CN104666294A

CN104666294A - 表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物在治疗白癜风中的应用

Info

Publication number: CN104666294A
Application number: CN201510056311.4A
Authority: CN
Inventors: 许爱娥; 王遂泉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: CN104666294B

Abstract

本发明的内容主要是对多羟基，具有很好水溶性，生物利用度低的表没食子儿茶素没食子酸酯进行脂溶性改造，包括用不同酸酐封住羟基，降低其水溶性，利用不同脂溶性链的酰氯进行酯化反应降低其水溶性以及减少其羟基个数三种方法。获得的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物经检测后，其中的全乙酰化衍生物和全丙酰化衍生物在防治白癜风的作用方面要明显优于表没食子儿茶素没食子酸酯前体。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物在治疗白癜风中的应用

技术领域

本发明属于化合物用途领域，具体是一种表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物在治疗白癜风中的用途。

背景技术

白癜风是一种色素缺失性皮肤病，其临床表现为局部或泛发性皮肤色素脱失。面颈部等暴露部位的白斑给患者造成了毁容性损害，严重的影响患者的身心健康。目前研究认为，该病是一种自身免疫性疾病，CD8+毒性T淋巴细胞对黑素细胞的特异性杀伤是造成表皮黑素细胞缺失的重要原因。另外白癜风皮损区局部存在过氧化氢等活性氧浓度的升高。高浓度过氧化氢除对黑素细胞有直接的杀伤作用，还能影响黑素细胞的抗原递呈，促进针对黑素细胞的自体免疫反应。因此抗氧化和抑制CD8+毒性T淋巴细胞活性是治疗白癜风的关键因素。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶中分离得到的儿茶素类单体，茶多酚中重要的抗氧化物质。EGCG具有抗菌保鲜，抗肿瘤，抗病毒，延缓皮肤衰老等作用。EGCG广泛用于食品，医药以及日化产品中。EGCG具有抑制淋巴细胞增殖和迁移，保护皮肤黑色素细胞免受氧化损伤的功效，能用于临床治疗白癜风。EGCG本身的多羟基结构导致在环境下不稳定，羟基容易被氧化，导致抗氧化能力下降。同时EGCG水溶性很好，透过细胞膜的能力较差，生物利用度低，给应用带来了困难。为了克服EGCG的这些缺点，本发明通过对 EGCG进行脂溶性改造，提高其透过细胞膜的能力和稳定性，从而提高EGCG对白癜风的治疗效果。

发明内容

表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物在治疗白癜风中的用途。

所述表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物是全乙酰化衍生物。

所述表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物是全丙酰化衍生物。

所述全乙酰化衍生物的合成方法如下：将EGCG溶于乙酸乙酯中，加入三乙胺，随后慢慢滴加醋酸酐，反应过夜，待反应完成后，用水，稀盐酸，饱和NaHCO₃分别洗反应液3次，加入无水Na₂SO₄干燥，减压回收溶剂，乙醇重结晶得白色固体。

所述全丙酰化衍生物的合成方法如下：将EGCG溶于乙酸乙酯中，加入三乙胺，随后慢慢滴加丙酸酐，反应过夜，待反应完成后，用水，稀盐酸，饱和NaHCO₃分别洗反应液3次，加入无水Na₂SO₄干燥，减压回收溶剂，乙醇重结晶得白色固体。

本发明可明显提高EGCG的抗氧化功能并明显抑制CD8+T细胞的活化增殖，在防治白癜风的作用方面要明显优于表没食子儿茶素没食子酸酯前体。

附图说明

图1是本发明实验例1的结果示意图；

图2是本发明实验例2的结果示意图；

图3是本发明实验例3的结果示意图；

图4是本发明实验例4的结果示意图。

具体实施方式

实施例1

全酰基化EGCG的合成

1.化合物A₁(全乙酰化)的合成：

将115mg化合物1(EGCG)溶于乙酸乙酯中，加入200mg三乙胺，随后慢慢滴加250mg醋酸酐，反应过夜。待反应完成后，用10ml水，10ml稀盐酸，10ml饱和NaHCO₃分别洗反应液3次，加入无水Na₂SO₄干燥，减压回收溶剂，乙醇重结晶得白色固体192mg，收率：95％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.62(s,2H),7.23(s,2H),6.73(d,J＝2.2Hz,1H),6.60(d,J＝2.3Hz,1H),5.63(d,J＝1.5Hz,1H),5.17(s,1H),3.02(qd,J＝17.9,3.5Hz,2H),2.31–2.22(m,24H).

2.化合物A₂(全丙酰化)的合成：

操作过程和化合物A₁的合成相同，只是把乙酸酐换成丙酸酐，得白色固体，收率：93％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.63(s,2H),7.25(s,2H),6.76(d,J＝2.3Hz,1H),6.64(d,J＝2.3Hz,1H),5.71–5.66(m,1H),5.20(s,1H),3.04(ddd,J＝20.1,17.9,3.5Hz,2H),2.61–2.50(m,16H),1.29–1.21(m,24H).

3.化合物A₃(全丁酰化)的合成：

操作过程和化合物A1的合成相同，只是把乙酸酐换成丁酸酐，得白色固体，收率：90％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.59(s,2H),7.21(s,2H),6.73(d,J＝2.1Hz,1H),6.60(d,J＝2.1Hz,1H),5.67(s,1H),5.18(s,1H),3.02(dt,J＝29.3,10.4Hz,2H),2.70–2.28(m,16H),1.96–1.64(m,16H),1.13–0.81(m,24H).

实施例2

部分酰基化EGCG的合成

表1：部分酰基化EGCG的合成的转化率

具体实施过程：

将2gEGCG溶于乙酸乙酯中，加入一定量K₂CO₃固体，随后慢慢滴加不同当量的不同酰氯(1～6当量)，反应5小时后，TLC板监测新点，随后用20ml水，20ml稀盐酸，20ml饱和NaHCO₃分别洗反应液3次，无水Na₂SO₄干燥，减压回收溶剂，过硅胶柱，分出不同新点，用¹H NMR标定转化率。

实施例3

基于EGCG改造不同数目羟基及不同数目羟基全乙酰化和全丙酰化的合成

具体实施过程：

1.化合物4的合成：

将化合物2(7.24mmoL)、KOH(15.93mmoL)、和溴化苄(10.86mmoL)溶解在乙醇(20mL)，和水(2.2mL)中，加热回流20h。再加入20％的KOH水溶液，混合物再加热回流4h，反应混合物冷却，加水，用2N盐酸酸化，抽滤，得到固体用乙醇重结晶得到化合物3，白色固体，收率70％-80％。

化合物3-2(R₂＝4-OBn)：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.64(s,1H),7.90(d,J＝8.8Hz,2H),7.40(ddd,J＝23.7,17.2,7.2Hz,5H),7.10(d,J＝8.8Hz,2H),5.18(s,2H).

化合物3-3(R₃＝3,4-diOBn):¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.55(d,J＝7.3Hz,2H),7.51–7.29(m,10H),7.16(d,J＝8.6Hz,1H),5.17(dd,J＝25.1,12.4Hz,4H).

将化合物3(300mg,1.32mmoL)加入到5mL二氯亚砜中，滴加2滴DMF,加热回流2h，反应完全，旋干得到淡黄色固体化合物4，马上用于下一步反应。

2.化合物5的合成：

将化合物1溶解在无水DMF中，加入20倍当量的碳酸钾，向反应体系中逐滴加入12倍溴化苄，常温下反应48小时。待反应完全后，将碳酸钾抽滤除去，用乙酸乙酯溶解滤液，并用水萃取除去剩余碳酸钾和DMF。减压旋干，过柱得到产物，再经乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色固体。

3.化合物6的合成

将化合物5溶解在甲醇(2mL)和乙二醇甲醚(2mL)内，加入碳酸钾，室温反应1h。待反应完全时，减压回收溶剂，乙酸乙酯/石油醚过柱纯化，得到淡黄色半油状固体，经LC-MS确证[M+H⁺]＝757.

4.化合物7的合成：

将化合物7溶解于无水二氯甲烷内，加入4倍当量的DMAP,并将上步的酰氯溶解在无水二氯甲烷内，在冰浴条件下注射进入反应体系，反应过夜。待反应完全，用1N盐酸洗反应液3次，饱和碳酸氢钠洗3次，饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干，过柱，得到淡黄色固体，经LC-MS确证后直接进行下一步脱苄反应。

5.化合物C1-C3的合成：

将上述得到苄基保护化合物，在甲醇体系下，加入Pd/C，经氢气还原得到化合物C1-C3。

C1:¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.29(s,1H),9.12–8.98(m,1H),8.79(d,J＝13.9Hz,2H),8.00(d,J＝13.6Hz,1H),7.90–7.41(m,4H),5.88(d,J＝32.9Hz,1H),5.02(s,1H),2.99(dd,J＝17.5,4.3Hz,1H),2.75(d,J＝16.8Hz,1H).

C2:¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.30(d,J＝10.9Hz,1H),9.10–8.98(m,1H),8.84–8.70(m,2H),7.75–7.63(m,2H),6.84–6.75(m,2H),5.40–5.27(m,1H),5.00(s,1H),2.94(dt,J＝28.4,14.3Hz,1H),2.72(d,J＝15.8Hz,1H).

C3:¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.33(dd,J＝7.1,1.9Hz,2H),6.80–6.72(m,1H),6.53(d,J＝4.7Hz,2H),5.97(ddd,J＝14.4,8.9,2.3Hz,2H),5.53(dd,J＝9.7,8.1Hz,1H),5.00(s,1H),3.01(dd,J＝17.3,4.6Hz,1H),2.94–2.81(m,1H).

随后对基于EGCG改造的不同羟基个数化合物C1-C3进行全乙酰化和全丙酰化修饰。

具体实施过程：

化合物C4-1的合成：

将化合物C1溶于乙酸乙酯中，加入三乙胺，然后慢慢滴加5.5倍当量乙酸酐，常温反应过夜。待反应完全后，用10ml水，10ml稀盐酸，10ml饱和NaHCO3分别洗反应液3次，加入无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，过柱得白色固体，收率：94％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.71(t,J＝11.5Hz,2H),7.56(dt,J＝31.5,9.1Hz,1H),7.56–7.34(m,3H),7.37–7.07(m,1H),6.91–6.59(m,2H),5.76–5.38(m,2H),3.15(dd,J＝17.7,4.1Hz,1H),2.94(d,J＝17.6Hz,1H),2.65–2.06(m,15H).

化合物C4-2的合成：

同化合物C4-1的合成过程，只是把乙酸酐换成丙酸酐，过柱得白色固体，收率：89％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.20–7.33(m,7H),6.81(s,1H),6.63(dd,J＝18.1,6.0Hz,1H),5.60(d,J＝36.4Hz,2H),3.23–3.07(m,1H),2.93(d,J＝17.6Hz,1H),2.76–2.39(m,10H),1.41–0.77(m,15H).

具体实施过程：

化合物C5-1的合成：

同化合物C4-1的合成过程，只是把5.5倍当量乙酸酐换成6.5倍乙酸酐，过柱得白色固体，收率：84％。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.86–7.73(m,2H),7.41(s,2H),7.28–7.16(m,2H),6.73(dd,J＝74.0,2.2Hz,2H),5.61(d,J＝40.6Hz,2H),3.16(dd,J＝17.7,4.3Hz,1H),2.95(d,J＝16.8Hz,1H),2.39–2.15(m,18H).

化合物C5-2的合成：

同化合物C5-1的合成，只是把乙酸酐换成丙酸酐，过柱得白色固体，收率：92％。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.85–7.75(m,2H),7.40(s,2H),7.26–7.17(m,2H),6.81(d,J＝2.2Hz,1H),6.66(d,J＝2.2Hz,1H),5.65(s,1H),5.56(s,1H),3.15(dd,J＝17.7,4.3Hz,1H),2.95(d,J＝16.9Hz,1H),2.69–2.53(m,12H),1.24–1.03(m,18H).

具体实施过程：

化合物C6-1的合成：

同化合物C4-1的合成过程，只是把5.5倍当量乙酸酐换成7.5倍乙酸酐，过柱得白色固体，收率：90％。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.67(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.61(d,J＝1.8Hz,1H),7.41(s,2H),7.36(d,J＝8.5Hz,1H),6.80(d,J＝2.1Hz,1H),6.68(t,J＝13.3Hz,1H),5.64(s,1H),5.56(s,1H),3.16(dd,J＝17.8,4.2Hz,1H),2.96(d,J＝17.4Hz,1H),2.47–2.03(m,21H).

化合物C6-2的合成：

同化合物C6‐1的合成过程，只是把乙酸酐换成丙酸酐。

实验例1

表没食子儿茶素没食子酸酯，H₂O₂：美国Sigma公司；

胎牛血清，0.25％胰酶-EDTA，PBS：美国Life Technologies公司；

RMPI-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；

MTS细胞活性检测试剂盒：Promega公司；

CO2培养箱：美国Thermo scientific公司；

Spectramax 190酶标仪：美国Molecular Devices公司；

细胞培养板：美国corning公司；

实验步骤：

1)消化正常人原代培养的黑色素细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，96孔板中每孔加100μL(每孔含10⁴个黑素细胞)，37℃、5％CO2培养24h后进行下一步试验

2)分组:空白对照；H₂O₂阳性对照；10μM、20μM、40μM药物处理组

3)用含不同浓度药物的培养基预处理黑素细胞，1h后，吸弃含药培养基

4)每孔加含1mM H₂O₂的无血清培养基，处理1h后吸弃上清

5)细胞用培养基洗涤三次，加入新鲜培养基，继续培养24h

6)每孔加入20μL MTS溶液，37℃孵育1-4h后用酶标仪在490nm波长处检测A值。设定空白对照组细胞活性为100％，计算各处理组细胞的相对活性。

实验结果：EGCG经羟基修饰后的衍生物，抗氧化能力较EGCG明显提高。其中全乙酰化衍生物(A1)抗氧化作用最强，全丙酰化衍生物(A2)作用稍弱，全丁酰化衍生物(A3)作用与EGCG单体相似。部分酯化的各种衍生物其抗氧化活性较包含同样取代基团的全酯化产物弱(图1A-D)。

实验例2：

表没食子儿茶素没食子酸酯，H₂O₂：美国Sigma公司；

胎牛血清，0.25％胰酶-EDTA，PBS：美国Life Technologies公司；

RMPI-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；

乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒：Promega公司；

CO2培养箱：美国Thermo scientific公司；

Spectramax 190酶标仪：美国Molecular Devices公司；

细胞培养板：美国corning公司；

实验步骤：

5)用含不同浓度EGCG、A1、A2或A3的培养基预处理黑素细胞，1h后，吸弃含药培养基

6)每孔加含1mM H₂O₂的无血清培养基，处理1h后吸弃上清

5)细胞用培养基洗涤三次，加入新鲜培养基，继续培养24h

6)取细胞培养上清每孔各50μL，加入50μL底物，室温反应10-30min，加入50μL终止液终止反应。用酶标仪在490nm波长处检测A值。设定空白对照组LDH释放量为1，计算各处理组细胞的LDH相对释放量。

实验结果：EGCG经羟基修饰后的全乙酰化衍生物(A1)，抑制H2O2造成的黑素细胞LDH释放作用较EGCG显著增强。全丙酰化衍生物(A2)作用稍弱，全丁酰化衍生物(A3)作用与EGCG单体相似。(图2)。

实验例3：

表没食子儿茶素没食子酸酯，IBMX,CT，H₂O₂：美国Sigma公司；

F12培养基，胎牛血清，0.25％胰酶-EDTA，PBS，DCFH-DA：美国Life Technologies公司；

bFGF：美国Peprotech公司；

CO2培养箱：美国Thermo scientific公司；

流式细胞仪：美国BD Biosciences公司

细胞培养板：美国corning公司；

实验步骤：

(1)消化正常人原代培养的黑色素细胞，6孔板中每孔加3x 10⁵个黑素细胞，37℃、5％CO2培养24h后进行下一步试验

(2)用含40μM EGCG、A1、A2或A3的培养基预处理黑素细胞0.5h,1h,2h或4h，然后吸弃含药培养基

(3)每孔加含10μM DCFH-DA的无血清培养基，37℃温箱孵育20min，去除培养液，PBS洗涤3次

(4)加入含1mM H2O2的无血清培养基处理30min，PBS洗三次

(5)胰酶消化细胞，流式细胞仪检测荧光强度。设定空白对照组细胞内ROS水平为1，计算各处理组细胞的相对ROS

实验结果：EGCG经羟基修饰后的全乙酰化衍生物(A1)，显著抑制H2O2处理后黑素细胞内的ROS水平显著升高。全丙酰化衍生物(A2)作用稍弱，全丁酰化衍生物(A3)作用与EGCG单体相似。(图3)。

实验例4：

实验动物：

C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，体质量(20±2)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司；

实验药品：

表没食子儿茶素没食子酸酯：美国Sigma公司，用水溶解；

胎牛血清：美国Life Technologies公司；

IL-2：美国Life Technologies公司；

PBS：美国Life Technologies公司；

RMPI-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；

红细胞裂解液：美国Life Technologies公司；

CD8+T细胞分离试剂盒：德国Miltenyl公司；

CD3、CD28单抗：美国eBioscience公司；

MTS细胞活性检测试剂盒：Promega公司；

CO₂培养箱：美国Thermo公司；

Spectramax 190酶标仪：美国Molecular Devices公司；

细胞培养板：美国corning公司；

实验步骤：

(1)小鼠脾脏单细胞悬液制备

颈髓脱臼处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏，置于盛有适量无菌PBS平皿中，用注射器将脾脏碾碎，制成单细胞悬液，室温1600rpm离心5分钟，弃上清加入3倍细胞体积的红细胞裂解液，混匀后裂解30秒，再用PBS洗3次，弃上清。

(2)CD8+T淋巴细胞分离培养

参照德国美天旎生物技术有限公司小鼠脾脏CD8+T细胞分离说明书操作。每1×10⁷小鼠脾脏单细胞用40ul分离缓冲液(含PBS pH 7.2，0.5％胎牛血清和2mM EDTA)重悬，加入10ul CD8+T细胞Biotin-Antibody Cocktail后于4度孵育10分钟，再加入30ul分离缓冲液和20ul Anti-Biotin MicroBeads，4度孵育15分钟，加入2ml分离缓冲液，1600rpm 10min离心，弃上清。用500ul分离缓冲液重悬细胞，通过磁力分选柱分离出CD8+T细胞，细胞计数板计数。

(3)CD8+T细胞增殖及药物干预

384孔板预先用5ug/ml CD3抗体4度包被过夜，PBS洗三次，每孔中加入3×10⁴CD8+T细胞，1ug/ml CD28抗体，30U/ml IL-2及不同浓度的EGCG及EGCG衍生物，总体积50ul。每组做3个复孔。培养48小时后将细胞转移至96孔板中，每孔补加200ul RPMI-1640培养基，继续培养72小时后，每孔加入20ulMTS溶液，37度孵育4小时，用酶标仪在490nm波长处检测A值。以未用CD3/CD28抗体激活的细胞作为阴性对照，单纯用CD3/CD28抗体激活的细胞作为阳性对照，结果见图2。

淋巴细胞相对增殖率(％)＝A_样品-A_阴性对照)/(A_阳性对照-A_阴性对照)]×100％。

实验结果：

由图4可见，EGCG从2uM开始对CD8+T细胞的活化增殖出现抑制，IC50约为6uM，在20uM时的抑制作用达到100％。A1衍生物(全乙酰化)IC50约为1.2uM，在6uM时抑制作用达到100％。A2衍生物(全丙酰化)IC50约为 1.8uM，在20uM时的抑制作用达到100％。A3衍生物(全丁酰化)的作用与EGCG基本一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物在治疗白癜风中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物是全乙酰化衍生物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物是全丙酰化衍生物。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述全乙酰化衍生物的合成方法如下：将EGCG溶于乙酸乙酯中，加入三乙胺，随后慢慢滴加醋酸酐，反应过夜，待反应完成后，用水，稀盐酸，饱和NaHCO3分别洗反应液3次，加入无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，乙醇重结晶得白色固体。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述全丙酰化衍生物的合成方法如下：将EGCG溶于乙酸乙酯中，加入三乙胺，随后慢慢滴加丙酸酐，反应过夜，待反应完成后，用水，稀盐酸，饱和NaHCO3分别洗反应液3次，加入无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，乙醇重结晶得白色固体。