WO2023285762A1 - Méthode de purification de glycoprotéines - Google Patents

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WO2023285762A1
WO2023285762A1 PCT/FR2022/051400 FR2022051400W WO2023285762A1 WO 2023285762 A1 WO2023285762 A1 WO 2023285762A1 FR 2022051400 W FR2022051400 W FR 2022051400W WO 2023285762 A1 WO2023285762 A1 WO 2023285762A1
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interest
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column
protein
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Hendrik RUSCHE
Olivier MONASSON
Anna Maria PAPINI ROVERO
Elisa PERONI
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Cy Cergy Paris Universite
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Definitions

  • glycoproteins preferably highly glucosylated glycoproteins.
  • Recombinant proteins are becoming increasingly important due to their many applications, particularly in the biopharmaceutical industry, the enzyme industry or the agricultural industry. Thanks to the increased availability of recombinant proteins, many advances have been made in the fields of medicine, diagnostics, food and nutrition, and the production of raw materials. Today, more than 200 FDA-approved peptide and protein pharmaceuticals are in use, such as insulin, albumin, human growth hormone, and antibodies, enhancing possibilities and strategies treatment.
  • Glycoproteins represent a promising research topic due to their role in cell signaling, cell adhesion and interaction with receptors. Many different strategies have been developed for biochemical/protein engineering and production of glycosylated proteins by expression in mammalian cell lines, orthogonal glycosylation by co-expression with a glycosyltransferase, or post-expression chemical glycosylation (H. Nothaft, et al ., Current opinion in Chemical biology 53 (2019) 16- 24). Due to the heterogeneity of expressed glycoproteins, purification is particularly challenging as the heterogeneous mixture may exhibit a variety of physicochemical properties.
  • the inventors have for the first time developed a method for purifying glycoproteins that improves the yield while obtaining good purity of the target compound with high-performance liquid phase chromatography (HPLC) equipment; Performance liquid Chromatography”) classic, or UPLC (for “Ultra Performance Liquid Chromatography”), or FPLC (for “Fast Protein Liquid Chromatography”) but with a much faster throughput.
  • HPLC high-performance liquid phase chromatography
  • Performance liquid Chromatography for “Ultra Performance Liquid Chromatography”
  • FPLC for “Fast Protein Liquid Chromatography”
  • IMAC immobilized metal ion affinity chromatography
  • the method of the present invention makes it possible to achieve a higher degree of purity while having a higher yield.
  • the present invention relates to a method for purifying a glycoprotein of interest in solution comprising the steps of: i. separation of the fraction comprising a glycoprotein by affinity chromatography, ii. separating said fraction obtained after step i. comprising the glycoprotein of interest by size exclusion chromatography in liquid phase comprising the steps of: a) multiple injections of the fraction, said injections succeeding each other after time intervals t1 in a first size exclusion chromatography column, b ) multiple withdrawals, the said withdrawal of the fractions succeeding each other after time intervals t1, generating an eluate enriched in the glycoprotein of interest formed from at least one of the fractions withdrawn, c) multiple injections of the eluate collected previously, the said injections succeeding one another after time intervals t2 in a second steric exclusion chromatography column, d) multiple withdrawals, the said withdrawals of the fractions succeeding each other after time intervals t2 in the second chromatography column of size exclusion.
  • the present invention also relates to a glycoprotein obtainable by the preceding method having a degree of purity greater than 80%, preferably 90% of the total mass of the proteins.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of size exclusion chromatography in the liquid phase according to the invention (WO2012/062985).
  • Fig. 2 [12] [Fig. 2] shows an SEC analysis of purified HMW1 ⁇ -Glc after IMAC His-Tag and after purification by two-step liquid phase size exclusion chromatography according to the invention. SEC analysis was performed at 1 mL/min.
  • FIG. 3 shows an SDS-PAGE of (1) HMW1ct-Glc purified after IMAC His-Tag and purification by two-step liquid phase size exclusion chromatography according to the invention (left), (2) after IMAC purification (right ).
  • the glycosyltransferase used for the orthogonal glycosylation is still present, at 70 kDa, whereas after purification by two-step liquid phase size exclusion chromatography according to the invention (1), only the HMW1ct-Glc is visible, at 40 -35 kDa.
  • This disclosure relates to a method for purifying a glycoprotein of interest in solution comprising the steps of: i. separation of the fraction comprising a glycoprotein by affinity chromatography, ii. separating said fraction obtained after step i. comprising the glycoprotein of interest by size exclusion chromatography in liquid phase comprising the steps of: a) multiple injections of the fraction, said injections succeeding each other after time intervals t1 in a first size exclusion chromatography column, b ) multiple withdrawals, the said withdrawal of the fractions succeeding each other after time intervals t1, generating an eluate enriched in the glycoprotein of interest, c) multiple injections of the eluate previously collected, the said injections succeeding each other after time intervals t2 in a second steric exclusion chromatography column, d) multiple withdrawals, the said withdrawal of the fractions succeeding each other after time intervals t2 in the second size exclusion chromatography column.
  • the method described in the present application makes it possible to separate a glycoprotein and in particular to obtain a highly purified glycoprotein, preferably with a degree of purity of more than 80%, preferably more than 90% of the mass of the total protein.
  • the present application relates to a glycoprotein capable of being obtained by the method described in the present application, which preferably has a degree of purity greater than 80%, preferably greater than 90% of the mass of the total proteins .
  • glycoprotein is meant a protein bearing one or more glycosyl groups.
  • the glycoprotein is a glucoprotein, which is a protein bearing one or more glucosyl groups.
  • a glycoprotein is synthesized by glycosylation of a protein which can be of three types, N-glycosylation, C-glycosylation or O-glycosylation.
  • the glycoprotein of interest is a highly glycosylated glycoprotein.
  • heavily glycosylated protein is meant a protein which comprises more than 1 glycosylation site every 100 residues of a protein sequence, preferably more than 1, 2 or 3 glycosylation sites every 100 residues of a protein sequence.
  • the glycoprotein of interest is a highly glucosylated glucoprotein.
  • highly glucosylated protein is meant a protein which comprises more than 1 glucosylation site in a protein sequence of 100 residues, preferably more than 1, 2 or 3 glucosylation sites in a protein sequence of 100 residues.
  • Glycosylation or glucosylation sites can be determined by high-resolution mass spectrometry by combining CID (collision induced dissociation) and ETD (Electron transfer dissociation).
  • CID collision induced dissociation
  • ETD Electro transfer dissociation
  • Examples of heavily glycosylated glycoproteins are: human sodium channel protein type 1 alpha subunit, human Teneurin-1, Mu protein tyrosine phosphatase receptor.
  • the glycoprotein is a highly glucosylated adhesin from non-determinable Haemophilus influenzae, also called Adhesin-GIc or HMW1ct-Glc (High molecular weight 1 adhesin) (NCBI Reference Sequence: WP_01 4550671.1, 09 Nov. 2020), of preferably the C-terminal fragment of the hyperglucosylated adhesin comprising amino acids 1205 to 1536 of the adhesin sequence.
  • the initial solution comprising the glycoprotein of interest to be separated can be obtained from a biological sample or from a eukaryotic cell culture capable of synthesizing the recombinant protein.
  • the various methods for synthesizing a protein by the recombinant route are well known to those skilled in the art and consist of the introduction into the cell of an expression cassette comprising a sequence coding for the glycoprotein of interest under the control of regulatory elements necessary for its expression such as strong promoters such as CMV or SV40.
  • the glycoprotein of interest is advantageously purified from a solution derived from a culture of eukaryotic cells.
  • the solution from which the glycoprotein is purified can be a cell culture supernatant in the case where the glycoprotein is secreted into the culture medium, or the solution can be obtained following cell lysis and separation of cell debris.
  • Cell lysis is a technique well known to those skilled in the art and can be carried out chemically, mechanically or enzymatically and the cell debris can then be separated, for example by centrifugation.
  • the glycoprotein is the C-terminal fragment of the non-determinable hyperglucosylated adhesin of Haemophilus influenzae as described above and is obtained by introducing into the cell (eg E. coli) an expression cassette comprising a sequence coding for the glycoprotein of interest and an expression cassette coding for the N-glycosyltransferase HMW1C.
  • the cells are then lysed using a detergent (eg RIPA buffer) and centrifuged to remove cell debris.
  • Affinity chromatography [26] The solution comprising the glycoprotein of interest is then separated in a first step by affinity chromatography.
  • Affinity chromatography is a chromatography technique that separates a compound, here a glycoprotein, using a ligand that specifically binds the glycoprotein of interest.
  • the specific ligand is coupled in a covalent or non-covalent way on a stationary support of the chromatography and will make it possible to capture the glycoprotein of interest from a solution. Indeed, when the solution comprising the glycoprotein of interest, called eluent, crosses the stationary support, the glycoprotein of interest binds specifically to the immobilized ligand.
  • the stationary support for chromatography is preferably a chemically inert macromolecular support such as, for example, agarose, crosslinked dextran, crosslinked poly(styrene-divinylbenzene) or silica, preferably agarose.
  • the stationary support is a column comprising agarose beads on which the specific ligand is fixed. The eluent passes through the column by gravity or under pressure.
  • the ligand can be for example in a nonlimiting way: an antibody to isolate a specific antigen, the ligand of an enzyme such as for example a non-hydrolyzable cofactor of the enzyme or a non-hydrolyzable structural analog of the substrate, a lectin for a glycoprotein.
  • an enzyme such as for example a non-hydrolyzable cofactor of the enzyme or a non-hydrolyzable structural analog of the substrate, a lectin for a glycoprotein.
  • the affinity chromatography is an immobilized metal affinity chromatography (IMAC, immobilized metal affinity chromatography) based on the chelation of immobilized metals.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • the metal ions are chelated on a stationary phase, for example agarose beads.
  • a stationary phase for example agarose beads.
  • chelating agents can be used to allow the bond between the metal ion and the stationary phase such as for example iminidoacetic acid (IDA), nitrilotriacetic acid (NTA) and tris[carboxymethyl]ethylenediamine (TED).
  • metals can be used for the IMAC method such as divalent or trivalent transition metals, preferably divalent Cu 2+ , Fe 2+ , Co 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ .
  • the metals used are Ni 2+ .
  • Metal ions can bind to histidine residues of the glycoprotein or to the His-Tag fused to the glycoprotein of interest.
  • the glycoprotein of interest included in the solution can be fused to a His-Tag.
  • the label (Tag) of the histidines comprises at least one histidine, preferably at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 or 14 histidines.
  • the Tag comprises 6 histidines. This histidine tag is added to the glycoprotein of interest at the N- or C-terminal part of the glycoprotein, preferably at the N-terminal part of the glycoprotein.
  • This Tag can be added to the glycoprotein of interest by gene manipulation, in particular by introducing into a cell an expression cassette coding for the glycoprotein of interest fused to the His-Tag.
  • fusion of two or more nucleotide sequences is meant the association of two or more nucleotide sequences which code for different proteins or fragments of proteins, the translation of the two fused genes giving a single functional polypeptide.
  • the solution comprising the glycoprotein of interest is added to the chromatography and the glycoprotein of interest binds to the ligand attached to the stationary phase.
  • the glycoprotein is then eluted.
  • the elution can be carried out in different ways, in particular by using a buffer with a pH different from that having allowed the charge which induces a change in the state of ionization of the protein, by using a buffer of ionic strength different from that having allowed the charge inducing a conformational change of the protein, or by competition with a free ligand.
  • the glycoprotein bound to the immobilized metal ions can be eluted by competition using, as non-limiting examples, imidazole, imidodiacetate or by lowering the pH.
  • the glycoprotein bound to the immobilized metal ions is eluted using imidazole.
  • fraction comprising the glycoprotein of interest obtained after the first step of affinity chromatography is then purified in a second step of steric exclusion chromatography (SEC for size exclusion chromatography) in the liquid phase.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the sentence stationary size exclusion chromatography is a porous matrix comprising porous beads.
  • the stationary phase may consist of dextran polymers such as Sephadex® (eg Sephadex G-25®), agarose such as Superose® or Sepharose® (eg Sepharose® CL-4B), or polyacrylamide such as Sephacryl® ( eg Sephacryl®-S400) or composite gels prepared from two types of gels such as Superdex200® combining Dextran gel (Sephadex®) and cross-linked agarose (Superose®).
  • the type and/or the size of the beads are chosen according to the size of the glycoproteins to be separated and the columns used.
  • the mobile phase comprising the glycoprotein of interest to be separated can be chosen from sodium phosphate, ammonium acetate, MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid), Bis-Tris (2 -bis(2-hydroxyethyl)amino- 2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol), ADA (N-(2-Acetamido) iminodiacetic acid), PIPES (piperazine-N,NI-bis(2- ethanesulfonic acid) , ACES (N-(2-Acetamido)- 2-aminoethanesulfonic acid), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid), TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid), HEPES (N-2-Hydroxyethyl
  • the mobile phase preferably comprises a detergent such as for example Triton-X100, glycerol, SDS, lysine or l arginine.
  • Arginine or lysine make it possible to reduce the non-specific interactions between the stationary phase and the glycoprotein and thus make it possible to improve the yield of the method.
  • the mobile phase buffer preferably comprises arginine or lysine, preferably arginine.
  • the method according to the present application is characterized in that the liquid phase of step ii. is a saline solution comprising arginine and/or lysine.
  • the mobile phase buffer may preferably comprise a low concentration of salts, especially less than 100 nM salts, preferably less than 50 nM, more preferably less than 20 nM salts.
  • the mobile phase buffer is a solution comprising 10 nM Na 2 SÜ 4 , 10 nM Na 2 HP0 4 , 200 mM arginine.
  • the mobile phase buffer is slightly higher than the theoretical isoelectric point (pi) of the glycoprotein of interest, preferably is at least 0.5, more preferably at least 1 higher than the theoretical isoelectric point (pi) of the glycoprotein of interest.
  • the separation of the glycoprotein of interest is preferably carried out in isocratic mode.
  • the method according to the invention is characterized in that the liquid phase of step ii. is a solution having a pH greater than at least 0.5, preferably at least 1, above the pi of the glycoprotein of interest.
  • the separation of the fractions can be carried out by gravity or under pressure, in particular using a pump.
  • the chromatography techniques can be carried out on an HPLC column (for "High performance liquid chromatography") in which the solution is led through the column under high pressure (for example between 1500 and 3000 psi), or in UPLC (for "Ultra performance liquid chromatography") in which the solution is led through the column under very high pressure (for example between 5000 and 12000 psi), or in FPLC (for "Fast protein liquid chromatography” in which the solution is conducted through the column under low pressure (eg between 200 and 700 psi).
  • HPLC column for "High performance liquid chromatography”
  • UPLC for "Ultra performance liquid chromatography”
  • FPLC for "Fast protein liquid chromatography” in which the solution is conducted through the column under low pressure (eg between 200 and 700 psi).
  • the flow rate of the HPLC chromatography step is advantageously adjusted to a value of between 0.1 to 5 mL/min, preferably 0.5 to 1 mL/min for an analytical column.
  • the flow rate of the UPLC chromatography step is advantageously adjusted to a value of between 0.1 to 1 mL/min, preferably 0.5 to 1 mL/min for an analytical column.
  • the flow rate of the FPLC chromatography step is advantageously adjusted to a value of between 10 to 70 mL/min, preferably 30 to 50 mL/min.
  • the eluent is collected in constant volume called fractions.
  • the collected fractions can be examined by spectroscopic techniques to determine the concentration of the eluted molecules.
  • Common spectroscopic detection techniques are refractive index and ultraviolet (UV), for example eluted solutions can be analyzed at 215 nm, 254 nm or 280 n.
  • Detection techniques can also be RALS/LALS light scattering or a viscometer.
  • the method according to the present application thus comprises a second stage of separation of the fraction comprising the glycoprotein of interest by size exclusion chromatography in the liquid phase comprising in particular the stages of: a) multiple injections of the fraction obtained during the first step, said injections succeeding one another after time intervals t1 in a first steric exclusion chromatography column, b) multiple withdrawals, said withdrawal of the fractions succeeding one another after time intervals t1, generating an eluate enriched in glycoprotein of interest, formed from at least one of the withdrawn fractions, c) multiple injections of the eluate enriched in glycoprotein of interest collected previously, said injections succeeding each other after time intervals t2 in a second column of steric exclusion chromatography, d) multiple withdrawals, said withdrawal of the fractions succeeding each other after intervals of te mps t2 in the second size exclusion chromatography column.
  • the first and second columns are identical and thus the second step of this method makes it possible to inject several times the solution comprising the glycoprotein to be separated in the same column.
  • the first and second column are one and the same column.
  • the time interval t1 of the multiple injections of step a) is chosen in such a way that the fraction enriched in the glycoprotein of interest is collected using a withdrawal device at the end of the column which respects the same protocol as that of injection.
  • the eluate obtained therefore includes the glycoprotein of interest but also impurities from other injections which migrate into the column and which have a retention time equal to one integer multiple of the value of t1.
  • These impurities are then separated in the second multiple injection step (step c) using an adequate time interval t2 which is different and not a multiple of t1 as illustrated in [FIG. 1] which makes it possible to collect the glycoprotein of interest without the impurities which were co-eluted with the glycoprotein of interest at all the time intervals t1 during the first phase.
  • the second step of the method may include a preliminary calibration step in order to optimize the values of the time intervals, their variations over time and the injection durations.
  • This preliminary step can be carried out by injecting the fraction comprising the glycoprotein of interest obtained following the separation by chromatography and by analyzing the different fractions.
  • a variant of this method is to set t1 and t2 to fixed values over time, determined such that t1 and t2 are not integer multiples of each other.
  • BL21 competent cells 50 ⁇ L (Novagen®, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) were mixed with the two plasmids pET-45 hmwlact and pET-24 hmwlc and shocked. heat to express hyperglucosylated adhesin. For expression of the non-glucosylated adhesin, only pET-45 hmwlact was mixed with BL21. After heat shock, the cells were mixed with 200 ⁇ l of SOC medium and incubated at 37°C for 90 min. An aliquot of the chemically competent cells was removed and plated onto plates containing carbenicillin and kanamycin and incubated overnight at 37°C.
  • the soluble fraction was then diluted 1/10 in His-Tag wash buffer (30 mM imidazole, 50 mM HEPES, 300 mM NaCl, 5% glycerol, pH 7.4), and the inclusion bodies dissolved in guanidine hydrochloride were diluted 1/10 in the same manner before being folded back onto the beads.
  • Purification was performed following the batch strategy by adding 5 mL per gram of HisPur® Ni-NTA bead suspension lysed cells (Thermo Scientific®, Waltham, MA, USA) to the dilute soluble fraction and the include body. The beads were incubated at 4°C overnight with gentle mixing by inversion followed by centrifugation. The supernatant was saved, and the beads were washed 3 times with wash buffer.
  • Elution of bound proteins was performed by briefly incubating the beads with 5 mL of elution buffer (300 mM imidazole, 50 mM HEPES, 300 mM NaCl, 5% glycerol). Elution was performed for a total of 3 times and the fractions were combined and processed immediately. All fractions were always kept on ice.
  • elution buffer 300 mM imidazole, 50 mM HEPES, 300 mM NaCl, 5% glycerol
  • the method of the present invention uses a continuous chromatography method using a single column in a two-step approach to achieve very high frequency separation. Rather than having multiple columns sequentially connected by valves and multiple pumps providing flow, a single column is used with a single pump providing flow.
  • the product is introduced into the chromatographic system in such a way that the separation is preferably carried out isocratically.
  • the frequency of product loading is chosen so that small impurities are superimposed on the product. These impurities are separated in a second multi-injection step [Fig. 1].
  • Size exclusion chromatography was performed using an Agilent® 1260 Inifinity binary LC HPLC instrument (Agilent Technologies®, Santa Clara, USA) equipped with a TSKgel® G2000SWXL Tosoh Bioscience® chromatography column 30 cm x 7.8 mm, 5 ⁇ m particle size (Tosoh Bioscience® GmbH, Griesheim, Germany) and a manual injection valve with a 1 mL injection loop.
  • Isocratic chromatography was carried out using a buffer mobile phase (10 mM Na 2 S0 4 , 10 mM Na 2 HP0 4 , 200 mM arginine, pH 6.8) operating either at 0.5 mL/min or at 1mL/min.
  • the eluates were analyzed at a wavelength of 215 nm, 254 nm and 280 nm.
  • a test injection to determine the injection interval was carried out by injecting 500 ⁇ l of the elution fraction obtained by IMAC poly His-Tag. After calculating the exact interval time for the injection frequency, 10 aliquots of 500 ⁇ L each were prepared. The reinjection of the product from the first stage was carried out by lowering the flow rate to 0.5 mL/min and injections of 900 ⁇ L were carried out.
  • the R-value of the analyte peak with the adjacent peak should be greater than 1.5, unless otherwise specified.
  • the R value is calculated using the following equation: [Math. 1]
  • N Number of Theoretical Column Plates (N) [61]
  • the N value is a measure of column efficiency. It should not be less than the value specified in the individual monograph.
  • the N value is calculated using the following equation: [Math. 2]
  • Î R is the retention time of the analyte peak in the test solution
  • W (h/ 2 ) is the width at half height of the analyte peak in the test solution.
  • SDS-PAGE was performed according to U.K. Laemmli, Nature (1970) 680-685. Aliquots of the purification fractions were taken and incubated with SDS-PAGE loading buffer at 98°C for 5 minutes. Proteins were then electrophorized using a ROTIPHORESE PROclamp® mini (Cari Roth GmbH + Co. KG, Düsseldorf, Germany) at a constant intensity of 40 mA in a 15% resolution gel until complete. . Gels were resolved using a modified and more sensitive Coomassie Brilliant Blue staining method, according to D.-H. Kang, et al., Bulletin of the Korean Chemical Society 23 (2002) 1511-1512, which shows detection limits of up to 1 ng/strip.
  • gels were washed 3 times with ultrapure water for 10 minutes each, then stained overnight with CBB staining solution (0.02% (w/v) CBB G-250 in 10% (v/v) ethanol, 5% (w/v) aluminum sulfate 18-hydrate and 2% (w/v) phosphoric acid) according to the protocol of Kang and al., Bulletin of the Korean Chemical Society 23 (2002) 1511-1512. The gels were then washed again 3 times with desalinated and filtered water, to remove the remaining CBB and the gels were scanned for documentation.
  • CBB staining solution 0.02% (w/v) CBB G-250 in 10% (v/v) ethanol, 5% (w/v) aluminum sulfate 18-hydrate and 2% (w/v) phosphoric acid
  • HMWIct and highly glucosylated HMWIct were immobilized at 4°C overnight after dilution in 30.5 M Na 2 C0, pH 8.0, at 10 ⁇ g per protein well in Nunc maxisorb 96-well plates ® (Thermo Scientific®, Waltham, MA, USA).
  • HMW1ct-Glc highly glucosylated adhesin protein
  • NTHi non-determinable Haemophilus influenzae
  • HMWIA is hyperglucosylated by the N-glycosyltransferase HMW1C and, after translocation by HMWIB, the two-partner system is responsible for cell-cell interaction and adherence to the host respiratory system epithelium during infection (J.W. St Geme, H. -J. Yeo, et al., Trends in microbiology 17 (2009) 355-360; L. Yakovlieva, C. Ramirez-Palacios, S.J. Marrink, M.T. Walvoort, Semi-processive hyperglycosylation of adhesin by bacterial protein N-glycosyltransferases, 2020).
  • HMW1ct-Glc protein highly glucosylated Adhesin (HMW1ct-Glc) of Haemophilus influenzae not determinable as a recombinant protein in E. coli (BL21) also encoding the glycosyltransferase HMW1C as previously described (MTC Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430).
  • IMAC His-Tag After purification by IMAC His-Tag, they obtained the complex consisting of a unit of HMW1ct-Glc, which migrates at 35-40 kDa on SDS-PAGE ([Fig. 3], sample 1) and of a unit of HMWIct, which migrates at 75 kDa in the gel.
  • the separation of the two proteins is not feasible with the IMAC method because the subunits interact strongly and a second purification step is required.
  • affinity tags such as FLAG tags or hemagglutinin tags (FIA) are available, they are found to be less suitable.
  • the FIA tag is not suitable for the purification of FlMWIct-Glc because it is the same class of protein, which could affect the biological activity during antibody recognition.
  • the bovine rhodopsin-derived TAG 1 D4 epitope is very hydrophobic and as such is only suitable for very hydrophilic proteins, unlike FIMW1ct-Glc.
  • Similar tags like the poly-Arg tag, often affect the tertiary structure of proteins due to their positive charges at neutral pFH, which also has a negative effect on antibody recognition in ELISA assays (C.L. Young, et al., Biotechnol J. 7 (2012) 620-634).
  • IMAC Flis-Tag proved to be optimal, even if a second purification step is necessary.
  • Anion exchange chromatography was found to be suitable for separating the two units, as the proteins interact with varying ionic strength and stationary phase, allowing them to be separated well from each other (M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430).
  • the analytical SEC of the product obtained using this purification strategy showed a purity of only 70% thus necessitating an additional separation step to remove the remaining impurities.
  • TAP for “Tandem Affinity Purification”
  • anion exchange a two-step liquid size exclusion chromatography (Inexiotech® chromatography as described in WO2012/062985) was employed.
  • the size of the particles must be chosen so as to meet predefined criteria in terms of purity and yield of final glycoprotein, while maintaining high efficiency for flow rate, column length and diameter as well as pressure.
  • Other considerations during SEC include the range of molecular weights to be separated: smaller particles, such as particles based on core shell technology, have been shown to perform better than fully porous particles for very narrow molecular weight ranges (BWJ Pirok, P. et al. J. Chromatogr. A 1486 (2017) 96-102).
  • the reduction in particle size leads to an increase in internal back pressure in packed columns, which can lead to compression of the chromatographic bed and damage to the column.
  • the final composition of the chosen buffer was a low salt concentration, a pH slightly higher than the theoretical pH calculated for the target protein (6.0) with addition of arginine: 10 mM Na2SO4, 10 mM Na2HPO4, 200 mM arginine, pH 6 ,8.
  • Arginine and also lysine are known to be able to break protein interactions where other detergents fail. Arginine and lysine are able to cross the water exclusion layer around hydrophobic proteins and also enter the additive exclusion layer for larger detergents such as SDS, thus allowing better hydration of the protein, resulting in the disruption of protein- protein and protein-surface (T. Arakawa, et al., Biophys. Chem. 127 (2007) 1-8).
  • Arginine was able to reduce the nonspecific interaction between the stationary phase and the protein, resulting in a tenfold higher UV signal compared to glycerol or Triton-X100. Unlike PCC or simulated moving bed (SMB) methods, column regeneration is not possible during passage. By injection of highly concentrated detergents, the loss of the glycoprotein of interest by non-specific interaction with the bed can be greatly reduced.
  • the column loading frequency for SEC was made such that less abundant impurities coelute with the glucosylated protein HMW1ct-Glc, allowing collection on repeated injections, while the majority of impurities coelute with the glycosyltransferase HMW1C.
  • the collected product was reanalyzed by SEC and the separation conditions were optimized to allow maximum separation of the product of interest.
  • the Intervals between injections were chosen such that the highly glucosylated adhesin protein could be collected separately from other impurities.
  • the non-determinable Haemophilus influenzae C-terminal recombinant protein HMWIct was expressed and glucosylated by co-expression with the glycosyltransferase HMW1C. His-Tag purification was performed as the first purification step, while the final purification was performed by continuous chromatography using Inexiotech® technology. Using this approach, we were able to reduce the chromatography run time and mobile phase consumption compared to existing methods. Unlike existing continuous chromatography methods, conventional HPLC equipment and columns can be used. The inventors have demonstrated the high degree of purity and biological activity of the otherwise difficult to purify highly glucosylated adhesin protein.

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Abstract

La présente divulgation relève du domaine des méthodes de purifications des glycoprotéines, de préférence les glycoprotéines fortement glucosylées.

Description

Méthode de purification de glycoprotéines
Domaine technique
[1] La présente divulgation relève du domaine des méthodes de purification des glycoprotéines, de préférence les glycoprotéines fortement glucosylées.
Technique antérieure
[2] Les protéines recombinantes prennent une importance croissante en raison de leurs nombreuses applications, notamment dans l'industrie biopharmaceutique, l'industrie des enzymes ou l'industrie agricole. Grâce à la disponibilité accrue des protéines recombinantes, de nombreuses avancées ont été réalisées dans les domaines de la médecine, du diagnostic, de l'alimentation et de la nutrition, ainsi que de la production de matières premières. Aujourd'hui, plus de 200 produits pharmaceutiques à base de peptides et de protéines approuvés par la FDA sont utilisés, comme l'insuline, l'albumine, l'hormone de croissance humaine et les anticorps, ce qui améliore les possibilités et les stratégies de traitement.
[3] Ces avancées ont été possibles grâce aux progrès réalisés dans les domaines de la production de protéines recombinantes (M. Délie, R. et al., Antioxidants & redox signaling 21 (2014) 414-437). L'expression de protéines recombinantes à l'aide de micro-organismes génétiquement modifiés tels que Escherichia coli sont maintenant des techniques courantes (A.L. Demain et al. Biotechnology advances 27 (2009) 297-306; K. Itakura, et al., Science 198 (1977) 1056-1063; R. B. Meagher, et al., Cell 10 (1977) 521-536). Cependant, la purification reste la principale étape limitante de la production de protéines recombinantes. Le repliement correct des protéines et la purification rapide et efficace constituent un défi majeur en raison des exigences d'optimisation pour chaque protéine.
[4] Les glycoprotéines représentent un sujet de recherche prometteur en raison de leur rôle dans la signalisation cellulaire, l'adhésion cellulaire et l'interaction avec les récepteurs. De nombreuses stratégies différentes ont été développées pour l'ingénierie biochimique/protéique et la production de protéines glycosylées par expression dans des lignées cellulaires de mammifères, glycosylation orthogonale par co-expression avec une glycosyltransférase ou glycosylation chimique post expression (H. Nothaft, et al., Current opinion in Chemical biology 53 (2019) 16- 24). En raison de l'hétérogénéité des glycoprotéines exprimées, la purification est particulièrement difficile car le mélange hétérogène peut présenter une variété de propriétés physicochimiques.
[5] La purification des protéines à petite échelle en laboratoire a fait de nombreux progrès et est facilement disponible, mais la purification à grande échelle reste un défi (D. Hardy, et al., Biochemical Society transactions 44 (2016) 838-844 ; J. Konczal, C.H. et al., Protein Expr. Purif. 133 (2017) 160-169). La stratégie de purification la plus couramment employée pour la purification des protéines recombinantes utilise des étiquettes d'affinité fixées à la protéine, telles que les étiquettes poly-His, en combinaison avec la chromatographie d'affinité à ions métalliques immobilisés (IMAC) (C.L. Young, et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 620- 634).
[6] Néanmoins, une seule purification par IMAC s'avère souvent insuffisante pour obtenir une pureté suffisante pour les analyses et études biochimiques. En effet, bien que l'IMAC présente de nombreux avantages, tels qu'une purification rapide et une mise à l'échelle facile, les niveaux de pureté élevés ne sont pas toujours atteints après un seul cycle de purification. Par conséquent, une deuxième étape de purification est souvent nécessaire, soit sous la forme d'une purification par affinité en tandem (TAP), soit par une étape de séparation par un autre type de chromatographie, comme la chromatographie d'exclusion stérique (Size-Exclusion Chromatography, SEC) (Y. Li, Biotechnology letters 33 (2011) 1487-1499).
[7] La SEC a été développée pour permettre la séparation des produits par taille, avec une résolution et un pouvoir de séparation élevés, ce qui la rend appropriée comme étape de séparation (G. H. Lathe, et al., The Biochemical Journal 64 (1956) 665-674). Depuis lors, elle est considérée comme une application standard dans la préparation des molécules biologiques et des protéines, y compris, mais sans s'y limiter, les applications préparatoires, l'étude du repliement des protéines (V. N. Uversky, et al., Biochemistry 32 (1993) 13288-13298), le dessalage et l'échange de tampons (T. Burnouf, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 664 (1995) 3-15) et l'élimination des agrégats (Katakam, et al. PDA Journal of pharmaceutical science and technology 49 (1995) 160-165). Cependant, en raison de la nature de la SEC, la séparation prend généralement beaucoup de temps car le principe de séparation repose sur la rétention différente des protéines dans les matrices réticulées. Par conséquent, les longues durées d'exécution de 30 minutes ou plus et la consommation élevée de phase mobile jouent un rôle critique, rendant souvent cette approche économiquement non viable. En outre, la faible capacité volumique des colonnes SEC a empêché son application dans les processus industriels de séparation. Bien que les applications de la SEC dans les approches de chromatographies continues telles que le lit mobile simulé (SMB), le contre-courant périodique (PCC) ou la chromatographie annulaire continue (CAC) soient connues, elles nécessitent un équipement spécialisé et très coûteux ainsi qu'un personnel spécialement formé, ce qui limite ces approches aux processus industriels dédiés (Dr. Rahul Godawat et al. Biotechnol. J. 7 (2012) 1496-1508 ; G. Iberer, et al., J. Chromatogr. A 921 (2001) 15-24; S. R. Schmidt, BioProcess Technical 15 (2017) 30-37).
Résumé
[8] Les inventeurs ont pour la première fois développé une méthode de purification des glycoprotéines permettant d’améliorer le rendement tout en obtenant une bonne pureté du composé cible avec un équipement de chromatographie en phase liquide haute performante (HPLC ; pour en anglais « High Performance liquid Chromatography ») classique, ou UPLC (pour en anglais « Ultra Performance Liquid Chromatography »), ou FPLC (pour en anglais « Fast Protein Liquid Chromatography ») mais avec un débit beaucoup plus rapide. Les inventeurs ont utilisé une chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) combinée à une méthode de chromatographie continue utilisant une seule colonne dans une approche en deux étapes telle que décrite dans la demande WO2012/062985 afin d’obtenir une séparation à très haute fréquence. Contrairement à la méthode utilisée précédemment par les inventeurs pour purifier une adhésine fortement glucosylée de l'Haemophilus influenzae de type non déterminable (HMW1ct-Glc) (M.T.C. Walvoort, et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430), comme illustré dans les exemples de la présente demande, la méthode de la présente invention permet d’atteindre un degré de pureté plus élevé tout en ayant un rendement plus important.
[9] La présente invention concerne une méthode de purification d’une glycoprotéine d’intérêt en solution comprenant les étapes de : i. séparation de la fraction comprenant une glycoprotéine par chromatographie d’affinité, ii. séparation de ladite fraction obtenue après l’étape i. comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant les étapes de : a) injections multiples de la fraction, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une première colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1, générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt formé à partir d’au moins d’une des fractions soutirées, c) injections multiples de l’éluat recueilli précédemment, les dites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, les dits soutirages des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans la seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique.
[10] La présente invention concerne également une glycoprotéine susceptible d’être obtenue par la méthode précédente présentant un degré de pureté supérieur à 80%, de préférence 90% de la masse totale des protéines.
Brève description des dessins
Fig. 1
[11] [Fig. 1] montre une représentation schématique de la chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide selon l’invention (WO2012/062985). A) Au cours de la première étape, le produit est introduit dans la colonne à une fréquence déterminée, choisie de manière à ce que le produit co-élue avec une petite quantité d'impuretés (gris foncé). B) Au cours de la deuxième étape, le produit est réinjecté en utilisant une fréquence différente optimisée de manière à le séparer de l'impureté précédemment co-éluée. Fig. 2 [12] [Fig. 2] montre une analyse SEC de HMW1ct-Glc purifié après IMAC His-Tag et après purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention. L'analyse SEC a été réalisée à 1 mL/min. 500 pL de produit ont été chargés sur la colonne. La glycosyltransférase HMW1C (Grass, S. et al. Mol Microbiol 48 (2003) 737; Gross, J. et al. J Biol Chem 283, (2008) 26010) élue en premier à 7.9 min tandis que l'adhésine HMW1 élue à 14.8 min.
Fig. 3
[13] [Fig. 3] montre un SDS-PAGE de (1) HMW1ct-Glc purifié après IMAC His-Tag et purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention (gauche), (2) après purification IMAC (droite). La glycosyltransférase utilisée pour la glycosylation orthogonale est toujours présente, à 70 kDa, alors qu'après purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention (1), seule la HMW1ct-Glc est visible, à 40-35 kDa.
Description des modes de réalisation
[14] La présente divulgation concerne une méthode de purification d’une glycoprotéine d’intérêt en solution comprenant les étapes de : i. séparation de la fraction comprenant une glycoprotéine par chromatographie d’affinité, ii. séparation de ladite fraction obtenue après l’étape i. comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant les étapes de : a) injections multiples de la fraction, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une première colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1 , générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt, c) injections multiples de l’éluat recueilli précédemment, les dites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans la seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique.
[15] La méthode décrite dans la présente demande permet de séparer une glycoprotéine et en particulier d’obtenir une glycoprotéine fortement purifiée, de préférence avec un degré de pureté de plus de 80%, de préférence de plus de 90% de la masse des protéines totales.
[16] Ainsi la présente demande porte sur une glycoprotéine susceptible d’être obtenue par la méthode décrite dans la présente demande, qui présente de préférence un degré de pureté supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90% de la masse des protéines totales.
[17] Par degré de pureté de la glycoprotéine dans une solution, on entend le pourcentage massique de la glycoprotéine par rapport à la masse totale en protéine.
[18] Par glycoprotéine, on entend une protéine portant un ou plusieurs groupements glycosyl. De préférence, la glycoprotéine est une glucoprotéine, qui est une protéine portant un ou plusieurs groupements glucosyl. Une glycoprotéine est synthétisée par glycosylation d’une protéine qui peut être de trois types, N- glycosylation, C-glycosylation ou O-glycosylation.
[19] De préférence, la glycoprotéine d’intérêt selon la présente demande est une glycoprotéine fortement glycosylée. Par protéine fortement glycosylée, on entend une protéine qui comprend plus d’1 site de glycosylation tous les 100 résidus d’une séquence protéique, de préférence plus de 1, 2 ou 3 sites de glycosylation tous les 100 résidus d’une séquence protéique.
[20] De préférence, la glycoprotéine d’intérêt selon la présente demande est une glucoprotéine fortement glucosylée. Par protéine fortement glucosylée, on entend une protéine qui comprend plus d’1 site de glucosylation dans une séquence protéique de 100 résidus, de préférence plus de 1, 2 ou 3 sites de glucosylation dans une séquence protéique de 100 résidus.
[21] Les sites de glycosylation ou glucosylation peuvent être déterminés par spectrométrie de masse à haute résolution en combinant CID (collision induced dissociation) et ETD (Electron transfer dissociation). [22] Les glycoprotéines fortement glycosylées sont par exemple : la sous-unité alpha de la protéine des canaux sodiques de type 1 humaine, Teneurine-1 humaine, le récepteur de type tyrosine phosphatase de la protéine Mu.
[23] De préférence, la glycoprotéine est une adhésine fortement glucosylée de Haemophilus influenzae non déterminable, également appelée Adhésine-GIc ou HMW1ct-Glc (High molecular weight 1 adhesin) (NCBI Reference Sequence : WP_01 4550671.1 , 09 Nov. 2020), de préférence le fragment C-terminal de l’adhésine hyperglucosylée comprenant les acides aminés 1205 à 1536 de la séquence d’adhésine.
[24] La solution initiale comprenant la glycoprotéine d’intérêt à séparer peut être obtenue à partir d’un échantillon biologique ou d’une culture cellulaire eucaryote capable de synthétiser la protéine recombinante. Les différentes méthodes permettant de synthétiser une protéine par voie recombinante sont bien connues de l’homme du métier et consiste à l’introduction dans la cellule d’une cassette d’expression comprenant une séquence codant pour la glycoprotéine d’intérêt sous le contrôle d’éléments régulateurs nécessaires à son expression tels que des promoteurs forts comme CMV ou SV40. Dans le cadre de la présente demande, la glycoprotéine d’intérêt est avantageusement purifiée à partir d’une solution dérivée d’une culture de cellules eucaryotes. La solution à partir de laquelle est purifiée la glycoprotéine peut être un surnageant de culture cellulaire dans le cas où la glycoprotéine est sécrétée dans le milieu de culture ou la solution peut être obtenue suite à la lyse des cellules et séparation des débris cellulaires. La lyse des cellules est une technique bien connue de l’homme du métier et peut être réalisée de manière chimique, mécanique ou enzymatique et les débris cellulaires peuvent être séparés ensuite par exemple par centrifugation.
[25] De préférence, la glycoprotéine est le fragment C-terminal de l’adhésine hyperglucosylée ô’Haemophilus influenzae non déterminable tel que décrit précédemment et est obtenue en introduisant dans la cellule (e.g. E. coli) une cassette d’expression comprenant une séquence codant pour la glycoprotéine d’intérêt et une cassette d’expression codant pour la N-glycosyltransferase HMW1C. De préférence, les cellules sont ensuite lysées à l’aide d’un détergent (e.g. tampon RIPA) et centrifugées pour éliminer les débris cellulaires. Chromatographie d’affinité [26] La solution comprenant la glycoprotéine d’intérêt est ensuite séparée dans une première étape par une chromatographie d’affinité.
[27] La chromatographie d’affinité est une technique de chromatographie qui permet de séparer un composé, ici une glycoprotéine en utilisant un ligand qui lie spécifiquement la glycoprotéine d’intérêt. Le ligand spécifique est couplé de manière covalente ou bien non covalente sur un support stationnaire de la chromatographie et va permettre de capturer la glycoprotéine d’intérêt d’une solution. En effet, lorsque la solution comprenant la glycoprotéine d’intérêt, appelée éluant traverse le support stationnaire, la glycoprotéine d’intérêt se lie spécifiquement au ligand immobilisé.
[28] Le support stationnaire de la chromatographie est de préférence un support macromoléculaire chimiquement inerte tel que par exemple de l’agarose, du dextran réticulé, du poly(styrene-divinylbenzene) réticulé ou de la silice, de préférence de l’agarose. De préférence, le support stationnaire est une colonne comprenant des billes d’agarose sur lesquelles sont fixées le ligand spécifique. L’éluant traverse la colonne par gravité ou sous pression.
[29] Le ligand peut être par exemple de manière non limitative : un anticorps pour isoler un antigène spécifique, le ligand d’une enzyme comme par exemple un cofacteur non hydrolysable de l’enzyme ou un analogue structural non hydrolysable du substrat, une lectine pour une glycoprotéine.
[30] De préférence, la chromatographie d’affinité est une chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC, immobilized métal affinity chromatography) basée sur la chélation de métaux immobilisés. Dans cette technique, les ions métalliques sont chélatés sur une phase stationnaire, par exemple des billes d’agarose. Plusieurs agents chélatants peuvent être utilisés pour permettre la liaison entre l’ion métallique et la phase stationnaire tels que par exemple l’acide iminidoacétique (IDA), l’acide nitrilotriacétique (NTA) et le tris[carboxyméthyl]éthylène diamine (TED).
[31] Plusieurs métaux peuvent être utilisés pour la méthode IMAC tels que les métaux de transition divalents ou trivalents, de préférence divalents Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+. De préférence, les métaux utilisés sont les Ni2+.
[32] Les ions métalliques peuvent se lier aux résidus d’histidines de la glycoprotéine ou à l’His-Tag fusionné à la glycoprotéine d’intérêt. [33] De préférence, lorsque la solution comprenant la glycoprotéine d’intérêt est séparée par une première étape de chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés, la glycoprotéine d’intérêt comprise dans la solution peut être fusionnée à un His-Tag. L’étiquette (Tag) des histidines comprend au moins une histidine, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 14 histidines. De préférence, le Tag comprend 6 histidines. Ce tag d’histidines est ajouté à la glycoprotéine d’intérêt à la partie N- ou C- terminale de la glycoprotéine, de préférence à la partie N-terminale de la glycoprotéine. Ce Tag peut être ajouté à la glycoprotéine d’intérêt par manipulation génique, notamment en introduisant dans une cellule une cassette d’expression codant pour la glycoprotéine d’intérêt fusionnée à l’His-Tag. Par fusion de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, on entend l’association de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques qui codent pour des protéines ou des fragments de protéines différentes, la traduction des deux gènes fusionnés donnant un seul polypeptide fonctionnel.
[34] La solution comprenant la glycoprotéine d’intérêt est ajoutée à la chromatographie et la glycoprotéine d’intérêt se lie au ligand fixé à la phase stationnaire. La glycoprotéine est ensuite éluée. L’élution peut être réalisée de différentes façons, notamment en utilisant un tampon à pH différent de celui ayant permis la charge qui induit un changement de l’état d’ionisation de la protéine, en utilisant un tampon de force ionique différente de celle ayant permis la charge induisant un changement de conformation de la protéine, ou par compétition avec un ligand libre.
[35] De préférence, la glycoprotéine liée aux ions métalliques immobilisés pourra être éluée par compétition en utilisant à titre d’exemples non-limitatifs l’imidazole, imidodiacetate ou en diminuant le pH. De préférence, la glycoprotéine liée aux ions métalliques immobilisés est éluée en utilisant l’imidazole.
Chromatographie d’exclusion stérique
[36] La fraction comprenant la glycoprotéine d’intérêt obtenue après la première étape de chromatographie d’affinité est ensuite purifiée dans une deuxième étape de chromatographie d’exclusion stérique (SEC pour size exclusion chromatography) en phase liquide.
[37] La chromatographie d’exclusion stérique permet de séparer les macromolécules en fonction de leur volume hydrodynamique. La phase stationnaire de la chromatographie d’exclusion stérique est une matrice poreuse comprenant des billes poreuses. La phase stationnaire peut être constituée de polymères de dextran tel que Sephadex® (e.g. Sephadex G-25®), d’agarose tel que Superose® ou Sepharose® (e.g. Sepharose® CL-4B), ou de polyacrylamide tel que Sephacryl® (e.g. Sephacryl®-S400) ou des gels composites préparés à partir de deux types de gels tel que le Superdex200® combinant le gel de Dextran (Sephadex®) et l’agarose réticulé (Superose®). Le type et/ou la taille des billes sont choisies en fonction de la taille des glycoprotéines à séparer et des colonnes utilisées.
[38] La phase mobile comprenant la glycoprotéine d’intérêt à séparer peut être choisie parmi les tampons de phosphate de sodium, d’acétate d’ammonium, MES (2-(N-morpholino) acide ethanesulfonique), Bis-Tris (2-bis(2-hydroxyethyl)amino- 2-(hydroxymethyl)-1 ,3-propanediol), ADA (N-(2-Acetamido) acide iminodiacétique), PIPES (piperazine-N,NI-bis(2- acide éthanesulfonique), ACES (N-(2-Acetamido)- 2-acide aminoethanesulfonique), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-acide aminoethanesulfonique), MOPS (3-(N-morpholino) acide propanesulfonique), TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- acide aminoethanesulfonique), HEPES (N-2- Hydroxyethylpiperazine-N'-2- acide éthanesulfonique), de préférence du sodium phosphate ou de l’acétate d’ammonium, préférentiellement de l’acétate d’ammonium.
[39] Afin de réduire les interactions entre les protéines et les interactions entre la phase stationnaire et les protéines, la phase mobile comprend de préférence un détergent tel que par exemple du Triton-X100, du glycérol, SDS, de la lysine ou de l’arginine. L’arginine ou la lysine permettent de réduire les interactions non- spécifiques entre la phase stationnaire et la glycoprotéine et permettent ainsi d’améliorer le rendement de la méthode. Ainsi, le tampon de la phase mobile comprend de préférence de l’arginine ou de la lysine, de préférence de l’arginine. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente demande est caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution saline comprenant de l’arginine et/ou de la lysine.
[40] Le tampon de la phase mobile peut comprendre de préférence une faible concentration de sels, notamment moins de 100 nM de sels, de préférence moins de 50 nM, plus préférentiellement moins de 20 nM de sels. De préférence, le tampon de la phase mobile est une solution comprenant du Na2SÜ4 à 10 nM, Na2HP04 à10 nM, arginine à 200mM. De préférence, le tampon de la phase mobile est faiblement supérieur au point isoélectrique (pi) théorique de la glycoprotéine d’intérêt, de préférence est supérieure au moins de 0.5, encore de préférence au moins de 1 au point isoélectrique (pi) théorique de la glycoprotéine d’intérêt.
La séparation de la glycoprotéine d’intérêt est réalisée de préférence en mode isocratique. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l’invention est caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution ayant un pH supérieur au moins de 0.5, de préférence au moins de 1 au pi de la glycoprotéine d’intérêt.
[41] La séparation des fractions peut être réalisée par gravité ou sous pression, notamment à l’aide d’une pompe. De préférence, les techniques de chromatographies peuvent être réalisées sur une colonne en HPLC (pour « High performance liquid chromatography ») dans laquelle la solution est conduite à travers la colonne sous une forte pression (par exemple entre 1500 et 3000 psi), ou en UPLC (pour « Ultra performance liquid chromatography ») dans laquelle la solution est conduite à travers la colonne sous une très forte pression (par exemple entre 5000 et 12000 psi), ou en FPLC (pour « Fast protein liquid chromatography » dans laquelle la solution est conduite à travers la colonne sous une faible pression (par exemple entre 200 et 700 psi).
[42] Le débit de l'étape de chromatographie en HPLC est avantageusement ajusté à une valeur comprise entre 0.1 à 5 mL/min, de préférence 0.5 à 1mL/min pour une colonne analytique. Le débit de l'étape de chromatographie en UPLC est avantageusement ajusté à une valeur comprise entre 0.1 à 1 mL/min, de préférence 0.5 à 1 mL/min pour une colonne analytique. Le débit de l'étape de chromatographie en FPLC est avantageusement ajusté à une valeur comprise entre 10 à 70 mL/min, de préférence 30 à 50mL/min.
[43] L’éluant est collecté en volume constant appelé fractions. Les fractions recueillies peuvent être examinées par des techniques de spectroscopie pour déterminer la concentration des molécules éluées. Les techniques courantes de détection par spectroscopie sont l’indice de réfraction et l’ultraviolet (UV), par exemple les solutions éluées peuvent être analysées à 215 nm, 254 nm ou 280 nm. Les techniques de détection peuvent également être la diffusion de lumière RALS/LALS ou un viscosimètre.
[44] Afin d’améliorer le rendement et obtenir une séparation de la glycoprotéine d’intérêt et notamment de glycoprotéine fortement glucosylée, les inventeurs ont réalisé une chromatographie d’exclusion stérique continue dans une approche en deux étapes telle que décrite dans la demande WO2012/062985 qui est incorporée ici par référence.
[45] En particulier, la méthode selon la présente demande comprend ainsi une deuxième étape de séparation de la fraction comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant notamment les étapes de : a) injections multiples de la fraction obtenue lors de la première étape, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une première colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) des soutirages multiples, ledit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1, générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt, formé à partir d’au moins une des fractions soutirées, c) injections multiples de l’éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt recueilli précédemment, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, ledit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans la seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique.
[46] De préférence, la première et deuxième colonnes sont identiques et ainsi la deuxième étape de cette méthode permet d’injecter plusieurs fois la solution comprenant la glycoprotéine à séparer dans la même colonne. En d’autres termes, de préférence, la première et deuxième colonne sont une seule et même colonne.
[47] De préférence, l’intervalle de temps t1 des injections multiples de l’étape a) est choisie de telle manière que la fraction enrichie en glycoprotéine d’intérêt est recueillie grâce à un dispositif de soutirage en fin de colonne qui respecte le même protocole que celui d’injection. L’éluat obtenu comprend donc la glycoprotéine d’intérêt mais également des impuretés issues d’autres injections qui migrent dans la colonne et qui présentent un temps de rétention égale à un multiple entier de la valeur de t1. Ces impuretés sont ensuite séparées dans la deuxième étape d’injection multiple (étape c) en utilisant un intervalle de temps adéquat t2 qui est différent et n’est pas un multiple de t1 comme illustré dans la [Fig. 1] qui permet de recueillir la glycoprotéine d’intérêt sans les impuretés qui étaient co-éluées avec la glycoprotéine d’intérêt à tous les intervalles de temps t1 lors de la première phase.
[48] La réinjection multiple à des temps d’intervalles t2 de l’éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt recueilli permet d’augmenter le rendement de la séparation et de diminuer la quantité de phase mobile utilisée.
[49] La deuxième étape de la méthode peut comprendre une étape préalable de calibrage afin d’optimiser les valeurs d’intervalles de temps, leurs variations au cours du temps et les durées d’injections. Cette étape préalable peut être réalisée en injectant la fraction comprenant la glycoprotéine d’intérêt obtenue à la suite de la séparation par chromatographie et en analysant les différentes fractions.
[50] De manière préférée, une variante de ce procédé est de fixer t1 et t2 à des valeurs fixes au cours du temps, déterminées telles que t1 et t2 ne soient pas des multiples entiers l'un de l'autre.
[51] Les exemples suivants illustrent l’invention sans en limiter la portée.
Exemples 1. Méthode
1.1 Production de protéines recombinantes - Expression de l'adhésine hyperglucosylée.
[52] Le clonage, la transformation et l'expression ont été réalisés dans une version modifiée selon M.T.C. Walvoort, et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430. Le gène codant pour le fragment C-terminal de l'adhésine HMW1A, résidus 1205-1536, appelé HMWIct a été cloné dans le vecteur pET-45 comprenant un gène de résistance à la carbénicilline. Le gène codant pour la glycosyltransférase HMW1C a été inséré dans un vecteur pET-24 comprenant un gène de résistance à la kanamycine. Le Tag His6-C-terminal a été retiré de ce vecteur. Des cellules compétentes BL21 (50 pL) (Novagen®, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) ont été mélangées avec les deux plasmides pET-45 hmwlact et pET-24 hmwlc et soumis à un choc thermique pour exprimer l'adhésine hyperglucosylée. Pour l'expression de l'adhésine non-glucosylée, seul le pET-45 hmwlact a été mélangé avec BL21. Après un choc thermique, les cellules ont été mélangées avec 200 pl_ de milieu SOC et incubées à 37°C pendant 90 min. Un aliquot des cellules chimiquement compétentes a été prélevé et étalé sur des plaques contenant de la carbénicilline et de la kanamycine et incubé pendant la nuit à 37°C. Des colonies uniques ont été sélectionnées et cultivées la nuit dans des cultures de 5 ml_ à 37°C sous agitation. Les 5 mL ont ensuite été utilisés pour l'inoculation de cultures de 1 L. Des mesures de l'DO600 ont été effectuées toutes les heures et l'induction par l'ajout d'IPTG à une concentration finale de 1 mM a été optimisée à DO600 = 0,7. Les cellules ont ensuite été cultivées pendant une nuit à 30°C.
1.2 Purification de l'adhésine hyperglucosylée par IMAC poly-His- Tag
[53] Les cellules ont été récoltées et lysées avec du tampon RIPA glacé (10 mM TRIS, 140 mM NaCI, 1% Triton-X100, 1% SDS, pH 7.4 contenant un inhibiteur de protéase) par agitation et mélange sur glace pendant 1 h. La fraction soluble a été séparée des débris cellulaires par centrifugation à 130000 x g pendant 30 min à 4°C. Les corps d'inclusion ont été dissous dans du chlorhydrate de guanidine 6 M et séparés des débris cellulaires insolubles par centrifugation. La fraction soluble a ensuite été diluée au 1/10 dans un tampon de lavage His-Tag (30 mM d'imidazole, 50 mM d'HEPES, 300 mM de NaCI, 5 % de glycérol, pH 7,4), et les corps d'inclusion dissous dans du chlorhydrate de guanidine ont été dilués au 1/10 de la même manière avant d'être repliés sur les billes. La purification a été réalisée en suivant la stratégie par lots en ajoutant 5 mL par gramme de cellules lysées de suspension de billes HisPur® Ni-NTA (Thermo Scientific®, Waltham, MA, USA) à la fraction soluble diluée et à la fraction de corps d'inclusion. Les billes ont été incubées à 4°C pendant une nuit en mélangeant doucement par inversion, puis par centrifugation. Le surnageant a été conservé, et les billes ont été lavées 3 fois avec du tampon de lavage. L'élution des protéines liées a été réalisée en incubant brièvement les billes avec 5 ml de tampon d'élution (300 mM imidazole, 50 mM HEPES, 300 mM NaCI, 5% glycérol). L'élution a été effectuée pour un total de 3 fois et les fractions ont été combinées et traitées immédiatement. Toutes les fractions ont toujours été conservées sur la glace.
1.3 Chromatographie continue (Inexiotech®) - Injection multiple
[54] La méthode de la présente invention utilise une méthode de chromatographie continue utilisant une seule colonne dans une approche en deux étapes afin d'obtenir une séparation à très haute fréquence. Plutôt que d'avoir plusieurs colonnes connectées de manière séquentielle par des vannes et plusieurs pompes fournissant le flux, une seule colonne est utilisée avec une seule pompe fournissant le flux. Le produit est introduit dans le système chromatographique de manière à ce que la séparation soit réalisée de préférence de manière isocratique. Pendant les premières injections séquentielles, la fréquence de chargement du produit est choisie de telle sorte que de petites impuretés se superposent au produit. Ces impuretés sont séparées dans une deuxième étape de multi- injections [Fig. 1].
[55] La chromatographie d'exclusion de taille a été réalisée à l'aide d'un instrument HPLC Agilent® 1260 Inifinity binary LC (Agilent Technologies®, Santa Clara, USA) équipé d'une colonne chromatographique TSKgel® G2000SWXL Tosoh Bioscience® 30 cm x 7,8 mm, 5 pm de taille de particules (Tosoh Bioscience® GmbH, Griesheim, Allemagne) et d'une valve d'injection manuelle avec une boucle d'injection de 1 mL. La chromatographie isocratique a été réalisée à l'aide d'une phase mobile tampon (10 mM Na2S04, 10 mM Na2HP04, 200 mM arginine, pH 6,8) fonctionnant soit à 0,5 mL/min soit à 1 mL/min. Les éluats ont été analysés à une longueur d'onde de 215 nm, de 254 nm et de 280 nm. Une injection test pour déterminer l'intervalle d'injection a été réalisée par injection de 500 pL de la fraction d'élution obtenue par IMAC poly His-Tag. Après calcul du temps d'intervalle exact pour la fréquence d'injection, 10 aliquots de 500 pL chacun ont été préparés. La réinjection du produit de la première étape a été effectuée en abaissant le débit à 0,5 mL/min et des injections de 900 pL ont été réalisées.
[56] L'acquisition des données a été lancée en paramétrant le logiciel de contrôle ChemStation Agilent® sur une exécution à blanc pour éviter l'injection par le passeur automatique d'échantillons. Avec le début de l'injection, l'acquisition des données a également été lancée ainsi que la collecte des fractions. Les injections ont été effectuées à la fréquence prédéterminée et les fractions collectées ont été conservées sur la glace ou au réfrigérateur jusqu'à l'analyse. L'analyse des chromatogrammes a été réalisée en utilisant le logiciel Origin® 2018 (OriginLab® Corporation, Northampton, USA).
[57] La quantification des protéines et le calcul du rendement ont été effectués à l'aide du kit de dosage des protéines Pierce® Coomassie Bradford (Thermo Scientific®, Waltham, MA, USA) (M.M. Bradford, Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-254). Une courbe d'étalonnage a été préparée selon les instructions du fabricant, allant de 0,125 mg/mL à 2 mg/mL. Des aliquots de fractions à analyser ont été préparés de la même manière que les échantillons pour la calibration et l'absorbance mesurée à l = 595 nm.
1.4 calculs théoriques
[58] Les calculs théoriques ont été calculés conformément à Brian A. et al., Column efficiency measurement, Analytical Chemistry 56 (1984) 1583A-1596A.
Facteur de résolution (R)
[59] Pour garantir la précision de l'analyse quantitative, la valeur R du pic de l'analyte avec le pic adjacent doit être supérieure à 1,5, sauf indication contraire. La valeur R est calculée à l'aide de l'équation suivante : [Math. 1]
Figure imgf000018_0001
[60] avec tR2 et ÎRI étant les temps de rétention de deux pics adjacents 1 et 2, respectivement et Wi et W2 étant les largeurs de deux pics adjacents 1 et 2, respectivement.
Nombre de plateaux théoriques de la colonne (N) [61] La valeur N est une mesure de l'efficacité de la colonne. Elle ne doit pas être inférieure à la valeur spécifiée dans la monographie individuelle. La valeur N est calculée en utilisant l'équation suivante : [Math. 2]
Figure imgf000018_0002
[62] Où ÎR est le temps de rétention du pic de l'analyte dans la solution d'essai [63] W(h/2) est la largeur à mi-hauteur du pic de l'analyte dans la solution d'essai.
1.5 SDS-PAGE
[64] La SDS-PAGE a été réalisée conformément à U. K. Laemmli, Nature (1970) 680-685. Des aliquots des fractions de purification ont été prélevés et incubés avec le tampon de chargement SDS-PAGE à 98°C pendant 5 minutes. Les protéines ont ensuite été électrophorisées à l'aide d'un ROTIPHORESE PROclamp® mini (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne) à une intensité constante de 40 mA dans un gel de résolution de 15 % jusqu'à la fin. Les gels ont été résolus à l'aide d'une méthode de coloration au bleu brillant de Coomassie modifiée et plus sensible, selon D.-H. Kang, et al., Bulletin of the Korean Chemical Society 23 (2002) 1511-1512, qui présente des limites de détection allant jusqu'à 1 ng/bande. Après l'électrophorèse, les gels ont été lavés 3 fois avec de l'eau ultrapure pendant 10 minutes chacun, puis colorés pendant une nuit avec la solution de coloration CBB (0,02% (p/v) de CBB G-250 dans de l'éthanol à 10% (v/v), du sulfate d'aluminium 18-hydrate à 5% (p/v) et de l'acide phosphorique à 2% (p/v)) selon le protocole de Kang et al., Bulletin of the Korean Chemical Society 23 (2002) 1511-1512. Les gels ont ensuite été lavés à nouveau 3 fois avec de l'eau dessalée et filtrée, pour éliminer le CBB restant et les gels ont été scannés pour la documentation.
1.6 ELISA (pour « Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay “)
[65] Le test ELISA a été réalisé conformément à M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430 et P. P. Engvall Eva, Immunochemistry 8 (1971) 871-874. Toutes les étapes ont été optimisées en fonction des conditions du laboratoire, notamment l'immobilisation, la dilution du sérum et la dilution des anticorps secondaires. La HMWIct et la HMWIct fortement glucosylée ont été immobilisées à 4°C pendant la nuit après dilution dans du Na2C030,5 M, pH 8,0, à raison de 10 pg par puits de protéine dans des plaques à 96 puits Nunc maxisorb® (Thermo Scientific®, Waltham, MA, USA). Les puits ont été lavés à l'aide d'un laveur de plaques TECAN® (Switzerland) programmé pour laver chaque puits 3 fois avec 100 pL de solution de lavage, suivi d'un blocage avec 10 % de FBS dilué dans 0,1 % de Tween, solution de lavage 150 mM NaCI pendant 1 h. Le sérum de référence de patient atteint de sclérose en plaques (appartenant à la sérothèque de PeptLab, Département NeuroFarBa, Université de Florence, Sesto Fiorentino (Italie)) où sont conservés les sérums de patients atteints de sclérose en plaques collectés par « The Multiple Sclerosis Clinical Care and Research Centre, Department of Neurosciences, Reproductive Sciences and Odontostomatology, Federico II University, Naples, Italy », dans le contexte de la collaboration ayant porté à la publication M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430 a été dilué au 1:200 dans la solution de blocage et incubé pendant la nuit à 4°C. Après un lavage ultérieur, l'anticorps secondaire (dilué au 1:3000 dans la solution de blocage) a été ajouté et les plaques ELISA ont été incubées à température ambiante pendant 3 heures. Les plaques ELISA ont été lavées à nouveau et la réaction de coloration a été effectuée : 100 pL de solution de réaction (1 mg/mL de PNPP 1 M de diéthanolamine 0,02% de carbonate de magnésium, pH 9,8) ont été ajoutés à chaque puit et les plaques ELISA ont été analysées à 405 nm à l'aide d'un lecteur de plaques TECAN®.
1.7 Purification des anticorps
[66] La purification des anticorps anti-HMW1ct-Glc abs a été réalisée comme décrit précédemment : la protéine HMWIct et la protéine fortement glucosylé HMW1ct-Glc ont été immobilisés indépendamment sur du Sepharose 4B activé par N-hydroxysuccinimide (NHS) (GE Healthcare®, Chicago, USA) selon le protocole du fabricant. Le succès de l'immobilisation a été contrôlé en déterminant la quantité de protéine avant et après le couplage. Le sérum de patient atteint de SEP (précédemment cité dans le paragraphe 1.6) a été dilué au 1:10 dans du PBS (pH 7,5) et passé trois fois sur la colonne HMWIct-Sepharose® prééquilibrée avec du PBS. Les fractions de passage ont été collectées et passées trois fois sur la colonne HMW1ct-Glc-Sepharose®. Les anticorps retenus sur la colonne HMW1ct-Glc-Sepharose® ont été élués avec un tampon glycine-HCI 200 mM (pH 2,6) et immédiatement neutralisés avec du Na2CÜ3 0,5 M (pH 8,0). La concentration d'anticorps a été déterminée en mesurant la DO280 nm en considérant que le coefficient d'extinction des anticorps à 1 mg/ml est de 1 ,4.
2. Résultats 2.1 Rôle immunologique et pertinence de l'adhésine hyperglucosylée de l'Haemophilus influenzae non déterminable (NTHi)
[67] Dans une étude précédente, les inventeurs ont montré qu’un test ELISA utilisant la portion C-terminale de la protéine adhésine fortement glucosylée (HMW1ct-Glc) de l'Haemophilus influenzae non déterminable (NTHi) permet de détecter des anticorps dans le sérum de patients atteints de sclérose en plaques (M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430). NTHi exprime diverses protéines d’adhésion de surface de haut poids moléculaire (HMW), dont HMW1A. L'HMWIA est hyperglucosylée par la N-glycosyltransférase HMW1C et, après translocation par l'HMWIB, le système à deux partenaires est responsable de l'interaction cellule-cellule et de l'adhérence à l'épithélium du système respiratoire de l'hôte pendant l'infection (J.W. St Geme, H. -J. Yeo, et al., Trends in microbiology 17 (2009) 355-360 ; L. Yakovlieva, C. Ramirez-Palacios, S.J. Marrink, M.T. Walvoort, Semi-processive hyperglycosylation of adhesin by bacterial protein N -glycosyltransferases, 2020). Lors de l'interaction avec le système immunitaire, une forte réponse humorale est déclenchée. Dans l'étude précédente, il a été montré que les anticorps de classe IgG et IgM des patients atteints de SEP reconnaissent spécifiquement la protéine bactérienne hyperglucosylée par opposition à la protéine d’adhésion non glucosylée et le HMW1ct-Glc est capable de différencier les patients des contrôles. Les inventeurs ont donc émis l'hypothèse que lors de la stimulation du système immunitaire au cours d'une infection bactérienne par NTHi, les adhésines glucosylées pourraient déclencher des cellules T autoréactives conduisant à la formation d'anticorps autoréactifs par mimétisme moléculaire.
2.2 Expression et IMAC His-Tag de l'adhésine hyperglucosylée
[68] Les inventeurs ont donc exprimé la protéine Adhésine fortement glucosylée (HMW1ct-Glc) de Haemophilus influenzae non déterminable sous forme de protéine recombinante dans E. coli (BL21) codant également pour la glycosyltransférase HMW1C comme décrit précédemment (M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430). [69] Après purification par IMAC His-Tag, ils ont obtenu le complexe constitué d'une unité de HMW1ct-Glc, qui migre à 35-40 kDa en SDS-PAGE ([Fig. 3], échantillon 1) et d'une unité de HMWIct, qui migre à 75 kDa dans le gel. Comme cela a été décrit précédemment, la séparation des deux protéines n'est pas réalisable avec la méthode IMAC car les sous-unités interagissent fortement et une seconde étape de purification est nécessaire.
[70] Bien que d'autres étiquettes d'affinité telles que les étiquettes FLAG ou les étiquettes d'hémagglutinine (FIA) soient disponibles, elles s'avèrent moins appropriées. Ainsi, l'étiquette FIA ne convient pas pour la purification de FlMWIct- Glc car il s'agit de la même classe de protéine, ce qui pourrait affecter l'activité biologique lors de la reconnaissance des anticorps. L'épitope TAG 1 D4 dérivé de la rhodopsine bovine est très hydrophobe et, en tant que tel, ne convient qu'aux protéines très hydrophiles, contrairement à l’FIMW1ct-Glc. Des étiquettes similaires, comme l’étiquette poly-Arg, affectent souvent la structure tertiaire des protéines en raison de leurs charges positives à pFH neutre, ce qui a également un effet négatif sur la reconnaissance des anticorps lors des tests ELISA (C.L. Young, et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 620-634).
[71] Ainsi, le choix de l'IMAC Flis-Tag s'est avéré optimal, même si une deuxième étape de purification est nécessaire. Une chromatographie d'échange d'anions a été jugée appropriée pour séparer les deux unités, car les protéines interagissent avec la force ionique variable et la phase stationnaire, ce qui permet de bien les séparer l'une de l'autre (M.T.C. Walvoort, C. et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430). Cependant, la SEC analytique du produit obtenu en utilisant cette stratégie de purification a montré une pureté de seulement 70% rendant ainsi nécessaire une étape supplémentaire de séparation pour éliminer les impuretés restantes. Plutôt que d'appliquer la TAP (pour « Tandem Affinity Purification ») ou l'échange d'anions, une chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes (chromatographie Inexiotech® comme décrit dans WO2012/062985) a été employée.
2.3 Chromatographie d'exclusion de taille en continu basée sur Inexiotech® pour la purification de l'adhésine fortement glucosylée [72] Les inventeurs ont démontré dans la présente étude, une approche de purification différente afin de séparer la protéine fortement glucosylée HMWIct- Glc et la glycosyltransferase HMW1C en une seule étape tout en minimisant le temps de passage chromatographique et en améliorant considérablement le rendement. Bien que, d'une manière générale, les approches SEC permettent d'obtenir une grande pureté grâce à un pouvoir de séparation élevé, la SEC ne convient généralement qu'aux applications préparatoires à l'échelle du laboratoire. Toutefois, la présente méthode permet de surmonter ces limites.
[73] Ainsi, des fréquences d'injection plus rapides sont possibles par rapport à la chromatographie en quinconce ou par empilement, car le chromatographe n'a pas à attendre que le produit soit séparé avant l'injection suivante. Par conséquent, une charge plus élevée du lit/phase stationnaire est obtenue par rapport aux autres types de chromatographies, ce qui augmente l'efficacité et la productivité globales. Le choix de la phase mobile et de la phase stationnaire est donc soigneusement sélectionné et optimisé pour obtenir une purification plus rapide plutôt qu'une purification à haute résolution. De cette manière, ce ne sont pas plusieurs états d'interaction entre la phase mobile et le lit qui sont simulés ou réalisés, mais plutôt un compromis entre les deux qui est trouvé (H. Nothaft, C.M. et al. Current opinion in Chemical biology 53 (2019) 16-24). L'interaction entre la phase stationnaire et le produit est optimisée de manière à ce que le produit interagisse suffisamment avec la phase stationnaire pour qu'à l'équilibre avec la phase mobile, la séparation du produit et de l'impureté soit obtenue. Par conséquent, des systèmes de chromatographie simples comprenant une pompe et une colonne (WO2012/062985) peuvent être utilisés pour appliquer cette méthode plutôt que des unités de chromatographie à contre-courant périodique (PCC) hautement sophistiquées et complexes.
[74] Des considérations particulières doivent être prises en compte lors de la SEC, notamment : la phase stationnaire, la composition de la phase mobile, le pH, les sels, les tensioactifs et autres additifs. Ces éléments doivent être optimisés en fonction du lit utilisé pendant la chromatographie. En raison de l'utilisation plus fréquente de la phase stationnaire, l’opérateur doit être plus attentif à ces considérations que lors d’une chromatographie classique. [75] Le choix de la phase stationnaire doit prendre en considération le type de particules, leur taille et leurs modifications (R.R. Burgess, Protein Expr. Purif. 150 (2018) 81-85). Le compromis entre l'efficacité de la chromatographie et les effets de transfert de masse sont particulièrement importants pour les types de chromatographie continue (Houwing, J., AICHE Journal 49 (2003) 1158-1167). Par conséquent, la taille des particules doit être choisie de manière à répondre à des critères prédéfinis en termes de pureté et rendement en glycoprotéine finale, tout en gardant une efficacité élevée pour un débit, une longueur et un diamètre de colonne ainsi qu'une pression à l'intérieur du système chromatographique utilisé. Parmi les autres éléments à prendre en compte lors de la SEC figure la gamme de poids moléculaires à séparer : les particules de taille réduite, telles que les particules basées sur la technologie « core Shell », se sont avérées plus performantes que les particules entièrement poreuses pour des plages de poids moléculaires très étroites (B.W.J. Pirok, P. et al. J. Chromatogr. A 1486 (2017) 96-102). En outre, la réduction de la taille des particules entraîne une augmentation de la contre-pression interne dans les colonnes garnies, ce qui peut entraîner une compression du lit chromatographique et endommager la colonne.
[76] Afin de réduire les interactions protéine-protéine et les interactions entre la phase stationnaire et les protéines à purifier, différents détergents ont été évalués, notamment le Triton-X100, le glycérol, le SDS et l'arginine. Les sels tampons ont également été évalués à différentes concentrations allant d'une faible concentration de sel (10 mM) à une forte concentration de sel (300 mM) ainsi que l'ajout de solvants organiques (tels que l’isopropanol à 10%). Différentes valeurs de pH ont également été testées dans la gamme de 6,8 à 8,0. La composition finale du tampon choisi était une faible concentration en sel, un pH légèrement supérieur au pl théorique calculé pour la protéine cible (6,0) avec ajout d'arginine : 10 mM Na2S04, 10 mM Na2HP04, 200 mM arginine, pH 6,8. Il est connu que l'arginine et aussi la lysine sont capables de rompre les interactions entre les protéines là où les autres détergents échouent. L'arginine et la lysine sont capables de franchir la couche d'exclusion de l'eau autour des protéines hydrophobes et d'entrer également dans la couche d'exclusion additive pour les détergents plus importants tels que le SDS, permettant ainsi une meilleure hydratation de la protéine, ce qui entraîne la rupture des interactions protéine- protéine et protéine-surface (T. Arakawa, et al., Biophys. Chem. 127 (2007) 1-8). L'arginine a été capable de réduire l'interaction non spécifique entre la phase stationnaire et la protéine, ce qui a entraîné un signal UV dix fois plus élevé par rapport au glycérol ou au Triton-X100. Contrairement aux méthodes PCC ou à lit mobile simulé (SMB, pour « stimulated moving bed »), la régénération de la colonne n'est pas possible pendant le passage. Par injection de détergents fortement concentrés, la perte de la glycoprotéine d’intérêt par interaction non spécifique avec le lit peut être fortement réduite.
2.4 Chromatographie en continu pour l’obtention de l’adhésine fortement glucosylée à haut degré de pureté, après une première purification par IMAC His-Tag
[77] Après optimisation de la séparation par IMAC, une purification par chromatographie continue a été réalisée [Fig. 2] Par cette méthode, l’adhésine fortement glucosylée à haut degré de pureté est obtenue par un processus en deux étapes : le premier passage chromatographique a été planifié de manière à séparer la protéine fortement glucosylée HMW1ct-Glc de la glycosyltransférase HMW1C par injections répétées sur colonne SEC du mélange obtenu après IMAC His-Tag, en faisant se chevaucher les passages chromatographiques. En utilisant le système de tampons précédemment décrit, en utilisant une SEC à un débit constant d’1 mL/min, une résolution de pic R de 4,60 a été obtenue (R>1,5 nécessaire pour une séparation complète). La glycosyltransférase HMW1C élue en premier à 8,2 minutes tandis que la protéine HMW1ct-Glc à plus bas poids moléculaire élue plus tard à 15,4 min [Fig. 2] La fréquence de chargement de la colonne pour SEC a été réalisée de manière à ce que les impuretés les moins abondantes coéluent avec la protéine glucosylée HMW1ct-Glc, permettant ainsi la collecte lors d'injections répétées, tandis que la majorité des impuretés coélue avec la glycosyltransférase HMW1C. Le produit collecté a été réanalysé par SEC et les conditions de séparation ont été optimisées pour permettre une séparation maximale du produit d’intérêt. La réinjection du mélange obtenu lors de la première phase de purification à 1 mL/min aboutit à une séparation insuffisante (R = 0.36). Ainsi, le débit a été réduit à 0,5 mL/min pour permettre une séparation complète des deux produits du mélange (R = 1,51). Lors de la réinjection, les intervalles entre les injections ont été choisis de telle sorte que la protéine adhésine fortement glucosylée puisse être recueillie séparément des autres impuretés. L'efficacité N de la colonne fut calculée selon Brian A. et al., Analytical Chemistry 56 (1984) 1583A-1596A. Par cette méthode il a été montré que l'efficacité N1 et N2 des étapes 1 et 2 (N1 = 3370,8 et N2 = 113 287,5) est bien supérieure à l’efficacité de la chromatographie d'échange d'anions (N = 3271,3). L'efficacité supérieure de la colonne pendant cette étape indique une utilisation plus efficace du volume de la colonne et, par conséquent, une résolution plus fine des pics par rapport à la chromatographie d'échange d'anions. [78] L'analyse par SDS-PAGE n'a montré qu'une seule bande de taille attendue de 35 kDa [Fig. 3]. La productivité globale, définie en mg par minute de produit collecté, a été calculée à 8,8 pour la chromatographie continue et est supérieure à celle de la méthode par échange d'anions qui montre une productivité = 6,3. En même temps, la pureté de la glycoprotéine d’intérêt a été 91% et donc plus élevée par rapport à la pureté de 70% obtenue par chromatographie par échange d'anions, tout en étant beaucoup plus rapide [Tableau 1]. Le rendement total en adhésine fortement glucosylée HMW1ct-Glc est de 1,93 mg/L de culture E. coli. [Tableau 1]
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*Le temps de rétention pour la méthode Inxiotech est donné pour les étapes 1 et 2 respectivement. [79] La stabilité la protéine glucosylée a été testée par ELISA comme décrit précédemment. Les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques ont été purifiés par chromatographie d’affinité en utilisant comme précédemment décrit l’adhésine non glucosylé HMW1 et l’adhésine fortement glucosylée HMWIct à haute degré de pureté. Ces anticorps ont ensuite été utilisés dans un test ELISA pour démontrer la reconnaissance de la HMW1ct-Glc purifiée par la présente méthode. Le signal pour le HMWIct glycosylé est presque deux fois plus élevé, ce qui indique la spécificité des anticorps purifiés et confirme l'activité biologique du HMW1ct-Glc après purification.
2.5 Avantages du procédé selon la présente invention par rapport aux autres types de chromatographies telles que la PCC et SMB.
[80] Classiquement des injections uniques sont effectuées en chromatographie « mode batch », tandis qu’en chromatographie continue, le mélange est introduit de manière répétée dans le système chromatographique. Les instruments de chromatographie en continue sont coûteux et ne sont donc adaptés que pour une utilisation permanente dans les procédés industriels (P.E. Barker, et al., Séparation and Purification Methods 17 (1988) 1-65). Cette stratégie de purification n'est en revanche pas adaptée aux petits volumes de mélanges. Pour la purification de ces mélanges, on utilise souvent la chromatographie en discontinue, qui est très inefficace en raison des longues durées d'exécution, de la forte consommation de phase mobile et de la faible productivité qui en résulte. La mise à l'échelle de la chromatographie en discontinue est réalisée en augmentant le diamètre de la colonne tout en réduisant les temps d'exécution et en optimisant les temps de séparation. Cependant, suivant cette approche, seule une petite partie de la phase stationnaire est utilisée pour la séparation lors de chaque cycle. L'approche utilisée selon la présente invention maximise la charge de travail de la phase stationnaire par injections répétées du mélange. Par conséquent, chaque partie de la phase stationnaire est utilisée au cours de la séparation du mélange, ce qui permet d'obtenir une productivité beaucoup plus élevée que les approches en « mode batch ».
[81] La chromatographie continue (chromatographie périodique à contre-courant, chromatographie à lit mobile simulé ou chromatographie annulaire continue) est basée sur l’utilisation de plusieurs colonnes en parallèle et d’un cycle de chargement, de lavage et d'élution. Les stratégies PCC et SMB permettent de passer à l'échelle supérieure en faisant un compromis entre la taille de la colonne (diamètre) et la vitesse de séparation. Souvent, l'exécution de gradients plus rapides et donc la réduction du temps de séjour du produit d’intérêt dans le système s'avèrent plus efficaces, permettant un chargement plus rapide du mélange dans le système chromatographique plutôt que l'augmentation des dimensions du système (A.C. Fisher, et al., Trends in biotechnology 37 (2019) 253-267 ; D. Baur, et al., Biotechnol. J. 11 (2016) 920-931). Par conséquent, les stratégies PCC et SMB fonctionnent à des débits beaucoup plus élevés permettant d'obtenir des temps de séjour réduits. En conséquence, les colonnes de plus grand diamètre ne peuvent souvent pas supporter les vitesses linéaires de ces débits élevés en raison des limitations de la stabilité du lit de la colonne (O. Kaltenbrunner, et al., Biotechnol. Prog. 32 (2016) 938-948). Comme chaque colonne subit le cycle de chargement du produit, de séparation et de régénération de la colonne, la productivité de chaque colonne individuelle est comparable à celle de la chromatographie en « mode batch ». La productivité globale du système est cependant comparable à celle de la méthode selon la présente invention car, à chaque instant, le mélange est chargé sur une colonne tandis qu'une autre colonne sépare le produit et une autre colonne élue le produit d’intérêt purifié. Comme plusieurs chromatographies sont exécutées en parallèle, la consommation de phase mobile est sensiblement plus élevée avec cette méthode.
[82] Bien que la méthode de l’invention décrite ne permet pas de purifier d'aussi grandes quantités que lors de la chromatographie en continue, les coûts beaucoup plus faibles qui y sont associés, puisque des systèmes et des colonnes HPLC conventionnelles sont utilisés, en font une alternative intéressante. Il est facile de passer à l'échelle supérieure en augmentant le diamètre de la colonne, sans perte de temps. La charge de mélange n'est pas limitée par le temps de séjour du produit dans le système, comme c'est le cas avec le SMB ou la PCC, mais plutôt par la fréquence d'injection la plus rapide possible. Un compromis optimal est établi entre une purification suffisante et le chargement du mélange pour assurer une productivité maximale.
[83] Cependant, la nécessité d'une séparation isocratique exige une optimisation minutieuse de la phase stationnaire et de la phase mobile pour obtenir une purification suffisante. De ce point de vue, la PCC et le SMB s'avèrent plus flexibles car ils ne nécessitent pas de développement de nouvelles méthodes de purification. Ils peuvent plutôt utiliser les protocoles de séparation existants. De plus, contrairement à la PCC ou au SMB, la régénération de la colonne par une étape de lavage n'est pas possible car le mélange est chargé sur la colonne de façon répétée.
Conclusions
[84] La protéine recombinante C-terminale HMWIct de Haemophilus influenzae non déterminable a été exprimée et glucosylée par co-expression avec la glycosyltransférase HMW1C. La purification par His-Tag a été effectuée comme première étape de purification, tandis que la purification finale a été réalisée par chromatographie continue en utilisant la technologie Inexiotech®. Grâce à cette approche, nous avons pu réduire le temps d'exécution de la chromatographie et la consommation de phase mobile par rapport aux méthodes existantes. Contrairement aux méthodes de chromatographie continue existantes, des équipements et les colonnes HPLC classiques peuvent être utilisés. Les inventeurs ont démontré le haut degré de pureté et l'activité biologique de la protéine adhésine fortement glucosylée autrement difficile à purifier.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Méthode de purification d’une glycoprotéine d’intérêt en solution comprenant les étapes de : i. séparation de la fraction comprenant une glycoprotéine par chromatographie d’affinité, ii. séparation de ladite fraction obtenue dans l’étape i. comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant les étapes de : a) injections multiples de la fraction, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une première colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1, générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt formé à partir d’au moins d’une des fractions soutirées, c) injections multiples de l’éluat recueilli précédemment, les dites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, les dits soutirages des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans la seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique.
[Revendication 2] Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est fusionnée à une étiquette histidine (Tag-His) et la chromatographie d’affinité est une chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés.
[Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est une protéine fortement glucosylée.
[Revendication 4] Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est le fragment C-terminal de l’adhésine fortement glucosylée de Haemophilus influenzae non déterminable.
[Revendication 5] Méthode selon les revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la glycoprotéine est obtenue à partir d’une culture cellulaire.
[Revendication 6] Méthode selon l’une quelconque des revendications 2 à 5 caractérisée en ce que les ions métalliques immobilisés dans la chromatographie d’affinité sont des ions Ni2+
[Revendication 7] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution saline comprenant de l’arginine et/ou de la lysine.
[Revendication 8] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution ayant un pH au moins supérieur à 0.5 au point isoélectrique (pi) de la glycoprotéine d’intérêt.
[Revendication 9] Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la première et la seconde colonne sont une seule et même colonne.
[Revendication 10] Glycoprotéine susceptible d’être obtenue par l’une des méthodes selon les revendications 1 à 9 présentant un degré de pureté supérieur à 80%, de préférence 90% de la masse totale des protéines.
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