CN104719615B - 一种复合乳酸菌瘤胃调控剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种复合乳酸菌瘤胃调控剂及其制备方法。该复合乳酸菌瘤胃调控剂由植物乳杆菌代谢物及灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及灭活的乳酸菌、粪肠球菌代谢物及灭活的粪肠球菌组成，植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌的质量比为1:1:1、1:2:1或1:1:2。本发明采用单一菌种高密度液态工业发酵技术产生抗应激性代谢物组，拓宽了产品的功效性和使用范围。该复合乳酸菌瘤胃调控剂可促进和维护瘤胃内微生物区系平衡，稳定瘤胃pH值，提高瘤胃挥发性脂肪酸的产量，提高菌体蛋白的含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种复合乳酸菌瘤胃调控剂及其制备方法。
背景技术
养好反刍动物的关键在于养好瘤胃中的微生物，研究证实，奶牛瘤胃内微生物，与奶牛的生长存在密切关系：奶牛采食后，饲料降解成小分子，经血液吸收，送到各组织、器官利用。奶牛瘤胃类似于一个庞大的发酵罐，瘤胃内有数以亿计的厌氧微生物-细菌和原虫，所以只有具备良好瘤胃功能的奶牛，才能最大限度地发挥其生产性能。通过向瘤胃内提供活性物质，从而激活瘤胃微生物的生长与代谢，可达到调控瘤胃功能的目的。
微生态制剂，是指在微生态学理论的指导下，调整微生态平衡失调，保持微生态平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代谢产物和选择性促进宿主正常菌群生长的物质制剂总称。主要包括乳酸菌类制剂、酵母菌类制剂及其复合微生态制剂。这些微生态制剂可以调节动物肠道微生态平衡,提高动物生长率,提高饲料利用率,促进动物对钙、镁、铁的吸收；抑制肠道有害微生物的繁殖,提高动物健康水平,增强动物免疫力；无毒副作用,无耐药性,无病原性,被视为绿色饲料添加剂之一。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)由一组形态、代谢和生理特性相同的细菌组成，大多为革兰氏阳性、无芽孢的球菌或杆菌，并且这群菌能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量的乳酸菌多为厌氧菌，以无氧呼吸为主，部分菌种可进行有氧呼吸，常用于食品和饲料发酵剂的乳酸菌主要集中于乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属里的几十种。
乳酸菌代谢物是乳酸菌在繁殖过程中产生一些胞外代谢产物，主要是乳酸、乙酸、丙酸、乳酸菌肽、乳酸菌素、多种维生素和促生长因子，其中乳酸、乙酸、丙酸具有较强的抑菌活性和较宽的抑菌范围，可抑制酵母菌、真菌、细菌及其它一些有害微生物的生长和发育，调整肠道菌群，增强机体抗病能力。乳酸菌代谢产物具有良好的热稳定性及较好的抗蛋白酶活性和抗过氧化氢酶活性，并且pH值越低，其抑菌能力越强。
复合乳酸菌代谢物制备工艺:本发明主要利用不同种属乳酸菌产生的代谢物对有害菌的抑制功能，以实验室筛选得到的产酸能力较强的植物乳杆菌、产乳酸菌素能力较强的乳酸乳球菌和产肽聚糖能力较强的粪肠球菌为发酵菌株，采用高密度工业发酵技术，得到高密度的乳酸菌发酵液，通过调整发酵条件使其能够更大程度上发挥其产酸的能力、产乳酸菌素能力和产肽聚糖的能力，提高产品有效组分的含量。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种微生态饲料添加剂及其制备方法。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种复合乳酸菌瘤胃调控剂，由植物乳杆菌代谢物及灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及灭活的乳酸菌、粪肠球菌代谢物及灭活的粪肠球菌组成，所述的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌的质量比为1:1:1、1:2:1或1:1:2。
所述的植物乳杆菌代谢物、乳酸乳球菌代谢物或粪肠球菌代谢物优选采用如下方法进行前处理：将植物乳杆菌代谢物、乳酸乳球菌代谢物或粪肠球菌代谢物进行喷雾干燥处理。
所述的复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、植物乳杆菌代谢物的制备:(1)将植物乳杆菌菌种接种到MRS斜面培养基中，35～37℃静止培养24小时得到复活的植物乳杆菌菌种；(2)将复活的植物乳杆菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2～8％的量接种至优化后的培养基中，33～37℃发酵12～24h，得到二级种子液；(4)液体厌氧发酵：将二级种子液以5～10％的接种量接种至液体厌氧发酵培养基中，30～33℃厌氧发酵16～24h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到植物乳杆菌代谢物；
步骤二、乳酸乳球菌代谢物的制备：(1)将乳酸乳球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的乳酸乳球菌菌种；(2)将复活的乳酸乳球菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2～4％的量接种至优化后的培养基进行发酵，得到发酵后的菌体；(4)将发酵后的菌体以5～10％接种至乳酸乳球菌液体厌氧培养基中，28～30℃厌氧发酵24～36h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到乳酸乳球菌代谢物；
步骤三、粪肠球菌代谢物的制备：(1)将粪肠球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的粪肠球菌菌种；(2)将复活的粪肠球菌接种至液体MRS培养基中，得一级种子液；(3)将一级种子液以1～3％的量接种至优化后的培养基中培养，得到二级种子液；(4)将二级种子液以6～8％的接种量接种至液体厌氧培养基中，35～37℃厌氧发酵16～36h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到粪肠球菌代谢物；
步骤四、复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备：将步骤一的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、步骤二的乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和步骤三的粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌按质量比1:1:1、1:2:1或1:1:2混合均匀，得到复合乳酸菌瘤胃调控剂。
步骤一中：
所述的液体厌氧发酵培养基由如下按质量分数计的成分组成：甜菜糖蜜5～10％、玉米浆5～10％、磷酸二氢钠0.05～0.15％、无水乙酸钠0.5～1％、硫酸镁0.01～0.15％、硫酸锰0.01～0.15％、吐温800.2～0.5％、余量为水，并调节pH为5.0～6.0。
所述的优化后的培养基由如下成分组成：蛋白胨30g、酵母粉10g、葡糖糖30g、无水乙酸钠15g、柠檬酸氢二铵5g、吐温804g、K2HPO42g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·H2O 0.07g、蒸馏水1L。
步骤二中：
所述的乳酸乳球菌液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜2％～5％、玉米浆5～10％、氯化钠0.1％～0.2％、硫酸镁0.01％～0.05％、硫酸锰0.0025～0.005％、吐温800.1％～0.3％、余量为水，并调节pH为6.5～7.0。
所述的优化后的培养基由如下成分组成：葡糖糖10g、甘蔗糖蜜50g、豆粕49.16g、Na2HPO44g、(NH4)2SO43.77g、无水乙酸钠1g、柠檬酸氢二铵0.5g、MgSO4·7H2O 0.4g、MnSO4·H2O 0.025g、吐温801g、蒸馏水1L。
步骤三中：
所述的液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜5～10％、玉米浆2～4％、磷酸二氢钠0.1～0.2％、无水乙酸钠0.2～0.5％、硫酸锰0.01～0.02％、硫酸镁0.02～0.04％、吐温800.05～0.1％、余量为水，并调节pH为6.0～7.0。
所述的优化后的培养基由如下成分组成：葡糖糖20g、玉米浆60g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵6g、NaH2PO43g、吐温801g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、蒸馏水1L。
步骤一中的液体厌氧发酵过程中采用适合植物乳杆菌代谢的应激条件，但要同时确保植物乳杆菌的活性，使其在应激条件下产生特定的抗应激代谢产物，培养基的pH控制在5.0～6.0，温度控制在30～33℃，接种量控制在5～10％，培养时间控制在20～36h。
步骤二中的乳酸乳球菌厌氧发酵培养基的pH控制在6.5～7.0，温度控制在28～30℃，接种量为5～10％。
步骤三中的厌氧发酵培养基的pH控制在6.0～7.0，温度控制在35～37℃，接种量为6～8％。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)国内目前尚无复合的乳酸菌应用于反刍动物瘤胃调控的瘤胃调控剂，本发明以三株产主要产物不同菌株的代谢物进行复合，可以改善瘤胃内环境，是安全、无毒副作用、无污染的瘤胃调控剂。
(2)本发明采用单一菌种工业发酵技术通过不同的条件刺激产生特定的抗应激代谢物，便于实现工艺稳定、产品稳定，而且有效解决了活菌制剂和酶制剂容易失活及抗生素类物质带来的负面影响；采用多个单菌种发酵代谢物组复配技术，进一步拓宽产品的功能性，解决了单一菌株功能的局限性问题。
(3)本发明的复合乳酸菌瘤胃调控剂品质优良，稳定性好，经瘤胃体外批次培养证明其功效性强，作为营养均衡的复合乳酸菌瘤胃调控剂，可提高瘤胃中挥发性脂肪酸的含量、菌体蛋白含量。复合乳酸菌瘤胃调控剂不是活菌制剂，而是经厌氧发酵后由活菌产生的抗特定性应激的代谢产物，易储存不会随保存时间的延长活性降低，确保了产品有效成分的含量。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明：
实施例1
一种复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、植物乳杆菌代谢物的制备:(1)将植物乳杆菌菌种接种到MRS斜面培养基中，35℃静止培养24小时得到复活的植物乳杆菌菌种；(2)将复活的植物乳杆菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(蛋白胨30g，酵母粉10g，葡糖糖30g，无水乙酸钠15g，柠檬酸氢二铵5g，吐温804g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O 0.07g，蒸馏水1L)中，33℃发酵12h，得到二级种子液；(4)液体厌氧发酵：将二级种子液以5％的接种量接种至液体厌氧发酵培养基中，30℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到植物乳杆菌代谢物；
步骤二、乳酸乳球菌代谢物的制备：(1)将乳酸乳球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的乳酸乳球菌菌种；(2)将复活的乳酸乳球菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖10g，甘蔗糖蜜50g，豆粕49.16g，Na2HPO44g，(NH4)2SO43.77g，无水乙酸钠1g，柠檬酸氢二铵0.5g，MgSO4·7H2O0.4g，MnSO4·H2O 0.025g，吐温801g，蒸馏水1L)进行发酵，得到发酵后的菌体；(4)将发酵后的菌体以5％接种至乳酸乳球菌液体厌氧培养基中，28℃厌氧发酵24h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到乳酸乳球菌代谢物；
步骤三、粪肠球菌代谢物的制备：(1)将粪肠球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的粪肠球菌菌种；(2)将复活的粪肠球菌接种至液体MRS培养基中，得一级种子液；(3)将一级种子液以1％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖20g，玉米浆60g，无水乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵6g，NaH2PO43g，吐温801g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，蒸馏水1L)中培养，得到二级种子液；(4)将二级种子液以6％的接种量接种至液体厌氧培养基中，35℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到粪肠球菌代谢物；
步骤四、复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备：将步骤一的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、步骤二的乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和步骤三的粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌按质量比1:1:1混合均匀，得到复合乳酸菌瘤胃调控剂。
步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基由如下按质量分数计的成分组成：甜菜糖蜜5～10％、玉米浆5～10％、磷酸二氢钠0.05～0.15％、无水乙酸钠0.5～1％、硫酸镁0.01～0.15％、硫酸锰0.01～0.15％、吐温800.2～0.5％、余量为水，并调节pH为5.0～6.0。
步骤二中所述的乳酸乳球菌液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜2％～5％、玉米浆5～10％、氯化钠0.1％～0.2％、硫酸镁0.01％～0.05％、硫酸锰0.0025～0.005％、吐温800.1％～0.3％、余量为水，并调节pH为6.5～7.0。
步骤三中所述的液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜5～10％、玉米浆2～4％、磷酸二氢钠0.1～0.2％、无水乙酸钠0.2～0.5％、硫酸锰0.01～0.02％、硫酸镁0.02～0.04％、吐温800.05～0.1％、余量为水，并调节pH为6.0～7.0。
步骤一中的液体厌氧发酵过程中采用适合植物乳杆菌代谢的应激条件，但要同时确保植物乳杆菌的活性，使其在应激条件下产生特定的抗应激代谢产物，培养基的pH控制在5.0～6.0，温度控制在30～33℃，接种量控制在5～10％，培养时间控制在20～36h。
步骤二中的乳酸乳球菌厌氧发酵培养基的pH控制在6.5～7.0，温度控制在28～30℃，接种量为5～10％。
步骤三中的厌氧发酵培养基的pH控制在6.0～7.0，温度控制在35～37℃，接种量为6～8％。
实施例2
一种复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、植物乳杆菌代谢物的制备:(1)将植物乳杆菌菌种接种到MRS斜面培养基中，35℃静止培养24小时得到复活的植物乳杆菌菌种；(2)将复活的植物乳杆菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(蛋白胨30g，酵母粉10g，葡糖糖30g，无水乙酸钠15g，柠檬酸氢二铵5g，吐温804g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O 0.07g，蒸馏水1L)中，33℃发酵12h，得到二级种子液；(4)液体厌氧发酵：将二级种子液以5％的接种量接种至液体厌氧发酵培养基中，30℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到植物乳杆菌代谢物；
步骤二、乳酸乳球菌代谢物的制备：(1)将乳酸乳球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的乳酸乳球菌菌种；(2)将复活的乳酸乳球菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖10g，甘蔗糖蜜50g，豆粕49.16g，Na2HPO44g，(NH4)2SO43.77g，无水乙酸钠1g，柠檬酸氢二铵0.5g，MgSO4·7H2O0.4g，MnSO4·H2O 0.025g，吐温801g，蒸馏水1L)进行发酵，得到发酵后的菌体；(4)将发酵后的菌体以5％接种至乳酸乳球菌液体厌氧培养基中，28℃厌氧发酵24h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到乳酸乳球菌代谢物；
步骤三、粪肠球菌代谢物的制备：(1)将粪肠球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的粪肠球菌菌种；(2)将复活的粪肠球菌接种至液体MRS培养基中，得一级种子液；(3)将一级种子液以1％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖20g，玉米浆60g，无水乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵6g，NaH2PO43g，吐温801g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，蒸馏水1L)中培养，得到二级种子液；(4)将二级种子液以6％的接种量接种至液体厌氧培养基中，35℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到粪肠球菌代谢物；
步骤四、复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备：将步骤一的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、步骤二的乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和步骤三的粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌按质量比1:2:1混合均匀，得到复合乳酸菌瘤胃调控剂。
步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基由如下按质量分数计的成分组成：甜菜糖蜜5～10％、玉米浆5～10％、磷酸二氢钠0.05～0.15％、无水乙酸钠0.5～1％、硫酸镁0.01～0.15％、硫酸锰0.01～0.15％、吐温800.2～0.5％、余量为水，并调节pH为5.0～6.0。
步骤二中所述的乳酸乳球菌液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜2％～5％、玉米浆5～10％、氯化钠0.1％～0.2％、硫酸镁0.01％～0.05％、硫酸锰0.0025～0.005％、吐温800.1％～0.3％、余量为水，并调节pH为6.5～7.0。
步骤三中所述的液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜5～10％、玉米浆2～4％、磷酸二氢钠0.1～0.2％、无水乙酸钠0.2～0.5％、硫酸锰0.01～0.02％、硫酸镁0.02～0.04％、吐温800.05～0.1％、余量为水，并调节pH为6.0～7.0。
步骤一中的液体厌氧发酵过程中采用适合植物乳杆菌代谢的应激条件，但要同时确保植物乳杆菌的活性，使其在应激条件下产生特定的抗应激代谢产物，培养基的pH控制在5.0～6.0，温度控制在30～33℃，接种量控制在5～10％，培养时间控制在20～36h。
步骤二中的乳酸乳球菌厌氧发酵培养基的pH控制在6.5～7.0，温度控制在28～30℃，接种量为5～10％。
步骤三中的厌氧发酵培养基的pH控制在6.0～7.0，温度控制在35～37℃，接种量为6～8％。
实施例3
一种复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、植物乳杆菌代谢物的制备:(1)将植物乳杆菌菌种接种到MRS斜面培养基中，35℃静止培养24小时得到复活的植物乳杆菌菌种；(2)将复活的植物乳杆菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(蛋白胨30g，酵母粉10g，葡糖糖30g，无水乙酸钠15g，柠檬酸氢二铵5g，吐温804g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O 0.07g，蒸馏水1L)中，33℃发酵12h，得到二级种子液；(4)液体厌氧发酵：将二级种子液以5％的接种量接种至液体厌氧发酵培养基中，30℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到植物乳杆菌代谢物；
步骤二、乳酸乳球菌代谢物的制备：(1)将乳酸乳球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的乳酸乳球菌菌种；(2)将复活的乳酸乳球菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖10g，甘蔗糖蜜50g，豆粕49.16g，Na2HPO44g，(NH4)2SO43.77g，无水乙酸钠1g，柠檬酸氢二铵0.5g，MgSO4·7H2O0.4g，MnSO4·H2O 0.025g，吐温801g，蒸馏水1L)进行发酵，得到发酵后的菌体；(4)将发酵后的菌体以5％接种至乳酸乳球菌液体厌氧培养基中，28℃厌氧发酵24h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到乳酸乳球菌代谢物；
步骤三、粪肠球菌代谢物的制备：(1)将粪肠球菌接种到MRS斜面培养基中，37℃静止培养24小时，得到复活的粪肠球菌菌种；(2)将复活的粪肠球菌接种至液体MRS培养基中，得一级种子液；(3)将一级种子液以1％的量接种至优化后的培养基(葡糖糖20g，玉米浆60g，无水乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵6g，NaH2PO43g，吐温801g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，蒸馏水1L)中培养，得到二级种子液；(4)将二级种子液以6％的接种量接种至液体厌氧培养基中，35℃厌氧发酵16h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到粪肠球菌代谢物；
步骤四、复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备：将步骤一的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、步骤二的乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和步骤三的粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌按质量比1:1:2混合均匀，得到复合乳酸菌瘤胃调控剂。
步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基由如下按质量分数计的成分组成：甜菜糖蜜5～10％、玉米浆5～10％、磷酸二氢钠0.05～0.15％、无水乙酸钠0.5～1％、硫酸镁0.01～0.15％、硫酸锰0.01～0.15％、吐温800.2～0.5％、余量为水，并调节pH为5.0～6.0。
步骤二中所述的乳酸乳球菌液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜2％～5％、玉米浆5～10％、氯化钠0.1％～0.2％、硫酸镁0.01％～0.05％、硫酸锰0.0025～0.005％、吐温800.1％～0.3％、余量为水，并调节pH为6.5～7.0。
步骤三中所述的液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜5～10％、玉米浆2～4％、磷酸二氢钠0.1～0.2％、无水乙酸钠0.2～0.5％、硫酸锰0.01～0.02％、硫酸镁0.02～0.04％、吐温800.05～0.1％、余量为水，并调节pH为6.0～7.0。
步骤一中的液体厌氧发酵过程中采用适合植物乳杆菌代谢的应激条件，但要同时确保植物乳杆菌的活性，使其在应激条件下产生特定的抗应激代谢产物，培养基的pH控制在5.0～6.0，温度控制在30～33℃，接种量控制在5～10％，培养时间控制在20～36h。
步骤二中的乳酸乳球菌厌氧发酵培养基的pH控制在6.5～7.0，温度控制在28～30℃，接种量为5～10％。
步骤三中的厌氧发酵培养基的pH控制在6.0～7.0，温度控制在35～37℃，接种量为6～8％。
产品功效验证
瘤胃体外批次培养
选取六只体况良好，体重相近、安装有永久性瘤胃瘘管的绵羊供采集瘤胃液，采用瘤胃体外批次培养的方法，对照组：添加基础日粮，试验组：在基础日粮中添加经喷雾干燥的不同代谢物产品及其复合产品，试验结果见表1。
表1不同代谢物对绵羊瘤胃内环境参数的影响
对比以上各试验组可以看出，实施例1所得的复合代谢物产品在细菌蛋白和总挥发性脂肪酸方面效果明显，细菌蛋白较对照组提高了22.03％，对总挥发性脂肪酸提高了23.01％。三株菌的配比在今后的工作中有待于进一步的优化组合，从而更大程度上探索该产品的潜力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种复合乳酸菌瘤胃调控剂，其特征在于，由植物乳杆菌代谢物及灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及灭活的乳酸乳球菌、粪肠球菌代谢物及灭活的粪肠球菌组成，所述的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌的质量比为1:1:1、1:2:1 或1:1:2；
复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、植物乳杆菌代谢物的制备:(1) 将植物乳杆菌菌种接种到MRS斜面培养基中，35～37℃静止培养24 小时得到复活的植物乳杆菌菌种；(2) 将复活的植物乳杆菌接种至液体MRS 培养基中培养，得一级种子液；(3)将一级种子液以2 ～ 8％的量接种至优化后的培养基中，33～ 37℃发酵12～24h，得到二级种子液；(4) 液体厌氧发酵：将二级种子液以5～10％的接种量接种至液体厌氧发酵培养基中，30 ～ 33℃厌氧发酵16 ～ 24h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到植物乳杆菌代谢物；
步骤二、乳酸乳球菌代谢物的制备：(1) 将乳酸乳球菌接种到MRS 斜面培养基中，37℃静止培养24 小时，得到复活的乳酸乳球菌菌种；(2) 将复活的乳酸乳球菌接种至液体MRS培养基中培养，得一级种子液；(3) 将一级种子液以2～4％的量接种至优化后的培养基进行发酵，得到发酵后的菌体；(4) 将发酵后的菌体以5～10％接种至乳酸乳球菌液体厌氧培养基中，28～30℃厌氧发酵24～36h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到乳酸乳球菌代谢物；
步骤三、粪肠球菌代谢物的制备：(1) 将粪肠球菌接种到MRS 斜面培养基中，37℃静止培养24 小时，得到复活的粪肠球菌菌种；(2) 将复活的粪肠球菌接种至液体MRS 培养基中，得一级种子液；(3) 将一级种子液以1 ～ 3％的量接种至优化后的培养基中培养，得到二级种子液；(4) 将二级种子液以6～8％的接种量接种至液体厌氧培养基中，35～37℃厌氧发酵16～36h，得厌氧发酵产物，经喷雾干燥处理，得到粪肠球菌代谢物；
步骤四、复合乳酸菌瘤胃调控剂的制备：将步骤一的植物乳杆菌代谢物及其灭活的植物乳杆菌、步骤二的乳酸乳球菌代谢物及其灭活的乳酸乳球菌和步骤三的粪肠球菌代谢物及其灭活的粪肠球菌按质量比1:1:1、1:2:1 或1:1:2 混合均匀，得到复合乳酸菌瘤胃调控剂；
步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基由如下按质量分数计的成分组成：甜菜糖蜜5～10％、玉米浆5～10％、磷酸二氢钠0.05～0.15％、无水乙酸钠0.5～1％、硫酸镁0.01～0.15％、硫酸锰0.01～0.15％、吐温-80 0.2～0.5％、余量为水，并调节pH为5.0～6.0；
步骤一中所述的优化后的培养基由如下成分组成：蛋白胨30g、酵母粉10g、葡萄糖30g、无水乙酸钠15g、柠檬酸氢二铵5g、吐温-80 4g、K2HPO42g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O0.07g、蒸馏水1L；
步骤二中所述的乳酸乳球菌液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜2％～5％、玉米浆5 ～ 10％、氯化钠0.1％～ 0.2％、硫酸镁0.01％～ 0.05％、硫酸锰0.0025 ～0.005％、吐温-80 0.1％～ 0.3％、余量为水，并调节pH 为6.5 ～ 7.0；
步骤二中所述的优化后的培养基由如下成分组成：葡萄糖10g、甘蔗糖蜜50g、豆粕49.16g、
Na2HPO44g、(NH4)2SO43.77g、无水乙酸钠1g、柠檬酸氢二铵0.5g、MgSO4·7H2O 0.4g、MnSO4·H2O 0.025g、吐温-80 1g、蒸馏水1L；
步骤三中所述的液体厌氧培养基由如下按质量分数计的成分组成：甘蔗糖蜜5 ～10％、玉米浆2 ～4％、磷酸二氢钠0.1 ～ 0.2％、无水乙酸钠0.2 ～ 0.5％、硫酸锰0.01～ 0.02％、硫酸镁0.02 ～ 0.04％、吐温-80 0.05 ～ 0.1％、余量为水，并调节pH 为6.0～ 7.0；
步骤三中所述的优化后的培养基由如下成分组成：葡萄糖20g、玉米浆60g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵6g、NaH2PO43g、吐温-80 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、蒸馏水1L。
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