CN1046351A - 蚯蚓的酶工程技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水解蛋白质、核酸、脂类的生化技术方法，其特征在于水解酶是蚯蚓自身的酶体系，不须分离提取，直接利用，直接进行水解反应，通过清洗、除杂、蒸煮、加入微生物、加入抑菌剂、配料拌匀、酶解反应等生化工艺处理方法，把蚯蚓体自身、或者动物体、或者植物种子的整体水解为含有氨基酸、核苷酸、甘油、脂肪酸为主要成分的多种物质组成的复合体(酶解液)，然后通过一系列生化工艺处理方法，对酶解液进行不同深度的加工，并配制成不同层次的生化系列产品。

Description

本发明涉及生物化学中生物酶的应用技术领域，它是利用蚯蚓的酶体系，把蚯蚓体自身、动物体、植物种子的蛋白质、核酸、脂类水解成氨基酸、核苷酸、甘油、脂肪酸等小分子物质，同时把贮存于细胞中的维生素、抗菌素、激素、微量元素等生物活性物质释放出来，并运用这些物质配制成一系列新产品。

国内外生产氨基酸的技术有如下几种：较老的酸水解法和碱水解法已较陈旧;酶水解法是要在市场上购买商品酶进行水解，虽不用高温高压，但这些商品酶在提取过程中其结构受到一定程度的破坏，水解不彻底，常有许多多肽产生，水解效率不高，而成本高;发酵法是目前国外生产氨基酸的新方法，它是利用特定的微生物产生的酶进行发酵，生产某一种或几种氨基酸，但设备多，投资大，成本高;固定化酶法，这是一种新兴技术，其酶被载体固定后可以多次使用，然而酶在提取和加工固定中，常使结构性能发生变化，酶的价格提高，固定的酶种类单一，目前在我国尚未用这种技术生产氨基酸。目前，国内外水解核酸和脂类的技术都有类似于水解蛋白质的一些弊端。已有的各种水解技术的共同弊端是水解的物质单一，能水解蛋白质，就不能水解核酸和脂类，能水解核酸，就不能水解蛋白质和脂类，能水解脂类，就不能水解蛋白质和核酸，更不能将动物体和植物种子整体进行水解。这样，被水解的原料中的某一种物质含量要高，这就要求对原料进行加工提取，原料中未被水解的物质将成为废弃物，不能物尽其用。水解的设备多，投资大，要求技术人员水平高，工艺复杂，但水解产物种类少，产品收率低，成本高。所以，目前我国生产氨基酸、核苷酸、甘油、脂肪酸的生化工业是我国工业的薄弱环节。由于现有各种水解技术落后，造成了上述生化产品的奇缺和昂贵，严重限制了相关产业的发展。

本发明旨在克服已有各种水解技术的弊端，发明一种新的水解技术-蚯蚓的酶工程技术，采用这种技术，其原料来源广泛，工艺不复杂，设备少，投资省，反应速度快，水解产物的种类多，用处广，成本低。本发明将为我国生化工业的发展开创一条新路。

发明者对蚯蚓进行了长达十多年的研究，发现在高等生物的某些特化器官才能产生的酶，而蚯蚓已分化的细胞结构也能产生，高等生物的酶类，要从上述特化器官分离提取后才能利用，而蚯蚓的体型小，结构不复杂，身体是分节的，它的酶是分布在身体的各个环节上，不需要分离提取，就可以直接利用。发明者还发现蚯蚓体内酶的种类多，含量丰富，活性高。本发明的实质就在于发现并利用了蚯蚓这个动物的特殊优势，充分发挥蚯蚓自身酶体系的作用，采用酶工程技术，对蚯蚓体内的酶，不经分离提取，其结构和活性都没有被破坏，直接利用，直接进行水解反应。本发明在大量实验的基础上找到了水解过程中的最适环境条件，包括蚯蚓被捣碎加工的颗粒大小0.01～0.10毫米，水解时间48小时，最佳温度55℃～60℃，相对湿度80～90%，酸碱度PH值6.8和水解设备等，研究了各种水解原料与蚯蚓酶制剂的最佳比例关系（例如，鳝鱼5公斤用1公斤蚯蚓酶制剂;蚕蛹4公斤，用1公斤蚯蚓酶制剂;玉米蛋白粉10公斤用1公斤蚯蚓酶制剂等），还研究了对于不同的原料所采用的不同的水解条件和方法（例如，水解动物体和植物种子则要把蚯蚓粉碎制成蚯蚓酶制剂;对于水解蚕蛹和植物种子，还要先用微生物进行分解后再加入蚯蚓酶制剂进行水解），并找到了各种原料的最佳水解效果，在此基础上制定和实施了最佳水解工艺流程。

因此，本发明不仅能利用蚯蚓的酶体系将蚯蚓体自身整体进行水解，而且还能够将动物体（如鳝鱼、鱼鳅、鱼、猪肉、猪血、蚕蛹等）和植物种子（如大豆、小麦、玉米的种子等）的整体进行水解。这样，本发明就不是以单一的纯度很高的某一种物质作为原料，水解的产物也不是单一的氨基酸，或单一的核苷酸，或单一的甘油、脂肪酸，而是含有氨基酸、核苷酸、甘油、脂肪酸，以及在水解过程中从细胞中释放出来的维生素、抗菌素、生长激素、微量元素等生物活性物质组成的复合体。

由于蚯蚓有富集重金属等有害物质的能力，水解后的复合体当然存在着有害物质。为此，本发明在利用蚯蚓的酶体系进行水解的基础上，又研究成功了一套消灭细菌，除去重金属等有毒有害物质的工艺处理方法。用这种工艺处理方法加工出来的蚯蚓酶解液和一系列产品，经卫生防疫部门检验，铅、铬、镉、锌、汞、砷、六六六、DDT等有害物质的含量都不超过国家食品卫生标准。例如：铅0.05（毫克/公升，下同）、铬0.06镉0.04、锌0.01、汞0.32、砷0.002、六六六低于2、DDT低于2。

本发明所获得的水解产物（蚯蚓酶解液），经有关部门进行蛋白质水解分析测定，测出十七种游离氨基酸的总含量达9.982克/100毫升酶解液。十七种游离氨基酸分项含量如下表：

氨基酸        含量（g/100ml）

天门冬氨酸        0.741

苏氨酸        0.603

丝氨酸        0.590

谷氨酸        1.231

甘氨酸        0.334

丙氨酸        0.772

半胱氨酸        0.183

缬氨酸        0.696

蛋氨酸        0.346

异亮氨酸        0.626

亮氨酸        1.076

酪氨酸        0.307

苯丙氨酸        0.290

赖氨酸        0.901

组氨酸        0.249

精氨酸        0.788

脯氨酸        0.249

合计        9.982

本发明所获得的水解产物（蚯蚓酶解液），经有关部门测定其核酸含量，测得核酸总含量为148.61mg/100ml，其中RNA含量为109.48mg/100ml，DNA含量为39.13mg/100ml。

本发明所获得的水解产物（酶解液），通过高温消毒灭菌，离心沉降过滤除去未水解的大分子物质和杂质，白酒保存浸提萃取，活性炭脱色除杂除去热原物质，酸碱处理、低温沉降、离心过滤除去重金属离子，高温蒸馏除去砷离子等有毒有害物质，离子交换层析精制等一系列生化工艺处理方法，对酶解液进行不同深度的加工处理，再根据生物或人体的不同需要，加入不同的辅料，配制成不同加工深度的生化产品系列，如高效抗病增丝灵、植物微生物营养添加剂、土壤改良剂、高效多能肥、健肤剂、畜禽饲料添加剂、食品饮料添加剂、精制的复合氨基酸核苷酸水剂和粉剂、药品添加剂等。

已有的水解技术，无论哪一种，被水解物与用于水解的药物相分离，被水解物是高含量高纯度的单一物质，原料来源受到限制，价格昂贵。用于水解的药物，无论是用酸、碱，或是用酶，或是用微生物，都是要分离提取，加工制造，或进行生物培养，要求纯度高、活性好。因此，这些药物不但价格高，而且效果并不好，这是由于在加工提取过程中，往往破坏了酶结构和活性。本发明利用并发挥蚯蚓自身酶体系的作用。不需要加工制造分离提纯，直接利用，直接进行水解反应。原料和药物来源广泛，价格低廉，水解的设备少，工艺不复杂，投资省，效率高。水解产物不是单一的某一种物质，而是多种物质所组成的复合体。这种复合体所含的多种物质，都是一切生命活动所必须的物质，用途广泛，运用这种复合体为主要原料，根据不同的需要，加入不同的辅料，配制成不同加工深度的一系列生化产品。运用这些生化产品做了大量的动物、植物、微生物的实验，证明了对生物的细胞分裂，组织的分化，器官系统的形成，生长发育，繁殖都有促进作用和增产效果，并已在生产上使用，产生了很好的经济效益和社会效益。

例如，高效抗病增丝灵，经几年试验的实践证明，平均每张蚕种，春季产茧重增加2.8公斤，秋季增加3.2公斤，增加收入30～50元，蚕茧等级提高。经四川省蚕桑研究所缫丝测定证明，试验茧平均每茧的茧丝长度增37.5公尺至85公尺，出丝率提高1.3%～1.6%，据有关专家测算，高效抗病增丝灵在全国推广后，每年可增加产值数亿元。

又如，在植物微生物营养添加剂中加入一定的辅料制成的高效多能肥        ，在水稻的细胞育种和花药育种的试验中施用，结果证明，比现有国内外公认为较好的MS和N6培养基的效果还要好，对细胞的分裂，组织的分化，器官系统的形成、生长、发育都有明显的促进作用，对改良土壤的性能也有良好的效果。在食用菌生产中施用，试验结果证明，菌丝体生长的速度提高14.2%至44.3%。该产品与从国外进口的恩肥相比，其物质成分和作用都相似。恩肥进口价格每100加仑（折合454.6公斤）高达10万美元，而相同数量的植物微生物营养添加剂成本只有3700～4000美元，本产品若能在全国推广使用，增加的粮食产量和产值都将以亿计。

再如，以健肤剂为主要原料的高级化妆品，经临床试验证明，具有护肤、消炎、消除雀斑和皱纹的作用。

说明书附图是蚯蚓的酶工程技术工艺流程图。

以下结合附图（工艺流程图）用下列实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

附图中①将鲜蚯蚓清洗干净，除去泥沙杂质和蚓粪，得到洁净的蚯蚓。②将洁净的蚯蚓捣碎成组织液，其颗粒大小在0.01至0.50毫米之间，制成蚯蚓酶制剂。③加入青霉素或链霉素（1万单位/每公斤原料）作为抑菌剂，成为既有被反应物又有蚯蚓酶体系的酶解反应物。⑩将酶解反应物在反应器（能保温的）中进行酶解反应，温度在37℃～70℃范围都可进行，最好55℃～60℃，相对湿度在70～95%，最好80～90%，ph值控制在6～8，最好6.8，经48小时反应，得到蚯蚓酶解液（即蚯蚓的水解产物）。(13)将蚯蚓酶解液在高温下消毒灭菌，温度在105℃～120℃范围，最好110℃，消毒时间达到温度标准后半小时，得到灭菌的蚯蚓酶解液。(14)通过离心沉降过滤，把灭菌的酶解液分离成为滤液和沉淀物。(15)将沉淀物烘干除湿后，加入粮食、麦麸皮等辅料制成饲料。(16)滤液的下一步流程有两条途径，一条途径是(17)加入20%白酒、抗菌素（氯霉素、洁霉素）和中药材板兰根、黄连、大蒜等15种中药的浸提液等作为辅料，混匀后装瓶制成高效抗病增丝灵;另一条途径是(17)将滤液放入白酒中保存，既要杀死一切细菌和芽孢，消毒灭菌，又可浸提水解物质，使未水解的大分子物质沉淀下来，得到保存酶解液。(18)通过离心沉降过滤，分离成上清液和沉淀物。(19)将沉淀物烘干除湿粉碎，成为饲料添加剂。(20)分离上清液，通过减压蒸馏，蒸出去的汽体经冷凝器后成白酒，回收再用，未蒸出去的酶解液是经过白酒浸提后的分离原液。(21)加活性炭，脱色除杂质，得脱色原液。(22)在蚓粪中加入0.3%的焦磷酸钠溶液，提取蚓粪中的胡敏酸、维生素、微量元素、生长刺激素和速效的氮、磷、钾、钙、镁、铁等元素，得蚓粪提取液。(23)将蚓粪提取液与分离原液混合（配合比为7∶3），并补充氮、磷、钾和生长素（如2-4-D或α萘乙酸含10PPM）等辅料，配制成土壤改良剂和植物微生物营养添加剂，以此为原料，根据不同生物的需要，补充或增加某些营养成分，制成高效多能肥的系列产品。(24)经过(21)处理后的脱色原液，再经低温沉降过滤后，分为两条途径，一条途径加入苯甲酸钠（0.25%）防腐剂，封装，成为健肤剂原液;另一条途径是得到滤液。(25)在健肤剂原液中加入化妆品原料，配制加工成健肤剂。(26)在滤液中加入IN的NaOH溶液，调PH值至8.0，得混合溶液。(27)将混合溶液经过低温沉降离心过滤后，把一部分与碱发生沉淀反应的重金属离子除掉，得滤液。(28)在滤液中加入IN的HCl，调PH值至5.0，使其中能与酸发生沉淀反应的重金属离子沉淀下来，得混合溶液。(29)将混合溶液经过低温沉降离心过滤后，把与酸发生沉淀反应的重金属离子除掉，得滤液。(30)由于砷化物与酸、碱均不发生沉淀反应，上述滤液中尚未除掉砷这个有害物质，本发明将滤液在高温108℃以上进行蒸馏处理，既可把砷蒸出去，又可把前道工序中残留下来的过量的酸蒸出去，注意在密闭条件下接收砷和酸的蒸汽，以免逸出中毒，得分离原液。(31)将分离原液再经低温沉降离心过滤后，再除掉一些杂质，得复合氨基酸核苷酸原液。(32)在复合氨基酸核苷酸原液中加入活性炭脱色，除去热原物质，离心沉降除去杂质后得滤液，其利用途径分为三条：第一条途径是作为食品饮料添加剂原液，经(33)在此原液中加入适当的辅料，加工封装成为食品饮料添加剂;第二条途径(34)将滤液加入装有701树脂的离子交换层析柱中，进行柱层析处理，得精制的氨基酸核苷酸复合溶液;第三条途径(37)将滤液高温干燥、烘干得畜禽饲料添加剂。精制的氨基酸核苷酸复合溶液的利用途径分成两条：一条途径是经(36)消毒灭菌封装，制成复合氨基酸核苷酸水剂;另一条途径是经(35)高温烘干，制成复合氨基酸核苷酸粉剂。(38)无论是水剂和粉剂，根据不同的需要加入不同的辅料，配制成为食品、饮料、药品添加剂。

实施例2

本实施例是利用蚯蚓的酶体系，把动物体水解成氨基酸、核苷酸、甘油等小分子物质的方法。动物体，例如鱼、鳝鱼、鱼鳅、猪肉、牛肉、羊肉、蚕蛹和猪血、动物脂肪等，经④清洗、除杂质、粉碎后，成为纯净的动物原料，其颗粒大小在0.5～1.0毫米范围。⑤动物体粉碎后在100℃以上的温度蒸煮约20～30分钟，蒸熟后，冷却至25℃～28℃，加入微生物分解，得分解的动物原料。⑥在分解的动物原料中加入②的蚯蚓酶制剂5%～30%，混匀搅拌，得酶解反应物。(11)将酶解反应物在能恒温的反应器中进行水解反应，温度范围在37℃～70℃，最好55℃～60℃，相对湿度在80%～95%范围，最好85%，PH值在6～8范围，最好6.8，经48小时至72小时反应，得到动物体的酶解液（即动物体的水解产物），以下工艺流程从(13)至(38)均与实施例1完全相同。

实施例3

本实施例是利用蚯蚓的酶体系，把植物种子水解成氨基酸、核苷酸、甘油等小分子物质的方法。植物种子，例如大豆、大麦、小麦、玉米等含淀粉量多，尽量将淀粉取出利用后再作为水解原料，因为蚯蚓体中淀粉酶含量不高。植物种子经⑦清洗、粉碎、除杂质，成为纯净的植物原料，粉碎后的颗粒大小在0.10～0.50毫米范围。⑧纯净植物原料在100℃以上的高温蒸煮，约20至30分钟，加入微生物时的温度控制在25℃至28℃，相对湿度在85%～95%的范围，分解原料48小时，得分解的植物原料。⑨在分解的植物原料中加入②的蚯蚓酶制剂，按5%～30%配料，混匀搅拌，得酶解反应物。(12)将酶解反应物在能恒温的反应器中进行水解反应，温度范围在37℃至70℃，最好55℃至60℃，相对湿度范围在80%至95%，最好85%，PH值范围6.0～8.0，最好6.8，按原料与水的比例1∶1加水，在水密封条件下，经48～72小时酶解反应，得植物种子的酶解液（即植物种子的水解产物）。以下工艺流程从(13)到(38)均与实施例1完全相同。

Claims (11)

1、一种水解蛋白质、核酸、脂类的生化技术方法，其特征在于水解酶是蚯蚓自身的酶体系，不须分离提取，直接利用，直接进行水解反应，通过清洗、除杂、蒸煮、加入微生物、加入抑菌剂、配料拌匀、酶解反应等生化工艺处理方法，把蚯蚓体自身、或者动物体、或者植物种子的整体水解为含有氨基酸、核苷酸、甘油、脂肪酸为主要成分的多种物质组成的复合体(酶解液)。

2、根据权利要求1所述的蚯蚓酶解液、动物酶解液、植物酶解液的生化加工方法，其特征在于通过高温消毒灭菌，离心沉降过滤除去未水解的大分子物质和杂质，白酒保存浸提萃取，活性炭脱色除杂除去热原物质，酸碱处理、低温沉降、离心过滤除去重金属离子，高温蒸馏除去砷离子等有毒有害物质，离子交换层析精制等一系列生化工艺处理方法，对酶解液进行不同深度的加工处理，再根据不同的需要加入适当的辅料，配制成不同加工深度的生化产品系列，如高效抗病增丝灵、植物微生物营养添加剂、土壤改良剂、高效多能肥、健肤剂、畜禽饲料添加剂、食品饮料添加剂，精制的复合氨基酸核苷酸水剂和粉剂、药品添加剂等。

3、根据权利要求1所述的蚯蚓体自身的水解技术和方法，其特征在于洗净的蚯蚓在反应前加入1万单位/每公斤蚯蚓的青霉素或链霉素作为抑菌剂，在反应器中进行酶解反应的温度范围在37℃～70℃，最好55℃～60℃，湿度范围在80%～90%，最好85%，PH值控制在6.0～8.0，最好6.8，经48小时反应即得蚯蚓酶解液。

4、根据权利要求1所述的水解动物体的生化技术和方法，其特征在于粉碎后的动物体的颗粒大小在0.5～1.0mm的范围，蒸煮的温度要达到100℃以上，湿度在70%～100%，时间20～30分钟，煮熟后冷却，加入微生物分解48小时之后，再加入蚯蚓酶制剂5%～30%，混匀搅拌，加入抑菌剂，得酶解反应物，然后在反应器中进行酶解反应，反应温度范围在37℃～70℃，最好55℃～60℃，湿度范围在80%～95%，最好85～90%，PH值控制在6.0～8.0，最好6.8，在密闭恒温条件下经48至72小时反应即得动物酶解液。

5、根据权利要求1所述的水解植物种子的生化技术和方法，其特征在于粉碎后的植物种子的颗粒大小在0.1～0.5mm范围内，配料前除去种子中的淀粉为宜，蒸煮的温度要达到100℃以上，时间20～30分钟，冷却，加入微生物时的温度控制在25℃～28℃范围，相对湿度保持在85%～95%范围，经48小时分解，得到分解的植物原料，加入蚯蚓酶制剂5%～30%，配料、混匀、搅拌、再加入抑菌剂（青霉素或链霉素1万单位/每公斤原料），得酶解反应物，然后在反应器中进行酶解反应，温度范围在37℃～70℃，最好55℃～60℃，湿度范围在80%～95%，最好85%～90%，PH值控制在6～8，最好6.8，在密闭恒温条件下经48小时反应即得植物酶解液。

6、根据权利要求3、4、5所述的蚯蚓酶解液、或者动物酶解液、或者植物酶解液的进一步加工方法，其特征在于上述酶解液单独、两种、或者三种混匀后，经105℃～120℃高温（最好110℃）处理20～30分钟，消毒灭菌，得灭菌的酶解液。

7、根据权利要求2所述的生化产品高效抗病增丝灵的制造方法，其特征在于在灭菌的酶解液的滤液中加入20%的白酒和抗菌素（氯霉素或洁霉素）以及板兰根、黄连、大蒜等15味中药材的浸提液作为辅料，混匀后既可防腐又可治蚕病，经封装后即成为高效抗病增丝灵。

8、根据权利要求2所述的生化产品植物微生物营养添加剂、土壤改良剂、高效多能肥的制造方法，其特征在于在复合原液中加入蚯蚓粪提取液，再根据不同植物和微生物的需要，加入适量的氮、磷、钾和微量元素、生长素等物质配制而成。

9、根据权利要求8所述的蚓粪提取液的加工方法，其特征在于在蚓粪中加入焦磷酸钠溶液（浓度为0.3%），浸提3～7天。

10、根据权利要求2所述的除去酶解液滤液中的重金属离子的工艺处理方法，其特征在于在滤液中加入IN的NaOH溶液，调pH值至8.0，使滤液中能与碱作用的重金属离子发生沉淀反应，经低温沉降、离心过滤后，除掉一部分重金属离子，然后在所得的滤液中加入IN的HCl，调pH值至5.0，使其中能与酸发生沉淀反应的重金属离子沉淀下来，再经低温沉降离心过滤后，又除掉另一部分重金属离子。

11、根据权利要求2所述的去除酶解液滤液中的砷离子的工艺处理方法，其特征在于将除掉重金属后的滤液在高温108℃以上进行蒸馏处理，即能够把其中的砷化物和过量的酸同时蒸出去。

Images