IT201900019190A1 - Derivato dell’epigallocatechina gallato - Google Patents
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Description
Descrizione di Brevetto per Invenzione Industriale avente per titolo:
“DERIVATO DELL’EPIGALLOCATECHINA GALLATO”.
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un derivato dell’Epigallocatechina gallato.
L’Epigallocatechina gallato (EGCG) è una catechina di origine naturale, estratta dalle foglie del tè verde.
È nota l’efficacia di tale molecola nei processi di inibizione delle specie radicaliche.
Tuttavia, la presenza di otto gruppi ossidrilici rende la struttura molecolare di EGCG estremamente polare e ne limita l’impiego all’interno di sistemi lipofili, come oli, grassi, formulazioni cosmetiche e compartimenti biologici in generale.
A ciò si aggiunge che la ridotta solubilità dell’EGCG nei sistemi lipofili incide anche sull’assorbimento in vivo e sulla biodisponibilità della molecola stessa che, quando somministrata oralmente, viene dispersa senza raggiungere i siti d’azione.
Per ovviare almeno in parte ai suddetti inconvenienti sono state messe a punto numerose metodiche di derivatizzazione descritte nei documenti brevettuali CN104666294, WO2011123942, CN104940191, WO2016118907, EP2425814 e KR20050034931.
Tuttavia, i metodi di derivatizzazione proposti dai suddetti documenti permettono di ottenere derivati dell’EGCG di tipo estereo e, pertanto, più soggetti a degradazione.
A questo proposito, è particolarmente sentita l’esigenza di ottenere derivati stabili nel tempo in grado di interagire efficacemente con sistemi lipidici, consentendone l’impiego in formulazioni farmaceutiche, cosmetiche e nutraceutiche.
Il compito principale della presente invenzione è quello di escogitare un derivato dell’Epigallocatechica gallato in grado di interagire efficacemente con sistemi lipidici.
Altro scopo del presente trovato è quello di escogitare un derivato dell’Epigallocatechina gallato che consenta di internalizzare massimizzare l’effetto antiossidante nelle cellule e nel bilayer lipidico della membrana cellulare.
Ancora uno scopo del presente trovato è quello di escogitare un derivato dell’Epigallocatechina gallato che consenta di migliorarne la biodisponibilità e l’efficacia come antiossidante rispetto ai derivati noti. Altro scopo del presente trovato è quello di escogitare un derivato dell’Epigallocatechina gallato che consenta di superare i menzionati inconvenienti della tecnica nota nell’ambito di una soluzione semplice, razionale, di facile ed efficace impiego e dal costo contenuto.
Gli scopi sopra esposti sono raggiunti dal presente derivato dell’Epigallocatechina gallato avente le caratteristiche di rivendicazione 1. Altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione di una forma di esecuzione preferita, ma non esclusiva, di un derivato dell’Epigallocatechina gallato, illustrata a titolo indicativo, ma non limitativo, nelle unite tavole di disegni in cui:
la figura 1 è un grafico rappresentativo della valutazione della minore tossicità del derivato EGCG-C18 rispetto a EGCG;
la figura 2 è un grafico rappresentativo della valutazione dell’attività protettiva del derivato secondo il trovato sulle cellule ARPE-19;
la figura 3 è un grafico rappresentativo dell’attività antitumorale del derivato secondo il trovato.
Il presente trovato riguarda un derivato dell’Epigallocatechina gallato (EGCG).
La richiedente ha sorprendentemente dimostrato che il nuovo derivato dell’EGCG esibisce elevata solubilità nei sistemi lipidici.
Oggetto della presente invenzione è il composto di formula I:
in cui R1, R2, R3, R4, R5, R6 rappresentano indipendentemente tra loro uno o più gruppi scelti tra un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico C1-C18. Preferibilmente, uno tra R1, R2, R3, R4, R5, R6 è un gruppo alchilico C1-C18 e gli altri sono idrogeno.
In accordo con una preferita forma di realizzazione del composto in accordo con il presente trovato, R2 è un gruppo alchilico C1-C18 e gli altri sono idrogeno (formula II).
Formula II – EGCG-C18
Inoltre, il presente trovato riguarda composizioni farmaceutiche, cosmetiche o nutraceutiche comprendenti il composto di formula I per il trasporto di antiossidanti all’interno di matrici lipidiche.
Nel dettaglio, in accordo con una preferita forma di realizzazione, le suddette composizioni farmaceutiche, cosmetiche o nutraceutiche comprendono il composto di formula II.
A questo proposito, si specifica che il presente trovato riguarda anche l’uso del composto di formula I in composizioni liposomiali.
Preferibilmente, il presente trovato riguarda l’uso del composto di formula II in composizioni liposomiali.
Infine, il presente trovato riguarda il procedimento di preparazione del composto che è un derivato del composto di formula I, dove la derivatizzazione è condotta mediante la formazione di un legame etereo in posizione 4’’.
Nel dettaglio, EGCG-C18 è stato ottenuto utilizzando la reazione di sintesi degli eteri di Williamson.
La reazione è stata allestita con una soluzione di EGCG (700 mg, 1.5 mmol) e K2CO3 (210 mg, 1.5 mmol) in dimetilformammide anidra (DMF) a cui è stato aggiunto lentamente ottadecil ioduro (578 mg, 1.5 mmol) in cicloesano. La reazione è stata mantenuta in atmosfera inerte.
La miscela di reazione così ottenuta è stata riscaldata ad una temperatura di lavoro sostanzialmente pari a 40°C per 8 ore.
Si specifica che, salvo diversamente indicato, termini quali “sostanzialmente” o "circa", quando usati in associazione ad un valore numerico, significa che il valore dovrebbe essere considerato come comprendente l'errore (ad es., errore standard) associato all’ottenimento o alla derivazione di esso.
Successivamente, si è aggiunta acqua alla miscela di reazione e si è sottoposto quest’ultima a liofilizzazione.
Il grezzo di reazione così ottenuto è stato quindi purificato per cromatografia su gel di silice (cicloesano-EtOAc, 75:25) per isolare EGCG-C18 (560 mg, 53%).
Si riportano qui di seguito i valori di chemical shifts ottenuti dall’analisi NMR del grezzo di reazione così ottenuto.
1H NMR (acetone, 400 MHz): δ = 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 1.28 (m, 30H), 1.40 (m, 1H), 1.72 (m, 1H), 2.97 (dd, J=2.4, J=13.9), 3.03 (dd, J=3.9, J=13.9), 4.09 (m,2H), 5.07 (m, 1H), 5.42 (m,1H), 6.03 (m, 2H), 6.66(s, 2H), 7.05 (s, 2H).
13C NMR (acetone, 100 MHz): δ = 14.4, 23.4, 26.6, 32.7, 70.2, 73.3, 78.3, 95.0, 95.9, 96.5, 98.9, 106.8, 109.9, 126.2, 130.5, 133.5, 139.6, 146.6, 151.4, 157.1, 157.5, 157.9, 166.3.
Tali valori, confermano la presenza della catena alifatica C1-C18 all’interno della molecola di formula I.
Lo spettro <1>HNMR dell’EGCG-C18 è molto simile a quello dell’EGCG, ad esclusione che per i protoni corrispondenti alla catena C1-C18. I chemical shifts dello spettro <13>CNMR di EGCG-C18 differiscono dai corrispondenti valori di EGCG per i valori relativi ai carboni nelle posizioni 1”-, 4”-, 3”-, 5”- e in posizione 3.
L’assenza di separazione tra i protoni H2” e H6” nello spettro <1>HNMR, può essere dovuta solamente ad una alchilazione nella posizione para.
I suddetti risultati consentono di affermare che l’alchilazione sia avvenuta nell’anello D in posizione para.
A conferma della suddetta struttura, lo spettro HMBC (Heteronuclear multiple-bond connectivity, correlazione carbonio-protone long range) presenta un cross-peak tra il C-4” e i protoni ossimetilenici della catena C18.
La tabella 1 riporta la comparazione dello spettro <1>HNMR dell’EGCG e EGCG-C18<a>.
<a>Spettro misurato in acetone-d6 a 298 K. I Chemical shifts sono espressi in ppm a fondo scala dai segnali per TMS e le costanti di accoppiamento in Hertz sono tra parentesi.
Tabella 1
Inoltre, la Tabella 2 riporta la comparazione dello spettro <13>CNMR dell’EGCG e EGCG-C18<a>.
<a >Spettro misurato in acetone-d6 a 298 K. I Chemical shifts sono espressi in ppm a fondo scala dai segnali per TMS e le costanti di accoppiamento in Hertz sono tra parentesi.
Tabella 2
Previsione in silico mediante DFT (Density functional Theory) della nucleofilicità degli ossidrili del EGCG.
Con lo scopo di confermare i dati di struttura precedentemente descritti e che identificano il composto maggioritario come derivato monoalchilato dell’ECGC in posizione 4’’ dell’anello D, sono stati condotti calcoli computazionali utilizzando la metodica del funzionale di densità con lo scopo di valutare la nucleofilicità di ciascun gruppo ossidrilico.
In particolare, calcolando la stabilità relativa dei derivati anionici, si è stabilita una scala di acidità dei gruppi ossidrilici con conseguente individuazione degli ossigeni più nucleofili. L’ossidrile in posizione 4” nell’anello D è risultato notevolmente più stabile di tutti gli altri (ΔE>2.7 Kcal/mol) e alla luce dell’elevato valore di energy gap, l’unico significativamente popolato e pertanto alchilabile. A supporto di tale analisi, si riportano qui di seguito (Tabella 3) i valori di stabilità delle forme anioniche dell’EGCG calcolate a livello B3LYP/6-31<+>G.
Tabella 3
Valutazione della ripartizione liposoma/PBS.
L’attività biologica di EGCG e di EGCG-C18 è strettamente legata all’efficienza del trasporto passivo attraverso le membrane cellulari, a sua volta dipendente dalla lipofilicità.
L’affinità di EGCG e di EGCG-C18 nei confronti di un bilayer lipidico è stata valutata misurando la ripartizione liposoma/tampone (PBS, pH 7.4). Le percentuali di EGCG e EGCG-C18 incorporate in bilayer lipidici di fosfatidilcolina, utilizzati come modelli di membrane cellulari, sono risultate essere rispettivamente di 50.7% and 93.3%.
Valutazione dell’attività biologica di EGCG-C18
Valutazione dell’attività antiossidante
L’attività antiossidante di EGCG-C18 è stata testata in vitro su cellule epiteliali retinali pigmentate della retina umane (ARPE19, Adult Retinal Pigment Epithelial Cells). Allo scopo di determinare l’IC50 (50% di inibizione della crescita), le ARPE19 sono state trattate con concentrazioni crescenti di EGCG e di EGCG-C18 per 48h seguito da valutazione della vitalità cellulare con saggio MTT.
Come visibile in figura 1, i valori di IC50 per EGCG-C18 e EGCG sono stati determinati in saggi di citotossicità in ARPE-19. Le cellule ARPE-19 sono state trattate con EGCG-C18 e EGCG per 48 ore in un range di concentrazioni 0–640 μM. La vitalità cellulare è stata misurata per mezzo del saggio MTT e i valori sono stati espressi relativamente ai valori di vitalità cellulare delle cellule non trattate normalizzati al 100%. Le curve di citotossicità sono state ottenute come medie di 5 esperimenti con 3 repliche di concentrazione di molecola bioattiva per ciascun esperimento. Le barre verticali nel grafico di figura 1 rappresentano ± SD. I valori di IC50 sono stati determinati tramite regressione lineare mediante il software Sigma Plot.
Dal grafico di figura 1 è visibile come sia EGCG che EGCG-C18 inibiscono la proliferazione cellulare con un effetto dose-dipendente.
Il trattamento con EGCG risulta essere non tossico in un range di concentrazioni 1-80 μM; al di sopra di tale concentrazione si osserva una diminuzione della crescita cellulare.
Si è calcolato un IC50 di 222.1 μM, dovuto ad una azione pro-ossidante della molecola. L’IC50 di EGCG-C18 è 312.3 μM., cioè 1.5 volte circa meno tossico della molecola naturale.
Come osservabile in Figura 1, è stato selezionato un range di concentrazione (10-80 µM) da utilizzare per la valutazione della capacità del nuovo derivato di proteggere le cellule retinali dalla morte indotta da un forte stress ossidativo. Le cellule sono state quindi trattate con perossido di idrogeno per 6 ore ed i risultati sono riportati in figura 2.
La figura 2 rappresenta un grafico relativo all’effetto di EGCG e EGCG-C18 in cellule ARPE19 dopo esposizione a H2O2. Le cellule sono state pretrattate con concentrazioni crescenti di EGCG-C18 e EGCG per 24 ore, prima di essere esposte ad H2O2 6 mM per 6 ore. La vitalità cellulare è stata determinata tramite saggio MTT.
I dati sono espressi come medie ± S.D. di 5 esperimenti indipendenti, ciascuno condotto in triplicato. *p < 0.001, *p < 0.05 rappresentano le differenze rispetto al controllo, ovvero le cellule trattate con la sola H2O2.
Valutazione dell’attività antitumorale
L’attività antitumorale del EGCG-C18 è stata testata su linee cellulari del tumore polmonare non a piccole cellule (NCSLC, Non Small Cell Lung Cancer), forma altamente maligna di carcinoma broncogeno, che rappresenta circa il 75-80% delle neoplasie polmonari.
I farmaci noti come antagonisti di EGFR come GEFITINIB ed ERLOTINIB, interagiscono con il recettore impedendone l'attivazione e rallentando così la crescita delle cellule tumorali.
Tuttavia, esistono diverse forme mutate di tale recettore che risultano resistenti a tali farmaci; per questo motivo ricopre una fondamentale importanza la ricerca di nuovi inibitori in grado di superare tali resistenze. EGCG è dotato di una alta attività inibitoria in vitro nei confronti del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor) la cui attivazione incontrollata è responsabile dello sviluppo e della progressione di diversi tumori, incluso il NSCLC.
L’attività di EGCG-C18 è stata quindi testata su cellule NSCLC con EGFR Wild Type (A549) e su due linee cellulari contenenti mutazioni attivanti di EGFR (H1975, HCC827) comparandola con EGCG. Le caratteristiche delle linee cellulari usate sono mostrate in tabella 4.
Tabella 4
Nel dettaglio, l’IC50 e la citotossicità sono state valutate dopo 72h dal trattamento con le molecole testate e la vitalità cellulare è stata determinata mediante saggio MTT. I risultati sono mostrati in figura 3.
Come visibile nella suddetta figura, EGCG-C18 determina una IC50 notevolmente e sorprendentemente più bassa rispetto a EGCG.
Si è in pratica constatato come l’invenzione descritta raggiunga gli scopi proposti.
In particolare, si sottolinea che il particolare accorgimento di derivatizzare EGCG con una catena alchilica C1-C18 consente di ottenere un composto derivato presentante notevole solubilità in sistemi lipidici.
A ciò si aggiunge che la suddetta solubilità consente di internalizzare ECGC-C18 all’interno del bilayer lipidico della membrana cellulare o di un sistema di trasporto liposomiale.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1) Composto di formula I:in cui R1, R2, R3, R4, R5, R6 rappresentano indipendentemente tra loro uno o più gruppi scelti tra un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico C1-C18.
- 2) Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che uno tra R1, R2, R3, R4, R5, R6 è un gruppo alchilico C1-C18 e gli altri sono idrogeno.
- 3) Composto secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che R2 è un gruppo alchilico C1-C18 e gli altri sono idrogeno.
- 4) Composizioni farmaceutiche, cosmetiche o nutraceutiche comprendenti il composto di formula I per il trasporto di antiossidanti all’interno di matrici lipidiche.
- 5) Uso del composto di formula I in composizioni liposomiali.
- 6) Procedimento di preparazione del composto secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che è un derivato dell’Epigallocatechina gallato, dove la derivatizzazione è condotta mediante la formazione di un legame etereo in posizione 4’’.
- 7) Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che presenta una temperatura di lavoro sostanzialmente pari a 40°C.
- 8) Procedimento secondo una o più delle rivendicazioni 6-7, caratterizzato dal fatto che comprende una fase di purificazione del grezzo di reazione ottenuto, detta fase di purificazione presentando una resa superiore a 50%.
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