重组淋巴毒素衍生物的生产工艺
本发明属于生物制药领域,具体涉及重组淋巴毒素衍生物的生产工艺。
从80年代中期开始,国内外已有大量文献报道淋巴毒素(lymphotoxin,LT)的生物学活性和抗癌机理(中国专利申请CN 1175638A;美国专利No.5747023;Aggarwal,B.B.:A Practical Approach,1992,p267;Sundan等,J.Biol.Chem.1996,271(16):p9778;Kaiji等,Proc.Natl.Acad.Sclusa,1997,94,p3324;Qin等,Blood 1995,85(10),p2779)。
淋巴毒素的生物学活性包括:
1.诱导成纤维细胞合成具有重要生理活性的物质,包括GM-CSF、G-CSF、IL-1、胶原酶和前列腺素E2等,这些蛋白因子可调控大多数细胞的新陈代谢。淋巴毒素刺激成纤维细胞的增殖,对皮肤的表皮损伤的愈合有较好的促进作用。
2.促进单核细胞的终末分化并合成G-CSF,激活B淋巴细胞的增殖。
3.作用于嗜中性细胞,使之产生活性氧,增强嗜中性细胞的吞噬能力及消化异物的能力;作为嗜中性细胞的趋化物质,促进嗜中性细胞的胞饮作用,促进嗜中性细胞粘附于内皮细胞。
4.调节成骨细胞的生长,抑制骨质增生;调节角化细胞的生长,从而调控表皮细胞的代谢。
5.抑制内皮细胞的生长,具有抗血管生成样因子的活性,可使肿瘤部位出血,从而导致肿瘤的死亡。
在淋巴毒素众多的生物学作用中,研究较多的是其对肿瘤的抑制作用。给健康小鼠和裸鼠分别移植Meth A肿瘤细胞,静脉注射适量淋巴毒素,则裸鼠需要几十倍的剂量,抑瘤效果才能与健康小鼠相当,表明了B淋巴细胞是淋巴毒素产生抗肿瘤作用的一个重要组成部分。淋巴毒素主要是通过激活机体免疫应答,即促进机体B淋巴细胞产生抗肿瘤细胞的抗体,进而产生对肿瘤的抑制作用。
天然淋巴毒素含171个氨基酸,分子量为25,000道尔顿;N-端62位有一个N-糖基化位点,不同细胞系的细胞分泌的淋巴毒素,其糖基化产物不同,但这种差别并不影响淋巴毒素的体外及体内生物活性,只对淋巴毒素的等电点有影响。淋巴瘤样细胞分泌的淋巴毒素,其等电点为pI5.8;CHO细胞表达的重组淋巴毒素,其等电点为pI6.85;而大肠杆菌表达的重组淋巴毒素无糖基化,等电点为pI8.3。天然淋巴毒素由上下两层反向平行的β折叠结构组成的片层并列构成;其中,上层由三条长的和两条短的β折叠片组成;而下层由5条逐渐缩短的β折叠片组成。淋巴毒素N-端27个氨基酸游离于其主要结构之外,进一步研究表明,N-端27个氨基酸完全缺失或部分缺失,不但生物学活性有不同程度的提高,而且其毒性及不良反应均大大减小了。
在T淋巴细胞或白细胞等培养中,加入有丝分裂原植物抗毒素或伴刀豆球蛋白Con A,可分泌淋巴毒素。成纤维细胞、星云状细胞、骨髓瘤细胞、内皮细胞、上皮细胞及一些转化细胞等在一定条件下也可分泌淋巴毒素;干扰素和白介素-2则可刺激淋巴毒素的产生。
有人在淋巴瘤样细胞RPMI-1788的培养中,加入植物抗毒素,引起淋巴毒素的分泌;培养液经硅胶吸附,植物凝集素(lentil lectin)亲和层析等等,可得均一的淋巴毒素,其分子量为25,000道尔顿,等电点pI5.8,比活为5×107IU/mg蛋白质;当蛋白浓度为0.5mg/ml时,这种淋巴毒素以三聚体形式存在并具有生物学活性。但是,培养细胞难度较大,表达量又较低,而且,纯化过程繁琐,费用较高,产率却很低,因此,用这种方式生产淋巴毒素是不可能的。
淋巴毒素及其衍生物,应用基因工程技术,可获得在CHO细胞、酵母细胞及大肠杆菌细胞中表达。淋巴毒素及其衍生物,于大肠杆菌中表达比较稳定,但若表达产物以活性形式产生,则表达量较低,后续纯化也比较困难;若表达量提高,则表达产物以包涵体的无活性形式产生,需要增溶包涵体,并通过一定复性方法使之恢复生物活性。文献所述淋巴毒素及其衍生物,于大肠杆菌中以包涵体方式表达,或者这种包涵体蛋白无法复性,或者复性率非常低。
中国专利CN1175638,以PCR方法获得了淋巴毒素N端缺失27个氨基酸的淋巴毒素衍生物的cDNA,并用基因重组技术将该淋巴毒素衍生物的cDNA克入大肠杆菌表达载体pRSET C,将该重组子导入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,获得了可表达淋巴毒素衍生物的工程菌。将该工程菌培养,并以IPTG诱导,SDS-PAGE表明淋巴毒素衍生物的表达量可达菌体总蛋白的60-80%,但表达的蛋白质在大肠杆菌中以包涵体形式存在。破菌,收集包涵体,将其悬于无菌水中,加入0.1N NaOH至溶液澄清,加入50mM Tris-HCl pH9.0,直至溶液为pH9.5,将该复性液过经50mM Tris-HCl pH9.0预平衡的DE52柱,以50mM Tris-HCl pH9.0-7.0梯度洗脱,收集pH7.0时的洗脱峰。如此可获得淋巴毒素衍生物,其比活大于2×108IU/mgPr.,RP-HPLC检测,纯度大于95%。
然而,CN1175638的发明仅处于实验室阶段,且表达不稳定、收率也不高。
本发明者利用CN1175638所述淋巴毒素衍生物工程菌,在完善重组菌的发酵、包涵体蛋白的制备、包涵体蛋白的变性复性以及淋巴毒素衍生物的分离纯化技术上进行潜心研究,从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供能大规模生产的重组淋巴毒素衍生物的生产工艺。
本发明提供的重组淋巴毒素衍生物的生产工艺以N端缺失27个氨基酸的rhLTαDa cDNA克隆入大肠杆菌表达载体pRSET C,所得重组子导入大肠杆菌BL21(DE3)得到工程菌,其特征在于:
(1)将所述工程菌在发酵罐中采用改良M9培养基发酵,温度30-37℃,pH6.7-7.2,通气量5-15L/分钟,罐压0.01-0.02M Pa,控制溶解氧浓度为20-40%,适时加补料培养基和加IPTG;
(2)收集菌体、破碎和收集包涵体后,以三种洗涤剂依次洗涤包涵体;
(3)用尿素、盐酸胍或氨水将包涵体增溶;
(4)用硼砂复性液或Tris复性液进行复性:
(5)相继用Q-Sepharose FF离子交换柱层析、Phenyl-Sepharose FF疏水层析和CM-Sepharose FF离子交换柱层析进行纯化。
图1是本发明的生产工艺流程图。
图2是本发明与CN1175638效果比较示意图。
下面对本发明的生产工艺作详细描述。
1.工程菌发酵培养
本发明的发酵工艺中采用的改良M9培养基包含:
(1)发酵培养基(15L)
蛋白胨 |
1.6-2.4g/L |
葡萄糖 |
4-6g/L |
Na2HPO4 |
6g/L |
KH2PO4 |
3g/L |
NaCl |
0.4-0.6g/L |
NH4C1 |
0.8-1.2g/L |
MgSO4 |
0.5g/L |
(2)补料培养基(3L)
蛋白胨 |
90-120g/L |
酵母粉 |
40-60g/L |
MgSO4 |
10g/L |
(3)葡萄糖(1L)
50%葡萄糖
自菌种库取菌种,划线于含50~100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃培养过夜;次日挑5~10个单菌落接种于10~20ml含50~100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养6-8小时,至菌密度为0.8-1.50D600,此为一级种;一级种以1~5%接种量接种于1升含50~100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养至菌密度为0.8-1.5OD600,该种子液按1~10%接种量以火焰法接种于Biostat全自动发酵系统(B.BRAUN Biotech International,TypeC20-3)或其他类似的发酵罐系统。
设定发酵过程温度为30-37℃,pH6.7-7.2(以2N NH3·H2O调节控制pH),空气通量5-15L/min,罐压0.01-0.02M Pa,通过自动调整转速控制溶解氧浓度(DO)为20-40%。当DO和pH同时上升,生长进入相对停滞期后,开始补加补料培养基和葡萄糖液,从而控制DO为20-40%。当OD600值为50-70时,加入IPTG至终浓度达0.1-1.0mM进行诱导,继续培养3-4h,停止发酵,放罐。测OD600为90~100。
2.菌体收集
HITACHI kimac CR7大容量离心机,设定离心温度为4℃,转速4,000rpm,离心10min收集菌体。刮取菌泥,称湿重。可得湿菌体2.2~2.7kg,而淋巴毒素衍生物表达量为30~40%。
3.菌体破碎
按5-15ml裂解液(20mMTris-HCl pH8.0,5mM EDTA)/g湿菌体,加预冷4℃裂解液。用高压匀浆泵破菌,镜检视野中完整菌体<5%,则认为破菌充分。菌体裂解物交下一步纯化工序。
4.包涵体收集
HITACHI kimac CR7大容量离心机,设定离心温度为4℃,菌体裂解物以4,000rpm,30-40分钟离心,收集沉淀即为粗包涵体。
5.包涵体洗涤
洗涤液A:10-60mM Tris-HCl pH8.0-9.0,1-5mM EDTA
洗涤液B:10-60mM Tris-HCl pH8.0-9.0,1-5mM EDTA,
0.1-0.5%Triton X-100
洗涤液C:10-60mM Tris-HCl pH8.0,1-5mM EDTA,
1-2M尿素,10-100mM β-巯基乙醇
按9ml洗涤液/克粗包涵体沉淀加洗涤液,依序以三种洗涤液,按如下操作洗涤;室温振荡,搅拌20min;10,000rpm,4℃,离心20Min,收集沉淀。按洗涤液/粗包涵体沉淀10∶1(w/w),用20mM Tris-HClpH8.0缓冲液,振荡悬浮沉淀,10,000rpm,4℃,离心10min,收集沉淀。该沉淀中淋巴毒素衍生物含量大于70%。
6.复性
包涵体的增溶方式与复性的方法有关。本发明以三种方式增溶包涵体,并用相应的方法复性,获得了具有生物活性的淋巴毒素衍生物。
本发明的三种包涵体增溶方式包括:
(1)1克包涵体悬浮于40-60ml 8-9M尿素,pH8.5-11.0,25-37℃,搅拌1-2小时;
(2)1克包涵体悬浮于20-30ml 6-8M盐酸胍,pH8.5-11.0,25-37℃,搅拌1-2小时;
(3)1克包涵体悬浮于0-50mM Tris-HCl,pH9.0,100-150ml,用2N氨水调pH至12.0-13.0,20-30℃,保持5-20分钟。
本发明的复性液选自以下三种配方:
(1)5-10nM NaB4O7 pH8.5-10.5,,2-5%蔗糖,0.05-0.25M精氨酸,0.5-1.5M尿素;
(2)5-10mM NaB4O7 pH8.0-11,2-5%蔗糖,0.05-0.25M精氨酸;或
(3)以上两种配方中的NaB4O7以Tris代替。
本发明的优选实施方案:将1克洗涤好的包涵体,以40-60ml 8-9M尿素(或20-30ml 6-8M盐酸胍),pH8.5-11.0悬浮,25-37℃,搅拌1-2小时,10000rpm,20-30分钟;取上清,以Lowery法测定蛋白浓度为4-6mg/ml(6-8M盐酸胍增溶,蛋白浓度为10-15mg/ml)。在4-10℃下,应用蠕动泵,将上述上清缓慢导至15~30倍量(v/v)的复性液(5-10mM NaB4O7 pH8.5-10.5,,2-5%蔗糖,0.05-0.25M精氨酸,0.5-1.5M尿素)中,控制蠕动泵转速,使此过程3-5小时完成。继续搅拌1-2小时。复性液最终蛋白浓度为0.15-0.5mg/ml,尿素浓度为1.0-1.5M。复性液以L-929细胞测活,淋巴毒素衍生物比活为8×107IU/mgPr.。复性液以1N HCL或2N氨水调节pH。硼砂(NaB4O7)可用Tris代替。
本发明的另一种优选实施方案:将1克包涵体,0-50mM Tris-HCl pH9.0100-150ml悬浮,2N氨水调pH至12.0-13.0,20-30℃,保持5-20分钟。在4-10℃下,应用蠕动泵,将上述增溶液缓慢导至15~30倍量的(v/v)复性液(5-10mM NaB4O7 pH8.0-11,2-5%蔗糖,0.05-0.25M精氨酸)中,控制蠕动泵转速,使此过程3-5小时完成。复性液最终蛋白浓度为0.1-0.3mg/ml。复性液以1N HCL或2N氨水调节pH。硼砂(NaB4O7)可用Tris代替。
7.柱层析纯化复性的淋巴毒素衍生物上述复性液,按下述方法分离纯化:
1)Q-Sepharose FF离子交换柱层析分离
以下操作除特殊标明外,均在4-10℃下进行。
按Q-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia公司)说明书,装填XK50/60层析柱,吸附容量以10-20mg/ml计。
以0.5N NaOH,60~100cm/h线速度,反向在位灭菌30~60min;用1M NaCl,100~150cm/h线速度,保持30~60min,进行再生。
柱的平衡:
平衡液1:100mMTris-HCl pH8.5,100~200cm/h线速度,
5~10倍柱体积
平衡液2:10mM Tris-HCl pH8.5,100~200cm/h线速度,
5倍柱体积,流出液与平衡液2电导及pH值一致。
复性蛋白溶液以100~200cm/h线速度上样。
洗涤:
洗涤液1:10mM Tris-HCl pH8.5,100~200cm/h线速度
10倍柱体积
洗涤液2:10mM Tris-HCl pH8.5,50mM NaCl,100~200cm/h
线速度,5倍柱体积
10mM Tris-HCl pH8.5,0.2M NaCl,50~150cm/h线速度以OD280监测,收集洗脱峰。取样,进行生物学活性检测及SDS-PAGE电泳纯度检测。比活为5×108IU/mgPr.,纯度95%以上。收集液加饱和硫酸铵至2.5M,搅拌过夜,10,000rpm,20分钟,收集沉淀备用。
2)Phenyl-Sepharose FF疏水层析:
按Phenyl-Sepharose FF(Amersham Pharmacia公司)说明书,装填XK50/60层析柱,吸附容量以10-20mg/ml计。
以0.5MNaOH,50~100cm/h线速度,反向在位灭菌30~60min;用1MNaCl,50~150cm/h线速度,保持30~60min,进行再生。
10mM Tris-HCl pH9.0,1.0M NaCL平衡,50~150cm/h线速度,约保持20~40min,流出液与平衡液电导及pH值一致。
上述硫酸铵沉淀称湿重,以50~100ml蒸馏水/g湿重,用蒸馏水悬浮,调pH至9.0,搅拌1h,10,000rpm,30分钟,取上清;上清以2N氨水及NaCL,调整pH及电导与平衡缓冲液一致。上样,流速50~150cm/h。
洗涤:
洗涤液1:10mM Tris-HCl pH9.0,1.0M NaCL,50~150cm/h
线速度,10倍柱体积
洗涤液2:10mM Tris-HCl pH9.0,50~150cm/h线速度5倍柱体积
10mM Tris-HCl pH9.0,20%乙二醇,50~150cm/h线速度,以OD280监测,收集洗脱峰,取样分析。置-20℃保存备用。
3)CM-Sepharose FF离子交换柱层析:
用CM-Sepharose FF填料(Amersham Pharmacia公司),按说明书装填XK50/60层析柱,吸附容量以10-15mg/ml计。
以0.5M NaOH,50~100cm/h线速度,反向在位灭菌30~60min;用1MNaCl,50~100cm/h线速度,保持30~60min,进行再生。
10mM NaH2PO4-NaOH pH6.4,50~150cm/h线速度,保持30min,流出液与平衡液电导及pH值一致。
上述Phenyl-Sepharose FF疏水层析洗脱液,加10倍蒸馏水稀释后,调节pH及电导与平衡液一致,以50~150cm/h线速度上样。10mM NaH2PO4-NaOHpH6.4,流速50~150cm/h,洗涤10倍柱体积。
5mM NaH2PO4-NaOH pH6.4,0.2M NaCl,流速50~150cm/h,以OD280监测,收集洗脱峰,测蛋白浓度,以洗脱液稀释至蛋白浓度为1-1.5mg/ml。
本发明所得淋巴毒素衍生物的理化性质
以WHO淋巴毒素标准品作为标准,L-929细胞测活,比活大于1.0×109IU/mgPr.;以SDS-PAGE、RP-HPLC、分子筛HPLC及毛细管区带电泳等四种方法检验,纯度高于99%;以离子散射质谱,测分子量为15989.2道尔顿。内毒素小于0.5EU/mgPr.,等电点pI6.9-7.1。分子筛HPLC检测分子量为15000道尔顿,即以单体形式存在,具有较高的生物学活性。PH5.0-9.0,2~37℃,0~30天生物活性不变化,SDS-PAGE银染检测未发现降解。
图2为本发明与CN1175638所述技术的效果比较。从图2可见,本发明从菌种的稳定、发酵规模、复性率的提高及分离纯化等技术方面均有显著改善。
本发明从选育菌种开始,实现了淋巴毒素衍生物重组菌的高密度、高表达量发酵,并在包涵体蛋白的变性复性以及淋巴毒素衍生物的分离纯化技术上进行改进,提供了能大规模生产的重组淋巴毒素衍生物的生产工艺。
本发明收获的包涵体洗涤后纯度达70%以上,复性液蛋白质浓度达0.2~0.5mg/ml,收率达80%,复性液经Q-Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF及CM-Sepharose FF柱层析纯化后,可得高纯度、高比活淋巴毒素衍生物,总收率大于40%。所得淋巴毒素衍生物以SDS-PAGE、RP-HPLC、分子筛HPLC和毛细管区带电泳分析,纯度大于98%;以WHO的淋巴毒素标准品作为标准,用鼠成纤维细胞株L-929测活,其比活大于1.0×109IU/mg蛋白质。所得淋巴毒素衍生物对三种小鼠肿瘤显示较好的抑制率,若以100ug/kg剂量静脉注射,分别为小鼠肉瘤S180 56.2%,结肠癌colon26 55.9%,肝癌HAC 56.9%。
以下用实施例和实验例对本发明进行举例说明,它们旨在阐述本发明的最佳实施方案。通过这些实施例和实验例的阐述,本发明的上述目的和效果也将变得更为明了。
本领域技术人员根据本发明的启示,结合本领域的常识所做的各种变更,均落在本申请权利要求的范围内。
实施例一、淋巴毒素衍生物工程菌的高密度发酵
称量蛋白胨30克,Na2HPO4 90克,KH2PO4 45克,NaCl 7.5克,4000ml蒸馏水,加热溶解后,导入30立升B.BRAUNBiostat全自动发酵罐,补加10000ml蒸馏水,启动发酵罐灭菌程序,121℃,25分钟。另取葡萄糖75克,MgSO4 7.5克,NH4Cl 15克,蒸馏水1000ml,以0.22u的无菌滤膜过滤除菌;灭菌完毕,待发酵罐温度冷至40℃以下,导入上述除菌过滤液。发酵罐罐压保持0.01Mpa备用。
称取蛋白胨300克,酵母粉180克,MgSO4 30克,蒸馏水3000ml,溶解后,121℃,20分钟,此为补料培养基A液。另取葡萄糖500克,蒸馏水1000ml,加热溶解后,115℃,10分钟,此为补料培养基B液。
自菌种库取菌种,划线于含100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃培养过夜;次日挑5个单菌落接种于20ml含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养6小时,至菌密度为1.2 OD600,此为一级种;一级种以1%接种量接种于1升含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养至菌密度为0.9OD600,该种子液按5%接种量以火焰法接种于Biostat全自动发酵罐。
设定发酵过程温度为35℃,pH 6.8(以2N NH3·H2O调节控制pH),空气通量12L/min,罐压0.01Pa,通过自动调整转速控制溶解氧浓度(DO)为25%。当DO和pH同时上升,生长进入相对停滞期后,开始补加补料培养基A液和B液,控制DO为309%。当OD600值为61时,加入IPTG至终浓度达0.6mM进行诱导,继续培养3.5,停止发酵,放罐。测OD600为93.4。
HITACHI kimac CR7大容量离心机,设定离心温度为4℃,转速4,000rpm,离心10min收集菌体。刮取菌泥,称湿重。可得湿菌体2450克,淋巴毒素衍生物表达量为38%。
按8ml裂解液(20mMTris-HCl pH8.0,5mM EDTA)/g湿菌体,加预冷4℃裂解液约20L。用高压匀浆泵破菌,镜检视野中完整菌体<5%,则认为破菌充分。HITACHI kimac CR7大容量离心机,设定离心温度为4℃,菌体裂解物以4,000rpm,30分钟离心,收集沉淀即为粗包涵体742克。
实施例二、包涵体的洗涤
洗涤液A:20mM Tris-HCl pH8.5,5mM EDTA,5000ml
洗涤液B:20mM Tris-HCl pH8.5,5mM EDTA,
0.2%Triton X-100,2000ml
洗涤液C:20mM Tris-HCl pH8.5,5mM EDTA
2M Urea,50mM β-巯基乙醇,2000ml
取200克粗包涵体,分别依序加1800ml洗涤液,按如下操作洗涤包涵体:室温振荡,搅拌20min;10,000rpm,4℃,离心20Min,收集沉淀。加20mM Tris-HClpH8.0缓冲液1200ml,振荡悬浮沉淀,10,000rpm,4℃,离心20min,收集沉淀,称重118.4克。该沉淀中淋巴毒素衍生物含量大于70%。
实施例三、复性方法(一)
30克包涵体,加1500ml 9M尿素pH9.5悬浮,25℃,搅拌1小时,10000rpm,25分钟;取上清,以Lowery法测定蛋白浓度为5.2mg/ml。在4-10℃下,应用蠕动泵,将上述上清缓慢导至30L复性液(5mM NaB4O7 pH9.5,3%蔗糖,0.05M精氨酸,0.5M尿素)中,控制蠕动泵转速,使此过程4小时完成。继续搅拌1小时。复性液以L-929细胞测活,淋巴毒素衍生物比活为8.12×107IU/mgPr.。
实施例四、复性方法(二)
20克包涵体,20mM Tris-HCl pH9.0 2000ml悬浮,2N氨水调pH至12.3,25℃,保持5-20分钟。在4-10℃下,应用蠕动泵,将上述增溶液缓慢导至40L(v/v)复性液(10mM NaB4O7pH10,2%蔗糖,0.05精氨酸)中,控制蠕动泵转速,使此过程3小时完成。比活为3.92×107IU/mgPr.。
实施例五、复性淋巴毒素衍生物的纯化
1)Q-Sepharose FF离子交换柱层析分离
Q-Sepharose FF 400ml装填XK50/60层析柱。
以0.5NNaOH,80cm/h线速度,反向在位灭菌30min;用1M NaCl,100cm/h线速度,保持30min,进行再生。平衡液1:100mM Tris-HCl pH8.5,150cm/h线速度,3000ml平衡液2:10mM Tris-HCl pH8.5,150cm/h线速度,2000ml
平衡流出液与平衡液2电导及pH值一致。
实施例三复性蛋白溶液以150cm/h线速度上样。
洗涤:洗涤液1:10mM Tris-HCl pH8.5,150cm/h线速度4000ml
洗涤液2:10mM Tris-HCl pH8.5,50mM NaCl,100cm/h线
速度,2000ml
10mM Tris-HCl pH8.5,0.2M NaCl,80cm/h线速度洗脱4,以OD280监测,收集洗脱峰620ml,蛋白浓度为5.92mg/ml。取样,进行生物学活性检测及SDS-PAGE电泳纯度检测。比活为5.14×108IU/mgPr.,纯度95%以上。收集液加硫酸铵205克,搅拌过夜,10,000rpm,20分钟,收集沉淀备用。
2)Phenyl-Sepharose FF疏水层析:
Phenyl-Sepharose FF 250ml装填XK50/60层析柱。
以0.5MNaOH,60cm/h线速度,反向在位灭菌30min;用1M NaCl,100cm/h线速度,保持30min,进行再生。
10mM Tris-HCl pH9.0,1.0M NaCL平衡,100cm/h线速度,约保持20min,流出液与平衡液电导及pH值一致。
将上述硫酸铵沉淀称湿重,1500ml蒸馏水悬浮,调pH至9.0,搅拌1h,10,000rpm,30分钟,取上清;上清以2N氨水及NaCL,调整pH及电导与平衡缓冲液一致。上样,流速80cm/h。洗涤:
洗涤液1:10mM Tris-HCl pH9.0,1.0M NaCL,80cm/h
线速度,2500ml
洗涤液2:10mM Tris-HCl pH9.0,80cm/h线速度
1300ml
10mM Tris-HCl pH9.0,20%乙二醇,80cm/h线速度,以OD280监测,收集洗脱峰480ml,蛋白浓度5.02mg,取样分析。置-20℃保存备用。
3)CM-Sepharose FF离子交换柱层析:
CM-Sepharose FF填料200ml装填XK50/60层析柱
以0.5M NaOH,80cm/h线速度,反向在位灭菌30min;用1M NaCl,100cm/h线速度,保持30min,进行再生。
10mM NaH2PO4-NaOH pH6.4,100cm/h线速度,保持30min,流出液与平衡液电导及pH值一致。
上述Phenyl-Sepharose FF疏水层析洗脱液,加4500ml蒸馏水稀释后,调节pH及电导与平衡液一致,以100cm/h线速度上样。10mM NaH2PO4-NaOH pH6.4,流速50cm/h,洗涤800ml。
10mM NaH2PO4-NaOH pH6.4,0.2M NaCl,流速50cm/h,以OD280监测,收集洗脱峰300ml,测蛋白浓度6.75mg/ml,以洗脱液稀释至蛋白浓度为1-1.5mg/ml。
实验例一
淋巴毒素衍生物的抗肿瘤动物试验
实验动物用昆明种小鼠,分别培养三种肿瘤细胞株colon26、S180及HAC至1.0×106细胞/ml,取0.1ml注射腋部皮下;同时,分别以静脉注射(iv)和腹腔注射(ip)两种给药方式,按一定剂量自尾静脉或腹腔注射淋巴毒素衍生物,连续给药7天,第10天解剖小鼠,取瘤体称重,计算抑瘤率。结果见如下表1。
表1淋巴毒素衍生物的抗肿瘤效果
肿瘤株 |
给药方式 |
剂量(ug/kg) |
抑瘤率(%) |
ID50(ug/kg) |
结肠癌Colon26 |
iv |
25 |
31.7 |
72.2 |
50 |
43.3 |
100 |
55.9 |
ip |
50 |
36.1 |
120.7 |
100 |
46.5 |
200 |
58.4 |
肉瘤S180 |
iv |
25 |
31 |
69.8 |
50 |
46.5 |
100 |
55.2 |
ip |
50 |
36.2 | 125.4 |
100 | 47.9 |
200 |
56.2 |
肝癌HAC |
iv |
25 |
34.7 |
65.7 |
50 |
45.4 |
100 |
56.9 |
ip |
50 |
32.1 |
145.4 |
100 |
47 |
200 |
53.6 |