CN104619716A - 在原核细胞周质中产生多肽的方法 - Google Patents

在原核细胞周质中产生多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明报道了用于产生多肽的方法，所述方法包括约25℃下，在溶液中孵育(重悬)原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的Tris-HCl和约2mM至约6mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。

Description

在原核细胞周质中产生多肽的方法
本文报道了在原核细胞中产生多肽的方法，其中使用存在螯合剂的缓冲系统中的孵育步骤，在确定pH值和温度值下，从原核细胞周质中回收重组产生的多肽。
背景技术
具有合适的信号序列时，重组产生的多肽可以被分泌到大肠杆菌细胞的周质间隙中(Joly,J.C.和Laird,M.W.,Periplasm编著，Ehrmann,M.,ASM印制,Washington D.C.,(2007)345-360)。在化学氧化环境中二硫键形成，由此有利于多肽在功能上的正确折叠。这些多肽从周质间隙中的选择性分离是所希望的，以避免来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白(HCP)的污染。由此，有利于随后的多肽纯化。
示例性分离方法是如Ren,G.等,J.of Bacteriology 189(2007)2777-2786所描述的渗压冲击。使用该方法，溶解于TRIS缓冲液(pH为7.2)中的EDTA使原核细胞外膜去稳定，这使得蔗糖渗透到周质间隙。蔗糖是不能透过内膜的。之后通过离心除去TRIS-EDTA缓冲液中，将细胞迅速重悬于冰冷的蒸馏水中。由此水浸入充满蔗糖的周质间隙，通过周质体积的增加使不稳定的外膜崩解。添加氯化镁重新稳定外膜。
可以在Humphreys,D.P.(The Periplasm(编著)Ehrmann,M.，第361-388页，Washington,D.C.:ASM印制(2007))和Middelberg,A.P.(Biotechnol.Adv.13(1995)491-551)中找到其他方法。
根据Joly和Laird(见上文)，“当培养体积达到或高于10升时，以小规模分离周质级分(fraction)的常规方法(如原生质体或渗压冲击处理)实际上不能完成”。“从外部介质回收蛋白或在仅破坏外膜和肽聚糖后回收蛋白仍然是尚未在大规模上付诸实践的一个目标”(第354页)。
在WO2012/013930中报道了，从表达重组蛋白和二硫化物异构酶DsbC的革兰氏阴性细菌宿主细胞的样品或提取物纯化重组蛋白，包括调节样品或提取物的pH值以沉淀和分离DsbC。在WO01/94585中报道了特异于人肿瘤坏死因子(TNF)-α的新型抗体对于治疗TNF-α介导的疾病是有用的，例如，充血性心力衰竭、败血症或内毒素性休克、恶病质和成人呼吸窘迫综合症。在美国2005/048056中报道了制备具有重链和轻链的肿瘤坏死因子-α抗体，包括发酵细胞混合物、形成细胞沉淀、并允许沉淀持续放置一段时间。
在WO 2007/106120中报道了调节肽分子组织，分布包括向组织施用包含血清白蛋白结合肽的缀合物分子。在WO01/45746中报道了对免疫球蛋白(Ig)G、IgM和/或人血清白蛋白具有亲和性的肽配体可被缀合，并用于延长活性剂从循环中清除的半衰期。在美国2004/001827中报道了调节肽分子的组织分布，用于增强治疗功效并减少副作用，其包括向组织施用包含肽的配体结构域和活性结构域的缀合物分子。
发明内容
在本发明中已经发现，通过在室温下使细胞接触pH值约为8的含有缓冲剂(如Tris)和螯合剂(如EDTA)的溶液、或孵育细胞与pH值约为8的含有缓冲剂(如Tris)和螯合剂(如EDTA)的溶液，可以从原核细胞的周质中分离重组产生的多肽。该方法能够在大规模生产过程中以高产率和纯度分离重组产生的多肽。分离的多肽对下游处理(例如纯化)显示出良好的可行性。
如本文中所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在溶液中孵育原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的缓冲剂和约0.5mM至约9.5mM的螯合剂，所述溶液的pH值约7至约10。
在一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺、次氮基三乙酸(NTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸(BAPTA)、乙二胺-N，N'-二琥珀酸(EDDS)、膦酸盐(如乙二胺四(亚甲基膦酸)EDTMP或二亚乙基五(亚甲基膦酸)DTPMP)、柠檬酸、卟啉类化合物(如血红素、叶绿素或维生素B12)。在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
如本文所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在约25℃在溶液中孵育(重悬)原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的Tris-HCl和约2mM至约6mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
如本文所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在约25℃在溶液中孵育(重悬)原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的Tris-HCl和约2mM至约4mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约1mM至约6mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约1mM至约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约1mM至约3mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约2mM至约6mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约2mM至约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约2mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约6mM。
在一个实施方案中，EDTA的浓度为约0.5mM至9.5mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约1mM至约3mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约2mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约4mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约6mM。
在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约2mM。
在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约4mM。
在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约6mM。
在一个实施方案中，溶液具有约7.5至约8.5的pH值。在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于，pH值约为8。
在一个实施方案中，孵育时间为约20分钟至约3.5小时。在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于，孵育时间是约30分钟。
在一个实施方案中，缓冲剂是与原核细胞外膜相互作用的物质。
在一个实施方案中，缓冲剂是一价有机胺。在一个实施方案中，缓冲剂是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或其盐。
在一个实施方案中，缓冲剂选自磷酸或其盐、吗啉或其盐(MOPS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐，或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或其盐。在一个实施方案中，盐是Tris-HCl。
在一个实施方案中，Tris-HCl的浓度为约10mM至约95mM。在一个实施方案中，Tris-HCl的浓度为约15mM至约50mM。在一个实施方案中，Tris-HCl的浓度为约20mM至约60mM。在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于：Tris-HCl的浓度为约20mM。在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于：Tris-HCl的浓度为约40mM。在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于：Tris-HCl的浓度为约60mM。
在一个实施方案中，在室温下进行该方法。在一个实施方案中，在20℃至33℃下进行如本文所报道的方法。在一个实施方案中，在约25℃下进行如本文所报道的方法。
在一个实施方案中，用于产生多肽的方法包括在约25℃在溶液中孵育(重悬)原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的Tris-HCl和约2mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于，所述原核细胞是革兰氏阴性细胞。
在一个实施方案中，所述原核细胞是重悬细胞。
在一个实施方案中，所述原核细胞选自具有外膜的革兰氏阴性细菌。在一个实施方案中，所述原核细胞选自醋杆菌属(Acetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、疏螺旋体(Borrelia)、Bortadella、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospiria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、变形菌属(Proteus)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、硫杆菌属(Thiobacter)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一个实施方案中，多肽是非糖基化多肽。
在一个实施方案中，多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段选自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一个实施例中，本发明所报道的方法中使用的溶液基本上不含肽聚糖水解酶。在一个实施方案中，肽聚糖水解酶选自溶菌酶(胞壁酸酶)、裂解的转糖基酶、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶或内肽酶。
在一个实施方案中，本发明所报道的方法中使用的溶液基本上不含糖。在一个实施方案中，糖是蔗糖。
在一个实施方案中，本发明所报道的方法中使用的溶液基本上不含糖和基本上不含肽聚糖水解酶。在一个实施方案中，本发明所报道的方法中使用的溶液基本上不含蔗糖和基本上不含溶菌酶。
在一个实施方案中，所述方法在孵育步骤后进一步包括分离所述多肽的步骤。
在一个实施方案中，所述方法包括纯化分离的多肽的步骤。
在一个实施方案中，所述方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约2mM，pH值约8，孵育时间为约30分钟，Tris-HCl的浓度为约20mM，孵育温度为约25℃和原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一个实施方案中，所述方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约4mM，pH值约8，孵育时间为约30分钟，Tris-HCl的浓度为约40mM，孵育温度为约25℃和原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一个实施方案中，所述方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约6mM，pH值约8，孵育时间为约30分钟，Tris-HCl的浓度为约60mM，孵育温度为约25℃和原核细胞是大肠杆菌细胞。如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的方法用于从原核细胞分离周质多肽。
附图说明
图1:用如本文所报道的方法大规模分离周质表达的蛋白(α-Synculein)的SDS-PAGE凝胶；泳道：LS＝长度标准，WC＝全细胞，Pe＝细胞沉淀，IPP＝分离的周质蛋白。
图2：用如本文中所报道的方法大规模分离假单胞杆菌外毒素(Nlys-PE25-LR8M)的SDS-PAGE凝胶；泳道：LS＝长度标准，WC＝全细胞，IPP＝分离的周质蛋白，Pe＝细胞沉淀。
发明详述
定义
术语“周质间隙”或“周质”是指边界有两个可选择性渗透的屏障，如生物膜的间隙。在一个实施方案中，周质位于革兰氏阴性细菌的内膜(即，细胞质膜)和外膜之间。
术语“螯合剂”是指能够与单一金属离子形成几个键的物质。换句话说，螯合剂是一种多基配体。
术语“抗体”在此用于最广泛的意义，并且包含各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，及抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”是指非完整抗体的分子，其包含结合所述完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本申请中所用的术语“缓冲”是指溶液，其中由于酸性或碱性物质的添加或释放改变的pH由缓冲剂调节(level)。可以使用产生这样的效果的任何缓冲剂。在一个实施方案中，使用药学上可接受的缓冲剂，如，例如磷酸或其盐(有用的pH范围6.8-8.2)、吗啉或其盐(MOPS，有用的pH范围6.5-7.9)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS，有用的pH范围7.7-9.1)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine，有用的pH范围7.6-9.0)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine，有用的pH范围7.4-8.8)、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO有用的pH范围7.0-8.2)、4-2羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES，有用的pH范围6.8-8.2)，2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES，有用的pH范围6.8-8.2)、组氨酸或其盐(5.5-7.5)、甘氨酸或其盐(8.7-10.7)、或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，有用的pH范围7.5-9.0)或其盐。在一个实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是磷酸或其盐、或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)或其盐。
缓冲剂的缓冲容量为最大p[H+]＝pKa。当p[H+]＝pKa±1时它下降到最大值的33％，当p[H+]＝pKa±1.5时下降到10％值。由于这个原因，有用的范围是约pKa±1。
术语“重组”是指通过重组方法被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“重组核酸”在文中指一种核酸，在一般情况下，其通过核酸内切酶操纵核酸，以在正常自然界中不能发现的形式最初形成于体外。因此，线性形式的分离的、突变DNA聚合酶的核酸，或通过连接通常不连接的DNA分子在体外形成的表达载体，都被认为是本发明目的的重组。可以理解，一旦重组核酸被生成并重新引入宿主细胞，其将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，一旦重组产生这样的核酸，尽管随后非重组地复制，其仍然被认为是本发明目的的重组。“重组多肽”是使用重组技术生成的多肽，即通过如上所述的重组核酸表达生成的多肽。任选地其是分离的或纯化的。
“分离的多肽”是基本上不含污染的细胞成分的多肽，所述细胞成分例如糖类、脂质、或与自然界中的多肽相关的其它蛋白的杂质。通常，分离的多肽制剂包含高度纯化形式的多肽，即至少约80％纯度、至少约90％纯度、至少约95％纯度、大于95％纯度、或大于99％纯度。一种表明特定蛋白制剂含有分离的多肽的方法是在蛋白制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶的考马斯亮蓝染色后，出现单一的条带。在一些实施方案中，多肽纯化至大于95％或99％的纯度，例如，通过电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。对于抗体纯度评估方法的综述，见，例如，Flatman,S.等,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。然而，术语“分离的”不排除在可替换的物理形式中存在的相同多肽，例如二聚体、衍生形式、不正确折叠的形式、不正确的二硫键的形式、或杂乱的形式(scrambled forms)。
“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生的或合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽被称为“肽”。“蛋白质”是包含一个或多个多肽链、其中至少一个包括100个或更多个氨基酸残基的分子。多肽和蛋白质也可包含非氨基酸成分，例如糖类基团。糖类基团和其它非氨基酸成分可以由在其中产生所述多肽或蛋白质的细胞加入，并且将随细胞的类型而不同。多肽和蛋白质在本文中由它们的氨基酸主链结构所定义；取代基如糖类基团通常不指定，但可以存在。
如本文所报道的方法
如本文所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在pH值约7至约10的溶液中孵育原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约10mM至约95mM的缓冲剂和约0.5mM至约9.5mM的螯合剂。
为了重组产生多肽，分离编码所述多肽的核酸并将所述核酸插入用于进一步克隆和/或用于在宿主细胞中表达的一种或多种载体。
用于克隆或表达编码多肽的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核细胞。例如，可在细菌中制备抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US5,648,237，US5789199和US5840523。(参见Charlton,K.A.,Methodsin Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana印制,Totowa,NJ(2003)，第245-254页,描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可在溶液级分中从细菌细胞糊中分离抗体并可以进一步纯化抗体。
在本发明中已经发现，通过在室温下使细胞与pH值约8的溶液接触或一起孵育，可以从原核细胞的周质中分离重组产生的多肽，所述溶液包含缓冲剂(例如Tris)和螯合剂(如EDTA)。该方法能够以高产率和纯度在大规模生产过程中分离重组产生的多肽。分离的多肽对下游处理(例如纯化)显示出良好的可行性。
例如，与全细胞的裂解/机械破碎相比较，使用文中所报道的方法，周质多肽选择性地从细胞中释放出来。
另外，如本文所报道的方法不需要存在肽聚糖水解酶(如溶菌酶)，即该方法在没有溶菌酶或任何其他肽聚糖水解酶时进行，即在溶液中基本上不含溶菌酶或任何其他的肽聚糖水解酶。
此外，如本文中所报道的方法适用于制备对温度敏感的多肽。
此外，如本文中所报道的方法不需要存在蔗糖或任何其它糖，即在不存在蔗糖或任何其它糖时进行本发明的方法，即溶液中基本上不含蔗糖或任何其它糖。
在下表中描述了不同条件下获得的示例性产率。
在没有EDTA时使用16小时的孵育时间，可以得到良好的蛋白产率(比较条件18)。
在本发明中已经发现，如果向孵育混合物中添加低浓度的EDTA，例如低于10mM，如2mM或4mM或6mm，孵育时间可以减少。在存在EDTA的这些条件下，可以实现与没有EDTA的孵育相当的产率。
已经发现，温度增加至高于约25℃，导致得到的产率降低。
已经发现，pH值低于约8的pH值(例如pH值6.8)导致得到的产率降低。增加的pH值能导致增加的产率。
已经发现，使用的Tris缓冲液的浓度必须低于100mM，例如低于50mM，如约20mM。
已经发现，这些在小规模(150μL分离体积)中产生的结果可以被转移到更大的规模，以从培养在发酵罐中的细胞分离周质蛋白。这将有利于制备用于市场供应的重组蛋白。
对于大规模生产，在某些情况下，增加缓冲剂和螯合剂的浓度并减少缓冲体积可能是有利的。
在本发明中，已经发现使用本发明的方法可以有效地分离周质表达的目的蛋白(参见图1)。
在某些实施方案中，多肽是抗体片段。抗体片段包括，但不限于下面描述的Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段，和其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，例如，参见Plueckthun,A.,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315页。还参见WO93/16185；和US 5,571,894和US 5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基和在体内具有增加的半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异的。参见，例如EP0404097；WO1993/01161；Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。在Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(20039129-134)中也描述了三抗体和四抗体。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分、或包含抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；例如参见US 6,248,516B1)。
抗体片段可通过各种技术制备，包括由重组宿主细胞生产(例如大肠杆菌或噬菌体)的技术来制备，如本文所述。
一般的色谱方法和它们的用途是本领域技术人员所熟知的。例如参见，Chromatography,第5版,A部分:Fundamentals and Techniques,Heftmann,E.(编著),Elsevier Science Publishing Company,New York,(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods inBiosciences,Deyl,Z.(编著),Elsevier Science BV,Amsterdam,TheNetherlands,(1998)；Chromatography Today,Poole,C.F.和Poole,S.K.,Elsevier Science Publishing Company,New York,(1991),Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982)；Sambrook,J.等(编著),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory印制,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(编著),John Wiley&Sons,Inc.,New York；or Freitag,R.,Chromatographical processes inthe downstream processing of(recombinant)proteins,Meth.Biotechnol.24(2007)421-453(Animal cell biotechnology第二版)。
用于纯化多肽的方法已经确立并广泛使用。其可单独或组合使用。这样的方法，例如，使用络合金属离子(例如，用镍(II)-和Cu(II)-亲和材料)或微生物来源的蛋白(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱)的硫基配体的亲和色谱、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换色谱)、亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳香族吸附色谱(例如，用苯基-琼脂糖凝胶，氮杂arenophilic树脂，或m-氨基苯硼酸)、尺寸排阻色谱和预制的电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
提供下列实施例、附图和序列以帮助对本发明中的理解，本发明真正的范围列于所附的权利要求中。可以理解的是在不偏离本发明主旨时可以对所述的步骤进行修改。
实施例
如文中报道的一般方法
-在20mM Tris-HCl缓冲液(pH8)中重悬收集的细胞
-以1:1的比例添加20mM Tris-HCl-4mM EDTA缓冲液(pH8)
-在25℃下振荡孵育30分钟，
-从含有周质间隙蛋白的上清液中分离细胞
实施例1：
测定重组产生的蛋白质的量
为了测定使用不同的方法从大肠杆菌周质间隙中可分离的重组产生的目的蛋白的量，进行了本实施例。
参考值：
全细胞裂解液对应于100％通过没有任何预处理地裂解细胞所获得的目的蛋白。
样品量：
通过使包含于培养样品(对应于3OD值(3/OD＝ml))中的细胞进行所有方法。通过离心获得所述细胞。
用于SDS-PAGE分析的全细胞的样品制备：
150μL PBS加入到细胞中，随后加入150μL SDS样品制备缓冲液。加热到95℃、振荡持续10分钟后，取5μL施加到SDS凝胶。
用于SDS-PAGE分析的使用周质回收的细胞提取物样品的制备：
使用150μL冰冷的Tris-缓冲液、有或无EDTA，重新悬浮沉淀的细胞。
将重悬的细胞在振荡下、在确定的温度下孵育。孵育后，以10,000×g离心混合物10分钟。
弃去沉淀物。
150μL SDS样品制备缓冲液加入到上清液中。加热到95℃、振荡持续10分钟后，取5μL施加到SDS凝胶。
比较实验参数和结果(组1)：
比较实验参数和结果(组2)：
比较实验参数和结果(组3)：
实施例2：
大规模生产低分子量转运蛋白(α-突触核蛋白)
在10L发酵罐中培养包含编码低分子量转运蛋白(α-突触核蛋白)的核酸的大肠杆菌细胞。在培养结束时，收获9.52L，其在578nm下测量的OD值为78。这相当于817g湿细胞重量。
在这些中，110g沉淀的细胞重悬于5L孵育缓冲液(20mM TRIS，2mM EDTA，pH 8)中。在25℃下震荡孵育30分钟后，通过在4℃、以4700转/分钟离心60分钟，从上清液中分离细胞，所述上清液包含来自周质间隙的目的蛋白。
低分子量转运蛋白从周质间隙中选择性地分离，其产率为94.9％。
已经发现使用本发明的方法能够有效地分离周质表达的目的蛋白(参见图1)。
实施例3：
大规模生产假单胞杆菌外毒素(Nlys-PE25-LR8M)
根据实施例2培养并收获包含编码假单胞杆菌外毒素(Nlys-PE25-LR8M)的核酸的大肠杆菌细胞。
106g沉淀的细胞重悬于5L孵育缓冲液(20mM TRIS，2mM EDTA，pH 8)中。在25℃下震荡孵育30分钟后，通过在4℃、以4700转/分钟离心60分钟，从上清液中分离细胞，所述上清液包含来自周质间隙的目的蛋白。
假单胞杆菌外毒素从周质间隙中选择性地分离。
已经发现使用本发明的方法能够有效地从周质间隙分离目的蛋白(参见图2)。

Claims (7)

1.用于产生多肽的方法，所述方法包括
-在约25℃下，在溶液中孵育(重悬)原核细胞约15分钟至约6小时，所述溶液包含约10mM至约95mM Tris-HCl和约2mM至约6mMEDTA，所述溶液的pH值约7至约10，
其中所述溶液基本上不含肽聚糖水解酶和糖。
2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述pH值约为8。
3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述孵育时间约为30分钟。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于Tris-HCl的浓度约为20mM。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述原核细胞是革兰氏阴性细胞。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法用于从原核细胞分离周质多肽的用途。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019050872A1 (en) * 2017-09-05 2019-03-14 Scarab Genomics, Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCED EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEINS
JPWO2022191223A1 (zh) * 2021-03-10 2022-09-15

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1311255A (zh) * 2000-03-03 2001-09-05 上海复旦张江生物医药有限公司 重组淋巴毒素衍生物的生产工艺
WO2003059386A2 (en) * 2002-01-18 2003-07-24 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07184680A (ja) * 1993-12-28 1995-07-25 Mitsui Toatsu Chem Inc ペリプラズムタンパク質の回収法
AU778437B2 (en) 1999-02-16 2004-12-02 Senesco, Inc. DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants
WO2002048376A2 (en) * 2000-12-14 2002-06-20 Genentech, Inc. Bacterial host strains
EP1656455B1 (en) * 2003-08-13 2012-09-19 Sandoz Ag Process for the purification of recombinant polypeptides
GB201001791D0 (en) * 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
RU2488635C1 (ru) 2012-03-22 2013-07-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1311255A (zh) * 2000-03-03 2001-09-05 上海复旦张江生物医药有限公司 重组淋巴毒素衍生物的生产工艺
WO2003059386A2 (en) * 2002-01-18 2003-07-24 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUOPING REN ET AL.: "Translocation of alpha-Synuclein Expressed in Escherichia coli", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
杨运桂等: "新型大肠杆菌裂解系统在重组蛋白回收中的应用", 《生物化学与生物物理学报》 *

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