CN104673867A - 模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽 - Google Patents

模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽 Download PDF

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刘妍妍
王宪青
张丽萍
刁静静
王雪
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Abstract

本发明的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，涉及生物技术领域，其生产步骤包括预处理、酶解、分离和纯化四个步骤，并在纯化步骤中利用模拟移动色谱分离法，对分离后的粗乳清蛋白肽进行工业化生产，得到乳清蛋白抗氧化肽。此生产方法自动化程度高、减少吸附剂及水的浪费与污染、提取效率高，既提高了乳清蛋白的利用率，又获得了高活性抗氧化肽；通过本发明制得的乳清蛋白抗氧化肽、其DPPH自由基清除活性IC50值为1.8mg/mL，羟自由基清除活性IC50为110μg/mL；且该方法生产成本低，便于工业化生产；所获得抗氧化肽产品安全、无毒副作用、抗氧化活性高、质量稳定，可广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。

Description

模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽。
背景技术
乳清是生产干酪、干酪素的主要副产物，一般每生产1 kg干酪可得到8～9 kg乳清。但其利用率仅占50 %左右，其余乳清均作为饲料或者直接作为废水排放掉，这样不仅浪费了宝贵的食物资源，同时也造成了严重的环境污染。乳清蛋白容易消化，具有很高代谢效率和生物利用效价，近年来的研究表明在乳清蛋白多肽链内部可能普遍存在着功能区，蕴藏着许多生物活性肽，通过蛋白酶水解释放出来即可在体内发挥特定的生理功能。人类的衰老与人体代谢所产生的氧化物有关，特别是自由基的产生，它会产生许多对人体及细胞的不良影响，引起脂质氧化反应从而生成对人体有害的难以降解的脂褐素，攻击生命大分子物质，破坏细胞内DNA、蛋白质以及细胞膜，诱导细胞凋亡，加速人体衰老。同时，自由基过多，也会诱发一系列疾病，如老年痴呆症、脑血栓、动脉粥样硬化和癌症等。因此，探寻能有效清除自由基的物质成分非常有必要。
天然蛋白来源的抗氧化肽因其分子量小、易吸收、清除自由基活性强、安全性高等特点，在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面有广阔的应用前景。但目前抗氧化肽的分离纯化过程一般较繁琐，成本较高，不能满足大规模生产的需求。
发明内容
本发明对于上述现有技术的不足，提供了一种模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽。
本发明的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份乳清蛋白粉与10～35份水混合，在95℃下恒温5min后，降温至45℃～60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.005～0.02份，同时用NaOH溶液维持系统的pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌2.0～6.0h后，再加入胰蛋白酶0.005～0.02份，仍维持反应液pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌1.0h～3.0h，然后升温至85℃～100℃，保持10min～15min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%～25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；
以上均为质量份数。
作为本发明的进一步优化，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份乳清蛋白粉与20～30份水混合，在95℃下保持5min后，降温至45℃～60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.01～0.015份，同时NaOH溶液维持系统的pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌3.0～5.0h后，再加入胰蛋白酶0.01～0.015份，仍维持反应液pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌2.0h～3.0h，然后升温至85℃～100℃，保持10min～15min，制得乳清蛋白酶解液；
 c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
 d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%～25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；
以上均为质量份数。
作为本发明的进一步改进，所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为大孔吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15～20BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20～30BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15～25BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%～4%、其控制流量为3～9BV/h；全程切换时间为300～700s、温度控制在25～60℃、压力控制为0.3～1.0MPa。
作为本发明的进一步改进，所述的乳清蛋白为食品级。
作为本发明的进一步改进，所述的大孔吸附树脂为XAD16N吸附树脂、XAD18吸附树脂或XAD1600N吸附树脂。
本发明的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，自动化程度高、减少吸附剂及水的浪费与污染、提取效率高，既提高了乳清蛋白的利用率，又获得了高活性抗氧化肽；通过本发明制得的乳清蛋白抗氧化肽其DPPH自由基清除活性IC50值为1.8mg/mL，羟自由基清除活性IC50为110μg/mL，产品的质量百分比浓度为5～20%，通过高效液相色谱检测，其纯度为70～90%；由解吸样品量除以进样量得出，其产品收率可达到95%；且该方法生产成本低，便于工业化生产；所获得抗氧化肽产品安全、无毒副作用、抗氧化活性高、质量稳定，可广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。
具体实施方式
实施例1
模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份食品级乳清蛋白粉与10份水混合，在95℃下恒温5min后，降温至45℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.005份，同时用NaOH溶液维持系统的pH为7.0，在45℃的条件下搅拌2.0h后，再加入胰蛋白酶0.005份，仍维持反应液pH为7.0，在45℃的条件下搅拌1.0h，然后升温至85℃，保持10min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为XAD16N吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%、其控制流量为3BV/h；全程切换时间为300s、温度控制在25℃、压力控制为0.3MPa；
以上均为质量份数。
实施例2
模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份食品级乳清蛋白粉与35份水混合，在95℃下恒温5min后，降温至60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.02份，同时用NaOH溶液维持系统的pH为8.5，在60℃的条件下搅拌6.0h后，再加入胰蛋白酶0.02份，仍维持反应液pH为8.5，在60℃的条件下搅拌3.0h，然后升温至100℃，保持15min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为XAD18吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为20BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为30BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为25BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为4%、其控制流量为9BV/h；全程切换时间为700s、温度控制在60℃、压力控制为1.0MPa；
以上均为质量份数。
实施例3
模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份乳清蛋白粉与20份水混合，在95℃下保持5min后，降温至45℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.01份，同时NaOH溶液维持系统的pH为7.5，在45℃的条件下搅拌3.0h后，再加入胰蛋白酶0.01份，仍维持反应液pH为7.5，在45℃的条件下搅拌2.0hh，然后升温至85℃，保持10min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为XAD1600N吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%、其控制流量为3BV/h；全程切换时间为300s、温度控制在25℃、压力控制为0.3MPa；
以上均为质量份数。
实施例4
模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份食品级乳清蛋白粉与30份水混合，在95℃下保持5min后，降温至60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.015份，同时NaOH溶液维持系统的pH为8.5，在60℃的条件下搅拌5.0h后，再加入胰蛋白酶0.015份，仍维持反应液pH为8.5，在60℃的条件下搅拌3.0h，然后升温至100℃，保持15min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为XAD16N吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15～20BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20～30BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15～25BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%～4%、其控制流量为3～9BV/h；全程切换时间为300～700s、温度控制在25～60℃、压力控制为0.3～1.0MPa；
以上均为质量份数。
实施例5
模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份食品级乳清蛋白粉与25份水混合，在95℃下保持5min后，降温至45℃～60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至8，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.015份，同时NaOH溶液维持系统的pH为8.0，在45℃的条件下搅拌5.0h后，再加入胰蛋白酶0.015份，仍维持反应液pH为8.0，在45℃的条件下搅拌2.0h，然后升温至95℃，保持10min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为15%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为XAD18吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15～20BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20～30BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15～25BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%～4%、其控制流量为3～9BV/h；全程切换时间为300～700s、温度控制在25～60℃、压力控制为0.3～1.0MPa；
以上均为质量份数。
以上实施例中所用的食品级乳清蛋白为澳大利亚迈高公司生产，其蛋白含量为82%；胰蛋白酶是由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键，本申请中所用的胰蛋白酶是由上海雅心生物科技有限公司生产，其酶活力为200万U/g；碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，催化部位为丝氨酸，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，本申请选用的碱性蛋白酶是由南宁庞博生物工程有限公司生产，其酶活力为60万U/g；使用的XAD16N吸附树脂、XAD18吸附树脂或XAD1600N吸附树脂，为北京赛福莱博科技有限公司生产。

Claims (5)

1.模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份乳清蛋白粉与10～35份水混合，在95℃下恒温5min后，降温至45℃～60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.005～0.02份，同时用NaOH溶液维持系统的pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌2.0～6.0h后，再加入胰蛋白酶0.005～0.02份，仍维持反应液pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌1.0h～3.0h，然后升温至85℃～100℃，保持10min～15min，制得乳清蛋白酶解液；
c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%～25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；
以上均为质量份数。
2.如权利要求1所述的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，作为进一步优化，其操作步骤如下：
a、预处理：将1份乳清蛋白粉与20～30份水混合，在95℃下保持5min后，降温至45℃～60℃，用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～8.5，制成乳清蛋白溶液；
b、酶解：在a步骤制得的乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶0.01～0.015份，同时NaOH溶液维持系统的pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌3.0～5.0h后，再加入胰蛋白酶0.01～0.015份，仍维持反应液pH为7.0～8.5，在45℃～60℃的条件下搅拌2.0h～3.0h，然后升温至85℃～100℃，保持10min～15min，制得乳清蛋白酶解液；
     c、分离：去除b步骤制得的乳清蛋白酶解液中的固体物质，收集酶解液中分子量小于1000Da的滤液，制得粗乳清蛋白肽；
     d、纯化：将粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其质量百分比浓度为5%～25%，用模拟移动床连续吸附进行分离纯化，然后将吸附液进行喷雾干燥，即制得乳清蛋白抗氧化肽；
     以上均为质量份数。
3.如权利要求1所述的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其特征在于所述的模拟移动床连续吸附分离，其吸附剂为大孔吸附树脂、吸附原料为粗乳清蛋白肽用水调制成混合液、其控制流量为15～20BV/h；解析剂为乙醇溶液、其质量百分浓度为90%、其控制流量为20～30BV/h；冲洗剂为去离子水、其控制流量为15～25BV/h；吸附树脂的再生剂是NaOH溶液、其质量百分浓度为2%～4%、其控制流量为3～9BV/h；全程切换时间为300～700s、温度控制在25～60℃、压力控制为0.3～1.0MPa。
4.如权利要求1所述的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其特征在于所述乳清蛋白为食品级。
5.如权利要求1所述的模拟移动色谱分离法制乳清蛋白抗氧化肽，其特征在于所述的大孔吸附树脂为XAD16N吸附树脂、XAD18吸附树脂或XAD1600N吸附树脂。
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