MX2015003028A - Metodo para produccion de polipeptidos en periplasma de celulas procarioticas. - Google Patents

Abstract

En la presente descripción se reporta un método para producir un polipéptido que comprende el paso de incubar células procarióticas (resuspendidas) en una solución que comprende aproximadamente 10mM hasta aproximadamente 95 mM de Tris-HCl y aproximadamente 2mM hasta aproximadamente 10 por aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas a aproximadamente 25°C.

Description

MÉTODO PARA PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS EN PERIPLASMA DE CÉLULAS PROCARIÓTICAS Campo de la Invención En este documento se reporta un método para producir un polipéptido en células procarióticas en donde el polipéptido producido de manera recombinante se recupera del periplasma de las células procarióticas utilizando un paso de incubación en un sistema amortiguado en la presencia de un agente quelante a valores de pH y temperatura definidos.

Antecedentes de la Invención Cuando tienen una secuencia de señal apropiada, polipéptidos producidos de forma recombinante pueden ser secretados en el espacio periplásmico de células de E. coli (Joly, J.C. and Laird, M.W., in The Periplasm ed. Ehrmann, M., ASM Press, Washington D.C., (2007) 345-360). En el entorno químicamente oxidante la formación de enlaces disulfuro y por lo tanto el plegamiento funcionalmente correcto de polipéptidos se ven favorecidos. Se desea el aislamiento selectivo de estos polipéptidos del espacio periplásmico para evitar contaminación con proteínas de la célula hospedera (HCPs) de E. coli. De esta manera, se facilita la purificación posterior de los polipéptidos.

Un método de aislamiento ejemplar es el choque osmótico como se describió por ejemplo, por Ren, G. et al, J. of Ref.: 254173 Bacteriology 189 (2007) 2777-2786. Usando este método, EDTA disuelto en solución amortiguadora TRIS (pH 7.2) desestabiliza la membrana externa de las células procarióticas, lo que permite la penetración de sacarosa en el espacio periplásmico. La membrana interna no es permeable para la sacarosa. Posteriormente, la solución amortiguadora Tris-EDTA se elimina por centrifgación y las células se resuspendieron rápidamente en agua destilada helada. De este modo el agua es sumergida en el espacio periplásmico lleno de sacarosa y la membrana externa desestabilizada es desintegrada a través del aumento del volumen periplásmico. La adición de MgCl2 reestabiliza la membrana externa.

Métodos adicionales se pueden encontrar en Humphrcys, D.P. (in The Periplasm (ed.) Ehrmann, M. pp. 361-388. Washington, D.C.: ASM Press (2007)) and Middelberg, A.P. (Biotechnol. Adv.13 (1995) 491-551).

De acuerdo con Joly and Laird (ver arriba) "métodos comunes para aislar fracciones periplásmicas en pequeña escala, tales como formación de esferoplastos o tratamiento de choque osmótico prácticamente no se realizan una vez que los cultivos alcanzan volúmenes en y por encima de 10 litros". La "recuperación de la proteína desde el medio externo o después de una interrupción de solamente la membrana externa y peptidoglicano sigue siendo un objetivo que no ha sido puesto en práctica a gran escala" (página En WO 2012/013930 se reporta la purificación de la proteína recombinante de la muestra o extracto de célula hospedera bacteriana Gramnegativa que expresa la proteína recombinante e isomerasa de disulfuro DsbC, implica el ajuste de pH de la muestra o extracto para precipitar y separar DsbC. Nuevo anticuerpo específico para el factor de necrosis tumoral humano (TNF)-alfa, útil para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF-alfa, por ejemplo, insuficiencia cardíaca congestiva, choque séptico o endotóxico, caquexia y síndrome de distrés respiratorio del adulto se reportó en WO 01/94585. En US 2005/048056 se reporta la preparación de un anticuerpo del factor alfa de necrosis tumoral que tiene una cadena pesada y ligera comprende fermentar una mezcla de células, formando una pelotilla celular y permitiendo que la pelotilla esté en reposo durante un tiempo de espera.

En WO 2007/106120 se reporta la modulación de la distribución de tejido de una molécula de péptido comprende administrar al tejido una molécula de conjugado que comprende péptido de unión a albúmina de suero. Los ligandos de péptido con afinidad por inmunoglobulina (Ig) G, IgM y/o albúmina de suero humano que puede ser conjugada y utilizada para prolongar el medio tiempo de eliminación de agentes activos de la circulación se reportan en WO 01/45746. En US 2004/001827 se reporta la modulación de la distribución del tejido de una molécula de péptido, para mejorar la eficacia terapéutica y reducir los efectos secundarios, comprende administrar al tejido una molécula de conjugado que comprende un dominio de ligando de péptido y un dominio activo.

Sumario de la Invención En la presente invención se ha encontrado que un polipéptido producido de manera recombinante se puede aislar del periplasma de una célula procariótica poniendo en contacto o incubando la célula con una solución que comprende un agente amortiguador (por ejemplo Tris) y un agente quelante (por ejemplo, EDTA) a un valor de pH de aproximadamente 8 y a temperatura ambiente. El método permite el aislamiento de un polipéptido producido de forma recombinante en altos rendimientos y pureza en los procesos de producción a gran escala. El polipéptido aislado muestra una buena viabilidad de los procesos dirección 3' (por ejemplo, depuración).

Un aspecto como se reportó en la presente descripción es un método para producir un polipéptido que comprende el paso de incubar células procarióticas en una solución que comprende aproximadamente lOiriM a aproximadamente 95mM de un agente amortiguador y aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 9.5 tti de un agente quelante a un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 6 horas.

En una modalidad el agente quelante es seleccionado del grupo que comprende etilendiamina, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido tetraacético de etilen glicol (EGTA), ácido pentaacético de dietilentriamina (DTPA), 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenodiamina-N,N'-disuccínico (EDDS), fosfonatos (por ejemplo, etilendiamina tetra(ácido metileno fosfónico) EDTMP o dietilentriamina penta (ácido metileno fosfónico)DTPMP), citrato, porfirinas (por ejemplo, hemo, clorofila o vitamina B12). En una modalidad, el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Un aspecto como se reportó en la presente descripción es el método para producir un polipéptido que comprende el paso de incubar células procarióticas (resuspendidas) en una solución que comprende aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 95 mM de Tris-HCl y aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 6 mM de EDTA a un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas a aproximadamente 25°C.

Un aspecto como se reportó en la presente descripción es el método para producir un polipéptido que comprende el paso de incubar (resuspendido) células procarióticas en una solución que comprende aproximadamente lOmM hasta aproximadamente 95 mM de Tris-HCl y aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 4 mM de EDTA a un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 25°C.

En una modalidad, la concentración del agente quelante es desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 6 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 4 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 3 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 6 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 4 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es aproximadamente 2 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es aproximadamente 4 mM. En una modalidad, la concentración del agente quelante es e aproximadamente 6 mM.

En una modalidad, la concentración de EDTA es desde aproximadamente 0.5 mM hasta 9.5 mM. En una modalidad, la concentración de EDTA es desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 3 mM. En una modalidad, la concentración de EDTA es aproximadamente 2 mM. En una modalidad, la concentración de EDTA es aproximadamente 4 mM. En una modalidad, la concentración de EDTA es aproximadamente 6 mM.

En una modalidad, el método como se reportó en el presente documento es caracterizado porque la concentración de EDTA es aproximadamente 2 mM.

En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción es caracterizado porque la concentración de EDTA es aproximadamente 4 mM.

En una modalidad, el método como se reporta en la presente descripción está caracterizado en que la concentración de EDTA es aproximadamente 6 mM.

En una modalidad, la solución tiene un valor de pH de aproximadamente 7 .5 hasta aproximadamente 8.5. En una modalidad, el método como se reporta en la presente descripción está caracterizado en que el valor pH es aproximadamente 8.

En una modalidad, el tiempo de incubación es desde aproximadamente 20 min hasta aproximadamente 3.5 horas. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción está caracterizado en que el tiempo de incubación es aproximadamente 30 min.

En una modalidad, el agente amortiguador es una sustancia que interactúa con la membrana externa de las células procarióticas.

En una modalidad, el agente amortiguador es una amina orgánica monovalente. En una modalidad, el agente amortiguador es tris(hidroximetillaminómetaño (Tris) o sales del mismo.

En una modalidad el agente amortiguador es seleccionado del grupo que comprende ácido fosfórico o sales del mismo, morfolina o sales del mismo (MOPS), 3- { [tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico (TAPS), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina(Bicina), N-tris (hidroximetil)metilglicina (Tricina), 3- [N- Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico (TAPSO), ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), ácido 2- { [tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico (TES), histidina o sales del mismo, glicina o sales de la misma, o tris(hidroximetil)aminometano (Tris) o sales del mismo. En una modalidad, la sal es Tris-HCl.

En una modalidad, la concentración de Tris-HCl es desde aproximadamente lOmM hasta aproximadamente 95mM. En una modalidad, la concentración de Tris-HCl es desde aproximadamente 15mM hasta aproximadamente 50mM. En una modalidad, la concentración de Tris-HCl es desde aproximadamente 20mM hasta aproximadamente 60mM. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se caracteriza en que la concentración de Tris-HCl es aproximadamente 20 mM. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se caracteriza en que la concentración de Tris-HCl es aproximadamente 40mM. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se caracteriza en que la concentración de Tris-HCl es aproximadamente 60 mM.

En una modalidad, el método se realiza a temperatura ambiente. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se realiza a 20°C hasta 33°C. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se realiza a aproximadamente 25°C.

En una modalidad, el método para producir un polipéptido comprende el paso de incubación de células procarióticas (resuspendidas) en una solución que comprende aproximadamente lOmM hasta aproximadamente 95mM de Tris-HCl y aproximadamente 2mM de EDTA a un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6h hasta aproximadamente 25°C.

En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se caracteriza porque la célula es una célula procariótica Gramnegativa.

En una modalidad, la célula procariótica es una célula resuspendida.

En una modalidad la célula procariótica es seleccionada del grupo de bacterias gram negativas que tienen una membrana externa. En una modalidad la célula procariótica es seleccionada del género Acetobacter, Bacteroides, Borrelia, Bordetella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Citrobacter, Enterobacter Escherichia, Fusobacterium, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospiria, Neisseria, Nitrobacter, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Shigella, Thiobacter, Treponema, Vibrio, Xanthomonas o Yersinia. En una modalidad, el método como se reportó en la presente descripción se caracteriza porque la célula procariótica es una célula de E. coli.

En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido no glicosilado.

En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una modalidad, el fragmento de anticuerpo se selecciona de Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

En una modalidad, la solución utilizada en e-1 método como se reportó en la presente descripción está sustancialmente libre de enzimas hidrolizantes de peptidoglicano. En una modalidad la enzima hidrolizante de peptidoglicano se selecciona de lisozimas (muramidasas), transglicosilasas líticas, N-acetil-PD-glucosaminidasas, N-acetilmuramil-L-alanina amidasas o endopeptidasas.

En una modalidad, la solución utilizada en el método como se reportó en la presente descripción está sustancialmente libre de azúcar. En una modalidad, el azúcar es sacarosa .

En una modalidad, la solución utilizada en el método como se reportó en la presente descripción está sustancialmente libre de azúcar y sustancialmente libre de enzimas hidrolizantes de peptidoglicano. En una modalidad, la solución utilizada en el método como se reportó en la presente descripción está sustancialmente libre de sacarosa y sustancialmente libre de lisozima.

En una modalidad, el método comprende además después del paso de incubación el paso de aislar el polipéptido.

En una modalidad, el método comprende el paso de purificar el polipéptido aislado.

En una modalidad, el método se caracteriza en que la concentración de EDTA es de aproximadamente 2 mM, el valor pH es de aproximadamente 8, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos, la concentración de Tris-HCl es 20 mM , la temperatura de incubación es de aproximadamente 25°C y la célula procariótica es una célula de E. coli.

En una modalidad, el método se caracteriza en que la concentración de EDTA es aproximadamente 4 mM, el valor pH es de aproximadamente 8, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos, la concentración de Tris-HCl es aproximadamente 40 mM, la temperatura de incubación es de aproximadamente 25°C y la célula procariótica es una célula de E. coli.

En una modalidad, el método se caracteriza en que la concentración de EDTA es aproximadamente 6 mM, el valor de pH es de aproximadamente 8, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos, la concentración de Tris-HCl de 60 mM, la temperatura de incubación es de aproximadamente 25°C y la célula procariótica es una célula de E. coli. Un aspecto como se reportó en la presente descripción es el uso de un método como se reportó en la presente descripción para el aislamiento de un polipéptido periplásmico de una célula procariótica.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: gel de SDS-PAGE de aislamiento a gran escala de proteína expresada periplásmica (a-Sinculeína) con el método como se reporta en la presente descripción; carriles: LS = longitud estándar, WC = células enteras, Pe = sedimento celular, IPP = proteínas periplásmicas aisladas.

Figura 2: gel de SDS-PAGE de exotoxina de Pseudomonas de aislamiento a gran escala (Nlys-PE25-LR8M) con el método como se reportó en este documento; Carriles: LS = longitud estándar, WC = células enteras, IPP = aislado de proteínas periplásmicas, Pe = sedimento celular.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones El término "espacio periplásmico" o "periplasma" significa un espacio delimitado por dos barreras permeables selectivas, por ejemplo, membranas biológicas. En una modalidad, el periplasma está situado entre la membrana interna (en este caso membrana citoplasmática) y la membrana externa de las bacterias Gramnegativas.

El término "agente quelante" significa una sustancia que puede formar varios enlaces a un único ión metálico. En otras palabras, un agente quelante es un ligando multidentado.

El término "anticuerpo" en la presente descripción se utiliza en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero no limitado a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la deseada actividad de unión al antígeno.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no es un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une el antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

El término "amortiguado" tal como se utiliza en esta solicitud indica una solución en la que los cambios de pH debido a la adición o liberación de sustancias ácidas o básicas es nivelada por un agente amortiguador . Cualquier agente amortiguador que resulta en un efecto de este tipo puede ser utilizado. En una modalidad agentes amortiguadores farmaceuticamente aceptables son utilizados, tal como por ejemplo, ácido fosfórico o sales de los mismos (intervalo de pH útil 6.8 a 8.2) , morf olina o sales de los mismos (MOPS, intervalo de pH útil 6.5 a 7.9) , 3- { [tris (hidroximetil)metil] amino }propanosul fónico (TAPS, intervalo de pH útil 7.7 a 9.1) , N,N-bis (2 -hidroxietil) glicina (bicina, intervalo de pH útil 7.6 a 9.0) , N-tris (hidroximetil)metilglicina (tricina, intervalo de pH útil 7.4 a 8.8) , 3- [N-Tris (hidroximetil)met ilamino] -2-hidroxipropanosulfónico (TAPSO, intervalo de pH útil 7.0 a 8.2) , ácido 4 -2 -hidroxietil- l-piperazinaetanosulfónico (HEPES, intervalo de pH útil 6.8 a 8.2) , 2 - { [tris (hidroximetil ) metil] amino}etanosulf ónico (TES , intervalo de pH útil 6 . 8 a 8.2 ) , histidina o sales de la misma ( 5 . 5 a 7 .5 ) , glicina o sales de la misma ( 8 . 7-10 .7 ) , o tris (hidroximetil) aminometano (Tris, intervalo de pH útil 7.5-9.0) o sales del mismo. En una modalidad, el agente amortiguador farmacéuticamente aceptable es ácido fosfórico o sales del mismo, o tris (hidroximetil) aminometano (Tris) o sales del mismo.

La capacidad amortiguadora de un agente amortiguador se encuentra en un máximo de p [H+] = pKa. Corresponde al 33% del valor máximo a p [H +] = pKa ± 1 y 10% en p [H+] = pKa ± 1. 5. Por esta razón, el intervalo útil es de aproximadamente pKa ± 1 .

El término "re combinante" se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada intencionadamente por métodos recombinantes. Por el término "ácido nucleico recombinante" en este documento se entiende un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Así, un ácido nucleico de ADN polimerasa mutante, aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas, ambas son consideradas recombinantes para los propósitos de esta invención. Se entiende que una vez que se hace un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula hospedera, se replicará de forma no recombinante, en este caso, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedera en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente se replicaron de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención. Un "polipéptido recombinante" es un polipéptido realizado utilizando téenicas recombinantes, en este caso, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representó anteriormente. Opcionalmente está aislado o purificado.

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Típicamente, una preparación de un polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, en este caso, por lo menos aproximadamente 80% puro, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, más de un 95% puro, o más de un 99% puro. Una manera de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una sola banda después de dodecil sulfato de sodio (SDS)-electroforesis en gel de poliacrilamida de la preparación de proteína y tinción con Azul Brillante de Coomassie del gel. En algunas modalidades, un polipéptido se purifica hasta más de 95% o 99% de pureza o como se determina mediante, por ejemplo, análisis electroforético (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoelectro (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para una revisión de métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros, formas derivatizadas, formas no correctamente plegadas, formas de disulfuro no correctamente puenteadas, o formas desordenadas.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producido naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos se conocen como "péptidos". Una "proteína" es una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas de las cuales, por lo menos una comprende 100 o más residuos de aminoácidos. Los polipéptidos y proteínas también pueden comprender componentes sin aminoácidos, tales como grupos carbohidrato. Los grupos de carbohidratos y otros componentes no aminoácidos pueden ser agregados por las células en las que se produce el polipéptido o proteína, y variarán con el tipo de célula. Los polipéptidos y proteínas se definen aquí en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; sustituyentes tales como grupos carbohidrato no se especifican generalmente, pero pueden estar presentes, no obstante.

El método como reporta en la presente descripción Un aspecto como se informó en la presente descripción es un método para producir un polipéptido que comprende él paso de incubar las células procarióticas en una solución que comprende aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 95 mM de un agente amortiguador y aproximadamente 0.5 mm hasta aproximadamente 9.5 mM de un agente quelante en un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas.

Para la producción recombinante de un polipéptido, el ácido nucleico que codifica el polipéptido es aislado e insertado en uno o más vectores para su posterior clonación y/o expresión en una célula hospedera.

Las células hospederas apropiadas para la clonación o expresión de vectores que codifican polipéptidos incluyen células procarióticas descritas en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, US 5,648,237, US 5,789,199 y US 5,840,523. (Ver también Charlton, K.A., En: Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254, describing expression of antibody fragments in E. coli). Después de la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

En la presente invención se ha encontrado que un polipéptido producido de manera recombinante se puede aislar del periplasma de una célula procariótica poniendo en contacto o incubando la célula con una solución que comprende un agente amortiguador (por ejemplo Tris) y un agente quelante (por ejemplo, EDTA) a un valor de pH de aproximadamente 8 y a temperatura ambiente. El método permite el aislamiento de un polipéptido producido de forma recombinante en altos rendimientos y pureza en procesos de producción a gran escala. El polipéptido aislado que muestra una buena viabilidad de los procesos dirección 3' (por ejemplo, depuración).

Con el método como se reportó en la presente descripción los polipéptidos periplásmicos se liberan selectivamente de las células en comparación, por ejemplo, a la lisis/ruptura mecánica de las células enteras.

Además, el método como se reportó en la presente descripción no requiere la presencia de enzimas hidrolizantes de peptidoglicano, tales como la lisozima, en este caso, el método se realiza en ausencia de lisozima o cualquier otra enzima hidrolizante de peptidoglicano, en este caso, la solución está sustancialmente libre de lisozima o cualquier otra enzima hidrolizante de peptidoglicano.

Además, el método como se reportó en la presente descripción es apropiado para la preparación de polipéptidos sensibles a la temperatura.

Además, el método como se reportó en la presente descripción no requiere la presencia de sacarosa o cualquier otro azúcar, en este caso, el método se realizó en ausencia de sacarosa o cualquier otro azúcar, en este caso, la solución está sustancialmente libre de sacarosa o cualquier otro azúcar .

En la siguiente tabla, se representan rendimientos ej emplares que se pueden obtener baj o diferentes condiciones .

Utilizando un tiempo de incubación de 16 horas en la ausencia de EDTA un buen rendimiento de proteínas puede ser obtenido (condición comparativa 18).

Se ha encontrado en la presente invención que el tiempo de incubación puede ser reducido si una baja concentración de EDTA, por ejemplo, por debajo de 10 mM, tal como 2 mM o 4 mM o 6 mM, se agrega a la mezcla de incubación. Bajo estas condiciones en la presencia de EDTA se puede lograr un rendimiento comparable en comparación con la incubación en la ausencia de EDTA.

Se ha encontrado que un aumento en la temperatura por encima de aproximadamente 25°C resulta en una disminución en el rendimiento alcanzable.

Se ha encontrado que un valor de pH por debajo de un valor de pH de aproximadamente 8 (por ejemplo, pH 6.8) resulta en una disminución en el rendimiento alcanzable. Un valor de pH incrementado puede resultar en un aumento del rendimiento.

Se ha encontrado que la concentración de la solución amortiguadora de Tris empleada tiene que estar por debajo de 100 mM, por ejemplo por debajo de 50 mM, tal como aproximadamente 20 mM.

Se ha encontrado que estos resultados generados en pequeña escala (150m1 de volumen de aislamiento) se pueden transferir a escalas más grandes para aislar la proteína periplásmica de celulas cultivadas en termentadores. Esto facilitará la producción de proteínas recombinantes para el abastecimiento del mercado.

Para la producción a gran escala en algunos casos en que podría ser ventajoso aumentar la concentración de agentes amortiguadores y quelantes en relación con la reducción de los volúmenes de la solución amortiguadora.

En la presente invención se ha encontrado que la proteína periplásmica expresada de interés puede ser aislada efectivamente utilizando el método de la invención (ver Fig. 1) .

En ciertas modalidades, un polipéptido es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab' , F b' -SH, F(ab') , Fv, y scFv, y otros fragmentos se describen a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, ver Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9(2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Plueckthun, A., En; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol . 113, Rosenburg and Moore (eds.) , Springer- Verlag, New York (1994) , pp. 269-315; ver también WO 93/16185; y US 5,571,894 y US 5,587,458. Para la discusión de fragmentos Fab y F(ab') que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor salvaje y que tiene semivida in vivo incrementada, ver US 5,869,046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al, Nat. Med.9 (2003) 129-134; and Holliger, P. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson, P.J. et al., Nat. Med.9 (20039129-134).

Anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden toda o una porción del dominio variable de cadena pesada o toda o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humano de dominio único (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo, US 6248516 Bl).

Los fragmentos de anticuerpos se pueden realizar mediante diversas téenicas, incluyendo la producción por las células hospederas recombinantes (por ejemplo, E. coli o fagos), como se describe en la presente descripción.

Métodos cromatográficos generales y su uso son conocidos para una persona experimentada en la técnica. Ver, por ejemplo, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Dcyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds)., John Wilcy & Sons, Inc., New York; or Freitag, R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24 (2007) 421-453 (Animal cell biotechnology 2nd Edition).

Los métodos para purificar polipéptidos son bien establecidos y son ampliamente utilizados. Son empleados ya sea solos o en combinación. Tales métodos son, por ejemplo, cromatografía de afinidad utilizando ligandos tiol con iones metálicos complejados (por ejemplo, con Ni(II) - y Cu(II)-material de afinidad) o proteínas derivadas de microbios (por ejemplo, cromatografía de afinidad de la proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, de intercambio catiónico (resinas de carboximetilo), intercambio de aniones (resinas de amino etil) y cromatografía de intercambio de modo mezclado), adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), interacción hidrofóbica o cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo, con fenil sefarosa, resinas aza-arenofílicas, o ácido m-aminofenilborónico), cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos preparativos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl.

Biochem. Biotech.75 (1998) 93-102).

Los siguientes ejemplos, figuras y secuencias se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance que se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Ejemplos Método general como se reporta en este documento: Resuspender las células recolectadas en 20 M de solución amortiguadora de Tris-HCl (pH 8) - Adición de solución amortiguadora de 20 mM de Tris-HCl -4 mM de EDTA (pH 8) con una proporción de 1:1 - Incubación durante 30 minutos a 25°C con agitación Separación de las células del sobrenadante que contiene las proteínas del espacio periplásmico Ejemplo 1 Determinación de la cantidad de proteína producida de forma recombinante El ejemplo actual se ha realizado con el fin de determinar la cantidad de proteína producida de forma recombinante de interés aislable del espacio periplásmico de E. coli utilizando diferentes métodos.

Valor de referencia : El lisado celular completo corresponde al 100% de proteína de interes obtenido por células de desintegración sin ningún pre- tratamiento .

Cantidad de la muestra : Todos los métodos se realizaron tomando las células comprendidas en el cultivo de una muestra correspondiente a valores OD 3 (3/OD = mi) . Las células se han obtenido por centrifugación.

Preparación de la muestra de células completas para el análisis de SDS PAGE: 150m1 de PBS se agregaron a las células seguido por la adición de 150m1 de solución amortiguadora de la solución amortiguadora de preparación de la muestra SDS. Después de calentar a 95°C durante 10 min con agitación, se aplicaron 5m1 al gel SDS .

Preparación de muestras de extractos de células utilizando recuperación de periplásmico para el análisis SDS PAGE : Las células pelotilladas se resuspendieron usando 150m1 de solución amortiguadora Tris helada con o sin EDTA.

Las células resuspendidas se incubaron a temperatura def inida baj o agitación . Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a 10 , 000 xg durante 10 min .

El sedimento se desecha . 150m1 de solución amortiguadora de preparación de la muestra de SDS se agregaren al sobrenadante. Después de calentar a 95 °C durante 10 min con agitación, 5m1 se aplicaron al gel SDS .

Parámetros y resultados experimentales comparativos (grupo 1): Parámetros y resultados experimentales comparativos (grupo 2): Parámetros y resultados experimentales comparativos (grupo 3): E j emplo 2 : Producción a gran escala de proteína de transporte de baj o peso molecular (a-sinucleína) Una celula de E. coli que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de transporte de bajo peso molecular (a-sinucleína) se cultivó en un termentador de 10 litros. Al final del cultivo se cosecharon 9.52 1 con un valor de OD 78 medido a 578nm. Esto corresponde a 817g de peso de células húmedas .

De éstas , 110 g células pelotilladas se resuspendieron en 5L de solución amortiguadora de incubación (20 mM de TRIS, 2 mM de EDTA, pH 8) . Después de la incubación durante 30 minutos a 25°C con agitación las células se separaron del sobrenadante, que contiene la proteína de interés del espacio periplásmico, por centrifugación con 4700 rpm durante 60 min a 4°C.

La proteína de transporte de bajo peso molecular se aisló selectivamente desde el espacio periplásmico con un rendimiento de 94.9%.

Se ha encontrado que la proteína periplásmica de interés expresada puede ser aislada efectivamente utilizando el método de la invención (ver Fig . 1) .

Ej emplo 3 : Exotoxina de Pseudomonas de producción a gran escala (Nlys-PE25-LR8M) Una célula de E. coli que comprende un ácido nucleico que codifica una exotoxina de Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M) fue cultivada y cosechada de acuerdo con el Ejemplo 2. 106g células pelotilladas se resuspendieron en 5 litros de solución amortiguadora de incubación (20 mM de TRIS, 2 mM de EDTA, pH 8). Después de la incubación durante 30 minutos a 25°C con agitación las células se separaron del sobrenadante, que contiene la proteína de interés del espacio periplásmico, por centrifugación con 4700rpm durante 60 min a 4°C.

La exotoxina de Pseudomonas se aisló selectivamente desde el espacio periplásmico.

Se ha encontrado que la proteína de interés puede ser efectivamente aislada del espacio periplásmico usando el método de la invención (ver la figura 2).

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (7)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir un polipéptido caracterizado porque comprende incubar células procariotas (resuspendidas) en una solución que comprende aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 95 mM de Tris-HCl y aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 6 mM de EDTA a un valor de pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 6 horas a aproximadamente 25°C en donde la solución está sustancialmente libre de enzimas hidrolizantes de peptidoglicano y azúcar.

2. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el valor de pH es de aproximadamente 8.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de Tris-HCl es aproximadamente 20 mM.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula procariótica es una célula gramnegativa.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula procariótica es una célula de E. coli.

7. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el aislamiento de un polipéptido periplásmico de células procarióticas.