CN1710091A - 一种提高玉米蛋白水解度和降解率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化技术领域。涉及酶解玉米蛋白制备寡肽的方法。其主要特征是，以玉米蛋白，玉米渣中的任何一种为原料，在不外加碱的pH值渐变条件下，利用特殊的热处理和酶解的方法达到高的水解度和降解率。热处理的温度100－160℃，热处理时间1－10h，水解的条件是温度30－60℃，时间为1－24h，底物浓度20－200克/升。本发明的效果和益处是，整个水解过程中不用向水解液中补加碱溶液，因此简化了产品的下游处理工艺，并有利于降低寡肽的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于酶催化技术领域。涉及到酶催化水解玉米蛋白，提供了一种在不外加碱的pH值渐变条件下，利用特殊的热处理的方法达到比单独使用酶水解高的水解度和降解率。
背景技术
玉米又称玉蜀黍，是世界三大粮食作物之一，又是重要的饲料，由于其单产高，增产潜力大，在农业生产中占有重要的地位。作为工业原料，玉米比甘薯含有较高的脂肪和蛋白质，因而自50年代以来，世界上的淀粉、淀粉糖、酒精工业也愈来愈多的用玉米代替甘薯作原料，这也大大的促进了玉米生产的发展。世界上以美国为玉米第一生产大国，年产2亿多吨，其播种面积占全世界20％以上，产量占46％。目前，我国玉米的总产量居世界第二位，占世界总产量的20％，占我国粮食总产量的25％。可以看出，我国的玉米的生产是很有潜力的。
但是在我国玉米加工主要是提取淀粉，只利用了玉米的50-60％作为商品淀粉，其余的大部分以粗饲料或者当作“三废”处理和排放，不仅极大浪费了资源，经济效益低，而且造成了环境污染。我国玉米人均只有90kg/年，所以必须对我国不太富裕的玉米资源进行综合开发利用；对玉米进行深加工和再次利用是发展食品工业和蛋白工业之急需，也是农业产业化之急需；在以玉米为原料的工业企业中，实行食品和饲料的联产，可以更好的提高玉米的经济效益，带动玉米生产的发展。
玉米淀粉生产中提取淀粉后的主要副产物称为玉米面筋粉(CGM，俗称玉米渣)，它是玉米蛋白的一种常见形式。CGM含有蛋白质约60％，其中玉米醇溶蛋白约占68％，谷蛋白约占28％，同时含有少量的球蛋白和白蛋白。玉米蛋白粉水解后得到多种氨基酸，其中人体必需氨基酸的含量高于大豆和小麦，这些氨基酸通过生物工程可获得具有多种生理功能的活性肽。玉米蛋白肽不仅具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，而且其粘度低、浓度高，在体内吸收快、利用率高。玉米蛋白经过酶水解后，变成分子量较小的肽还可以释放出抗氧化性、消除疲劳、降低血氨浓度、降血压、促进乙醇代谢等独特的生理活性。玉米肽的开发成功将会对玉米深加工业产生重大影响，也将为人们的健康提供一个良好的新食物源，是一种比较理想的新型玉米深加工产品。由于该产品的应用范围很广，市场开发潜力很大，因此，潜藏着巨大的商机和很好的经济效益。
我国对生物活性肽研究开发起步晚，近几年研究逐步活跃起来。1997年翟瑞文等用地衣芽抱杆菌碱性蛋白酶对玉米面筋粉进行水解，获得制取玉米肽饮料的工艺。1998年翟瑞文等又报道了玉米肽的制备特性与应用的研究结果。2000年鲁晓翔等报道了酶法改性玉米蛋白功能特性的研究结果，该研究主要材料为玉米蛋白粉，所用酶为胰蛋白酶。同年王遂等报道了微生物蛋白酶对玉米皮蛋白水解作用的研究，他们采用枯草芽抱杆菌蛋白酶对玉米皮蛋白水解，使其转变为可溶性多肤，最终达到分离、提取蛋白肽的目的。1999年王梅等报道了酶解黄粉蛋白制备可溶性肽的研究，所用酶为碱性蛋白酶，讨论了温度、pH、底物浓度、酶浓度及预处理对水解的影响。2002年何慧等报道了大豆和玉米蛋白酶解肽及其活性研究，所制备活性肽具有抗经基自由基活性。
玉米肽在食品工业中的应用还很少，这主要是因为玉米蛋白中的醇溶蛋白有大区域的α-螺旋结构，N末端有很强的疏水性，是高憎水蛋白，它只溶于异丙酮或乙醇水溶液中；而谷蛋白只溶于碱水溶液中。因此，玉米蛋白与其他的商业化蛋白资源相比，食品功能特性差。在通常条件下，蛋白质只有处于溶解状态时，才能表现良好的功能特性，才具有实用性。为了提高玉米蛋白粉的水溶性，就必须通过改变其结构，达到改善其功能性质的目的。其次，酶解生产工艺中的一些难题也是制约其应用的一个主要原因。在酶解玉米蛋白的过程中，近年来的研究大都是在水解的过程中外加碱维持一定PH，在碱性环境下酶解以得到较高的水解度。如在pH6.5-8.5的碱性环境中，碱性蛋白酶的水解效率高，但是，在酶解过程中，随着蛋白质肽键的不断打开，游离出的羧基数量不断增加，水解液的pH值会不断下降。因此，在单纯使用碱性蛋白酶的情况下，必须通过补加碱液，稳定pH值，从而维持碱性蛋白酶的水解活性，否则，难以得到满意的原料水解度和寡肽含量。由于盐类杂质的引入，必须在下游处理中采用复杂的脱盐除杂操作，这将增加现有方法实施的难度和产品的成本。综上所述目前的研究总结起来还存在如下问题：一是大多集中在高得率玉米肽所用蛋白酶的筛选上的研究，且一般均是采用单一酶对玉米蛋白粉进行水解；二是在水解过程中无一例外的采用外加碱来维持PH
为了解决以上两个问题，我们开展了对玉米蛋白进行酶解的研究，通过一种特殊的热处理步骤和酸性蛋白酶酶解相结合的方法，在没有外加碱的PH渐变条件下，得到一些有益的试验结果。
国内关于酶解玉米蛋白的专利很少，但由于玉米蛋白属于植物蛋白，是一种蛋白资源，因此一些蛋白酶解的专利对玉米蛋白的酶解是有参考价值的。
以下是已公开的关于蛋白酶解的相关专利：
专利96119603.3的发明涉及一种蛋白质酶解物及其制备方法，其特征是先将经加热变性处理并去掉蛋黄和蛋壳的卵白蛋白加水搅拌成乳状，然后在温度为55℃±1℃、pH值为7～8的条件下加胰酶进行酶解，酶解时间为7～8小时，最后将酶解液离心分离成清液和残渣，去掉残渣，将清液加热至沸后冷却至室温备用。本发明酶解时使用胰蛋白酶。
专利98104693.2的发明公开了一种动植物混合蛋白水解制备营养酱油的方法。它是将1千克蚕蛹和(2～7)千克水粉碎至浆状液，加热、冷却、去油。接着，加入脂肪酶和蛋白酶酶解。与1千克脱脂大豆配合后，加入(2～7)千克食用盐酸水解，其压滤液加入碳酸钠中和，再过滤所得中和液加入活性碳脱色、脱臭。再次过滤液加入食盐、食糖、焦糖色、食用调梓料和山梨酸钾，搅拌均匀后，灌装、灭菌。本发明酶解使用脂肪酶和蛋白酶。
专利00103392.1的发明为一种以大豆分离蛋白为原料生产小分子量肽的制备方法及其所用设备。本方法包括使大豆分离蛋白和水混合后经灭菌、冷却、加酶、调pH进行酶解反应，酶解后再经调pH值、升温、保温后灭菌，及过滤、浓缩、干燥即可。本发明在酶解时调PH。
专利03157121.2一种大豆蛋白活性肽的制作方法，经过提取、分离、微滤、膜超滤、酶解等过程。本发明酶解过程加入了碱，产生了大量盐类。
专利03117586.4的发明是一种从大豆废渣中制备多肽的技术，将预处理过的提取大豆异黄酮后的大豆废渣100份、去离子水100～300份、多元复合蛋白酶0.2～1.0份搅拌均匀后，在pH＝5～7，温度40～60℃下酶解反应5～24小时；再调节酶解液的pH值为4.0～4.5，去除未水解的蛋白质沉淀，用活性炭脱苦脱色，再以色谱法脱盐，采用超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术进行分级和浓缩，得到不同分级水平分子量和结构、具有不同生物功能的天然活性肽。本发明利用了多次酶解，且加入碱调节了PH值。
专利00809847.6的发明提供了含有酶催化水解玉米蛋白的可吸收及可降解的口香糖胶基和口香糖。使用中性、碱性、酸性蛋白酶，但没有热处理过程。
专利200310115958.7的发明属于生物技术领域，具体涉及一种低分子量的功能玉米短肽产品、利用酶法直接降解玉米蛋白粉中的玉米蛋白制备该短肽的方法及该短肽产品的应用。制备方法涉及原料预处理、酶水解、酶灭活、精制和干燥制粉等步骤。该发明原料预处理用碱调PH，酶选用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或卡纸谷草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶，蛋白质水解度达到10-30％。
专利03132522.x的发明涉及的是一种玉米蛋白酶解制备高F值低聚肽的生产方法。将玉米蛋白粉加水配成溶液，调pH8.0，加入亚硫酸钠Na2SO3，在50℃-60℃温度下保温搅拌；加入枯草杆菌碱性蛋白酶，恒温搅拌水解后，进行离心取上清液进行超滤；用将滤液的pH调至6.0，温度保持恒定为50℃，加入木瓜蛋白酶搅拌反应；调pH值至2.5，灭活、离心去残渣得到二步水解液，通过阴阳离子交换树脂进行脱盐处理，再加入7号活性炭，30℃保温搅拌后过滤即得产品。本发明采用多次酶解同时调PH的方法制备寡肽。
专利200410006119.6的发明涉及大米蛋白肽的制备方法及其用途，本发明利用味精生产中的废料和廉价易获得的酶制剂，通过双酶法水解，生产出大米蛋白肽。
专利00107727.9，00110471.0，01107935.5，01142823.6，03157121.2，200310112130.6等是对大豆蛋白经过加入盐酸或氢氧化钠调节PH值进行水解，加入植物蛋白酶或微生物蛋白酶酶解从而得到蛋白水解液，最后再中和溶液。这些专利的缺点，同样是引入了盐类杂质。
发明内容
本专利的目的是利用酶解法的优点，但是不外加碱不引入盐类杂质，而可以提高水解度降解率的方法。在酶解反应前，采用一定预处理使之适当变性，使蛋白质的二级、三级结构变得松散，以增加酶与它的接触位点，提高酶解效果。本发明采用密闭的加压加热容器对玉米蛋白进行热处理，可以达到不外加碱不引入盐类杂质，而可以提高水解度降解率的目的。
具体来说，本发明的目的是将玉米的下脚料玉米蛋白通过特殊的热处理和酸性蛋白酶相结合的方法来达到较好的水解效果，同时在酶解过程中不用加碱调PH值。最后得到的产品具有较好的物理性质和生理活性。
本发明技术方案及具体的步骤如下：
在金属釜中按照底物浓度要求向其中加入一定量的玉米蛋白，加入适量自来水，密闭金属釜，在烘箱中加热数小时。开釜后将原料液转移到带有机械搅拌装置的普通发酵罐中，启动机械搅拌浆，使之以适当的速度搅动浆液，同时通过水夹套或/和水蒸汽直接接触将反应浆液温度提到指定温度。用pH计和固定于发酵器内的pH计电极测定水解反应之前的浆液酸碱度。然后，向发酵罐中加入蛋白酶，开始水解反应。最后，用pH计监测水解液酸碱度的变化，并通过采样(搅拌均匀的水解液)分析不同时刻的原料降解率、蛋白质水解度和水解物中肽分子量分布。水解反应结束之后，将水解液在95℃煮沸5-10分钟使蛋白酶变性失活，终止反应。
本发明的核心是热处理的温度和时间，影响本发明实施效果的水解条件包括底物浓度、水解温度和时间。
本发明中使用的酸性蛋白酶为黑曲霉酸性蛋白酶，来源于黑曲霉，使用pH值2-5.0，使用温度45-65℃。
本发明中预热温度和时间的选择根据原料液的颜色和味道来确定。温度在100-160℃，时间在1-10小时选择。当温度越高时间越长，原料液颜色呈深褐色，味道呈焦糊味，会对接着的酶解液造成不好的影响，如脱色，脱苦。
黑曲霉酸性蛋白酶的投放量以酶固体占底物重量的百分率表示。水解温度的选择主要取决于酶的使用温度。本发明可采用任何玉米蛋白为原料，根据本发明，底物浓度的选择范围为20-200克/升。底物浓度太高时，酶的水解活性低，难以得到满意的底物降解率。另一方面，底物浓度太低，虽然酶的水解活性高，但会增加下游处理过程中蒸发、浓缩水解液的难度。
本发明的实施效果可以用玉米蛋白原料(底物)的降解率和蛋白质的水解度两个指标衡量。底物降解率定义为被水解的玉米蛋白原料重量占投料的玉米蛋白原料重量的百分比；水解度定义为在水解过程中打开的肽键数量占蛋白质分子总肽键数量的百分比。
降解率的测定方法如下：水解液在4000r/min下离心10min，把上层清液和固体物分离，将固体不溶物在110℃下干燥至恒重，称重。然后按下式计算底物降解率：
降解率＝(底物投料量-剩余残渣量)/底物投料量
其中，玉米蛋白投料量折算成干基。玉米蛋白的含水量是在110℃下干燥至恒重后测定的。
蛋白质水解度的测定采用甲醛滴定法，具体测定方法如下：将水解液在4000r/min下离心10min，取5ml上层清液，用0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液滴定到pH＝8.2，加入5毫升37％的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用氢氧化钠滴定到pH＝8.2)，再用0.1摩尔/升的氢氧化钠滴定到pH＝8.2。记录加入甲醛后把溶液滴定到pH＝8.2所耗碱量。pH值测量使用精密pH计。然后按照下式计算蛋白质的水解度：
其中，玉米蛋白彻底水解的方法是将玉米蛋白在6摩尔/升盐酸中于105-110℃下水解24个小时。
根据本发明，玉米蛋白在以上所述的条件下水解的适宜时间范围为1-24小时。在此条件下，玉米蛋白原料的降解率可以达到10-40％，蛋白质的水解度可以达到10％以上。同时，通过电泳和凝胶层析的方法分析了肽分子量的分布，发现水解物的分子量分布是连续的，且小于5000。在最佳水解条件下，水解8h，水解物的平均分子量达到2170，水解24小时，水解物的平均分子量达到1479。通过高效液相色谱分析水解物的氨基酸组成，发现水解产物中的氨基酸含有人体必须的几种氨基酸，且随着水解时间的延长，氨基酸含量逐渐增加，其中谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸等几种氨基酸尤其增加的多。
本发明的效果和益处是，整个水解过程中不用向水解液中补加碱溶液，因此简化了产品的下游处理工艺，并有利于降低寡肽的生产成本。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1.将16克玉米浓缩蛋白(干基重量)和200毫升自来水加入金属釜中，140℃预热6小时，之后转移到带有水夹套的发酵罐中，在搅拌下将发酵罐内的温度提高到60℃。通过pH计测得发酵罐内料液的pH值约为4.0。然后，向发酵罐内加入10％(以底物干基重量为基准)的黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)，在不断搅拌下开始水解。在本例中，底物浓度为80克玉米蛋白/升水，总水解时间为24小时。在水解过程中对底物降解率和蛋白质水解度进行跟踪分析。分析结果为：底物降解率在考察时间内持续增加，水解时间8h，在此水解条件下，水解度达到19.85％，降解率达到了36.70％，且随着时间延长，水解度和降解率增加缓慢，但蛋白质水解度在考察时间内持续增加，当水解时间达到24小时时，水解度增加到21.74％，降解率达到40.36％。
实施例2.将16克玉米浓缩蛋白(干基重量)和200毫升自来水加入金属釜中，140℃预热4小时，之后转移到带有水夹套的发酵罐中，在搅拌下将发酵罐内的温度提高到60℃。然后，向发酵罐内加入2％(以底物干基重量为基准)的黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)，在不断搅拌下开始水解。在本例中，底物浓度为80克玉米蛋白/升水，总水解时间为10小时。在水解过程中对底物降解率和蛋白质水解度进行跟踪分析。分析结果为：底物降解率在考察时间内持续增加，水解时间6小时，在此水解条件下，水解度达到6.35％，降解率达到了28.42％，且随着时间延长，水解度和降解率增加缓慢，但蛋白质水解度在考察时间内持续增加，当水解时间达到10小时，水解度增加到7.48％，降解率达到31.63％。
实施例3.将12克玉米浓缩蛋白(干基重量)和200毫升自来水加入金属釜中，140℃预热6小时，之后转移到带有水夹套的发酵罐中，在搅拌下将发酵罐内的温度提高到55℃。然后，向发酵罐内加入4％(以底物干基重量为基准)的黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)，在不断搅拌下开始水解。在本例中，底物浓度为60克玉米蛋白/升水，总水解时间为1小时。在此水解条件下，水解度达到8.22％，降解率达到33.21％。
实施例4.将24克玉米浓缩蛋白(干基重量)和200毫升自来水加入金属釜中，140℃预热6小时，之后转移到带有水夹套的发酵罐中，在搅拌下将发酵罐内的温度提高到55℃。然后，向发酵罐内加入10％(以底物干基重量为基准)的黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)，在不断搅拌下开始水解。在本例中，底物浓度为120克玉米蛋白/升水，总水解时间为1小时。在此水解条件下，水解度达到13.00％，降解率达到21.91％。
Claims (1)
1.一种提高玉米蛋白水解度和降解率的方法，其特征在于，在不外加碱的pH值渐变条件下，利用特殊的热处理酶解的方法比单独使用酶水解方法得到高的水解度和降解率；其中，热处理的温度是100-160℃，黑曲酸性蛋白酶，水解条件为温度30-60℃，时间1-24小时。底物浓度20-200克/升。
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