CN104591808A - 用混合菌种发酵水产品下脚料的方法 - Google Patents

用混合菌种发酵水产品下脚料的方法 Download PDF

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CN104591808A CN201410842419.1A CN201410842419A CN104591808A CN 104591808 A CN104591808 A CN 104591808A CN 201410842419 A CN201410842419 A CN 201410842419A CN 104591808 A CN104591808 A CN 104591808A
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罗红宇
宋敏
刘为
童晓倩
赵玉谨
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Abstract

本发明公开了一种用混合菌种发酵水产品下脚料的方法，其特征在于：所述方法利用组合菌株对水产品下脚料进行发酵，工艺参数为：转速203rpm、接种量5％、温度30℃。在此条件下，发酵液中游离氨基酸态氮含量达到13.865g/L，较优化前(12.365g/L)提高了12.13％，符合水溶性氨基酸肥料标准，也适合制备微生物肥料。

Description

用混合菌种发酵水产品下脚料的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体的说是一种利用混合菌种发酵水产品下脚料的方法。
背景技术
随着人们对健康和食品营养的需求越来越高，水产品以低脂肪、高蛋白、富含维生素和矿物质等特点而越来越受到人们的青睐，由此带来水产品加工业的迅速发展壮大，产量逐年提升。但在加工过程中，会产生大量的下脚料，如鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼内脏、鱼骨、鱼胆、鱼漂、虾壳、蟹壳、贝类及其残留鱼肉，其重量约占原料鱼的40％～55％。这类下脚料大部分被废弃，不仅污染环境，还造成了资源的浪费。从资源利用的角度分析，水产品下脚料中含有丰富的营养物质和有用成分，如鳗骨、鳗头等废弃物中含有丰富的蛋白质、磷脂质、软骨素、维生素等，这些下脚料经过微生物的发酵，可以成为很好的农业肥料。
近些年来，大量使用化肥带来的环境污染、土壤板结、地方衰退、生态恶化等问题日益严重，破坏了环境，影响了土壤肥力，降低了农产品的品质。微生物菌肥以投入低、产出高且绿色无污染等优点而成为发展绿色农业的重要方向。菌肥的矿物质含量和有机质含量都决定了菌肥的应用范围和效果。优良的菌种及发酵工艺是影响菌肥品质的重要的因素。目前，对微生物发酵生产菌肥的工艺优化方面的研究很多，但原料多局限于动物粪便粪、稻壳、污泥和秸秆等，使用菌种单一，工艺优化也多采用正交试验进行，如曹慧玲等以新鲜牛粪和稻壳粉为发酵原料，进行牛粪好氧发酵试验，以正交试验，探讨生物有机肥生产的最佳工艺条件。宋鹏等利用生活垃圾以及污泥混合物为原料，接入有机物料腐熟固体混合菌剂和有益菌群混合菌悬液，生产微生物肥料。
本发明以水产品下脚料为唯一原料，采用对下脚料有高效分解作用的多株菌进行混合发酵，以游离氨基酸态氮含量为评价发酵的指标，对影响发酵的条件通过单因素试验及响应面法分析，确定发酵生产的最佳工艺条件，旨在为微生物菌肥的生产拓宽领域及提供一定的理论依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用混合菌种发酵水产品下脚料的方法。
为了实现上述目的，本发明采用技术方案为：
用混合菌种发酵水产品下脚料的方法，其特征在于：所述方法是利用组合菌种对水产品下脚料进行发酵，具体步骤包括：
(1)种子培养：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取组合菌种各一环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基；所述组合菌种为菌株a、菌株b、菌株c和菌株d；所述菌株a为食酸菌、菌株b为假单胞菌、菌株c为黑曲霉、菌株d为酵母；
(2)发酵培养：250mL锥形瓶中装入发酵培养基50mL，按5％接种量将发酵菌液接入发酵培养基中，在28℃，120rpm条件下摇床培养3d；所述发酵培养基按照重量百分比计含有：10％经绞碎的水产品下脚料,90％蒸馏水。
本发明的另一技术方案是所述种子培养步骤中：所述菌株a为
菌株a:热带假丝酵母Candida tropicalis、
菌株b:罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii、
菌株c:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、
菌株d:蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
优化地，所述水产品下脚料包括鱼鳞、鱼皮及内脏混合物。
优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b各一环，菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b和菌株c各一环、菌株d两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
优化地，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
本发明利用混合菌株直接发酵水产品下脚料的过程中无需添加任何其他辅助原料，微生物即可良好生长，且发酵工艺简单、发酵效果也非常显著，解决了水产品资源浪费和环境污染问题。
本发明通过混合菌株发酵的单因素试验和工艺优化发现，在混菌发酵水产品下脚料的过程中,发酵条件对游离氨基酸态氮的含量有着重要的影响。本发明在单因素试验基础上，对发酵温度、接种量和转速三个因素进行响应面法分析，建立二次多项数学模型得到响应面立体图，优化后得到混合菌株的最佳的发酵条件为：转速203rpm、接种量5％、温度30℃。经过试验，在上述发酵条件下发酵水产品下脚料，游离氨基酸态氮含量可达13.865g/L，较优化前(12.365g/L)提高了12.13％。发酵产物符合水溶性氨基酸肥料标准，也适合制备微生物肥料。
本发明由于利用了水产品加工下脚料，同时又可提高产品的附加值，因而具有较好的市场开发前景。另外，微生物发酵过程中由于显著减少了产生化学污染和病原菌污染的机会，与动物源性蛋白和植物源性蛋白相比，品质更稳定、更安全、更可靠。
附图说明
图1是游离氨基酸态氮标准曲线示意图。
图2是转速对发酵液游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
图3是接种量对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
图4是温度对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
图5是培养时间对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
图6是料液比对游离氨基酸态氮含量的影响示意图。
图7是转速与接种量对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
图8是转速与温度对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
图9是接种量与温度对游离氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线图。
具体实施方式
实施例1
1、制备培养基
菌种活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
种子培养基：马铃薯液体培养基(将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加水至1000mL)。
发酵培养基：10％(w/v)经绞碎的低值水产品,90％的蒸馏水。
2实验方法
2.1培养方法
平板活化培养：28℃培养3d。
种子培养：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取所述菌株a食酸菌、菌株b假单胞菌、菌株c黑曲霉、菌株d酵母各一环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在28℃，120rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出。
发酵培养：250mL锥形瓶中装入发酵培养基50mL，按5％接种量将发酵菌液接入发酵培养基中，在28℃，120rpm条件下摇床培养3d。
2.2显色剂的配制
15.00mL37％甲醛与7.80mL乙酞丙酮混合,加水定容至100mL,剧烈振荡使其反应完全,放置12h后使用。
2.3游离氨基酸态氮含量的测定
制作氨基酸态氮标准曲线。
样品测定：用移液枪吸取10.0mL发酵上清液于100mL容量瓶中，加水至刻度混匀，再从中吸取5mL于50mL容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。取备用样品1mL于lOmL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂,加水稀释至刻度,混勻。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后,移入1cm比色杯内,以零管为参比,于波长400nm处测量吸光度值,并从标准曲线上查出相应的氮含量，乘以样品在整个过程中的稀释倍数1000，最后折算成氮含量单位为g/L。
2.4影响发酵效果的单因素试验
将一定量的种子液接入盛有灭菌发酵培养基的250mL锥形瓶中进行摇瓶发酵，以游离氨基酸态氮含量为评价指标，分别探究了转速、水分含量、接种量、发酵温度、发酵时间对低值水产品发酵效果的影响。
2.5响应面试验设计
在单因素试验基础上，确定了需要优化的因素，采用中心组合设计(central compositedesign,CCD)，对关键因子进一步研究，以获得混和菌株发酵的最佳条件。
2.6数据处理
所有实验设计与结果分析统计均采用Design-Expert7.0软件进行。
3、实验结果
3.1游离氨基酸态氮标准曲线
以OD值为横坐标，游离氨基酸态氮含量为纵坐标，得到游离氨基酸态氮标准曲线如图1所示。经统计分析，得线性回归曲线为：y＝121.98x-1.2967，R2＝0.9982，说明曲线可信度较高，可以运用。
3.2发酵单因素试验
3.2.1转速对发酵效果的影响
发酵体系的含氧量是影响微生物生长的重要因素之一，而转速正是决定含氧量的重要条件。为了确定适宜的转速，本试验设定种子液接种量5％，温度28℃，摇床转速分别设定为120rpm、160rpm、200rpm、240rpm，培养72h后，检测各样品的游离氨基态氮含量，每组做三个平行样。结果如图2所示。
由图2可知，发酵液中游离氨基酸态氮的含量随摇床转速增大呈先上升后平稳、略微下降的趋势，当摇床转速为200rpm时，游离氨基酸态氮的含量趋于最高值。随着摇床转速增加，发酵液流体湍动程度增大，气相间的传质和液相中的传质过程加快，溶解氧的溶解速度也越快，对菌体生长和产物的转化有利。而当摇床转速继续增大时，发酵液中溶解氧浓度达到上限，此时转速再快溶解氧也不会增加，产物的转化也达到平稳。故选择转速200rpm为较佳参数。
3.2.2接种量对发酵效果的影响
菌株的接种量直接影响到降解原料中有机质的速度和程度。接种量过少会导致发酵过程缓慢，降解效果不佳；接种量过高，也可能导致菌体过度生长抑制了蛋白酶的分泌，造成蛋白质降解率下降。为了确定适宜的接种量，本试验将接种量分别设定为5％、10％、15％、20％，摇床温度28℃，转速160rpm，培养72h，分别测定各组样品的游离氨基酸态氮含量，每组做三个平行样。结果如图3所示。
由图3可知，游离氨基酸态氮的含量随接种量的增加呈先上升后缓慢下降的趋势，当接种量为5％时，游离氨基酸态氮的含量趋于最高值。原因为随着接种量的增加，微生物的延迟期缩短，菌体迅速生长，产生的蛋白酶的总量也多，所以小分子肽和氨基酸含量都逐渐升高；随着接种量继续增加，可能由于菌种生长过快，造成营养竞争乃至缺乏，蛋白酶的分泌减少，导致小分子肽和氨基酸含量都有所下降。故选择接种量5％为较佳参数。
3.2.3温度对发酵效果的影响
温度变化与微生物生长代谢紧密相关，过高或过低的温度均不利于微生物生长及代谢的进行。为了确定适宜的温度范围，本试验分别设定温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，接种量5％，转速160rpm，培养72h，分别检测各组样品的游离氨基态氮含量，每组样品做三个平行样。结果如图4所示。
由图4可知，发酵液中游离氨基酸态氮的含量随温度的增加呈先升后降趋势，当发酵温度为30℃时，游离氨基酸态氮的含量趋于最大值。这是因为温度较低时，酶活受到影响，不能很好地降解蛋白质，而温度过高易使酶失活，菌体加速衰老，影响发酵周期。因此选择温度30℃为较佳参数。
3.2.4培养时间对发酵效果的影响
在发酵过程中，一般随时间的延长菌株对有机质的降解率逐渐增加，但达到一定时间后，降解率趋于不变。为了确定适宜的培养时间，本试验设定接种量5％，温度28℃，转速160rpm，培养7天，培养期间，每24h取发酵液检测游离氨基态氮含量，平行测定三次。结果如图5所示。
由图5可知，在1～5d里，发酵液中游离氨基酸态氮的含量随发酵时间的增加有明显的上升趋势，第5天含量达到最高值，之后游离氨基酸态氮的含量趋于平稳。故考虑实际生产周期越短越好，确定培养时间为5d。
3.2.5料液比对发酵效果的影响
培养基含水量是决定固态发酵成败的关键因素之一。水分不仅影响微生物的生长代谢，而且与基质的理化性质也有复杂关系。为了确定适宜的料液比，本试验分别设定料液比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9，接种量5％，温度28℃，转速160rpm，培养72h，分别检测各组样品的游离氨基态氮含量，每组做三个平行样。结果如图6所示。
由图6可知，发酵液中游离氨基酸态氮的含量随料液比的减小(即水分含量增大)而不断增加，当料液比为1:9时，游离氨基酸态氮的含量趋于最大值，之后变化较小。故确定料液比为1:9为最优条件。
4、发酵工艺优化试验结果
4.1响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果，对转速、接种量、温度3个因素进行进一步优化，以这3个因素为自变量，以发酵液中游离氨基酸态氮的含量为响应值，利用Box-Behnken进行中心组合试验设计(见表1、表2)。
表1响应面因素水平编码表
Table 1.Factors and levels of response surface design
表2响应面试验设计及结果
Table 2.Design and results of response surface tests
通过对表2进行二次多项回归拟合，获得回归方程，其中Y为游离氨基酸态氮含量：
Y()＝+13.89+0.23*A+0.030*B+0.11*C+0.000*A*B-0.030*A*C+0.060*B*C-1.38*A2-0.79*B2-0.57*C2
对回归方程进行方差分析，结果见表3。
由表3可知，回归模型是显著的(P＜0.0001)，失拟项不显著(P＝0.7021>0.05)，表明回归方程拟合程度良好；回归模型的决定系数R2＝0.9849，说明该模型能够解释98.49％的变化，仅有总变异的1.51％不能用此模型来解释，该模型拟合程度良好；模型校正决定系数R2 Adj＝0.9654，说明模型非常显著，且信噪比为18.246(一般信噪比大于4认为精密度是准确可信的)。综上所述，模型可信度较高，可以使用该模型对设计的发酵工艺的效果进行预测和分析。
表3回归方程方差分析结果
Table 3.Analysis of variances for the developed regression equation
注：P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。
在表3中，由回归方程系数显著性检验可知：一次项A及二次项A2、B2、C2表现为极显著，其它因子均不显著。通过回归方程进行中心标准化处理，用回归系数绝对值大小分析各因素的改变对游离氨基酸态氮含量的影响程度。回归方程一次项的回归系数绝对值依次为A＝0.23、C＝0.11、B＝0.030，由此确定三个因素的影响主次顺序为：A(转速)>C(温度)>B(接种量)。
4.2响应面分析
利用Design Expert 7.0软件，对多元回归方程进行响应曲面分析(图7～图9)。再通过该组动态图对两因素间的交互影响作用对游离氨基态氮含量的效应进行分析与评价，并确定最优工艺参数。
等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著。从图7～图9中可直观了解各因素及其交互作用对发酵液中游离氨基酸态氮含量的影响，从响应面的陡峭程度可知转速对游离氨基酸态氮含量的影响较大，而温度、接种量对游离氨基酸态氮含量的影响相对较小，与方差分析结果一致。各因素都在零水平左右存在最佳点。
利用Design软件求出回归模型极值点，即最佳发酵条件为：转速203.32rpm、接种量5.06％、温度30.08℃，此条件下发酵液中游离氨基酸态氮含量的理论值为13.905g/L。在最佳发酵条件下进行验证实验，考虑到实际操作的精度要求，将最佳条件修正为：转速203rpm、接种量5％、温度30℃。此条件下进行3次平行实验，发酵液中游离氨基酸态氮的含量为13.865g/L，与预测值接近，说明回归方程能较真实地模拟各因素对游离氨基酸态氮含量的影响。
实施例2
与实施例1不同的是，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b各一环，菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
菌株a:热带假丝酵母Candida tropicalis、
菌株b:罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii、
菌株c:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、
菌株d:蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
实施例3
与实施例1不同的是，所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b和菌株c各一环、菌株d两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
菌株a:热带假丝酵母Candida tropicalis、
菌株b:罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii、
菌株c:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、
菌株d:蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
实施例4
所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
菌株a食酸菌、菌株b假单胞菌、菌株c黑曲霉、菌株d酵母
实施例5
所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
菌株a食酸菌、菌株b假单胞菌、菌株c黑曲霉、菌株d酵母
实施例2-5是不同菌种配比下的不同方案，表4位不同菌种配比情况下的游离氨基酸态氮的结果图。

Claims (7)

1.用混合菌种发酵水产品下脚料的方法，其特征在于：所述方法是利用组合菌种对水产品下脚料进行发酵，具体步骤包括：
(1)种子培养：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取组合菌种各一环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基；所述组合菌种为菌株a、菌株b、菌株c和菌株d；所述菌株a为食酸菌、菌株b为假单胞菌、菌株c为黑曲霉、菌株d为酵母；
(2)发酵培养：250mL锥形瓶中装入发酵培养基50mL，按5％接种量将发酵菌液接入发酵培养基中，在28℃，120rpm条件下摇床培养3d；所述发酵培养基按照重量百分比计含有：10％经绞碎的水产品下脚料,90％蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养步骤中：所述菌株a为
菌株a:热带假丝酵母Candida tropicalis、
菌株b:罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii、
菌株c:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、
菌株d:蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水产品下脚料包括鱼鳞、鱼皮及内脏混合物。
4.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b各一环，菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
5.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a、菌株b和菌株c各一环、菌株d两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
6.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
7.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述种子培养步骤：250mL锥形瓶中装入种子培养基50mL，用接种环取菌株a一环，菌株b、菌株c、菌株d各两环，接入灭菌的种子培养基，用封口膜封口，在30℃，203rpm条件下摇床培养至菌种的对数期取出；所述种子培养基为马铃薯液体培养基。
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