CN101988081B

CN101988081B - 通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法

Info

Publication number: CN101988081B
Application number: CN2009100903727A
Authority: CN
Inventors: 张爱君; 伍一军; 秦启联; 李瑄; 张寰; 王红托; 苗麟; 杨青; 杜贺
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2009-08-06
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2029-08-06
Also published as: CN101988081A

Abstract

本发明提供一种通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法，适用于发酵、生物制药工业等所用蛋白胨的生产。本发明所提供方法的酶解条件如下：温度为10～85℃、时间为2～10小时、酶底比为100～1000u/g和pH1.0～11.0。本发明的方法将昆虫干粉脱脂后，按照不同的底物浓度、酶底比、不同种类的酶首先进行单因素实验，在单因素实验结果的基础上，选取两种酶进行正交试验，优化酶解工艺条件，得到高品质的昆虫蛋白胨粉。本发明所提供的方法工艺设备简单，操作简便，产品收率高，产品品质好，生产成本低。

Description

通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法。

背景技术

蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，质地细腻，易吸湿，具有特殊的肉香气息，富含微生物生长发酵及动物生长发育所需要的多肽、寡肽以及各种氨基酸成分。作为微生物培养基的主要原料，蛋白胨在医药工业、生化制品、抗生素、发酵工业以及微生物学研究等领域中应用广泛，需求量大。因含有丰富的氨基酸，尤其是硫氨基酸较高，且含有细菌生长需要的维生素和其它生长因子，蛋白胨在实验室用在培养基中进行细菌培养，其在培养基中的主要作用是为微生物生长提供氮源，一般用量为0.5％～5％。在饲料行业中，将蛋白胨用于饲料中可提高饲料的品质，有效改善饲料蛋白不足，降低饲料生产成本，提高饲料的利用效率。

一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白(酪蛋白、肉类)和植物蛋白(豆类)两种，不同蛋白来源的蛋白胨可以满足不同的生物体所需要的特定氨基酸和多肽。目前市场上销售的蛋白胨有鲜鱼蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨等，尚未见有昆虫源的蛋白胨。

目前，我国已出现昆虫养殖以及昆虫产品开发的热潮，农户养殖或者工厂化昆虫养殖规模空前壮大，其中以蝇蛆和黄粉虫的养殖热为代表。

家蝇(Musca domestica)，属双翅目昆虫，繁殖能力强，发育历期短，对环境适应强，具有较强的转化能力。目前国内家蝇的规模化生产技术已见成熟与完善，但蝇蛆产品开发层次较低，主要是将蝇蛆直接作为动物饲料加以利用，产品附加值较低。经试验粗略计算，干蛆粗蛋白含量约60％，据研究蝇蛆含有丰富的营养成分，蝇蛆原物质和粗制的蝇蛆干粉粗蛋白含量分别高达15％和60％以上，且氨基酸含量全面，必需氨基酸配比合理。蝇蛆养殖具有繁殖快，生产周期短，生产转化效率高，成本低，饲料来源广泛等显著优点，尤其是可以利用各种工农业有机废弃物，可以缓解环境污染，蝇蛆养殖的废弃物还可开发成促进作物生长的复合肥及抗虫抗病能力的杀虫剂或抗病制剂。

黄粉虫(Tenebrio molitor)，又名黄粉甲，因营养丰富又称面包虫，原产于美洲。其幼虫、蛹和成虫都含有丰富的蛋白质和多种氨基酸，具有高蛋白、低脂肪的特点，富含磷、钾、铁、钠、铝等多种微量元素和维生素。黄粉虫能利用和转化以农作物秸秆为主的农业有机废弃物，成为人类可利用的高蛋白、低脂肪、多氨基酸的营养来源，同时还解决了大量秸秆资源浪费与污染环境的问题。黄粉虫幼虫含蛋白高达50％～60％，氨基酸种类齐全，氨基酸比例均衡。黄粉虫食性杂，饲料来源广、廉价，以麦麸为主，兼食各种杂粮、油料和粮油加工的副产品，各类蔬菜和果皮。抗病力强、生长周期短，易于养殖，生产无污染，生产成本低，投资小，随时随地可养殖，国内黄粉虫养殖户数量众多，黄粉虫产量高。此外，黄粉虫粪便经化验含氮3.37％、磷1.04％、钾1.04％，同时含有丰富的锌、锰、硼、铁、镁、钙、铜七种微量元素。施用以虫粪沙为主要原料的高效生物有机肥不仅能增肥土壤，增加农作物产量，提高农产品品质，还能降低农业生产成本，改善土壤结构，改善农业生态环境，可促进种植业的可持续发展。

蛋白胨的制备常采用酸水解、碱水解和酶水解等方法。采用酸水解动植物蛋白时，盐酸在高温下与油脂分解后的产物反应会生成有害甚至有毒的化学物质。水解后的产物一般颜色较深，需要进行脱色处理。工业上一般采用成本较低、浓度约30％的氢氧化钠溶液作为中和剂，中和产生大量的盐分，脱盐工作大大增加了生产成本。而且中和作用使水解液的温度、pH值升高，促进了类黑素的生成以及蛋氨酸分解为二甲基硫醚的反应，使中和时水解液色泽变深，水解液的异味增强，增加脱臭难度。油脂的分解产物脂肪酸在中和时同氢氧化钠反应，生成脂肪酸钠，造成产品荧光效应，降低品质。碱水解同样存在脱盐、脱色以及产品荧光效应等问题。碱水解过程中多数氨基酸会遭到不同程度的破坏，酸水解中色氨酸全部被酸破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等也有一小部分被分解，而酶水解不破坏氨基酸，因其操作简便、成品质量稳定、品质优良而逐渐取代了酸碱等化学法。但仅使用一种酶进行水解动植物蛋白往往水解不够彻底，需几种酶协同作用才能使蛋白质水解较为完全，使用单一酶水解动植物蛋白生产蛋白胨存在水解收率较低的局限。

发明内容

在本发明中，所使用的术语“酶底比”，是指单位质量蝇蛆干粉[g]的酶用量[u]。

本发明的目的在于，提供一种通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法。

本发明的另一个目的在于，提供上述方法所制备的昆虫干粉蛋白胨及其用途。

本发明的又一个目的在于，提供一种昆虫干粉的新用途。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法，该方法的酶解条件如下：温度为10～85℃、时间为2～10小时、酶底比为100～1000u/g和pH 1.0～11.0；优选地，所述酶解条件如下：温度为30～55℃、时间为4～8小时和酶底比为300～800u/g；更优选地，所述酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意两种。

优选地，所述方法还包括升温灭酶的步骤；更优选地，所述升温灭酶的条件如下：温度为80～100℃、时间为15～45分钟和pH 5.5～7.8。

优选地，所述方法还包括过滤除杂、干燥及灭菌的步骤；更优选地，所述干燥的条件如下：温度为80～100℃、时间为2～4小时。

优选地，所述方法还包括在酶解前的对昆虫干粉进行脱脂的步骤；更优选地，所述脱脂包括：在120～135℃下，用石油醚浸提25～45分钟，淋洗30～60分钟，干燥回收，即得脱脂粉。

优选地，所述昆虫粉选自蝇蛆干粉和黄粉虫干粉。

在一个优选的实施方案中，所述蝇蛆干粉的酶解条件如下：酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意两种，温度为40～55℃，时间为4～8小时，酶底比为400～800u/g和pH 8.0～9.0；优选地，所述蝇蛆干粉的酶解条件为采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，温度为55℃、时间为4小时、酶底比为400u/g和pH 8.0。

在一个优选的实施方案中，所述黄粉虫干粉的酶解条件如下：酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意两种，温度为30～45℃，时间为4～8小时，酶底比为300～700u/g和pH 1.5～2.5；优选地，所述黄粉虫干粉的酶解条件为采用胃蛋白酶和酸性蛋白酶，温度为40℃，时间为6小时，酶底比为300u/g和pH 2.0。

另一方面，本发明提供了上述方法制备的昆虫干粉蛋白胨。本发明还提供了上述昆虫干粉蛋白胨在制备微生物培养基或饲料中的用途。

又一方面，本发明还提供了昆虫干粉在制备蛋白胨中的用途。

优选地，所述昆虫干粉包括不同来源的蛋白含量高、氨基酸全面、配比合理，同时富含多种微量元素和维生素的昆虫干粉，优选选自蝇蛆干粉和黄粉虫干粉。

综上所述，本发明的方法是采用以下技术方案来实施的。先将昆虫干粉脱脂，使用索氏浸提系统，在120～135℃条件下，用石油醚浸提25～45分钟，淋洗30～60分钟，预干燥10～25分钟，干燥回收25～45分钟。脱脂结束后，样品置通风橱内充分干燥，即得脱脂粉。经实验证实，如不脱脂，会发生严重的皂化反应等不良反应，严重降低产品品质。随后，分别对脱脂粉进行不同酶、底物浓度及酶底比的单因素实验。在单因素实验的基础上，选取两种反应条件较为接近、蛋白胨收率较高的酶，对温度、pH值、酶底比和时间这四个主要影响因素采用正交试验，进行优化酶解工艺条件，以期得到较高的收率，考察指标为昆虫干粉水解后的收率。昆虫干粉中按照一定的酶底比加入一定量两种蛋白酶，然后加入一定体积的蒸馏水搅匀，调节料液pH值，在一定温度下保温水解一段时间。酶解实验结束后，调节pH并升温至80～100℃，保温15～45分钟，过滤除杂，喷雾干燥。然后置于80～100℃烘2～4小时，密封，干热或湿热灭菌，得到昆虫蛋白胨粉。根据正交试验结果，确定优化后的酶解条件，并进行酶解实验验证。

由此可见，本发明具有以下优点和效果：

1)原料来源广泛，生产成本低。蝇蛆养殖与黄粉虫养殖是当前的热点，养殖技术已经非常成熟，农户养殖或者工厂化养殖颇具规模。因此，采用蝇蛆干粉、黄粉虫干粉等生产蛋白胨，不仅原料来源广泛，生产成本低，而且具有一定的社会生态效益。其中，养殖蝇蛆进行蛋白胨开发，可以配合昆虫病毒生物杀虫剂产业化工作同时进行，解决病毒生产中废饲料的再利用问题。目前，已有采用人工饲料进行大批量生产棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾等宿主昆虫，用于扩增生产相应的病毒生物杀虫剂，会产生大量的废弃昆虫人工饲料需要处理，这些废弃人工饲料主要由农副产品组成，营养丰富，组分中不含对健康有害的物质，直接丢弃则导致资源浪费和环境污染。利用蝇蛆生活力强、转化效率高的优势，使用废饲料养殖蝇蛆，将获得的蝇蛆进行深加工，可以得到高附加值的产品，经蝇蛆利用过的废饲料没有异味，质地疏松，是适合养花、种菜的优质有机肥，还可加工成复合肥，从而形成高效率的资源充分利用的产业链。

2)本发明在单因素的基础上对酶解工艺过程进行正交试验，优化酶解工艺条件，为提高产品收率、降低生产成本提供可靠的理论依据。由于采用优化后的工艺条件进行双酶水解昆虫干粉，因此产品质量高，收率高。

3)本发明酶解工艺过程所需设备简单，易于操作。而且采用昆虫干粉生产蛋白胨，原料易得，来源广泛，成本低。

4)本发明生产的蛋白胨可用作微生物培养基，提供氮源，也可添加至饲料中，改善饲料品质。

因此，本发明选用来源广泛、生产成本低廉的蝇蛆干粉和黄粉虫干粉作为原料，在单一酶的单因素实验基础上，选取两种酶进行正交实验，对酶解昆虫干粉生产蛋白胨的工艺流程进行优化，研究出新的蛋白胨生产工艺，适用于发酵、生物制药工业等所用蛋白胨的生产。本发明降低了生产成本，提高了产品品质和产品收率，为蛋白胨的生产提供理论参考。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明以蝇蛆干粉为原料酶解制备蛋白胨正交试验的综合方差分析。

图2为本发明以黄粉虫干粉为原料酶解制备蛋白胨正交试验的综合方差分析。

具体实施方式

实施例1：以蝇蛆干粉为原料酶解制备蛋白胨的方法

首先将一定细度的蝇蛆干粉脱脂，即使用索氏浸提系统，在125℃下用石油醚浸提30分钟，淋洗40分钟，预干燥10分钟，干燥30分钟，然后置通风橱内充分干燥，得脱脂蝇蛆粉。称取脱脂蝇蛆粉2g，加入水后，在水温45℃下，分别加入不同种类的酶进行反应，用4M HCl或3M NaOH溶液调节pH，在一定温度下保温反应4小时，每处理3次重复，分别按照不同的底物浓度(即蝇蛆干粉[g]与水[ml]的配比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50)、酶底比(即单位质量蝇蛆干粉[g]的酶用量[u]分别为200u/g，400u/g，600u/g，800u/g和1000u/g)、不同酶种类(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)进行单因素实验。考虑到生产成本，结果表明，较为合适的底物浓度为蝇蛆干粉与水的比例为1∶20时，较为合适的酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，较为合适的酶底比为200～800u/g。本实施例中选取木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行正交试验，选取二酶较为适宜的条件进行正交试验，优化反应条件。正交实验测定各因素及水平见表1。

采用SPSS软件将测定因素及水平进行组合，然后依据各组合条件进行试验，酶解结束后，调节料液pH 7.5，然后升温至100℃，保温30分钟，冷却后过滤，喷雾干燥，灭菌得蝇蛆蛋白胨粉。对正交试验结果进行统计分析，结果见图1，其中同一曲线上相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

表1 蝇蛆蛋白胨制备的正交实验测定因素与水平

考虑到生产成本，图1中结果表明较适合的工艺因素组合为A2B4C2D1，即：酶底比为400u/g，温度为55℃，时间为4小时，pH 8.0。在此优化条件下实验，所得蛋白胨收率达60％。

实施例2：以黄粉虫干粉为原料酶解制备蛋白胨的方法

首先将一定细度的黄粉虫干粉脱脂，即使用索氏浸提系统，在130℃下用石油醚浸提45分钟，淋洗45分钟，预干燥15分钟，干燥35分钟，然后置通风橱内充分干燥，得脱脂黄粉虫粉。称取脱脂黄粉虫粉2g，加入水，在水温40℃下，分别加入不同种类的酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶)进行反应，用4M HCl或3M NaOH溶液调节pH，在一定温度下保温反应6小时，每处理3次重复，分别按照不同的底物浓度(即黄粉虫干粉[g]与水[ml]的配比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)、酶底比(即单位质量蝇蛆干粉[g]的酶用量[u]分别为200u/g、400u/g、600u/g、800u/g和1000u/g)、不同酶种类(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶)进行单因素实验，考虑到生产成本，结果表明较为合适的底物浓度为黄粉虫干粉与水的比例为1∶30时，较为合适的酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，较为合适的酶底比为100～700u/g。本实施例中选取胃蛋白酶和酸性蛋白酶进行正交试验，选取二酶较为适宜的条件进行正交试验，优化反应条件，正交实验测定各因素及水平见表2。

采用SPSS软件将测定因素及水平进行组合，然后依据各组合条件进行试验，酶解结束后，调节料液pH 6.0，然后升温至90℃，保温20分钟，冷却后过滤，喷雾干燥，灭菌得黄粉虫蛋白胨粉。对正交试验结果进行统计分析，结果见图2，其中同一曲线上相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

表2 黄粉虫蛋白胨制备的正交实验测定因素与水平

考虑到生产成本，图2中结果表明较适合的工艺为A2B3C3D3，即：酶底比为300u/g，温度为40℃，时间为6小时，pH 2.0时。在此优化条件下实验，蛋白胨收率达65％。

Claims

1.一种通过双酶水解昆虫干粉制备蛋白胨的方法，其特征在于，该方法的酶解条件如下：温度为10～85℃、时间为2～10小时、酶底比为100～1000u/g和pH1.0～11.0，所述方法还包括在酶解前的对昆虫干粉进行脱脂的步骤；所述酶选自碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意两种；所述脱脂包括在120～135℃下，用石油醚浸提25～45分钟，淋洗30～60分钟，干燥回收，即得脱脂粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶，所述中性蛋白酶为胰蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括升温灭酶的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述升温灭酶的条件如下：温度为80～100℃、时间为15～45分钟和pH5.5～7.8。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括过滤除杂、干燥及灭菌的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述干燥的条件如下：温度为80～100℃和时间为2～4小时。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述昆虫粉选自蝇蛆干粉和黄粉虫干粉。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蝇蛆干粉的酶解条件如下：酶选自碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意两种，温度为45～55℃，时间为4～8小时，酶底比为400～800u/g和pH8.0～9.0。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蝇蛆干粉的酶解条件中，所述碱性蛋白酶为木瓜蛋白酶，所述中性蛋白酶为胰蛋白酶。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述蝇蛆干粉的酶解条件为采用木瓜蛋白酶和除木瓜蛋白酶之外的其它任意一种碱性蛋白酶，温度为55℃、时间为4小时、酶底比为400u/g和pH8.0。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述黄粉虫干粉的酶解条件如下：酶选自木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意两种，温度为30～45℃，时间为4～8小时，酶底比为300～700u/g和pH1.5～2.5。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述黄粉虫干粉的酶解条件中，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述黄粉虫干粉的酶解条件为采用胃蛋白酶和除胃蛋白酶之外的其它任意一种酸性蛋白酶，温度为40℃，时间为6小时，酶底比为300u/g和pH2.0。

14.权利要求1至13中任一项所述方法制备的昆虫干粉蛋白胨。

15.权利要求14所述的昆虫干粉蛋白胨在制备微生物培养基或饲料中的用途。