CN104650188A - 多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽及其应用。所述多肽包含SEQIDNo.1～SEQIDNo.3中任一项所示的氨基酸序列，特别是SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，其能够特异性结合非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞，而不与正常的肺细胞、其他肺癌细胞及正常干细胞结合，同时其制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本发明为肺癌干细胞的鉴定、分离及靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。

Description

多肽及其应用

技术领域

本发明特别涉及一种肺癌干细胞特异性结合多肽及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

2008年世界卫生组织在其公布的报告中明确指出，非传染性疾病正成为人类最为致命的“杀手”，每年有大约500 万人死于癌症。但整体来讲，对于肿瘤的治疗效果并不理想。主要在于肿瘤发病机理尚不清楚，例如肿瘤的起源问题。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)理论的提出让我们看到新的希望。肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织具有异质性，所有的肿瘤细胞中，只有很小一部分细胞具有形成并维持肿瘤生长和异质性的能力，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞。并且人们认为肿瘤干细胞是肿瘤起始和生长，复发和转移，以及耐药性产生的根源。对于肿瘤干细胞的研究有利于我们更好的了解肿瘤发生发展的过程和建立一种更有效的治疗策略。

目前，肿瘤干细胞的研究主要依赖于分子标志物，然而多数实体瘤并没有找到特异的肿瘤干细胞分子标志物。研究人员一直期望建立一种新的策略，建立一种不依赖于特异分子标志物的鉴定和分离肿瘤干细胞方法。近些年出现的表面展示技术可以在未知细胞表面分子的情况下实现细胞特异性结合多肽的筛选。表面展示技术是利用基因工程手段实现外源多肽（或蛋白质结构域）以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质结构域可以保持相对独立的空间结构和生物活性。细菌表面展示技术结合流式细胞分选技术以快速、高通量的特点为展示技术领域中应用的热点。但是，如何利用上述表面展示技术进行肺癌干细胞特异性结合多肽筛选及进一步建立一种不依赖于特异分子标志物的鉴定和分离肿瘤干细胞的方法仍是业界亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种多肽，它包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列。

本发明的目的之二在于提供前述多肽的衍生物，它包括：

(i) SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基被取代形成的多肽，

或者，(ii)在SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基内引入取代基团而形成的多肽，

或者，(iii) 权利要求1所述多肽与选定化合物融合形成的多肽，

或者，(iv)将选定的附加氨基酸序列融合于SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列而形成的多肽。

进一步的，所述多肽的衍生物包括：

SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示氨基酸序列中的一个以上，优选1～3个，更优选1～2个，尤其优选1个保守性氨基酸残基被取代形成的、能与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的多肽。

进一步的，所述多肽的衍生物包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的核心氨基酸序列，而在核心氨基酸序列两端分别连接具有X1、X2个氨基酸的肽段，其中X1、X2为0～7中的任一个整数。

作为其中较为典型的案例之一，所述多肽的衍生物具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于提供又一种多肽，它具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，并且其中的两个半胱氨酸之间形成二硫键，构成环形多肽结构。

本发明的目的之四在于提供前述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒中的应用。

本发明的目的之五在于提供前述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460的治疗药物中的应用。

本发明的目的之六在于提供一种分离的多核苷酸或其变异体，它能够编码前述的多肽或其衍生物。

本发明的目的之七在于提供包含编码前述多肽或其衍生物的多核苷酸或其变异体的表达载体。

本发明的目的之八在于提供包含前述多核苷酸或其变异体或前述载体的宿主细胞。

本发明的目的之九在于提供一种荧光素标记的多肽，它包含：

前述多肽或其衍生物， 

以及，用以标记所述多肽或其衍生物的荧光素分子。

本发明的目的之十在于提供一种多肽标记的磁性粒子，它包含前述多肽或其衍生物以及磁性粒子，其中，所述磁性粒子包括磁性纳米粒子或超顺磁纳米粒子。

本发明的目的之十一在于提供一种非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒，它包含前述多肽或其衍生物。

本发明的目的之十二在于提供一种用于治疗非小细胞肺癌H460的药物组合物，包含可药用载体及前述多肽或其衍生物。

本发明采用细菌随机多肽库体外展示技术和流式细胞分选技术筛选出与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的细菌，经基因测序及体外细胞结合实验鉴定后，得到与肺癌干细胞特异性结合的13肽，具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列，其可分别命名为“HCBP-1肽”、“HCBP-2肽”及“HCBP-3肽”。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：该HCBP-1肽～HCBP-3肽，特别是其中的HCBP-1肽可与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合，而对正常肺成纤维细胞HLF细胞、多种肺癌细胞及人间充质干细胞无特异性结合作用，显示出多肽对肺癌肿瘤细胞的特异性选择。同时，该HCBP-1肽～HCBP-3肽的制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本发明为肺癌干细胞的鉴定、分离及靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A- 1B显示了非小细胞肺癌H460肿瘤干细胞的富集扩增，其中，图1A显示了细胞培养在有血清的环境中单层贴壁生长，保持分化状态。图1B显示了少量的细胞在无血清培养体系中持续分离生长，形成球状的克隆球，保持干细胞状态。

图2A-2B显示了本发明非小细胞肺癌H460肿瘤干细胞特异性结合细菌（以下简称特异细菌，而图中所示cell是作为空白对照的肿瘤干细胞）的富集过程，其中，图2A示出了随着分选次数的增加，特异细菌对肿瘤干细胞的结合效率逐步增长，图2B示出了随着分选次数的增加，特异细菌对H460贴壁细胞的结合效率并没有增加。

图3显示了本发明筛选所得特异细菌与肺正常成纤维细胞系HLF细胞，肺癌细胞系A549、H1299细胞，人间充质干细胞MSC细胞的结合效率均很低。

图4A-4B显示了筛选出来的3个细菌克隆（分别含HCBP-1肽～HCBP-3肽）与肿瘤干细胞和贴壁H460细胞的结合情况，图4A示出了HCBP-1的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达52.3 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.6 %, 图4B示出了HCBP-2的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达38.6 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.5 %。图4C示出了HCBP-3的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达37.2 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.9 %。

图5显示了荧光显微镜鉴定肿瘤干细胞的结果，其中，富集了肿瘤干细胞的克隆球表面结合了大量 FITC标记的HCBP-1多肽，而H460细胞表面仅结合了少量的HCBP-1多肽，control多肽对两种细胞结合均较低。

图6A-6B显示了流式细胞仪鉴定肿瘤干细胞的结果，其中图6A显示了富集了肿瘤干细胞的克隆球细胞与FITC标记的control多肽的结合率仅有1.1%，而与HCBP-1’多肽的结合率可高达60%，图6B显示了两种多肽对H460细胞结合率均较低。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现具有核心序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3，尤其是SEQ ID No.1的多肽，可以特异性地与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞结合，并且证实了，根据该核心序列多肽进行一定范围内衍生的多肽，同样具有结合活性。实验证明，该多肽及其衍生多肽可用于非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞的鉴定和分离，且不限于此。在此基础上完成了本发明。

活性多肽

在本发明中，术语“具有核心序列的多肽”指具有SEQ ID No.1～ SEQ ID No.3，特别是SEQ ID No.1所示氨基酸序列作为核心序列的且具有非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞结合活性的蛋白或多肽。

其中，一种优选的具有核心序列的多肽具有如下结构式：

X1-LGCFPEGEMACWW-X2

式中，X1、X2为0或1-7个氨基酸的肽段。

本发明中，术语“衍生多肽”、指具有非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞结合活性的、以SEQ ID No.1- SEQ ID No.3所示序列作为原序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：与原序列相比，1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

术语“本发明多肽”指的是“核心序列”、“具有核心序列的多肽”以及“衍生多肽”的总称

本发明还包括所示本发明多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞结合活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)核心序列与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式i的氨基酸序列或相应的原序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
			Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
			Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
			Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
			His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe	Leu
			Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
			Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Leu
			Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
			Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
			Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala	Leu

本发明还提供本发明多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

其中，修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及分别编码本发明多肽的多核苷酸。

其中一种优选的编码序列核心序列的序列如SEQ ID No.5所示，它编码SEQ ID No.1所示的核心多肽片段。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID No.5所示的序列相同或者是其简并的变异体。如本文所用，以核心序列为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID No.1所示序列的多肽，但与SEQ ID No.5中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的编码核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括本发明多肽的单克隆抗体和多克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

本发明多肽的制备方法

本领域的普通技术人员可以使用常规方法制备本发明多肽，如生物合成，全化学合成等方法。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4% 对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一个优选的实施例中，生物合成法有以下步骤：

(1)用编码本发明活性多肽或其衍生物的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化本发明的多肽。

本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达本发明的活性多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的活性多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化所述的活性多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明多肽可与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合；

(b)本发明多肽可进行荧光分子标记或偶联到磁性粒子表面，特异性识别肺癌干细胞，从而进行肿瘤干细胞的鉴定和分离；

(c)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 

实施例1 非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞的富集：

将贴壁培养的H460细胞消化成单细胞悬液，以1 × 10⁴ 个/ml的密度接种到无血清DMEM/F12培养基中，添加20 ng/ml的EGF和bFGF以及2% B27。每隔一天用含有生长因子的新鲜培养基进行半量换液，直至需要传代培养。当克隆球长至100-200 μm，低速离心收集克隆球，加入1 ml胰酶，37℃消化2 min，反复吹打至单细胞悬液，加入10 ml PBS，混匀离心1000 rpm，5 min，PBS洗2遍，PBS重悬，细胞计数，以1 × 10⁴ 个/ml的密度重新接种到无血清DMEM/F12培养基中，进行传代培养。

图1A显示了细胞培养在有血清的环境中单层贴壁生长，保持分化状态。图1B显示了少量的细胞在无血清培养体系中持续分离生长，形成球状的克隆球，保持干细胞状态。通过有限稀释的方法将单个的克隆球细胞接种到96孔板中，每一个孔中仅含有一个细胞，这种单个的克隆球细胞可以在10天的时间里重新长成一个较大的克隆球，并且这些克隆球细胞可以连续传代20代以上，表明了这些克隆球细胞具有干细胞自我更新和无限增殖的特性。因此说明非小细胞肺癌H460细胞系中存在少量的肿瘤干细胞，并可通过无血清培养体系进行富集。

实施例2 筛选与H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的多肽：

本发明所使用的细菌随机多肽库来自美国加州大学圣巴巴拉分校化学工程系Patrick S.Daugherty实验室。其详细构建过程是：对OmpX(outer membrane protein X)基因序列进行改造，使其第2个loop上的s53及s54残基之间断开，形成游离于胞外COOH端和NH2端，成为CPX（circularly permuted outer membrane protein OmpX）。之后将随机合成的X2CX7CX2的多肽编码序列连接到CPX序列中，使其表达于CPX的胞外的NH2端，将改造后的CPX片段连接到pBAD33（Guzman，L. et al.，Tight regulation，modulation，and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter，J. Bacteriol.，1995,177，p4124-4130）质粒中alajGFP1（Bessette, P.H. et al. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. (2004) Protein Eng. Des. Sel. 17, 731-739）下游的多克隆位点上,改造后的pBAD33质粒可以利用araBAD 启动子来控制CPX及表面展示多肽的表达。改造后的pBAD33质粒转化入大肠杆菌MC1061菌株，就可以利用阿拉伯糖（arabinose）控制CPX及随机多肽在细菌表面的展示（Dane, K.Y. et al. Isolation of cell specific peptide ligands using fluorescent bacterial display libraries (2006) J. Immunol Methods. 309, 120-129）。

（1）利用流式细胞仪分选表达与肿瘤干细胞特异性结合的细菌

细菌随机多肽库复苏，至少取库容量10倍的菌量于LB培养基中，37 ℃下扩大生长，用0.02% (m/v) arabinose室温1小时诱导细菌，按细菌：细胞为100：1的比例和非小细胞肺癌细胞系H460细胞孵育，4 ℃，30 min，离心1000 rpm，4℃，5 min，取上清和同样数量的克隆球细胞孵育，4 ℃，30 min，离心1000 rpm，4 ℃，5 min，3遍，弃上清，PBS ( pH 7.4)重悬，流式细胞术分析其结合情况，分选出结合有细菌的细胞，将分选出来的细胞置于细菌培养基中过夜培养，扩增有特异性结合的细菌，重复以上的体外筛选步骤5次左右，细菌与肿瘤干细胞的结合效率达到40 %且不再增长时，收集菌液并将收集的菌液接种到5 mL LB培养基中，过夜培养。

（2）细菌的特异性验证

 将最后一轮分选的细菌进行培养、诱导，并按比例分别和肺成纤维细胞HLF细胞、肺癌细胞系A549细胞、H1299细胞、人间充质干细胞MSC细胞孵育，4℃，30 min，离心1000 rpm，4 ℃，5 min，3遍，弃上清，PBS ( pH 7.4)重悬，流式细胞术分析其结合情况。

（3）特异性结合多肽的测序

从最后一轮分选的细菌中取出10 μl涂布在LB固体培养基上，在37 ℃过夜培养。从平板上随机挑选50个单克隆细菌，编号为clone1-clone50，分别接种到5mL LB液体培养基中，在37 ℃、200转/分的条件下过夜培养，并对过夜培养的细菌分别进行多肽的测序，这里，在苏州金唯智生物科技有限公司对多肽进行测序。

图2A示出了随着分选次数的增加，细菌对肿瘤干细胞的结合效率逐步增长。图2B示出了随着分选次数的增加，细菌对H460贴壁细胞的结合效率并没有增加。

图3示出了最后一轮分选的细菌与其肺正常成纤维细胞系HLF细胞、其他肺癌细胞系A549、H1299细胞、与人间充质干细胞MSC细胞的结合效率均很低。

测序结果显示50个克隆中共有3条多肽序列，其中LGCFPEGEMACWW序列的多肽出现的频率最高(为66.7％)，命名为“HCBP-1肽”，LKCDWYGINMCVR序列出现的频率为20.0%，命名为“HCBP-2肽”，LNCGFMSLWECWY序列出现的频率为13.3%，命名为“HCBP-3肽”。

图4A示出了HCBP-1的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达52.3 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.6 %, 图4B示出了HCBP-2的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达38.6 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.5 %。图4C示出了HCBP-3的细菌与肿瘤干细胞的结合效率可达37.2 %，而与贴壁细胞的结合效率只有0.9 %。

因此流式分选逐步富集了与肿瘤干细胞结合的细菌，并得到了3个高结合效率的特异性多肽。

实施例3 荧光标记多肽进行肿瘤干细胞鉴定：

在上海上海波泰生物科技有限公司分别合成序列为SEQ ID No.4的HCBP-1’多肽和序列为SEQ ID No.6的control多肽，并在N端进行FITC荧光素标记。

（1）利用荧光显微镜进行肿瘤干细胞的鉴定

a）细胞爬片：无菌处理的盖玻片放入6孔板中，H460细胞接种到含有盖玻片的6孔板中，培养基为含有10 % FBS的RPMI 1640培养基，过夜培养，使细胞在盖玻片表面贴壁伸展。克隆球生长至100 μm左右，低速离心进行收集，无血清培养基进行重选，加入含有盖玻片的6孔板中，过夜孵育，使得克隆球贴在盖玻片上。

b) 细胞固定：将孔板中的培养基吸出，2 ml PBS洗2遍，每孔加入1 ml 4 %多聚甲醛，室温固定10 min, 2 ml PBS洗2遍。

c) 封闭：每孔加入1 ml 3% BSA，室温封闭10 min, 2 ml PBS洗2遍。

d) 孵育：每孔加入终浓度为3× 10³ mM FITC标记的荧光多肽，室温避光孵育30 min, 2 ml PBS洗2遍。

e）复染：每孔加入终浓度为2 μg/ml的Hoechst 33342, 室温避光染色10 min, 2 ml PBS洗2遍。

f）封片，荧光显微镜观察拍照。

图5示出了HCBP-1多肽和control多肽对两种细胞的结合情况，富集了肿瘤干细胞的克隆球表面结合的大量 FITC标记的HCBP-1’多肽，而H460细胞表面仅结合了少量的HCBP-1’多肽，control多肽对两种细胞结合均较低。

（2）利用流式细胞仪进行肿瘤干细胞的鉴定

a）H460细胞和克隆球细胞消化成单细胞悬液，密度为1 × 10⁶ 个/ml。

b）每组细胞均加入终浓度为0.5 μM FITC标记的多肽，4℃，避光孵育30min。

c）4℃，1000 rpm离心5 min, 1 ml PBS洗2遍。

d）0.5 ml PBS重悬，流式细胞仪检测或分选。

图6示出了HCBP-1’多肽和control多肽对两种细胞的结合情况，其中图6A显示了富集了肿瘤干细胞的克隆球细胞与FITC标记的control多肽的结合率仅有1.1%，而与HCBP-1’多肽的结合率可高达60%。图6B显示了两种多肽对H460细胞结合率均较低。

因此，由前述实验可以证实，本发明的HCBP-1肽具有如下特性：

（1）能与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合，而对正常肺成纤维细胞HLF细胞、肺癌细胞系A549、H1299、H460细胞、与人间充质干细胞MSC细胞的结合效率均很低。

（2）可利用荧光标记的多肽进行肿瘤干细胞的鉴定和分离工作。

（3）该HCBP-1肽的制备方法操作简单，易于实施，利于进行大规模工业化生产。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

 

<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> 多肽及其应用

<160> 6

 

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Gly Cys Phe Pro Glu Gly Glu Met Ala Cys Trp Trp

1           5               10       13

 

<201> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Lys Cys Asp Trp Tyr Gly Ile Asn Met Cys Val Arg

1            5             10        13

 

<201> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Asn Cys Gly Phe Met Ser Leu Trp Glu Cys Trp Tyr

1            5              10        13

 

<201> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Gly Leu Gly Cys Phe Pro Glu Gly Glu Met Ala Cys Trp Trp Ser Gly Gly

1            5              10              15

Ser Gly Lys

   20

 

<201> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CCACCAGCACGCCATCTCGCCCTCGGGGAAGCACCCCAA

 

<201> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Ser Ser Gly Cys Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser

1           5             10             15

Ser Lys

20

Claims (16)

1.一种多肽，其特征在于，它包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述多肽的衍生物，其特征在于，它包括：

(i) SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基被取代形成的多肽，

或者，(ii)在SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基内引入取代基团而形成的多肽，

或者，(iii) 权利要求1所述多肽与选定化合物融合形成的多肽，

或者，(iv)将选定的附加氨基酸序列融合于SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的氨基酸序列而形成的多肽。

3.权利要求2所述多肽的衍生物，其特征在于，它包括：

SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示氨基酸序列中的一个以上保守性氨基酸残基被取代形成的、能与非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞特异性结合的多肽。

4.权利要求3所述多肽的衍生物，其特征在于，它包括：

SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示氨基酸序列中的1～3个，优选1～2个，尤其优选1个保守性氨基酸残基被性质相似或相近的氨基酸取代形成的多肽。

5.权利要求1所述多肽的衍生物，其特征在于，它包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中任一项所示的核心氨基酸序列，而在核心氨基酸序列两端分别连接具有X1、X2个氨基酸的肽段，其中X1、X2为0～7中的任一个整数。

6.权利要求5所述多肽的衍生物，其特征在于，它具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

7.一种多肽，其特征在于，它具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，并且其中的两个半胱氨酸之间形成二硫键，构成环形多肽结构。

8.权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒中的应用。

9.权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物在制备非小细胞肺癌H460的治疗药物中的应用。

10.分离的多核苷酸或其变异体，其特征在于，它能够编码权利要求1-7中任一项所述的多肽或其衍生物。

11.包含编码权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物的多核苷酸或其变异体的表达载体。

12.包含权利要求10所述多核苷酸或其变异体或权利要求11所述载体的宿主细胞。

13.一种荧光素标记的多肽，其特征在于，它包含：

权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物， 

以及，用以标记所述多肽或其衍生物的荧光素分子。

14.一种多肽标记的磁性粒子，其特征在于，它包含权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物以及磁性粒子，其中，所述磁性粒子包括磁性纳米粒子或超顺磁纳米粒子。

15.非小细胞肺癌H460细胞系肺癌干细胞检测和/或分离试剂或试剂盒，其特征在于，它包含权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物。

16.用于治疗非小细胞肺癌H460的药物组合物，其特征在于，包含可药用载体及权利要求1-7中任一项所述多肽或其衍生物。