CN104655784A - 一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法，涉及农学领域，具体步骤如下：首先选取供试材料的植株秸秆进行预处理，接着进行72％浓硫酸和4％稀硫酸两步酸解，将植物秸秆中的木质纤维素组分降解、分离，然后通过HPLC方法精确测定纤维素以及半纤维素的含量，利用UV方法测定降解液中酸可溶木质素的含量，通过灼烧法测定酸不溶木质素的含量。该方法弥补了前人方法上预处理不充分、处理过程粗放、定量测定方法不精确的缺点，取得了HPLC方法测定植物秸秆纤维素半纤维含量的新突破，能精确测量各类植物秸秆中木质纤维素组分含量，结果准确可靠，在农业作物生产、生物化学分析、生物质新能源利用等领域具有广泛的参考和使用价值。

Description

一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法

技术领域

本发明涉及农学领域，具体提供了一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法。

背景技术

植物秸秆木质纤维素主要包括纤维素(38％-50％)、半纤维素(23％-32％)和木质素(15％-30％)三种组分(Rubin，2008)，其构成了植物细胞壁的基本骨架，对植株起支持和保护作用，植物秸秆中纤维素、半纤维和木质素含量高低与植株的秸秆机械强度、抗倒伏能力等农艺性状直接相关；植物秸秆中的木质纤维素组分可直接燃烧产热、发电或降解后转化为乙醇、合成气体和氢等(谢光辉等，2007)，是一种来源丰富、可用于生产替代能源的可再生资源(Himmel et al.，2007)，生物质中的纤维素、半纤维素和木质素含量高低直接影响到生物质能源的转化率。

精确测定植物秸秆木质纤维素组分对于评价植株的抗倒伏能力、生物质质量和产量、生物质的定量转化水平以及选育优良种质具有重要的意义。目前测定植物秸秆木质纤维素的含量主要分为材料的预处理(化学法、物理法、生物法和物理化学法)和定量测定(重量法、浓酸水解定糖法、紫外分光度法和同位素标记法等)两部分，前人进行过玉米、水稻等粮食作物以及芒草、甘蔗等生物质能源作物秸秆木质纤维素含量的测定，因其对样品预处理不充分，操作过程粗放，后期定量测定方法不精确甚至方法存在误区，导致最终测定结果误差较大，且无法在各类植物秸秆中通用。

发明内容

基于上述原因，本发明提供了一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法，具体步骤如下：首先选取供试材料的植株秸秆进行预处理，接着进行72％浓硫酸和4％稀硫酸两步酸解，将植物秸秆中的木质纤维素组分降解、分离，然后通过HPLC方法精确测定纤维素以及半纤维素的含量，利用UV方法测定降解液中酸可溶木质素的含量，通过灼烧法测定酸不溶木质素的含量。该方法弥补了前人方法上预处理不充分、处理过程粗放、定量测定方法不精确的缺点，取得了HPLC方法测定植物秸秆纤维素半纤维含量的新突破，能精确测量各类植物秸秆中木质纤维素组分含量，设计科学合理，相关技术成熟，步骤细致完整，操作性强，容易实施，结果准确可靠，在农业作物生产、生物化学分析、生物质新能源利用等领域具有广泛的参考和使用价值。

本发明的具体技术方案如下：具体步骤如下：

一)植物秸秆预处理

首先按照试验目的取样，将所取秸秆进行适当的晾晒，直至秸秆含水量低于10wt％，然后擦拭干净，去除灰尘，放于40℃的干燥烘箱中烘干至样品达恒重；然后将样品粉碎并过40目筛，40℃干燥箱烘干至恒重；所述恒重标准为样品再次加热1h后，样品重量变化在±0.1％范围内即可；

将烘干的样品进行两步萃取，即水萃取和乙醇萃取,萃取选用索氏萃取器：

首先将上述获得的样品加入提前折叠好重量为m₀的滤纸包中称重m₁，将装有样品的滤纸包放入已加入超纯水的索氏提取器中进行萃取，10h后取出滤纸包，放于40℃干燥烘箱烘干后再次将滤纸包放入加有无水乙醇的索氏提取器中继续萃取16h；

萃取速率因所选取索氏提取器装置大小而异，一般水萃取速率大约为一分钟平均冷凝60滴水蒸汽，乙醇萃取速率为一分钟冷凝约120滴乙醇；

两步萃取完成后将滤纸包放于40℃干燥烘箱烘干至恒重(重复加热1h冷却，样品重量变化在±0.3mg范围内)，称取滤纸包重量m₂。滤纸包中样品经两步萃取后会结成块，需重新粉碎后再次过40目筛，烘干至恒重，密封保存。经两步萃取过程，萃取物(Extractives)含量计算为

$\%\mathrm{Extractives}=\frac{m1-m2}{m1-m0}\×100\%$

萃取回收率(Recovery)计算为

$\%\mathrm{Recovery}=(1-\frac{m1-m2}{m1-m0})\×100\%$

以上是本方法提供的材料预处理过程，从取材、烘干、粉碎、过筛到两步萃取，去除了样品中游离的水分，非结构性糖、无机物、含氮化合物等水溶性物质和叶绿素、植物蜡质、其他微量成分等醇溶性物质，过程全面，步骤完整，秸秆样品处理充分，为后期的秸秆木质纤维素组分精确测定奠定基础。

二)样品的两步酸解

称量300.0±10mg已萃取烘干后的样品(记作m_s)，放入已标记好的耐压管，每份材料至少做两个重复。向每个耐压管中加3.00ml 72wt％的H₂SO₄，用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌1min至样品完全混匀，放置到水浴锅，30±3℃水浴，60±5min，期间每5-10min搅拌一次；水浴结束后将耐压管取出，浓酸水解完成；向每支耐压管中准确加入84.00±0.04ml ddH₂O，将72wt％浓酸稀释为4wt％稀硫酸，稀释后体积为86.73ml；

稀释完成后取出搅拌棒，拧紧耐压管盖子，将耐压管震荡混匀后放于高压灭菌锅，调至湿灭状态，121℃，1h，进行稀酸水解；稀酸水解完成后取出耐压管，冷却至室温。

利用过滤坩埚以及真空抽滤装置，真空抽滤经两步酸解后的酸解液。收集滤液约50ml，用于之后的算可溶木质素以及单糖含量的测定。用大量去离子水冲洗耐压管，收集管中所有滤渣于过滤坩埚中，用于酸不溶木质素的测定；抽滤时可用热的去离子水，以加速抽滤过程；

所用过滤坩埚必须经过575℃马弗炉灼烧，且已至恒重(经马弗炉再次灼烧1h冷却称重变化少于±0.3mg)，坩埚必须做好永久标记，经马弗炉灼烧后标记完好，如果不能，坩埚进行灼烧时应按顺序排放，以便确认。

本发明提供了样品经过两步酸解，酸解后抽滤的过程，顺利将预处理后的秸秆粉末进行降解、组分分离。

三)纤维素、半纤维素含量的测定

1.单糖含量测定

植物秸秆中的纤维素、半纤维等多糖经适当的硫酸酸解后会降解成相应单糖，其中纤维素会降解成葡萄糖，半纤维素会降解成木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，其中以木糖和阿拉伯糖为主。因此我们采用高效液相色谱方法分析酸解液中各单糖的含量，从而计算样品中纤维素和半纤维素的含量。

首先需要用D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖五种单糖标准品配置单糖标准溶液、混合糖标准溶液、糖回收标准液(SRS)，单糖标准液是为了确定HPLC分析中各单糖的峰位置，浓度不需要很精确，各单糖均配置浓度为1mg/ml；

混合糖标准溶液包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖，此溶液是为了确定HPLC分析中峰面积与对应单糖的浓度的关系，根据表1提供的单糖浓度范围，平均选用五个点，配置一套混合糖标准溶液，用于绘制标准曲线。混合糖标准液须要求浓度尽可能与样品溶液中各单糖含量接近，用混合糖标准液制的标准曲线的上下界应该包含所有样品出现的可能浓度，而且必须保证精度，因此混合糖标准溶液应根据所测样品中单糖浓度而定，经过反复试验，逐步缩小精确每种单糖浓度范围。单糖标准溶液及混合糖标准溶液无需现配现用，一次配置可放于冰箱保存3-4天。

糖回收标准液(SRS)是为了矫正在稀酸水解过程中损失的单糖，包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖。配置SRS中各单糖浓度与样品中的各单糖浓度接近，准确称量各种糖，加10.0ml去离子水，加348μl的72wt％H₂SO₄，转移到耐压管拧紧盖子，进行稀酸水解(同样品稀酸水解步骤)。

表1混合糖标准溶液各单糖浓度范围

上面表1中给出的各糖浓度范围比较笼统，因不同植物对应测量得到的单糖浓度不同，所以本发明没有给出具体浓度范围，只需要根据测定对象不同在以上范围中选取，通过反复试验不断缩小即可获得精确的范围，以从中选用五个点，配置一套混合糖标准溶液，用于绘制标准曲线。

取抽滤后待测样品滤液和SRS溶液4mL于10ml的烧杯中，用CaCO₃中和样品到pH为5-6，离心取上清。将配制好的单糖标准溶液、混合糖标准溶液、中和好的待测样品滤液以及SRS过孔径为0.2μm的过滤器，之后进行HPLC分析。HPLC分析溶液中各单糖含量，所使用的色谱柱有Shodex sugar SP0810或者Biorad Aminex HPX-87P，测定时色谱柱与相应型号的保护柱配合使用。

HPLC参数设置：

进样量：10-50μl

流动相：ddH₂O(经0.2μm过滤，脱气)

流速：0.6ml/min

柱子温度：80℃

检测器温度：与柱温接近

运行时间：35minutes

以上参数为HPLC分析的常规参数设置，其中具体进样量要根据样品浓度以及所选用检测器的灵敏度而定，一般检测器可选示差检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)，一般来讲，ELSD比示差检测器更灵敏，因此当待测样品中单糖含量很低时，建议使用ELSD，但ELSD稳定性比示差检测器差一些，所以检测器的选择应根据具体情况而定。运行时间可根据所测单糖成分的出峰时间而调整，当所测成分出峰时间短于35min，可适当调整运行时间，以提高效率。另外，所使用保护柱最好处于室温状态下而无需与分析柱共同加热，这样可减少色谱图中诡峰的出现。

HPLC分析完成后检查样品色谱图，如果显示纤维二糖的含量高于3mg/mL，说明样品酸解不充分，需要进一步酸解后再分析，如果在纤维二糖峰前有诡峰出现，则说明样品酸解过度，需要重新对样品进行酸解后分析。

利用一套混合糖标准溶液经HPLC得到的单糖峰值面积及已知浓度，分别对每种单糖成分做一条浓度与峰面积之间的标准曲线，要求各标准曲线的相关系数r²≥0.999。通过此标准曲线能得出待测样品中每种单糖的相应浓度C_HPLC。

对于糖回收标准液(SRS)经HPLC分析后，利用标准曲线会得到一个测定浓度，利用已知浓度与测定浓度可得到各种糖的回收率，从而知道稀酸水解过程中单糖损失的量。公式计算如下：

样品中每种糖浓度最终表示为

$C_{\mathrm{sugar}}=\frac{C_{\mathrm{HPLC}}}{\%R_{\mathrm{sugar}}}$

其中:C_HPLC表示为通过HPLC测定得到的浓度，mg/ml

％R_sugar表示为利用SRS计算出的糖回收率

C_sugar表示为经校正稀酸水解中损失的糖含量后样品中单糖浓度

那么，样品中单糖百分含量的计算为

$\%\mathrm{Sugar}=\frac{C_{\mathrm{sugar}}\×V}{m_s}\×100$

其中：V(V_filtrate)：液体总体积(86.73ml)；m_s：称量的萃取后的样品净重

2.纤维素、半纤维素含量计算

通过单糖含量计算相应多糖浓度时，还需利用校正系数，那么纤维素、半纤维素含量计算如下：

％Celloulose＝％Glu×Ac

％Hemicellose＝％Xyl×Ac+％Ara×Ax+％Man×Ac+％Gal×Ac

其中：A_c表示脱水矫正系数，用0.88(132/150)校正五碳糖(木聚糖xylose和阿拉伯糖arabinose),0.90(162/180)校正六碳糖(葡萄糖glucose、半乳糖galactose和甘露糖mannose)。

以上所有关于单糖含量以及纤维素、半纤维素含量的计算均是指各成分在萃取后干物质中的百分含量，如需要转化为在萃取之前的干物质中百分含量，只需要再乘以萃取后样品回收率(％Recovery)。

通过上述方法即可获得物料中纤维素、半纤维素的含量。

本方法重点描述了利用HPLC方法定量测定秸秆纤维素、半纤维素含量的方法，该方法取得了利用HPLC方法测定植物秸秆纤维素、半纤维含量的新突破，较常规方法测定结果准确、可信度强、容易操作。

四)木质素含量测定

1.酸不溶性木质素(AIL)的测定

该步骤的处理物为两步酸解后获得的酸解液，该酸解液经真空抽滤，所有酸不溶滤渣(AIR)收集于已在575℃灼烧至恒重且做好永久标记的过滤坩埚中，然后将坩埚放入105±3℃的干燥烘箱，至少4h，使其达到恒重。干燥后将过滤坩埚取出放于干燥器中冷却1h至室温，记录坩埚及酸不溶残渣的总重，精确至0.1mg。将坩埚与酸不溶残渣一同放入575±25℃的马弗炉灼烧24±6h。灼烧结束后，将坩埚从马弗炉取出放入干燥器中，冷却时间与灼烧前冷却时间相同，直至室温，称量坩埚及灰分的总重，精确至0.1mg，然后将坩埚再次放入马弗炉灰化，直至冷却后称量重量变化在±0.3mg范围内，记录重量。酸不溶木质素(AIL)含量计算为

$\%\mathrm{AIL}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusAIR}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusash}\right)}}{m_s}\×100$

其中m_s指酸解前称量的萃取后干物质重量，

Weight_{(crucible plus AIR)}表示为灼烧前坩埚与酸不溶残渣的总重；

Weight_{(crucible plus ash)}表示为灼烧后剩余坩埚与灰分的总重，此灰分为酸不溶灰分；

2.酸可溶性木质素(ASL)的测定

取酸解后抽滤所得滤液，利用紫外分光光度计，以4wt％H₂SO₄作为空白对照，测定待测样品在适当波长下的吸光度；参考表2提供的推荐波长测定木质素的吸光度，当推荐波长下样品吸光度大于0.7时，用4wt％H₂SO₄稀释样品并记录稀释倍数，直至测定样品在该波长下吸光度落于0.2-0.7范围内，吸光度数字要保留三位小数，每个样品至少两次重复，重复之间吸光度应在±0.05吸光度范围内；

酸可溶木质素含量计算为：

$\%\mathrm{ASL}=\frac{\mathrm{UVabs}\×V\×D}{\mathrm{\ϵ}\×m_s\×P}\×100$

其中UVabs表示推荐波长下测定样品的吸光值；

V表示溶液体积为86.73ml；

D表示样品的稀释倍数；

ε表示推荐波长下的吸光系数；

m_s表示酸解时称量样品重量；

P表示光程(一般为1cm)；

表2不同生物质类型酸可溶木质素的吸光系数列表

3.总木质素含量的计算

％Lignin＝％AIL+％ASL

以上计算表示为所有木质素在萃取后干物质中的百分含量，如需换算成木质素在萃取前干物质中的百分含量只需乘以萃取后样品的回收率。

本方法提供的测定木质素方法是利用灼烧法与UV方法结合，对于不同种类植物秸秆，提供了不同测定波长，减小了其他物质对木质素吸光度的干扰，使木质素含量的测定全面、准确，同时测定吸光度时不断调整稀释倍数，使吸光度在0.2-0.7范围内，符合朗伯比尔定律，又保证稀释倍数与吸光度的相关性，纠正了前人在酸可溶木质素测定方法上存在的误区。

五)样品中总灰分的测定

样品中的总灰分是指烘干至恒重后萃取前生物质样品中总灰分的含量。

之所以对灰分进行进一步的测定，主要原因在于灰分是植物秸秆中独立于木质纤维素的生物组分，但对于评价植物秸秆的生物学意义有作用，如植物秸秆中灰分含量低、木质纤维素含量高的植株比灰分含量高、木质纤维素含量低的植株有更好的利用价值，故而这一测定可以有助于分析植物秸秆木质纤维素组分比重的分析，具有较强的实际意义。

首先需要将带盖子的坩埚做好永久标记后放于马弗炉，575±25℃，至少4h，取出后放于干燥器中冷却1h，称重，精确至0.1mg；再次将坩埚放回马弗炉灼烧，直至恒重，即在马弗炉反复灼烧冷却称重，重量差少于±0.3mg。然后称取0.5-2.0g样品放入坩埚记录重量，精确至0.1mg，将坩埚放入马弗炉，575±25℃，24±6h；取出坩埚放于干燥器中冷却1h，称重；再次将坩埚放入马弗炉，继续灰化样品至恒重，即再次灰化1h内，冷却称重，重量变化小于±0.3mg。计算总灰分含量：

$\%\mathrm{Ash}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; ash}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible}\right)}}{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; sample}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{cruible}\right)}}\×100$

其中Weight_{(crucible plus ash)}指灰化后至恒重的坩埚与灰分总重；

Weight_(crucible)指坩埚经反复灼烧后所至恒重；

Weight_{(crucible plus sample)}指灰化前称量坩埚与样品总重

灰分为植物秸秆木质纤维素组分含量以外的成分，灰分含量能反应植物生物质质量高低，灰分含量的高低影响生物质能量转化率，是评价生物质质量的重要指标。

综上所述，该方法弥补了前人方法上预处理不充分、处理过程粗放、定量测定方法不精确的缺点，取得了HPLC方法测定植物秸秆纤维素半纤维含量的新突破，能精确测量各类植物秸秆中木质纤维素组分含量，设计科学合理，相关技术成熟，步骤细致完整，操作性强，容易实施，结果准确可靠，在农业作物生产、生物化学分析、生物质新能源利用等领域具有广泛的参考和使用价值。

具体实施方式

以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。不同实例是针对不同试验目的确定取材方式、取材部位、取材时间，并对本方法用到的很多参数进行进一步精确，部分步骤进行调整，以期测定过程更加简洁，节约测定成本，测定结果更加精确，符合试验需求。本发明中除特殊注明外，所述的百分比均为重量百分比；

实施例1：芒属植物秸秆木质纤维素组分的精确测定

芒属植物是多年生高光效C4植物，被认为是世界上最具开发潜力的非粮纤维素能源植物，其生物质产量高、抗逆性强、纤维素品质优良，通过测定芒属植物秸秆木质纤维素成分，能对其生物质利用价值进行评估，对不同芒属种类进行生物学品质评价，对芒属植物的应用潜力进行挖掘，同时为优良品种的选育、生物质中纤维素合成的分子机理研究提供指导。

一)材料预处理

1.取材

取材时间：次年二月底或三月初(最好已经连续多日晴天)

取材用具：果枝剪、棉质手套、30cm左右的绳子、网袋、材料分布图、签字笔、标签纸

取材方法：对于南荻、五节芒、芒和杂交种等单株比较大的种类，取完整植株，每份材料取3-5株，每株剪成约15cm一段，按株捆绑，连同标签纸一同放入网袋。对于荻等单株比较小的种类，可以几株捆绑在一起，取样量保证测量需求。对于从实验田取回的样品材料，如果含水量要大于10％要进行晾晒。达到要求后进行擦拭，以便除去材料上的灰尘等。建议用干燥的抹布擦拭，有些灰尘擦拭不掉，也可以稍微湿润抹布。擦拭过程中，把处秸秆以外的其他成分(叶片，叶鞘等)与秸秆分离，然后分别捆绑，其他成分保存备用，将秸秆立即进行烘干。

2.烘干并粉碎样品

(1)烘干

秸秆样品用网袋存放(也可用牛皮纸信封存放)，40℃，干燥箱烘干至接近恒重(大约需要10天)。

(2)粉碎并过筛

仪器耗材：万能粉碎机(FW-80)、40目筛、刷子、吹风机、干抹布、果枝剪、一次性手套、塑料盆、牛皮纸袋、签字笔、称量纸、滤纸(约30cm×30cm，A4纸也行)等。

粉碎步骤：将材料剪碎，放入万能粉碎机，盖好盖子，严格按万能粉碎机使用说明进行操作，粉碎约2-3分钟。

粉碎完成，将样品倒入40目筛过滤，如样品粉碎不彻底，会导致后期酸解过程中酸解不充分，所以粉碎后样品孔径应小于40目筛孔径。在剪碎、粉碎和过筛过程中，一定要清理干净所有与样品接触的各物品，避免样品混杂。

(3)再次烘干

过筛完成后，将材料保存于牛皮纸袋中，做好标记，放入40℃干燥烘箱继续烘干，直至恒重，恒重即重复加热1h冷却，样品重量变化低于0.1％。烘干至恒重的样品需密封保存于干燥环境。用于总灰分和秸秆中多糖组分测定前需要再次烘干，称重，确保测定前样品处于恒重状态。

3.总灰分的测定

(1)仪器耗材：

万分之一电子天平、钥匙、一次性手套、马弗炉、坩埚钳、带盖坩埚(以下提到坩埚重量均包含盖子)、棉质手套、签字笔、吸耳球等。

(2)测定步骤：

先将带盖坩埚清洗并烘干，做好永久标记后置于马弗炉，575±25℃，12h。干燥器冷却至常温称重。再置于高温烘箱，575±25℃，12h。干燥器冷却至常温称重。重复加热冷却称重，坩埚重量变化小于±0.3mg，方可使用并记录坩埚重量。任何接触坩埚步骤均要求带手套，避免操作过程对坩埚重量产生影响。

然后称取0.5-2.0g样品(已烘干至恒重)，放入坩埚，称重记录，精确至0.1mg，将坩埚放入马弗炉，575±25℃，12h高温处理完成，关闭高温烘箱开关，自然降温至80℃左右，约2h)，取出坩埚放于干燥器中冷却至室温，称重；称重完成，用吸耳球吹干净坩埚(如有必要可以用水清洗)，然后放置到干燥器备用。

(3)计算样品总灰分含量：

$\%\mathrm{Ash}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; ash}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible}\right)}}{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; sample}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{cruible}\right)}}\×100$

其中Weight_{(crucible plus ash)}指灰化后至恒重的坩埚与灰分总重；

Weight_(crucible)指坩埚经反复灼烧后所至恒重；

Weight_{(crucible plus sample)}指灰化前称量坩埚与样品总重；

注：1.重复灼烧坩埚是为了减少坩埚重量变化对实验的影响；

2.签字笔的标记，经高温处理，比较模糊，每次实验结束都要查看标记，如有必要需要重新标记，为了防止因标签不清楚出错，放坩埚的位置最好固定并标记，而且放置在高温烘箱中的位置也要相对固定；

3.用坩埚钳把带盖坩埚放入马弗炉，排齐位置，不要贴高温烘箱内壁；

4.马弗炉高温灼烧过程，不能长时间无人，防止意外；

5.多次试验表明，12h后，坩埚已至恒重，坩埚内样品灼烧完全，无需再次放入马弗炉灼烧；

4.样品的两步萃取

(1)仪器耗材：索氏萃取器、电热套、滤纸(11cm直径)、万分之一天平、钥匙、一次性手套、铅笔、干燥器等。

(2)萃取步骤：

1)萃取装置的清洗、干燥以及安装

萃取装置选用索氏萃取器，从上往下依次是冷凝管、虹吸管、圆底烧瓶(500mL)，首先将萃取装置清洗、干燥，安装于铁架台上，下方加热装置为电热套。电热套使用时严格按照说明书进行操作，避免危险，首次使用先干烧后安装。安装时遵循从下往上的原则，先将圆底烧瓶放于电热套固定于铁架台，然后依次是虹吸管和冷凝管，冷凝管必须遵循冷凝水下进上出的原则，冷凝水的引流橡胶管要勤检查，如果有老化迹象，及时清换，防止漏水。

2)滤纸包的折叠与干燥

用11cm直径的滤纸折叠萃取所需滤纸包，滤纸包折叠时要带一次性手套或者橡胶手套，避免汗渍影响实验结果。而且用于滤纸包折叠的滤纸尽量用同一批次的滤纸。折叠后的滤纸包用于盛装样品粉末，进行萃取，大小适中且不能漏样。折叠好的滤纸包要进行烘干处理至恒重后，储存于干燥器，备用。

3)水萃取

称量空滤纸包重，记录数据m₁，直接加样品(已烘干至恒重)约0.5-0.6g，记录滤纸包和样品的总重量m₂。每个的样品需要萃取1.5g左右，需要萃取三包，另外可以加一个空白滤纸包作为参照，用于计算萃取过程中滤纸包减少的量(如使用定量滤纸则无需此对照)。索氏提取器圆底烧瓶中加入250ml去离子水，将称好的滤纸包捆扎后放入虹吸管中，调整电热套(电压直接用220V加热)，进行水萃取，回流10h后取出滤纸包，置干燥箱40℃烘干。

4)乙醇萃取

在索氏提取器圆底烧瓶中加入250ml无水乙醇，将经水萃取后并烘干的滤纸包放入虹吸管，调整电热套(电压用110V)，进行无水乙醇的萃取，16h后取出样品，置干燥箱40℃烘干至恒重，记录数据m₃。

5)萃取后样品过筛

材料萃取完成后会板结成块，所以需要将萃取后样品重过40目筛，方法同上次过筛，最终使样品成粉末状，混匀，在再次烘干至恒重，装于离心管中或封口袋中，密封保存，备用。

6)样品回收率及萃取物含量计算

$\%\mathrm{Extractives}=\frac{m2-m3}{m2-m1}\×100\%$

$\%\mathrm{Recovery}=(1-\frac{m_2-m_3}{m_2-m_1})\×100$

5.两步酸解

(1)实验仪器、试剂：

万分之一天平、钥匙、耐压管、架子(固定耐压管)、搅拌棒、保鲜膜等；72％的H2SO4(50ml98％H2SO4+33.22mlddH2O，酸入水，缓慢滴入)，ddH2O

(2)操作步骤

1)浓酸水解

准确称量0.3000g已萃取的样品(记作m_s)，放入标记好的耐压管，每管中加3.00mL72％的H₂SO₄，用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌至样品完全混匀，用保鲜膜密封耐压管管口，放置到水浴锅，30℃水浴，60min，每10min搅拌一次。

2)稀酸水解

浓酸水解完成，加84.00mLddH₂O，搅拌混匀，取出搅拌棒，拧紧耐压管的盖子，放于高压灭菌锅，U04湿灭状态，121℃，1h，进行稀酸水解。

6.抽滤

(1)仪器耗材：

玻璃真空抽滤装置(500ml)，真空抽气泵，过滤坩埚(15μm孔径)，保鲜膜，15ml离心管；

(2)操作步骤

稀酸水解完成，缓慢冷却至室温进行抽滤。去掉玻璃抽滤装置上方光口杯，用过滤坩埚替换，该过滤坩埚也要经过马弗炉反复灼烧至恒重后使用，用一块保鲜膜连接过滤坩埚与抽滤装置，防止漏气，连接好真空抽气泵，倒入部分酸解液，开始抽滤，此部分酸解液用于清洗抽滤装置；继续抽滤，收集此部分酸解液，大约30ml储存于2个15ml离心管中，一管用于测定酸可溶木质素，酸可溶木质素的测定在6h内完成，另一管用于测定单糖含量，4℃条件下，滤液最多存放两周；收集滤液后，用大量去离子水清洗耐压管中的残渣，继续抽滤，收集全部残渣于过滤坩埚中，抽滤残渣用于酸不溶性木质素的测定。

7.木质素含量测定

(1)酸不溶性木质素(AIL)的测定

将收集滤渣的过滤坩埚放到105℃干燥箱烘干至恒重，称重记录，将其移到马弗炉中，575±25℃，18h，称重记录，酸不溶木质素(AIL)计算为：

$\%\mathrm{AIL}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusAIR}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusash}\right)}}{m_s}\×100$

其中m_s指酸解前称量的萃取后干物质重量；

Weight_{(crucible plus AIR)}表示为灼烧前坩埚与酸不溶残渣的总重；

Weight_{(crucible plus ash)}表示为灼烧后剩余坩埚与灰分的总重，此灰分为酸不溶灰分，不同于生物质中总灰分，生物质样品中总灰分的测定已有详细描述。

(2)酸可溶性木质素(ASL)的测定

收集1管酸解后抽滤所得滤液，利用紫外-可见分光光度计，以4％H₂SO₄作为空白对照，测定待测样品在210nm波长下的吸光度；吸光度大于0.7时，用4％H₂SO₄稀释样品并记录稀释倍数，直至测定样品在该波长下吸光度落于0.2-0.7范围内，吸光度数字要保留三位小数，每个样品至少两次重复，重复之间吸光度应在±0.05吸光度范围内。

那么，酸可溶木质素含量计算为：

$\%\mathrm{ASL}=\frac{\mathrm{UVabs}\×V\×D}{\mathrm{\ϵ}\×m_s\×P}\×100$

其中UVabs表示推荐波长下测定样品的吸光值；

V(V_filtrate)表示溶液体积为86.73ml；

D(Dilution)表示样品的稀释倍数；

ε表示推荐波长下的吸光系数；

m_s表示酸解时称量样品重量；

P表示光程，一般为1cm。

注：1.根据查阅资料以及反复实验研究证实测量值需要在0.2-0.7之间，此时吸光值与稀释倍数相关性好，同时符合朗伯-比尔定律。

2.根据大量实验研究，在测量芒属植物秸秆木质纤维素成分时，将样品稀释10倍，这时候的吸光值在0.5左右，符合测定条件，若吸光值过高或过低，还应根据具体情况调整稀释倍数。

(3)总木质素含量的计算

％Lignin＝％AIL+％ASL

以上计算表示为所有木质素在萃取后干物质中的百分含量，如需换算成木质素在萃取前干物质中的百分含量只需乘以样品回收率(％Recovery)。

8.纤维素、半纤维含量的测定

(1)各种糖标准溶液(单糖标准溶液、混合糖标准溶液的制备、糖回收标准液)

糖标准液的制备，参考下表3建议的成分浓度范围，

表3(芒属植物)糖标准溶液中各糖浓度范围

具体配置方法如下：

1)单糖标准液是为了确定HPLC分析中各单糖的峰位置，浓度不需要很精确，建议各单糖均可配置浓度1mg/ml

2)混合糖标准溶液包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖，此溶液是为了确定HPLC分析中峰面积与对应单糖的浓度的关系，混合糖标准液就必须要求浓度尽可能与样品溶液中各单糖含量接近，用混合糖标准液制的标准曲线的上下界应该包含所有样品出现的可能浓度，而且必须保证精度。因此根据上表提供的单糖浓度范围，平均选用五个点，配置一套混合糖标准溶液，具体选用浓度如下：

混合糖标准溶液1-5中葡萄糖浓度由低到高依次为1.000mg/ml、1.250mg/ml、1.500mg/ml、1.750mg/ml、2.000mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中木糖的浓度由低到高依次为0.500mg/ml、0.625mg/ml、0.750mg/ml、0.875mg/ml、1.000mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中半乳糖的浓度由低到高依次为：0.015mg/ml、0.01875mg/ml、0.0225mg/ml、0.02625mg/ml、0.030mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中阿拉伯糖的浓度由低到高依次为：0.060mg/ml、0.7625mg/ml、0.9250mg/ml、0.10875mg/ml、0.125mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中甘露糖的浓度由低到高依次为：0.005mg/ml、0.00625mg/ml、0.0075mg/ml、0.00875mg/ml、0.010mg/ml；

3)糖回收标准液(SRS)是为了矫正在稀酸水解过程中损失的单糖，包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖。配置SRS中各单糖浓度与样品中的各单糖浓度接近，准确称量各种糖，加10.0ml去离子水，加348μl的72％H₂SO₄，转移到耐压管拧紧盖子，进行稀酸水解(同样品稀酸水解步骤)。

(2)样品中单糖含量测定

本实验HPLC分析选用的是ELSD检测器，Biorad Aminex HPX-87P糖分析柱，其操作步骤要严格按照HPLC、ELSD、HPX-87P糖分析柱操作规范使用。

将配置好的单糖溶液，混合糖标准溶液，经0.2μm过滤器过滤，准入自动进样瓶；取样品滤液、SRS 4mL于10mL的烧杯中，用CaCO₃中和样品pH到4.0就要减慢CaCO₃加入，最终pH为5-6。离心取上清液，过0.2μm过滤器，转入自动进样器的样品瓶；标记进样顺序，按HPLC分析要求开始进行液相分析。

HPLC及检测器参数设置：

利用五个单糖标准溶液，确定每种单糖的出峰时间，在此基础上，利用一套混合糖标准溶液HPLC分析的个单糖峰值面积及已知浓度，分别对每种单糖成分做一条浓度与峰面积之间的标准曲线，要求各标准曲线的相关系数r²≥0.999。通过此标准曲线及HPLC分析所得待测样品中单糖峰面积，得出待测样品中每种单糖的相应浓度。

对于糖回收标准液(SRS)经HPLC分析后，利用标准曲线会得到一个测定浓度，利用已知浓度与测定浓度可得到各种糖的回收率，从而知道稀酸水解过程中单糖损失的量。公式计算如下：

样品中每种糖浓度最终表示为

$C_{\mathrm{sugar}}=\frac{C_{\mathrm{HPLC}}}{\%R_{\mathrm{sugar}}}$

其中:C_HPLC表示为通过HPLC测定得到的每个单糖浓度，mg/mL

％R_sugar表示为利用SRS计算出的糖回收率

C_sugar表示为经校正稀酸水解中损失的糖含量后样品中单糖浓度

那么，样品中单糖百分含量的计算为

$\%\mathrm{Sugar}=\frac{C_{\mathrm{sugar}}\×V}{m_s}\×100$

其中：V(V_filtrate)：稀酸溶液总体积(86.73mL)；m_s：称量的萃取后的样品净重

(3)样品中纤维素、半纤维素含量的计算

通过单糖含量计算相应多糖浓度时，还需利用校正系数，那么纤维素、半纤维素含量计算如下：

％Celloulose＝％Glu×Ac

％Hemicellose＝％Xyl×Ac+％Ara×Ax+％Man×Ac+％Gal×Ac

其中：A_c(Anhydro correction)表示脱水矫正系数，用0.88(132/150)校正(anhydrocorrection)五碳糖(Xyl，Ara)及0.90(162/180)校正六碳糖(Glu，Gal，Man)。

以上所有关于单糖含量以及纤维素、半纤维素含量的计算均是指各成分在萃取后干物质中的百分含量，如需要转化为在萃取之前的干物质中百分含量，只需要再乘以萃取后样品回收率。

9.测定结果

表4表示通过本方法测定的芒属植物不同种间木质纤维素含量百分比，每个结果表示为该种内所有样品测量结果的平均值。将表4中各组分含量乘以萃取回收率得到各组分在萃取前干物质中的百分含量，见表5。由表中可知，芒属植物秸秆中纤维素含量最高，其次是半纤维素、木质素，其木质纤维素含量高达80％，甚至更高，充分说明了芒属植物是最具开发潜力的生物质能源之一；此外不同种类芒属植物其木质纤维素含量存在很大差异，这就为芒属植物种质资源的筛选、开发提供了指导。

表4芒属植物秸秆木质纤维素成分在萃取后干物质中的百分含量(％)

表5芒属植物秸秆木质纤维素成分在萃取前干物质中的百分含量(％)

实施例2：玉米秸秆木质纤维素组分的精确测定

玉米是世界第一大粮食作物，也是重要的饲料作物，玉米秸秆是重要的生物质能源，其秸秆木质纤维素组分影响生物质能源转化效率、影响秸秆机械强度和植株的抗倒伏能力。我们通过此方法测定不同生物性状玉米植株秸秆的木质纤维素组分，包括脆杆玉米、倒伏玉米与正常玉米，对此方法进行验证同时对不类型玉米材料进行秸秆木质纤维素组分分析，为玉米的生物质生产、抗倒伏育种提供指导。

一)材料预处理

1取材

(1)取材时期：玉米生长成熟期

(2)取材部位：玉米秸秆地上部第三茎节

(3)取材用具：果枝剪、牛皮纸袋、铅笔、标签纸等

(4)取材方法：在玉米生长成熟期，于目标材料中选取三株长势一致的玉米植株，取其茎杆地上部第三节间，剥掉叶鞘及其它部位，并用抹布擦净秸秆上的泥土，装于备好的牛皮纸袋，放入标签纸，做好材料标记。

2.烘干并粉碎样品

(1)烘干

所取样品放于干燥烘箱，40℃，烘干至接近恒重(大约需要10天)。

(2)粉碎并过筛

仪器耗材：万能粉碎机(FW-80)、40目筛、刷子、吹风机、干抹布、果枝剪、一次性手套、塑料盆、牛皮纸袋、签字笔、称量纸、滤纸(约30cm×30cm，A4纸也行)等。

粉碎步骤：将材料剪碎，放入万能粉碎机，盖好盖子，严格按万能粉碎机使用说明进行操作，粉碎约2-3分钟。

粉碎完成，将样品倒入40目筛过滤，如样品粉碎不彻底，会导致后期酸解过程中酸解不充分，所以粉碎后样品孔径应小于40目筛孔径。在剪碎、粉碎和过筛过程中，一定要擦拭干净所有与样品接触的各物品，避免样品混杂。

(3)再次烘干

过筛完成后，将材料保存于牛皮纸袋中，做好标记，放入40℃干燥烘箱继续烘干，直至恒重，恒重即重复加热1h冷却，样品重量变化低于0.1％。烘干至恒重的样品需密封保存于干燥环境。用于总灰分和秸秆中多糖组分测定前需要再次烘干，称重，确保测定前样品处于恒重状态。

3.总灰分的测定

(1)仪器耗材：万分之一电子天平、钥匙、一次性手套、马弗炉、坩埚钳、带盖坩埚(以下提到坩埚重量均包含盖子)、棉质手套、签字笔、吸耳球等。

(2)测定步骤：

先将带盖坩埚清洗并烘干，做好永久标记后置于马弗炉，575±25℃，12h。干燥器冷却至常温称重。再置于高温烘箱，575±25℃，12h。干燥器冷却至常温称重。重复加热冷却称重，坩埚重量变化小于0.1％，方可使用并记录坩埚重量。任何接触坩埚步骤均要求带手套，避免操作过程对坩埚重量产生影响。

然后称取0.5-2.0g样品(已烘干至恒重)放入坩埚，记录称重₁，精确至0.1mg，将坩埚放入马弗炉，575±25℃，12h高温处理完成，关闭高温烘箱开关，自然降温(至80℃左右，约2h)，取出坩埚放于干燥器中冷却至室温，称重；称重完成，用吸耳球吹干净坩埚(如有必要可以用水清洗)，然后放置到干燥器备用。

(3)计算样品总灰分含量：

$\%\mathrm{Ash}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; ash}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible}\right)}}{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; sample}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{cruible}\right)}}\×100$

其中Weight_{(crucible plus ash)}指灰化后至恒重的坩埚与灰分总重；

Weight_(crucible)指坩埚经反复灼烧后所至恒重；

Weight_{(crucible plus sample)}指灰化前称量坩埚与样品总重

注：1.重复灼烧坩埚是为了减少坩埚重量变化对实验的影响；

2.签字笔的标记，经高温处理，比较模糊，每次实验结束都要查看标记，如有必要需要重新标记，为了防止因标签不清楚出错，放坩埚的位置最好固定并标记，而且放置在高温烘箱中的位置也要相对固定；

3.用坩埚钳把带盖坩埚放入马弗炉，排齐位置，不要贴高温烘箱内壁；

4.马弗炉高温灼烧过程，不能长时间无人，防止意外；

5.多次试验表明，12h后，坩埚已至恒重，坩埚内样品灼烧完全，无需再次放入马弗炉灼烧；

4.样品的两步萃取

(1)仪器耗材：索氏萃取器、电热套、圆形滤纸(11cm直径)、万分之一天平、钥匙、一次性手套、铅笔、干燥器等。

(2)萃取步骤：

1)萃取装置的清洗、干燥以及安装

萃取装置选用索氏萃取器，丛上往下依次是冷凝管、虹吸管、圆底烧瓶(500mL)，首先将萃取装置清洗、干燥，安装于铁架台上，下方加热装置为电热套。电热套使用时严格按照说明书进行操作，避免危险，首次使用先干烧后安装。安装时遵循从下往上的原则，现将圆底烧瓶放于电热套固定于铁架台，然后依次是虹吸管和冷凝管，冷凝管必须遵循冷凝水下进上出的原则，冷凝水的引流橡胶管要勤检查，如果有老化迹象，及时清换，防止漏水。

2)滤纸包的折叠与干燥

圆形滤纸折叠萃取所需滤纸包，滤纸包折叠时要带一次性手套或者橡胶手套，避免汗渍影响实验结果。而且用于滤纸包折叠的滤纸尽量用同一批次的滤纸。折叠后的滤纸包用于盛装样品粉末，进行萃取，大小适中且不能漏样。折叠好的滤纸包要进行烘干处理至恒重后，储存于干燥器，备用。

3)水萃取

称量空滤纸包重，记录数据m₁，直接加样品(已烘干至恒重)约0.5-0.6g，记录滤纸包和样品的总重量m₂。每个的样品需要萃取1.5g左右，需要萃取三包，另外可以加一个空白滤纸包作为参照，用于计算萃取过程中滤纸包减少的量(如使用定量滤纸则无需此对照)。索氏提取器圆底烧瓶中加入250ml去离子水，将称好的滤纸包捆扎后放入虹吸管中，调整电热套(电压直接用220V加热)，进行水萃取，回流10h后取出滤纸包，置干燥箱40℃烘干。

4)乙醇萃取

在索氏提取器圆底烧瓶中加入250ml无水乙醇，将经水萃取后并烘干的滤纸包放入虹吸管，调整电热套(电压用110V)，进行无水乙醇的萃取，16h后取出样品，置干燥箱40℃烘干至恒重，记录数据m₃。

5)萃取后样品过筛

材料萃取完成后会板结成块，所以需要将萃取后样品重过40目筛，方法同上次过筛，最终使样品成粉末状，混匀，在再次烘干至恒重，装于离心管中或封口袋中，密封保存，备用。

6)样品回收率及萃取物含量计算

$\%\mathrm{Extractives}=\frac{m2-m3}{m2-m1}\×100\%$

$\%\mathrm{Recovery}=(1-\frac{m_2-m_1}{m_2-m_1})\×100\%$

5.两步酸解

(1)实验仪器：万分之一天平、钥匙、耐压管、架子(固定耐压管)、搅拌棒、保鲜膜等

实验试剂：72％的H₂SO₄(50ml 98％H₂SO₄+33.22mlddH₂O，酸入水，缓慢滴入)，ddH₂O

(2)操作步骤

1)浓酸水解

准确称量0.3000g已萃取的样品(记作m_s)，放入标记好的耐压管，每管中加3.00ml 72％的H₂SO₄，用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌至样品完全混匀，用保鲜膜密封耐压管管口，放置到水浴锅，30℃水浴，60min，每10min搅拌一次。

2)稀酸水解

浓酸水解完成，加84.00ml ddH₂O，搅拌混匀，取出搅拌棒，拧紧耐压管的盖子，放于高压灭菌锅，U04湿灭状态，121℃，1h，进行稀酸水解。

6.抽滤

(1)仪器耗材：玻璃真空抽滤装置(500ml)，真空抽气泵，过滤坩埚(15μm孔径)，保鲜膜，15ml离心管；

(2)操作步骤

稀酸水解完成，缓慢冷却至室温进行抽滤。去掉玻璃抽滤装置上方光口杯，用过滤坩埚替换，该过滤坩埚也要经过马弗炉反复灼烧至恒重后使用，用一块保鲜膜连接过滤坩埚与抽滤装置，防止漏气，连接好真空抽气泵，倒入部分酸解液，开始抽滤，此部分酸解液用于清洗抽滤装置；继续抽滤，收集此部分酸解液，大约30ml储存于2个15ml离心管中，一管用于测定酸可溶木质素，酸可溶木质素的测定在6h内完成，另一管用于测定单糖含量，4℃条件下，滤液最多存放两周；收集滤液后，用大量去离子水清洗耐压管中的残渣，继续抽滤，收集全部残渣于过滤坩埚中，抽滤残渣用于酸不溶性木质素的测定。

7.木质素含量测定

(1)酸不溶性木质素(AIL)的测定

将收集滤渣的过滤坩埚放到105℃干燥箱烘干至恒重，称重记录，将其移到马弗炉中，575±25℃，18h，称重记录，酸不溶木质素(AIL)计算为：

$\%\mathrm{AIL}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusAIR}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erueibleplusash}\right)}}{m_s}\×100$

其中m_s指酸解前称量的萃取后干物质重量，

Weight_{(crucible plus AIR)}表示为灼烧前坩埚与酸不溶残渣的总重；

Weight_{(crucible plus ash)}表示为灼烧后剩余坩埚与灰分的总重，此灰分为酸不溶灰分，不同于生物质中总灰分，生物质样品中总灰分的测定已有详细描述。

(2)酸溶性木质素(ASL)的测定

收集1管酸解后抽滤所得滤液，利用紫外-可见分光光度计，以4％H₂SO₄作为空白对照，测定待测样品在320nm波长下的吸光度；吸光度大于0.7时，用4％H₂SO₄稀释样品并记录稀释倍数，直至测定样品在该波长下吸光度落于0.2-0.7范围内，吸光度数字要保留三位小数，每个样品至少两次重复，重复之间吸光度应在±0.05吸光度范围内。

那么，酸可溶木质素含量计算为：

$\%\mathrm{ASL}=\frac{\mathrm{UVabs}\×V\×D}{\mathrm{\ϵ}\×m_s\×P}\×100$

其中：UVabs表示推荐波长下测定样品的吸光值；

V(V_filtrate)表示溶液体积为86.73ml；

D(Dilution)表示样品的稀释倍数；

ε表示推荐波长下的吸光系数；

m_s表示酸解时称量样品重量；

P表示光程(一般为1cm)

(3)总木质素含量的计算

％Lignin＝％AIL+％ASL

以上计算表示为所有木质素在萃取后干物质中的百分含量，如需换算成木质素在萃取前干物质中的百分含量只需乘以样品回收率(％Recovery)。

8.纤维素、半纤维含量的测定

(1)各种糖标准溶液(单糖标准溶液、混合糖标准溶液的制备、糖回收标准液)

表6是我们经过反复实验分析，最终锁定测定样品中各单糖可能出现的浓度范围。

表6(玉米)糖标准溶液中各单糖浓度范围

使所配置糖标准溶液中各单糖浓度与样品中的各单糖浓度接近，样品中各单糖含量在表中各糖浓度范围内，不同糖标准溶液配制方法如下：

(1)单糖标准液是为了确定HPLC分析中各单糖的峰位置，浓度不需要很精确，建议各单糖均可配置浓度1mg/ml

(2)混合糖标准溶液包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖，此溶液是为了确定HPLC分析中峰面积与对应单糖的浓度的关系，混合糖标准液就必须要求浓度尽可能与样品溶液中各单糖含量接近，用混合糖标准液制的标准曲线的上下界应该包含所有样品出现的可能浓度，而且必须保证精度。因此根据上表提供的单糖浓度范围，平均选用五个点，配置一套混合糖标准溶液，具体选用浓度如下：

混合糖标准溶液1-5中葡萄糖浓度由低到高依次为0.500mg/ml、0.875mg/ml、1.250mg/ml、1.625mg/ml、2.000mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中木糖的浓度由低到高依次为0.500mg/ml、0.625mg/ml、0.750mg/ml、0.875mg/ml、1.000mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中半乳糖的浓度由低到高依次为：0.015mg/ml、0.02125mg/ml、0.02750mg/ml、0.03375mg/ml、0.040mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中阿拉伯糖的浓度由低到高依次为：0.100mg/ml、0.150mg/ml、0.200mg/ml、0.250mg/ml、0.300mg/ml；

混合糖标准溶液1-5中甘露糖的浓度由低到高依次为：0.010mg/ml、0.015mg/ml、0.020mg/ml、0.025mg/ml、0.030mg/ml；

(3)糖回收标准液(SRS)是为了矫正在稀酸水解过程中损失的单糖，包括D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖。配置SRS中各单糖浓度与样品中的各单糖浓度接近，准确称量各种糖，加10.0ml去离子水，加348μl的72％H₂SO₄，转移到耐压管拧紧盖子，进行稀酸水解(同样品稀酸水解步骤)。

(2)样品中单糖含量测定

本实验HPLC分析选用的是ELSD检测器，Biorad Aminex HPX-87P糖分析柱，其操作步骤要严格按照HPLC、ELSD、HPX-87P糖分析柱操作规范使用。

将配置好的单糖溶液，混合糖标准溶液，经0.2μm过滤器过滤，注入自动进样瓶；取样品滤液、SRS溶液4ml于10ml的烧杯中，用CaCO₃中和样品，pH到4.0时减慢CaCO₃加入，最终调pH为5-6，离心取上清液，过0.2μm过滤器，转入自动进样瓶；标记进样顺序，按HPLC分析要求开始进行液相分析。

HPLC及检测器参数设置：

利用五个单糖标准溶液，确定每种单糖的峰出峰时间，在比基础上，利用一套混合糖标准溶液HPLC分析的个单糖峰值面积及已知浓度，分别对每种单糖成分做一条浓度与峰面积之间的标准曲线，要求各标准曲线的相关系数r²≥0.999。通过此标准曲线及HPLC分析所得待测样品中单糖峰面积，得出待测样品中每种单糖的相应浓度。

对于糖回收标准液(SRS)经HPLC分析后，利用标准曲线会得到一个测定浓度，利用已知浓度与测定浓度可得到各种糖的回收率，从而知道稀酸水解过程中单糖损失的量。公式计算如下：

样品中每种糖浓度最终表示为

$C_{\mathrm{sugar}}=\frac{C_{\mathrm{HPLC}}}{\%R_{\mathrm{sugar}}}$

其中:C_HPLC表示为通过HPLC测定得到的浓度，mg/mL

％R_sugar表示为利用SRS计算出的糖回收率

C_sugar表示为经校正稀酸水解中损失的糖含量后样品中单糖浓度

那么，样品中单糖百分含量的计算为

$\%\mathrm{Sugar}=\frac{C_{\mathrm{sugar}}\×V}{m_s}\×100$

其中：V(V_filtrate)：稀酸溶液总体积(86.73mL)；m_s：称量的萃取后的样品净重

(3)样品中纤维素、半纤维素含量计算

通过单糖含量计算相应多糖浓度时，还需利用校正系数，那么纤维素、半纤维素含量计算如下：

％Celloulose＝％Glu×Ac

％Hemicellose＝％Xyl×Ac+％Ara×Ax+％Man×Ac+％Gal×Ac

其中：A_c(Anhydro correction)表示脱水矫正系数，用0.88(132/150)校正五碳糖(Xyl，Ara)及0.90(162/180)校正六碳糖(Glu，Gal，Man)。

以上所有关于单糖含量以及纤维素、半纤维素含量的计算均是指各成分在萃取后干物质中的百分含量，如需要转化为在萃取之前的干物质中百分含量，只需要再乘以萃取后样品回收率。

9.测定结果

表7描述了不同玉米材料秸秆木质纤维素成分含量，从表中可看出不同类型玉米材料之间，木质纤维素含量差异明显。其中A188、LH277为正常玉米自交系，916CA、Y17、Y09为玉米脆杆材料，其生长特性表现为4-5叶期之后地上部分所有组织表现为脆性易折断，其秸秆木质纤维素成分较正常材料相比纤维素含量低，半纤维素含量高；5407K、20790表现为易倒伏，其秸秆木质纤维素成分较正常材料相比，木质素含量较低。秸秆木质纤维素是组成构成了植物细胞壁的基本骨架，对植株起支持和保护作用，植物秸秆中纤维素、半纤维和木质素含量高低与植株的秸秆机械强度、抗倒伏能力直接相关，因此上述结果能充分说明该测定玉米秸秆木质纤维素含量方法的可靠性与准确性。

将表7中各组分含量乘以萃取回收率得到各组分在萃取前干物质中的百分含量，见表8；

同时将表8与表5对比，不难看出与玉米秸秆木质纤维素成分对比，芒属植物秸秆中木质纤维素总含量较高，萃取物、灰分含量低，这充分展示了芒属植物作物新一代能源植物的优越性，由此说明，该方法测定植物秸秆中木质纤维素含量的通用性。

本发明系统全面的介绍了一种通用的测定植物秸秆木质纤维素含量方法，本研究方法具有测定植物秸秆木质纤维素含量的准确性、可靠性与通用性。通过此方法，可以对不同种类生物质、不同农艺性状材料进行科学合理的生物学评价，为生物质新能源的利用、特异种质的筛选、优异品种选育提供指导。

表7玉米秸秆木质纤维素在秸秆萃取后干物质中的百分含量(％)

表8玉米秸秆木质纤维素成分在秸秆萃取前干物质中百分含量(％)

Claims (3)

1.一种测定植物秸秆木质纤维素组分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：

一)植物秸秆预处理

取样将所取秸秆进行晾晒，直至秸秆含水量低于10wt％，然后擦拭干净，去除灰尘，放于40℃的干燥烘箱中烘干至样品达恒重；然后将样品粉碎并过40目筛，40℃干燥箱烘干至恒重；所述恒重标准为样品再次加热1h后，样品重量变化在±0.1％范围内即可；

将烘干的样品进行两步萃取，即水萃取和乙醇萃取,萃取选用索氏萃取器：

首先将上述获得的样品加入提前折叠好重量为m₀的滤纸包中称重m₁，将装有样品的滤纸包放入已加入超纯水的索氏提取器中进行萃取，10h后取出滤纸包，放于40℃干燥烘箱烘干后再次将滤纸包放入加有无水乙醇的索氏提取器中继续萃取16h；

两步萃取完成后将滤纸包放于40℃干燥烘箱烘干至恒重，称取滤纸包重量m₂；经两步萃取过程，萃取物(Extractives)含量计算为

$\%\mathrm{Extractives}=\frac{m1-m2}{m1-m0}\×100\%$

萃取回收率(Recovery)计算为

$\%\mathrm{Recovery}=(1-\frac{m1-m2}{m1-m0})\×100\%;$

二)样品的两步酸解

称量300.0±10mg已萃取烘干后的样品，记作m_s，放入已标记好的耐压管，每份材料至少做两个重复；向每个耐压管中加3.00ml 72wt％的H₂SO₄，用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌1min至样品完全混匀，放置到水浴锅，30±3℃水浴，60±5min，期间每5-10min搅拌一次；水浴结束后将耐压管取出，浓酸水解完成；向每支耐压管中准确加入84.00±0.04ml ddH₂O，将72wt％浓酸稀释为4wt％稀硫酸，稀释后体积为86.73ml；

稀释完成后取出搅拌棒，拧紧耐压管盖子，将耐压管震荡混匀后放于高压灭菌锅，调至湿灭状态，121℃，1h，进行稀酸水解；稀酸水解完成后取出耐压管，冷却至室温；

真空抽滤经两步酸解后的酸解液，收集滤液用于之后的可溶木质素以及单糖含量的测定；用去离子水冲洗耐压管，收集管中所有滤渣于过滤坩埚中，用于酸不溶木质素的测定；

三)纤维素、半纤维素含量的测定

1.单糖含量测定

首先用D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖，D(+)甘露糖五种单糖标准品配置单糖标准溶液、混合糖标准溶液、糖回收标准液SRS，各单糖均配置浓度为1mg/ml；

取抽滤后待测样品滤液和SRS溶液4mL于10ml的烧杯中，用CaCO₃中和样品到pH为5-6，离心取上清；将配制好的单糖标准溶液、混合糖标准溶液、中和好的待测样品滤液以及SRS过孔径为0.2μm的过滤器，之后进行HPLC分析；HPLC分析溶液中各单糖含量，所使用的色谱柱有Shodex sugar SP0810或者Biorad Aminex HPX-87P，测定时色谱柱与相应型号的保护柱配合使用；

利用一套混合糖标准溶液经HPLC得到的单糖峰值面积及已知浓度，分别对每种单糖成分做一条浓度与峰面积之间的标准曲线，要求各标准曲线的相关系数r²≥0.999；通过此标准曲线能得出待测样品中每种单糖的相应浓度C_HPLC；

对于糖回收标准液SRS经HPLC分析后，利用标准曲线会得到一个测定浓度，利用已知浓度与测定浓度可得到各种糖的回收率，从而知道稀酸水解过程中单糖损失的量；公式计算如下：

样品中每种糖浓度最终表示为

$C_{\mathrm{sugar}}=\frac{C_{\mathrm{HPLC}}}{\%R_{\mathrm{sugar}}}$

其中:C_HPLC表示为通过HPLC测定得到的浓度，mg/ml

％R_sugar表示为利用SRS计算出的糖回收率

C_sugar表示为经校正稀酸水解中损失的糖含量后样品中单糖浓度；

样品中单糖百分含量的计算为

$\%\mathrm{Sugar}=\frac{C_{\mathrm{sugar}}\×v}{m_s}\×100$

其中：V：液体总体积；m_s：称量的萃取后的样品净重；

2.纤维素、半纤维素含量计算

通过单糖含量计算相应多糖浓度时，需利用校正系数，则纤维素、半纤维素含量计算如下：

％Celloulose＝％Glu×Ac

％Hemicellulose＝％Xyl×Ac+％Ara×Ac+％Man×Ac+％Gal×Ac

其中：A_c表示脱水矫正系数，用0.88校正五碳糖,0.90校正六碳糖；

四)木质素含量测定

1.酸不溶性木质素AIL的测定

该步骤的处理物为两步酸解后获得的酸解液，该酸解液经真空抽滤，所有酸不溶滤渣AIR收集于已在575℃灼烧至恒重且做好永久标记的过滤坩埚中，然后将坩埚放入105±3℃的干燥烘箱，至少4h，使其达到恒重；干燥后将过滤坩埚取出放于干燥器中冷却1h至室温，记录坩埚及酸不溶残渣的总重，精确至0.1mg；将坩埚与酸不溶残渣一同放入575±25℃的马弗炉灼烧24±6h，灼烧结束后，将坩埚从马弗炉取出放入干燥器中，冷却时间与灼烧前冷却时间相同，直至室温，称量坩埚及灰分的总重，精确至0.1mg，然后将坩埚再次放入马弗炉灰化，直至冷却后称量重量变化在±0.3mg范围内，记录重量；则酸不溶木质素AIL含量计算为

$\%\mathrm{AIL}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{eruetible\; plus\; AIR}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{erucible\; plus\; ash}\right)}}{m_s}\×100$

其中m_s指酸解前称量的萃取后干物质重量，

Weight_{(crucible plus AIR)}表示为灼烧前坩埚与酸不溶残渣的总重；

Weight_{(crucible plus ash)}表示为灼烧后剩余坩埚与灰分的总重，此灰分为酸不溶灰分；

2.酸可溶性木质素ASL的测定

取酸解后抽滤所得滤液，利用紫外分光光度计，以4wt％H₂SO₄作为空白对照，测定待测样品在适当波长下的吸光度；吸光度数字要保留三位小数，每个样品至少两次重复，重复之间吸光度应在±0.05吸光度范围内；

酸可溶木质素含量计算为：

$\%\mathrm{ASL}=\frac{\mathrm{UVabs}\×V\×D}{\mathrm{\ϵ}\×m_s\×P}\×100$

其中UVabs表示推荐波长下测定样品的吸光值；

V表示溶液体积为86.73ml；

D表示样品的稀释倍数；

ε表示推荐波长下的吸光系数；

m_s表示酸解时称量样品重量；

P表示光程；

3.总木质素含量的计算

％Lignin＝％AIL+％ASL

以上计算表示为所有木质素在萃取后干物质中的百分含量；

五)样品中总灰分的测定

样品中的总灰分是指烘干至恒重后萃取前生物质样品中总灰分的含量；

首先将带盖子的坩埚做好永久标记后放于马弗炉，575±25℃，至少4h，取出后放于干燥器中冷却1h，称重，精确至0.1mg；再次将坩埚放回马弗炉灼烧，直至恒重，即在马弗炉反复灼烧冷却称重，重量差少于±0.3mg；然后称取0.5-2.0g样品放入坩埚记录重量，精确至0.1mg，将坩埚放入马弗炉，575±25℃，24±6h；取出坩埚放于干燥器中冷却1h，称重；再次将坩埚放入马弗炉，继续灰化样品至恒重，即再次灰化1h内，冷却称重，重量变化小于±0.3mg。计算总灰分含量：

$\%\mathrm{Ash}=\frac{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; phusash}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible}\right)}}{{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible\; plus\; sample}\right)}-{\mathrm{Weight}}_{\left(\mathrm{crucible}\right)}}\×100$

其中Weight_{(crucible plus ash)}指灰化后至恒重的坩埚与灰分总重；

Weight_(crucible)指坩埚经反复灼烧后所至恒重；

Weight_{(crucible plus sample)}指灰化前称量坩埚与样品总重。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用过滤坩埚必须经过575℃马弗炉灼烧，且已至恒重。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：混合糖标准溶液各单糖浓度范围为D(+)葡萄糖为0.1-4.0mg/ml，D(+)木糖为0.1-4.0mg/ml，D(+)半乳糖为0.1-4.0mg/ml，L(+)阿拉伯糖为0.1-4.0mg/ml，D(+)甘露糖为0.1-4.0mg/ml。