆酸钠3.32g、氯化钙(二水)5.88g、胆酸钠4g，和辅脂肪酶8mg分别加入到上述缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
(二)试剂II制备(2L)
(1)先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水；加酒石酸1.0g，酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10分钟溶解，测pH应为4.0；
(2)将下例组份：牛磺去氧胆酸18.4g、胆酸钠2g，聚乙二醇40003g、磷脂1.0g加入到酒石酸缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
(3)称取色团底物400mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
(4)色团底物的乳化：搅拌速度，要求试剂II基础液在不出现气泡情况下的最快搅拌转速；用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂为桔黄色微乳浊液。
实施例3制备血清脂肪酶测定试剂盒：
(一)制备试剂I(4L为例)
(1)先配制N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.4g，1500转/分，搅拌5分钟，使N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解溶解，用4N NaOH调pH至8.0，去离子水补足到4.0L，加生物防腐剂适量；
(2)将下例组份：去氧胆酸钠3.0mg、氯化钙(二水)5.88g、胆酸钠4g，和辅脂肪酶6mg分别加入到上述缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
(二)试剂II制备(2L)
(1)先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水；加酒石酸1.0g，酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10分钟溶解，测pH应为4.0；
(2)将下例组份：牛磺去氧胆酸12g、胆酸钠2g，聚乙二醇40002g、磷脂0.15g加入到酒石酸缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
(3)称取色团底物320mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
(4)色团底物的乳化：搅拌速度，要求试剂II基础液在不出现气泡情况下的最快搅拌转速；用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂为桔黄色微乳浊液。
实施例4制备血清脂肪酶测定试剂盒：
(一)制备试剂I(4L为例)
(1)先配制N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.4g，1500转/分，搅拌5分钟，使N，N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解溶解，用4N NaOH调pH至8.0，去离子水补足到4.0L，加生物防腐剂适量；
(2)将下例组份：去氧胆酸钠2.0mg、氯化钙(二水)5.88g、胆酸钠4g，和辅脂肪酶4mg分别加入到上述缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
(二)试剂II制备(2L)
(1)先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水；加酒石酸1.0g，酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10分钟溶解，测pH应为4.0；
(2)将下例组份：牛磺去氧胆酸10g、胆酸钠2g，聚乙二醇40001.0g、磷脂0.15g加入到酒石酸缓冲液中，1500转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
(3)称取色团底物360mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
(4)色团底物的乳化：搅拌速度，要求试剂II基础液在不出现气泡情况下的最快搅拌转速；用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌5分钟，制得的试剂为桔黄色微乳浊液。
本发明优化的脂肪酶测定试剂盒测得的实验数据：
(1)线性范围
本发明优化的试剂及测定程序测得的线性范围可达650U/L；Roche试剂及测定程序测得的线性为320U/L，比较于图1：
注：-◆-改进法测定的线性范围达650U/L，直线回归方程图2；
---▲---Roche法测得的线性范围为320U/L，直线回归方程图3；
(2)批间相对偏差
三批本发明优化的试剂和测定程序测得的各项技术指标均达到优，批间相对偏差≤5％。
三批脂肪酶测定试剂技术指标对照表
三批产品保存一年的留样的技术指标测定，说明试剂的稳定性很好，各项技术指标均优于规定的标准，且批间差保持在一个较小的值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种血清脂肪酶测定试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由下列试剂I和试剂II按2：1的比例组成；
试剂I：N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液50 mmol/L、辅脂酶0.5-2.0 mg/L、去氧胆酸钠0.42-0.83 g/L、二水氯化钙1.47 g/L、胆酸钠1 g/L；
试剂II：酒石酸缓冲液10 mmol/L、牛磺去氧胆酸3.4-7.1 g/L、胆酸钠1 g/L、聚乙二醇4000为0.5-1.5 g/L、磷脂0.05-0.2g/L、色团底物150-200 mg/L；
所述N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液的pH值为8.0，所述酒石酸缓冲液的pH值为4.0；
所述试剂I和试剂II还添加有去污剂和防腐剂。
2.一种血清脂肪酶测定试剂盒的制备方法，其特征在于：
所述试剂盒由下列试剂I和试剂II按 2：1 的比例组成；
试剂I：pH8.0的N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液50 mmol/L、辅脂酶0.5-2.0 mg/L、去氧胆酸钠0.42-0.83 g/L、二水氯化钙1.47 g/L、胆酸钠1 g/L；
试剂II：pH4.0的酒石酸缓冲液10 mmol/L、牛磺去氧胆酸3.4-7.1 g/L、胆酸钠1 g/L、0.5-1.5 g/L聚乙二醇 4000、磷脂0.05-0.2g/L、色团底物150-200 mg/L；
所述制备方法包括下列步骤，以试剂I 4 L，试剂II 2 L 为例：
（一）试剂I制备(4 L)
（1）先配制N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液：向容器内加入去离子水3.5L，加N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸40.5g，1500 转/分，搅拌10分钟，使N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸完全溶解，用4N NaOH调pH至 8.0，去离子水补足到 4.0 L，加生物防腐剂适量；
（2）将下例组份，去氧胆酸钠1.68-3.32g、二水氯化钙5.88g、胆酸钠 4g和辅脂肪酶2-8mg分别加入到上述缓冲液中，1500 转/分，搅拌10分钟，使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量，混匀即为试剂I；
（二）试剂II制备(2 L)
（1）先配制酒石酸缓冲液：向容器内加入2L去离子水、加酒石酸1.0g、酒石酸钠3.1g，1500转/分，搅拌10 分钟溶解，测pH应为 4.0；
（2）将下例组份：牛磺去氧胆酸 6.8-14.2g、胆酸钠 2g、聚乙二醇 4000 1-3g、磷脂0.1-0.4g 加入到酒石酸缓冲液中，1500 转/分，搅拌 10分钟使加入组份完全溶解，再加生物防腐剂适量；此为试剂II基础液；
（3）称取色团底物300-400mg，先溶于10ml正丙醇中，搅拌溶解；
（4）底物的乳化：搅拌试剂II基础液，搅拌速度控制在基础液不出现气泡情况下的最快搅拌转速，用恒流泵控制底物有机溶液匀速而缓慢的加入到连续搅拌的试剂II基础液的液面下，直到底物有机溶液全部加入，再搅拌 5 分钟，制得的试剂II为桔黄色微乳浊液。
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